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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Isolierung von HSP25

Die Isolierung von HSP25 erfolgte in Anlehnung an Benndorf et al. (1992) aus EAT-Zellen der Maus in der stationären Wachstumsphase (Bielka et al., 1994; Benndorf et al., 1988a). Dabei wurde besonderes Augenmerk auf eine schonende Behandlung der Präparate gelegt, um das Protein in möglichst nativer Form zu gewinnen. Die Isolierung erfolgte über eine Ammoniumsulfatpräzipitation und drei Chromatographieschritte. Nach dem Zellaufschluß wurden die EAT-Zellextrakte schockgefroren und für die weitere Aufreinigung dann pro Präparation ca. 50 ml aufgetaut. Die Fällung mit Ammoniumsulfat erfolgte bei einer Sättigung von 45%. Bei der anschließenden Dialyse des Niederschlags zeigte sich, daß nicht mehr alle Proteine in Lösung gingen. Die elektrophoretische Analyse dieser unlöslichen Komponenten ergab, daß es sich dabei um Fremdproteine handelte. Durch Abzentrifugation des Dialysates wurden diese Aggregate entfernt und damit ein zusätzlicher Reinigungseffekt erzielt. Der erste Chromatographieschritt bestand in einer Auftrennung des Dialysats über eine DEAE52-Säule. Zur Elution wurde ein Gradient von 0-250 mM NaCl verwendet (Abb. 3.1 A). Benndorf et al. (1994) verwendeten bei der Reinigung von HSP25 aus EAT-Zellen an dieser Stelle eine Phenylsepharose-Säule, die die Verwendung von Triton X-100, einem starken Detergens, notwendig macht. Da Triton X-100 eine Veränderung der nativen Struktur der HSP25-Komplexe bewirken könnte und Vorversuche zeigten, daß sie nur wenig effektiv bei der Reinigung von HSP25 ist, wurde hier auf diese Säulenart verzichtet. Die HSP25-haltigen Fraktionen aus der DEAE52-Elution wurden dialysiert und auf eine Hydroxylapatit-Säule aufgetragen. Unter den in Kapitel 2.1.4 beschriebenen Bedingungen bindet HSP25 nicht an die Säule und wird damit von den Proteinen abgetrennt, die eine Affinität zu dem Säulenmedium aufweisen (Abb. 3.1 B).

Aus Vorversuchen mit alternativen Säulen ergab sich, daß eine weitere Aufreinigung von HSP25 mittels einer Chromatofokussierung über eine Mono P-Säule zwar sehr effektiv ist, daß aber nach diesem Präparationsschritt kaum noch supramolekulare Komplexe vorhanden waren und daß das Protein die Actinpolymerisation nicht hemmte. Anschließende Analysen mittels zweidimensionaler SDS-PAGE (nicht gezeigt) belegten, daß das auf diese Weise gewonnene Material überwiegend unphosphoryliertes HSP25 war, das nach den Befunden von Benndorf et al. (1994) einen hemmenden Einfluß auf die Actinpolymerisation haben sollte. Da das Protein bei der Chromatofokussierung im Bereich des isoelektrischen Punktes (pI = 6,12) von der Säule gewaschen wird, ist es möglicherweise denaturiert. Es wurde deshalb auf die Mono P-Säule verzichtet und statt dessen im Anschluß an die Hydroxylapatit-Säule eine Mono Q-Säule eingesetzt. Dies hatte zusätzlich den Vorteil, daß die Proben vor dem Lauf nicht erneut dialysiert werden mußten. Die Elution der Proteine von der Mono Q-Säule erfolgte mit einem Gradienten von 0-400 mM NaCl, die HSP25-haltigen Fraktionen wurden bei 100-200 mM NaCl eluiert (Abb. 3.1 C).

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Abb. 3.1: FPLC-Chromatogramme der Aufreinigungsschritte des nativen HSP25
Trennung der Präparate nach: A, DEAE52-Säule; B, Hydroxylapatit-Säule; C, Mono Q-Säule. In den Elutionsprofilen sind die Absorption der Eluate bei 280 nm (\|[boxh ]\|) und der Verlauf des Gradienten (---) aufgezeichnet. Die gekennzeichneten Flächen im Elutionsprofil markieren die zur weiteren Aufreinigung verwendeten Fraktionen. Dabei entspricht jede senkrechte Linie einer Fraktion.

Abb. 3.2 zeigt den Fortgang der Aufreinigung anhand der Proteinmuster der einzelnen Reinigungsschritte. Die Identifizierung von HSP25 mit Hilfe des monospezifischen Antikörpers ist ebenfalls in Abb. 3.2 dargestellt. Die in dem Western-Blot erkennbaren Unterbanden stellen vermutlich Abbauprodukte von HSP25 dar. Sie sind nach der Hydroxylapatit-Säule nicht mehr zu erkennen. Nach der Reinigung über die Mono Q-Säule ist auf dem SDS-Gel nur noch eine Bande bei ca. 25 kDa zu erkennen. Damit gelang es, HSP25 mit nur drei Chromatographieschritten in einem elektrophoretisch sauberen Zustand zu isolieren. Tab. 3.1

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Tab. 3: Bilanz einer repräsentativen HSP25-Präparation
Eine typische Präparation umfaßte etwa 8 x 10⁹ EAT-Zellen.

Reinigungsschritt	Proteinmenge (mg)	Reinigungsfaktor	Ausbeute (%)
EAT-Lysat	175	1	100
Ammoniumsulfat-Fällung	64	3	44
DEAE 52	14,4	4	35
Hydroxylapatit	1,4	20	8
Mono Q	0,4	55	5

Der Einfluß des nach diesem Schema isolierten HSP25 auf die in vitro Actinpolymerisation wird in Kapitel 3.3.1 behandelt. Eine weitere Auftrennung der in dieser Präparation enthaltenen unterschiedlich großen supramolekularen Komplexe mittels Zentrifugation über einem Saccharosekissen (Kapitel 2.1.6) bildete die Basis für Strukturanalysen mittels Elektronenmikroskopie und hydrodynamischen Methoden (siehe Kapitel 3.2.1).

Abb. 3.2: Proteinmuster der Proben und Nachweis von HSP25 nach den einzelnen Reinigungsschritten
SDS-PAGE (oben) und Western-Blot (unten) der Präparate nach der Lyse der EAT-Zellen (Bahn 1), Ammoniumsulfat-Fällung (Bahn 2), DEAE-Zellulose-Säule (Bahn 3), Hydroxylapatit-Säule (Bahn 4) und Mono Q-Säule (Bahn 5). Der Pfeil markiert die Position der HSP25-Bande.Abb. 1:

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3.2 Struktur von HSP25

3.2.1 Natives HSP25

3.2.1.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen

Das aus EAT-Zellen isolierte HSP25 enthält sowohl niedermolekulares Material als auch HSP25-Komplexe verschiedener Größe. Die hochmolekularen HSP25-Komplexe konnten von den HSP25-Monomeren (Überstand oder Fraktion 1) wie in Kapitel 2.1.6 beschrieben abgetrennt werden. Die Komplexe bestanden jedoch nicht aus einer einheitlichen Fraktion, sondern aus mindestens drei verschiedenen Größenklassen. Diese wurden mittels einer Sepharose 6B-Säule voneinander getrennt, so daß insgesamt vier Fraktionen untersucht wurden. Bei der elektronenmikroskopischen Analyse negativkontrastierter Präparate dieser Fraktionen ergab sich das folgende Bild: Der Überstand (Fraktion 1) enthält nur niedermolekulares Material (Abb. 3.3 A), hochmolekulare Komplexe waren nicht zu erkennen. Die anderen, durch Säulenchromatographie aufgetrennten Fraktionen, unterschieden sich kaum in ihrem elektronenmikroskopischen Erscheinungsbild. Sie beinhalten ringförmige Komplexe mit einem Durchmesser von ca. 16 nm, in deren Mitte (ca. 8 nm im Durchmesser) eine Anreicherung von Kontrastmittel zu erkennen ist (Abb. 3.3 B). Die Ablagerung von Kontrastmittel in diesem zentralen Bereich läßt auf eine Vertiefung oder einen Hohlraum schließen, wobei der Kontrastierungsgrad dieser Struktur deutlich variierte.

Um eine genauere Vorstellung von der Feinstruktur dieser Komplexe gewinnen zu können, wurde eine Bildanalyse mit Hilfe des Programmes IMAGIC-5 durchgeführt. Die resultierenden Klassenmittel, die verschiedenen Ansichten der HSP25-Komplexe entsprechen, sind in Abb. 3.4 A gezeigt. Diese Ansichten weisen ein rundes, ringförmiges Profil mit uneinheitlich strukturiertem Zentrum auf. Die Klassenmittel aus der mittleren Reihe erscheinen dabei etwas kompakter als die anderen Ansichten. Die während der MSA (Multivariate Statistische Analyse) generierten Eigen-Bilder deuten auf eine vierfache, zweifache und zum Teil auch achtfache Symmetrie der HSP25-Komplexe hin (siehe Abb. 3.4 B). Dabei stellt das erste Eigen-Bild die Summe des alignierten Datensatzes dar, wohingegen die folgenden drei eine leichte Kippung der Moleküle zum Untergrund, also der Trägerfolie, widerspiegeln. Aufgrund einer bevorzugten Orientierung der Komplexe wurden sehr viele `Ansichten´ von oben und nur wenige von der Seite gefunden. Darum konnte auf der Basis dieser Daten eine dreidimensionale Struktur nicht berechnet werden. Die Punktgruppensymmetrie der HSP25-Komplexe konnte nicht zweifelsfrei ermittelt werden, jedoch wird aus dem vorhandenen Datensatz deutlich, daß im Falle des nativen HSP25 die Komplexe eine ringförmige Struktur aufweisen und keine dicht gepackten Assoziate bilden, wie sie für rekombinantes HSP25 beschrieben wurden (Behlke et al., 1991).

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Abb. 3.3: Elektronenmikroskopische Darstellung von nativem HSP25
A, niedermolekulares HSP25. B, HSP25-Komplexe. Die Meßbalken weisen eine Länge von 50 nm auf. Vergrößerung 235.000 x.

Abb. 3.4: Ergebnisse der Strukturanalyse der negativ kontrastierten HSP25-Komplexe
A, Galerie charakteristischer Ansichten von HSP25-Komplexen. Die Ansichten entsprechen aufsummierten und gemittelten Einzelbildern. B, Die ersten 12 Eigen-Bilder, die bei der Bildverarbeitung generiert wurden. Die Symmetrie-Eigenschaften des Datensatzes treten in der mittleren und unteren Reihe zutage.

3.2.1.2 Hydrodynamische Untersuchungen

Die verschiedenen HSP25-Fraktionen, die nach der Zentrifugation und abschließenden Chromatographie über eine Sepharose 6B-Säule erhalten wurden, wurden wie in Kapitel 2.8 geschildert mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifuge untersucht. Der Überstand (Fraktion 1) enthielt in Übereinstimmung mit der elektronenmikroskopischen Analyse nur niedermolekulares Material, das durch einen Sedimentationskoeffizienten von 2,5 S und einen Diffusionskoeffizienten von 10,1 x 10^-7 cm²/s gekennzeichnet ist (Abb. 3.5 A). Unter

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Abb. 3.5: Grafiken zur Bestimmung der Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten
Alle Diffusionsexperimente wurden bei einer Drehzahl von 6.000 U/min durchgeführt. X_WP steht für den Betrag der Verbreiterung der wandernden Grenzschicht am 16 bzw. 84%-Wert des Plateaus. A, Bestimmung des Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten des Überstands der HSP25-Präparation. Die Rotorgeschwindigkeit für die Sedimentation betrug 40.000 U/min. B, Bestimmung des Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten von Fraktion 2. Die Rotorgeschwindigkeit für die Sedimentation betrug 30.000 U/min. C, Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten von Fraktion 2 () und 3 (). Die Trennung der beiden Fraktionen war nach ca. 50 min möglich. Die Rotorgeschwindigkeit betrug 20.000 U/min. D, Bestimmung des Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten von Fraktion 4. Die Rotorgeschwindigkeit für die Sedimentation betrug 20.000 U/min.

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3.2.1.3 Ableitung eines Strukturmodells für natives HSP25

Auf der Basis der elektronenmikroskopischen und hydrodynamischen Daten wurde versucht, die Struktur der multimeren Komplexe des nativen HSP25 zu modellieren. Mit Hilfe des Programmes HYDRO (Garcia de la Torre et al., 1994) und unter Verwendung von vorgegebenen Daten für die Molmasse der Komplexe, der Anzahl, Größe und Koordinaten der Monomere sowie des Auftriebsterms wurden verschiedene Anordnungen der Monomere (angenommener Radius = 1,9 nm) konstruiert. Neben anderen Parametern wurden mit diesem Programm auch die theoretischen Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten für die jeweiligen Modelle ermittelt. Ein gute Übereinstimmung der theoretischen mit den experimentell ermittelten Werten konnte mit einem Modell erreicht werden, bei dem die Komplexe aus gestapelten Ringen mit je acht Monomeren bestehen. In Abb. 3.6 sind die Monomere und die Modell-Komplexe aus je einem, zwei oder vier Ringen mit den für sie berechneten Parametern dargestellt und den experimentell ermittelten Werten der vier Fraktionen gegenübergestellt. Das Vier-Ring-Modell repräsentiert den Aufbau der Komplexe aus der vierten Fraktion und entspricht der vorherrschenden Form der nativen Komplexe. Es ist gekennzeichnet durch einen Sedimentationskoeffizienten von 22 S, einen Diffusionskoeffizienten von 2,9 F und ein Molekulargewicht von 736 kDa bei einem Durchmesser von 14 nm und einer Höhe von 16 nm (Behlke et al., 1995).

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Abb. 3.6: Strukturmodell für die aus EAT-Zellen aufgereinigten HSP25-Komplexe
Modelle der dreidimensionalen Struktur der HSP25-Komplexe mit den dazugehörigen experimentell (ohne Klammern) und rechnerisch (in Klammern) bestimmten Parametern. Die Dimension [F] steht für 10^-7cm²/s, _ für Durchmesser und h für Höhe. n.b. = nicht bestimmt.

3.2.2 Rekombinantes HSP25 und HSP25-Mutanten

Im Labor von M. Gaestel (MDC, Berlin) wurden in E. coli neben den Wildtypen (wt) die folgenden Mutanten des murinen und des menschlichen HSP25 kloniert und isoliert:

1. HSP25-C18: C-terminal um 18 Aminosäuren verkürztes HSP25 der Maus
2. HSP25-S15D: menschliches HSP25 mit Aspartat statt Serin an Position 15
3. HSP25-S15,78D: menschliches HSP25 mit Aspartat statt Serin an Position 15 und 78
4. HSP25-S15,78,82D: menschliches HSP25 mit Aspartat statt Serin an Position 15, 78 und 82

Die stufenweise Ersetzung der phosphorylierbaren Serine 15, 78 und 82 durch Aspartate wurde vorgenommen, um eine Phosphorylierung an diesen Positionen zu imitieren. Darüber hinaus wurde zum

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3.2.2.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen

Elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden mit dem HSP25-Wildtyp und der HSP25-C18-Mutante der Maus sowie dem HSP25-Wildtyp, der S15D-Mutante, der S15,78D-Mutante, der S15,78,82D-Mutante und dem in vitro phosphorylierten HSP25-Wildtyp des Menschen durchgeführt. Die Komplexe beider HSP25-Wildtypen erscheinen nach Negativkontrastierung als mehr oder weniger globuläre Komplexe mit ca. 15 bis 20 nm Durchmesser (Abb. 3.7 A und Abb. 3.8 A). Nur ein sehr geringer Teil der Komplexe ist kleiner als 10 nm. Die Komplexe der C18-Mutante ähneln denen des Wildtyps. Lediglich die Größenverteilung der Komplexe erscheint hier etwas uneinheitlicher (Abb. 3.7 B). Damit wird klar, daß der C-terminale Teil der Proteins keinen entscheidenden Einfluß auf die Quartärstruktur der Komplexe besitzt. Im Präparat der S15D-Mutante (Abb. 3.8 B) sind die Komplexe im Vergleich zum Wildtyp etwas unregelmäßiger im Umriß und es erscheinen mehr kleinere Komplexe. Dem sehr ähnlich stellt sich das Präparat der S15,78D-Mutante dar (Abb. 3.8 C). Die Tendenz zur Ausbildung kleiner Komplexe setzt sich bei dieser Mutante fort. Im Falle der Dreifach-Mutante S15,78,82D (Abb. 3.8 D) sind die Komplexe deutlich kleiner. Die Mehrzahl hat nur noch einen Durchmesser von 5 bis 10 nm. Lediglich vereinzelte Komplexe weisen die gleiche Größe wie diejenigen des Wildtyps auf. Auffällig sind die vielen länglichen Strukturen in diesem Präparat, möglicherweise eine spezielle Form der HSP25-Komplexe. Nahezu das gleiche Bild ergibt sich bei dem Präparat des in vitro phosphorylierten Wildtyps (Abb. 3.8 E). Auch hier sind hauptsächlich kleine Komplexe und nur wenige mit 15 bis 20 nm Durchmesser zu finden. Diese Daten zeigen eindeutig, daß der Phosphorylierungszustand die Größenverteilung der HSP25-Komplexe beeinflußt. Die Tendenz zur Ausbildung kleinerer Komplexe wird dabei schon durch den Austausch eines Serins erkennbar, aber erst bei der vollständigen Mutagenese aller phosphorylierbaren Reste, bzw. der vollständigen Phosphorylierung des Wildtyp-Proteins, wird die Ausbildung der hochmolekularen Komplexe nahezu vollständig unterbunden.

Daß die Dreifach-Mutante denselben Phänotyp zeigt wie der phosphorylierte Wildtyp, belegt eindrucksvoll die gelungene Imitation der Phosphorylierung durch den Austausch der Serine in Aspartate. Diese Befunde belegen die Bedeutung der Phosphorylierung für die Quartärstruktur von HSP25 und sprechen damit für eine Regulation der Funktion von HSP25 über die supramolekulare Organisation.

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Abb. 3.7: Elektronenmikroskopische Darstellung von rekombinantem murinem HSP25
A, HSP25-Wildtyp. B, HSP25-C18-Mutante. Die Proteinkonzentration betrug bei beiden Präparaten 0,1 mg/ml. Die Meßbalken weisen eine Länge von 50 nm auf. Vergrößerung 270.000 x.

3.2.2.2 Statistische Analyse der Partikelgrößen

Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der verschiedenen rekombinanten HSP25-Spezies wurden mit Hilfe des Programmes analySIS (Soft Imaging System GmbH, Münster) hinsichtlich der Größenverteilung der Partikel analysiert (Zur Methodik siehe Kapitel 2.7.2.3). Um die Proben miteinander vergleichen zu können, wurde bei der Herstellung aller Präparate die gleiche Proteinkonzentration (0,1 mg/ml) eingesetzt und die gleiche Auftragungszeit gewählt. Eine statistische Auswertung der Ergebnisse der Partikelanalyse in den Präparaten des Wildtyps und der Mutanten des HSP25 des Menschen ist in Tab. 3.2 zusammengefaßt. Ausgehend vom mittleren Durchmesser der Wildtyp HSP25-Komplexe wurde das Volumen einer entsprechenden Kugel berechnet. Unter Verwendung des partiellen spezifischen Volumens (0,7326 ml/g für HSP25) und basierend auf der Annahme, daß eine hexagonale Packung der Monomere mit einer Packungsdichte von 74% vorliegt, konnte dann das Molekulargewicht der zur Kugel approximierten Komplexe und damit die Anzahl der HSP25-Monomere in den Komplexen abgeschätzt werden. Die hexagonale Anordnung der Monomere entstammt dem Strukturmodell einer früheren Untersuchung von rekombinanten HSP25-Komplexen von Behlke et al. (1991), nach der die Hauptfraktion der Wildtyp-Komplexe aus 32 kugelförmigen Monomeren besteht. Unter Annahme dieser Anordnung korrespondieren die fünf Haupt-Größenklassen der Wildtyp-Komplexe (Klassen im Größenbereich von 100 bis 200 nm²) bei einem mittlerem Durchmesser von ca. 14 bis 18 nm mit einer Anzahl von etwa 24 bis 54 HSP25-Molekülen. Im Mittel sind das etwa 38 Monomere pro HSP25-Komplex.

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Abb. 3.8: Elektronenmikroskopische Darstellung von rekombinantem menschlichem HSP25
A, HSP25-Wildtyp. B, HSP25-S15D. C, HSP25-S78,82D. D, HSP25-S15,78,82D. E, phosphoryliertes wt-HSP25. Die Proteinkonzentration betrug bei allen Präparaten 0,1 mg/ml. Die Meßbalken weisen eine Länge von 50 nm auf. Vergrößerung 270.000 x.

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Tab. 4: Statistische Auswertung der Partikelgrößen von HSP25-Wildtyp und -Mutanten
Ausgewertet wurde der einer Fläche von 1 µm² entsprechende Bereich einer repräsentativen elektronenmikroskopischen Aufnahme der jeweiligen Mutante. Insgesamt wurden 3156 (wt), 4838 (S15D), 6363 (S78,82D), 8113 (S15,78,82D) bzw. 7709 (HSP25-P) Komplexe detektiert. Die fünf Klassen mit der größten Anzahl von Partikeln jeder HSP25-Spezies sind grau unterlegt.

Größen-bereich der Partikel	Flächenanteil der Partikelklassen					Mittlerer Durchmesser von wt-HSP25	Berechnete molekulare Masse	Berechnete Anzahl an HSP25-Monomeren
	HSP25 wt	HSP25 S15D	HSP25 S78,82D	HSP25 S15,78,82D	HSP25 P
Nm²	%					nm	kDa
0 - 20	2,9	6,4	11,1	15,2	15,0	3,8	11	0,5
20 - 40	2,2	7,8	11,8	19,7	18,1	7,9	72	3,2
40 - 60	2,1	7,2	10,7	17,8	15,9	10,2	164	7,3
60 - 80	3,1	7,8	9,7	14,5	14,0	11,9	271	12,0
80 - 100	5,9	8,2	9,4	9,8	9,6	12,9	396	17,6
100 - 120	9,6	9,3	10,1	6,9	6,6	14,0	536	23,8
120 - 140	13,2	9,3	11,3	4,6	5,2	14,9	687	30,5
140 - 160	15,4	9,1	9,7	3,4	4,1	16,0	847	37,7
160 - 180	15,2	10,8	6,3	3,1	2,6	17,0	1012	45,0
180 - 200	10,6	7,0	3,9	1,3	2,3	17,9	1204	53,5
200 - 220	6,1	5,4	2,2	0,9	1,7	19,3	1393	61,9
220 - 240	5,2	3,0	1,0	0,7	1,1	20,2	1591	70,7
> 240	8,6	8,6	2,7	2,2	3,8	23,2	2164	96,2
	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0

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3.3 Wechselwirkung von kHSPs mit Actin

3.3.1 Hemmung der Actinpolymerisation durch kHSPs und HSP25-Mutanten

Zur Messung der Actinpolymerisation wurde Pyrenyl-markiertes G-Actin verwendet, das durch die Zugabe von Actin-Keimen und Salzen zur Polymerisation gebracht wird. Die fortschreitende Polymerisation des Actins wurde in einem Fluoreszenzphotometer als Anstieg in der Fluoreszenzintensität registriert (siehe Kapitel 2.9). Unter den gewählten Bedingungen ist der Start der Polymerisation von der Gegenwart von Actin-Keimen abhängig (Pollard, 1983) (Abb. 3.9 A, Kurve 1). Der Verzicht auf die Keime resultiert in einer verlängerten Verzögerungsphase der Polymerisation (Abb. 3.9 A, Kurve 2).

In Abb. 3.9 B ist der Einfluß von nativem HSP25 auf die Actinpolymerisation dargestellt. Die Hemmung der Actinpolymerisation durch dieses Präparat ist deutlich zu erkennen (Kurve 2). Das isolierte HSP25 liegt nach den schon dargelegten elektronenmikroskopischen und hydrodynamischen Analysen (vgl. Kapitel 3.2.1) zum Teil als Monomer vor, und diese Fraktion ist wahrscheinlich für die Hemmung der Actinpolymerisation verantwortlich. Die abgeschätzte Aktivität dieser HSP25-Fraktion liegt bei ca. der Hälfte des von Benndorf et al. (1994) ermittelten Wertes, was mit der fehlenden Auftrennung dieser Probe in die einzelnen HSP25-Spezies erklärt werden kann. Die für diese Versuche notwendigen Mengen an Monomeren wurden hier nicht noch einmal isoliert.

Abb. 3.9: Hemmung der Actinpolymerisation durch kHSPs und HSP25-Mutanten
A, Actinpolymerisation (50 µg/ml G-Actin = 1,16 µM) ohne (Kurve 1) oder mit 4,3 µg/ml (= 0,1 µM) Actin-Keimen (Kurve 2). B, Actinpolymerisation (50 µg/ml G-Actin) unbeeinflußt (Kurve 1) oder in Anwesenheit eines zweifachen molaren Überschusses an nativem HSP25 (Kurve 2). C, Actinpolymerisation (50 µg/ml G-Actin) unbeeinflußt (Kurve 1) oder in Anwesenheit eines 20-fachen molaren Überschusses an humanem HSP25 (Kurve 3), murinem HSP25-C18 (Kurve 2, nur 10-facher Überschuß) bzw. humanem HSP25-S15,78,82D (Kurve 4).

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Da sowohl das rekombinante HSP25 als auch B-Crystallin hauptsächlich als hochmolekulare Komplexe vorliegen, deuten die Ergebnisse darauf hin, daß diese Proteine aufgrund ihres Assoziationszustandes nicht in der Lage sind, die Actinpolymerisation zu hemmen. Interessanterweise bildet die Mutante mit den drei Aminosäureaustauschen keine hochmolekularen Komplexe mehr (vgl. Kapitel 3.2.2), so daß hier die Proteine als Mono- bis Oligomere mit simulierter Phosphorylierung vorliegen. Da auch diese Mutante die Actinpolymerisation nicht hemmt, wird die Hypothese bestätigt, daß für die Funktion als Inhibitor der Actinpolymerisation zumindest in vitro nur die monomeren nichtphosphorylierten HSP25-Moleküle verantwortlich sind.

3.3.2 Hemmung der Actinpolymerisation durch Peptide von kHSPs

Um zu analysieren, welche Teile des HSP25-Moleküles hauptverantwortlich für die inhibitorische Wirkung bei der Actinpolymerisation sind, wurde eine Peptid-Bibliothek synthetisiert, die die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins in Form von sich überlappenden Peptidsequenzen umfaßt. Als Kriterium für die Synthese wurde eine Peptidlänge von 15 Aminosäuren und eine Überlappung von ca. fünf Aminosäuren zugrundegelegt. In Tab. 3.3 sind die entsprechenden Peptidsequenzen aufgelistet.

Tab. 5: Peptid-Bibliothek der HSP25-Sequenz
Peptid 1 repräsentiert den N-Terminus und Peptid 22 den C-Terminus des Proteins. Die Peptide haben überlappende Enden von 4-7 Aminosäuren und wurden bis auf die Peptide 1, 2 und 10 als 15mer synthetisiert. Die nicht mit Nachbarpeptiden überlappenden Regionen sind durch Fettdruck hervorgehoben.

Peptid	Rest	Sequenz	Rest
1	1	MTERRVPFSLLR	12
2	7	PFSLLRSPSWEP	18
3	14	PSWEPFRDWYPAHSR	28
4	24	PAHSRLFDQAFGVPR	38
5	34	FGVPRLPDEWSQWFS	48
6	43	WSQWFSAAGWPGYVR	57
7	53	PGYVRPLPAATAEGP	67
8	63	TAEGPAAVTLAAPAF	77
9	73	AAPAFSRALNRQLSS	87
10	83	RQLSSGVSEIRQTA	96
11	92	IRQTADRWRVSLDVN	106
12	102	SLDVNHFAPEELTVK	116
13	112	ELTVKTKEGVVEITG	126
14	121	VVEITGKHEERQDEH	135
15	131	RQDEHGYISRCFTRK	145
16	140	RCFTRKYTLPPGVDP	154
17	150	PGVDPTLVSSSLSPE	164
18	160	SLSPEGTLTVEAPLP	174
19	169	VEAPLPKAVTQSAEI	183
20	177	VTQSAEITIPVTFEA	191
21	186	PVTFEARAQIGGPEA	200
22	195	IGGPEAGKSEQSGAK	209

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Abb. 3.10: Einfluß von HSP25 Peptid 6 und 11 auf die Actinpolymerisation
A, Actinpolymerisation (2µM G-Actin) in Abwesenheit (Kurve 1) oder Anwesenheit von 16 µM Peptid 11 (Kurve 3) oder 16 µM Peptid 6 (Kurve 2). B, Actinpolymerisation in Anwesenheit von 0-, 4-, 8-, 12- und 16- fachem molaren Überschuß von Peptid 6 zu G-Actin (2 µM), Actinpolymerisation in Anwesenheit von 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 und 10-fachem molaren Überschuß von Peptid 11 zu G-Actin (2 µM). D, prozentuale Hemmung der Actinpolymerisation bei verschiedenen molaren Verhältnissen von Peptid 6 () und Peptid 11 () zu G-Actin. Die Daten ergeben sich aus dem Anstieg der in Teil B und C dargestellten Kurven.

Die Peptide wurden im Actinpolymerisations-Assay zunächst bei einem 20-fachen molaren Überschuß zu G-Actin getestet. Von diesen Peptiden wiesen Peptid 6 (Trp43-Arg57) und Peptid 11 (Ile92-Asn106) einen deutlichen inhibitorischen Effekt auf. Alle anderen Peptide hatten unter diesen Bedingungen keinen signifikanten Einfluß. Peptid 11 ist dabei wesentlich effizienter als Peptid 6 (Abb. 3.10 A).

Die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung dieser beiden Peptide ist in Abb. 3.10 B und C wiedergegeben. Dabei wurde Peptid 6 (Abb. 3.10 B) mit einem 4-, 8-, 12- und 16-fachen molaren Überschuß eingesetzt und Peptid 11 (Abb. 3.10 C) bei molaren Verhältnissen von 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, und 10 von Peptid zu G-Actin getestet. Die Abschätzung der Aktivität der Peptide als prozentuale Hemmung der Actinpolymerisation wurde aus der Steigung dieser Kurven während der ersten 5 min ermittelt und ist in Abb. 3.10 D dargestellt. Aus diesen Daten geht hervor, daß eine 50%ige Hemmung im Falle von Peptid 6 bei einem molaren Verhältnis von 1:10 und im Falle von Peptid 11 bei einem Verhältnis von 1:2,5 erreicht wird.

Als zweite, unabhängige Methode zur Kontrolle der Actinpolymerisation wurde die Elektronenmikroskopie genutzt. In diesem Fall wurden die Bedingungen insoweit modifiziert, als die Actin-Keime weggelassen wurden, um sicher zu sein, daß alle beobachteten Actinfilamente neu gebildet waren. Außerdem wurden die Versuchsansätze für 15 min inkubiert, bevor sie für die elektronenoptische Auswertung verarbeitet wurden, um der verlängerten Verzögerungsphase bei der Abwesenheit von Polymerisations-Keimen Rechnung

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Abb. 3.11: Darstellung des Einflusses von HSP25 Peptid 11 auf die Actinpolymerisation mittels Elektronenmikroskopie
A, Actinpolymerisation (1 µM) in Abwesenheit (A) und in Anwesenheit von 10 µM Peptid 11 (B). Die Meßbalken weisen eine Länge von 200 nm auf. Vergrößerung, x 90 000.

Während es bei der Kontrolle (1 µM G-Actin) zur Ausbildung von langen Actinfilamenten kommt (Abb. 3.11 A), werden in Anwesenheit von 10 µM Peptid 11 keine Filamente mehr gebildet (Abb. 3.11 B). Die Anwesenheit derselben Menge Peptid 6 führt zu einer reduzierten Anzahl an Filamenten (nicht gezeigt). Damit bestätigen die elektronenmikroskopischen Untersuchungen die Resultate der Fluoreszenzspektroskopie.

Um zu analysieren, welche Aminosäuren des effektivsten Peptids 11 hauptverantwortlich für die Hemmung der Actinpolymerisation sind, wurden N-terminal und C-terminal verkürzte Varianten dieses Peptids hergestellt. Der Einfachheit halber wurden für die Benennung dieser Peptide Abkürzungen verwendet, wie sie in Tab. 3.4 aufgelistet sind. Im Experiment zeigten alle verkürzten Peptide eine schwächere, z.T. sogar deutlich schwächere Aktivität bei der Hemmung der Actinpolymerisation im Vergleich zum Original-15mer. Aus diesem Grund wurden sie bei höheren molaren Verhältnissen von Peptid zu Actin getestet. Bei einem 40-fachen Überschuß an verkürztem Peptid ergab sich das in Abb. 3.12 A wiedergegebene Bild mit folgenden Reihenfolge in der Effektivität: Peptid 11N1 (Kurve 8) > Peptid 11N6 (Kurve 7) >> Peptid 11C4 (Kurve 6) > Peptid 11N2 (Kurve 5) = Peptid 11N9 (Kurve 4) = Peptid 11C6 (Kurve 3) > Peptid 11N3 (Kurve 2). Die Peptide 11C8 und 11N4C3 waren in diesem Assay inaktiv (nicht gezeigt). In Tab. 3.4 sind die relativen Aktivitäten dieser Peptide im Vergleich zu Peptid 11 als Zahlenwerte dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß es keine einfache Korrelation zwischen der Länge der Peptide und der Beibehaltung der Funktion von Peptid 11 gibt. Während bei einer Kürzung des N-Terminus um die beiden Aminosäuren IR (Peptid 11N2) ein drastischer Abfall in der Aktivität zu beobachten ist, hat die Kürzung des C-Terminus um die 4 Aminosäuren LDVN (Peptid 11C4) einen deutlich schwächeren Effekt.

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Tab. 6: Vergleich der vom Maus HSP25 Peptid 11 abgeleiteten Sequenzen
Die Peptide wurden entsprechend der HSP25-Sequenz verschiedener Spezies (Maus, Mensch und Huhn) und der Maus B-Crystallin-Sequenz synthetisiert. N- bzw. C-terminale Verkürzungen oder Verlängerungen, ausgehend vom Peptid 11 der Maus, spiegeln sich in der Bezeichnung der Peptide wider. Die Nummern geben die Position der N-terminalen (links) und der C-terminalen (rechts) Aminosäuren der Peptide im Protein an. Die Effektivität der Peptide im Actinpolymerisationsexperiment ist durch relative Werte im Vergleich zum Peptid 11 angegeben. Die Angaben in Klammern beziehen sich auf die phosphorylierte Variante des Peptids (P). Die jeweils phosphorylierten Serinreste sind in der Sequenz durch Unterstreichung und Fettdruck markiert.

Peptid		Sequenz		relative Aktivität	Spezies
11	92	IRQTADRWRVSLDVN	106	100	Maus
11Hu	88	IRHTADRWRVSLDVN	102	0	Mensch
11Ch	86	IRQSADSWKVTLDVN	100	10	Huhn
11B	68	MRLEKDRFSVNLDVK	82	0	Maus
11rm	-	TWLQRDANVRDISRV	-	0	-
11C4	92	IRQTADRWRVS	102	10	Maus
11C6	92	IRQTADRWR	100	5	Maus
11C8	92	IRQTADR	98	0	Maus
11N1	93	RQTADRWRVSLDVN	106	25	Maus
11N2	94	QTADRWRVSLDVN	106	5	Maus
11N3	95	TADRWRVSLDVN	106	2	Maus/Mensch
11N6	98	RWRVSLDVN	106	12	Maus/Mensch
11N9	101	VSLDVN	106	5	Maus/Mensch
11N4C3	96	ADRWRVSL	103	0	Maus/Mensch
11+N16(P)	76	AFSRALNRQLSSGVSEIRQTADRWRVSLDVN	106	50 (25)	Maus
11Hu+N16(P)	72	AYSRALSRQLSSGVSEIRHTADRWRVSLDVN	102	12 (0)	Mensch
11B+N15(P)	53	SFLRAPSW-IDTGLSEMRLEKDRFSVNLDVK	82	50 (25)	Maus

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Abb. 3.12: Einfluß verschiedener Peptid 11-Abkömmlinge auf die Actinpolymerisation
A, Actinpolymerisation (2 µM G-Actin) ohne Peptide (Kurve 1) oder in Gegenwart von 80 µM der verkürzten Peptide 11N3 (Kurve 2), 11C6 (Kurve 3), 11N2 (Kurve 4), 11N9 (Kurve 5), 11C4 (Kurve 6), 11N6 (Kurve 7) und 11N1 (Kurve 8). B, Actinpolymerisation (2 µM G-Actin) ohne Peptide (Kurve 2) oder in Gegenwart von 40 µM der zu Peptid 11 homologen Peptide des B-Crystallins (11B, Kurve 1), des menschlichen HSP25 (11Hu, Kurve 3), des HSP25 des Huhns (11Ch, Kurve 5) und des Zufallspeptids (11rm, Kurve 4) sowie in Gegenwart von 80 µM des Huhn-Peptids (11Ch, Kurve 6). C, Actinpolymerisation (2 µM G-Actin) ohne Peptide (Kurve 1) oder in Gegenwart von 20 µM der verlängerten Peptide 11Hu+N16P (Kurve 2), 11Hu+N16 (Kurve 3), 11B+N15P (Kurve 4) 11+N16P (Kurve 5), 11+N16 (Kurve 6) und 11B+N15 (Kurve 7). Die Kurven sind Repräsentanten aus 3 bis 5 unabhängigen Versuchen.

Aufgrund der konservierten Struktur und Funktion der kleinen Hitzeschockproteine und des ubiquitären Vorkommens von Actin in eukaryotischen Zellen konnte man vermuten, daß die homologen Regionen des Maus-HSP25-Peptids 11 aus anderen Spezies ebenfalls die Polymerisation von Actin inhibieren. Aus diesem Grund wurden die zum Peptid 11 homologen Sequenzen des humanen (11Hu) und des Huhn-HSP25 (11Ch) sowie die des murinen B-Crystallin (11B) synthetisiert. Die Sequenzen wurden einem Vergleich entnommen, der für die gesamte Aminosäuresequenz dieser Proteine durchgeführt wurde, wie sie in Abb. 3.13 gezeigt sind. Aus der Gegenüberstellung in Tab. 3.4 geht hervor, daß die menschliche Sequenz von Peptid 11 an einer Position (Glu3 His), die Huhn-Sequenz an vier Positionen (Thr4Ser; Arg7Ser; Arg9Lys und Ser11Thr) und die B-Crystallin-Sequenz an acht Positionen (Ile1Met, Gln3Leu, Thr4Glu, Ala5Lys, Trp8Phe, Arg9Ser, Ser11Asn und Asn15Lys) von der Maus-Sequenz abweicht. Außerdem wurde als Kontrolle eine Zufallssequenz mit den Aminosäuren des Peptids 11 konstruiert (11rm). Erstaunlicherweise hatten bei einem 20-fachen molaren Überschuß sowohl das von der B-Crystallin-Sequenz abgeleitete als auch das menschliche Peptid 11 keinen Einfluß auf die Actinpolymerisation in vitro (Abb. 3.12 B, Kurven 1 und 3). Dies traf auch für das

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Da der einzige Unterschied zwischen dem murinen und dem menschlichen Peptid 11 der Austausch eines Glutamins zu einem Histidin ist, wurde untersucht, ob möglicherweise eine posttranslationale Modifikation des Histidins nötig ist, um eine inhibitorische Wirkung des Peptids bei der Actinpolymerisation zu erreichen. Häufig vorkommende Modifikationen beim Histidin sind Methylierungen und Phosphorylierungen und für eine Reihe anderer Hitzeschockproteine wurden bereits Methylierungen beschrieben. Deshalb wurde das menschliche Peptid 11 mit den beiden möglichen Methylierungen an diesem Histidin, dem N-Methyl-Histidin und dem N-Methyl-Histidin synthetisiert und im Actinpolymerisations-Assay getestet. Es stellte sich heraus, daß auch diese modifizierten Peptide keinen Einfluß auf die Actinpolymerisation haben (nicht gezeigt).

Abb. 3.13: Vergleich der Sequenzen von Maus-, Mensch- und Huhn-HSP25 sowie von Maus-B-Crystallin.
Alle Sequenzen stammen aus der SWISSPROT Datenbank. Sie wurden mit dem Programm MSA (Lipman et al., 1989) aligniert und von Hand nachgebessert. In der Consensus-Reihe sind die Reste, die in allen vier Sequenzen identisch sind, mit Großbuchstaben und die Reste, die in drei von vier Sequenzen identisch sind, mit Kleinbuchstaben vertreten. Die geschlossenen Pfeile deuten auf die Phosphorylierungsstellen des murinen HSP25 und der offene Pfeil auf die zusätzliche Phosphorylierungsstelle beim menschlichen HSP25. Die Peptid 6 und 11 umfassenden und getesteten Sequenzen sind durch Fettdruck hervorgehoben. Das Doppelkreuz kennzeichnet den Beginn der konservierten -Crystallin-Domäne (de Jong et al., 1993; Caspers et al., 1995) und die Sterne die hoch konservierten Regionen nach Singh et al. (1995). Die Quellen der Sequenzen sind: Mus musculus-HSP25 (Gaestel et al., 1989) korrigiert von Gaestel et al. (1993), Homo sapiens-HSP25 (Hickey et al., 1986) korrigiert von Carper et al. (1990), Gallus gallus-HSP25 (Miron et al., 1991) und Mus musculus-B-Crystallin (Datenbanknummer P23927).

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Die getesteten Modifikationen von Peptid 11 zeigen, daß es keinen einfachen Zusammenhang zwischen der Aminosäuresequenz und der Beeinflussung der Funktion gibt. Der Vergleich der Sequenzen von murinem und menschlichem HSP25 deutet allerdings auf eine essentielle Rolle des Glutamins an Position 3 des Peptids 11 hin (Position 94 in HSP25), da das inaktive menschliche Peptid 11 nur an dieser Stelle von der murinen Sequenz abweicht. Eine regulatorische Rolle durch Methylierung scheint dem Histidin des menschlichen Proteins an dieser Stelle nicht zuzukommen, da die methylierten Varianten des humanen Peptids 11 sich im Actinpolymerisationsexperiment nicht anders verhielten als das nicht methylierte Peptid. Aus den Daten geht weiterhin hervor, daß ein aktives Peptid mindestens neun Aminosäuren lang sein sollte, da alle kürzeren Peptide und ein 9mer nur noch sehr geringe Aktivitäten als Inhibitoren der Actinpolymerisation aufwiesen. Zusammen mit den Ergebnissen mit dem Zufallspeptid deutet dies darauf hin, daß nicht allein die Aminosäurezusammensetzung, sondern die Sequenz in Kombination mit der Sekundärstruktur zu dem inhibierenden Effekt der Peptide führt.

Wie schon in der Einleitung besprochen, ist eine auffällige Eigenschaft von HSP25 die rasche Phoshorylierbarkeit. Es ist bekannt, daß die Phosphorylierung ein wichtige Rolle bei der Regulation der Actinpolymerisation-hemmenden Eigenschaft von HSP25 spielt (Benndorf et al., 1994). Aus diesem Grund wurden die Peptide aus der murinen bzw. humanen Sequenz, die das Peptid 11 und die N-terminal angrenzende Phosphorylierungsstelle am Serin 86 bzw. an den Serinen 78 und 82 umfaßten und ein dazu homologes Peptid aus der Sequenz des B-Crystallins der Maus synthetisiert und getestet. Die resultierenden Peptide waren 31 bzw. 30 Aminosäuren lang und beinhalteten die Aminosäuren 76 bis 106 (Maus HSP25: 11+N16) bzw. 72 bis 102 (Mensch HSP25: 11Hu+N16) oder 53 bis 82 im Falle des Maus B-Crystallins (11B+N15). Von diesen Peptiden wurde jeweils die phosphorylierte und die unphosphorylierte Variante hergestellt, um zu testen, ob diese Modifikation, ähnlich wie beim gesamten Protein, die Polymerisations-hemmende Wirkung beeinflussen kann. Aus Abb. 3.12 C geht hervor, daß die unphosphorylierten Peptide aus der Sequenz des murinen HSP25 (Peptid 11+N16, Kurve 6) und des B-Crystallins (11B+N15, Kurve 7) die Actinpolymerisation bei einem 10-fachen molaren Überschuß etwa halb so effektiv hemmen wie das Peptid 11 (vgl. Abb. 3.10 C). Die dazugehörigen phosphorylierten Varianten (11+N16P, Kurve 5 und 11B+N15P, Kurve 4) zeigen ebenfalls noch einen deutlichen Hemmeffekt, der jedoch in beiden Fällen signifikant schwächer ausfällt als bei den entsprechenden unphosphorylierten Peptiden. Im Vergleich dazu hat das unphosphorylierte humane HSP25-Peptid (11Hu+N16) einen wesentlich schwächeren Effekt (Abb. 3.12 C, Kurve 3) und die phosphorylierte Variante dieses Peptids (Hu11+N16P) war sogar inaktiv (Abb. 3.12 B, Kurve 2). Der Unterschied zwischen phosphorylierter und nichtphosphorylierter Variante des humanen Peptids wurde bei einem 20-fachen Überschuß zum Actin wesentlich deutlicher. Während der Effekt des unphosphorylierten Peptids deutlich ansteigt, bleibt das phosphorylierte Peptid auch unter diesen Bedingungen inaktiv (nicht gezeigt). Die relativen Aktivitäten aller getesteten Peptide im Vergleich zu Peptid 11 können aus Tab. 3.4 entnommen werden. Diese Ergebnisse bestätigen die regulatorische Rolle der Phosphorylierung in bezug auf die Funktion von HSP25 als Inhibitor der Actinpolymerisation.

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3.3.3 Hydrodynamische Parameter von Actin und HSP25-Peptiden

Die Bestimmung der molekularen Masse von G-Actin wurde aus der radialen Konzentrationsverteilung unter Sedimentations-Gleichgewichts-Bedingungen bestimmt und betrug 41.300 ± 700 Dalton. Dabei lag das G-Actin bei einem Sedimentationskoeffizienten von 3,0 ± 0,1 S als homogene Fraktion ohne Oligomere vor. Peptid 11 liegt in Lösung ebenfalls als Monomer vor, was sich aus der molekularen Masse von 1825 ± 166 Dalton ergibt. Dieser Wert steht in guter Übereinstimmung mit dem aus der Aminosäure-Zusammensetzung berechneten theoretischen Molekulargewicht von 1830 Dalton und zeigt, daß das Peptid nicht zur Selbstassoziation neigt. Die hydrodynamischen Parameter einiger weiterer untersuchter Peptide sind in Tab. 3.5 aufgelistet. In allen Fällen liegen die Peptide offensichtlich als Monomere vor. Die Reibungsverhältnisse f/f₀ deuten auf eine leichte bis deutliche Abweichung von der Kugelform bei der Konformation der Peptide in Lösung hin, wie dies für Peptide dieser Größenordnung zu erwarten ist.

Tab. 7: Hydrodynamische Parameter einiger HSP25-Peptide
M_th = theoretisches Molekulargewicht, M_ex = experimentell bestimmtes Molekulargewicht, s = Sedimentationskoeffizient, D = Diffusionskoeffizient, = partielles spezifisches Volumen, f/f₀ = Reibungsverhältnis, V = Volumen

Peptid	Mth	Mex	s (S)	D (107cm2/s)	(ml/g)	f/f0	V (nm3)
11	1829	1825 ± 166	0,455 ± 0,017	22,15 ± 1,15	0,725	1,19 ± 0,02	2,203
11C6	1201	1184 ± 42	0,297 ± 0,003	21,76 ± 0,54	0,718	1,40 ± 0,01	1,433
11C4	1388	1373 ± 40	0,310 ± 0,002	19,88 ± 0,45	0,723	1,46 ± 0,02	1,667
11N4C3	1002	996 ± 47	0,290 ± 0,006	26,96 ± 0,61	0,729	1,20 ± 0,01	1,214
11+N16	3533	3506 ± 262	0,517 ± 0,015	13,07 ± 0,60	0,725	1,62 ± 0,06	4,253
11+N16P	3612	3597 ± 272	0,526 ± 0,019	12,97 ± 0,53	0,725	1,62 ± 0,06	4,348

Um die Stärke der Wechselwirkung zwischen G-Actin und Peptid 11 zu untersuchen, wurden verschiedene Mischungen von 3,9 µM Protein und äquimolaren Mengen an Peptid 11 bis zu einem 7-fachen Überschuß an Peptid zentrifugiert Die Konzentrationsverteilungs-Kurven unter Sedimentations-Gleichgewichts-Bedingungen wurden dann im Hinblick auf die partiellen

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Abb. 3.14: Konzentrationsverteilungskurven von Actin und Peptid 11
Radiale Konzentrationsverteilungen von Actin und Peptid 11 bei einem 5-fachen molaren Überschuß an Peptid unter Sedimentations-Gleichgewichts-Bedingungen, aufgezeichnet bei 280 nm (), 285 nm () und 290 nm (). Die partiellen Konzentrationen des Actin/Peptid-Komplexes (Kurve 1), der freien Actins (Kurve 2) und des freien Peptids (Kurve 3 ) für die bei 280 nm aufgezeichnete Konzentrationsverteilung wurden wie in Kapitel 2.8 beschrieben ermittelt.

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3.3.4 Peptid-Epitop-Scanning von HSP25 und Actin

Zellulose-gebundene Peptid-Bibliotheken wurden von der HSP25- und der Actin-Sequenz angefertigt. Hinweise für einer Interaktion zwischen HSP25 und Actin waren mit dieser Methode nur bei der Inkubation von HSP25 mit der Actin-Peptidmembran, nicht aber bei der Inkubation von Actin mit der HSP25-Peptidmembran zu erkennen. Die Wechselwirkungen konnten erst bei der direkten Detektion der gebundenen Proteine auf der Peptid-Membran nachgewiesen werden, vorausgegangene Elektrotransferversuchen zum indirekten Nachweis der gebundenen Proteine auf einer Western-Blot-Membran blieben ohne Erfolg. In Abb. 3.15 ist das Ergebnis des direkten Nachweises von HSP25 auf der Actin-Membran dargestellt. Es konnten insgesamt 11 Actinpeptide detektiert werden, an denen HSP25 gebunden war. Die Sequenzen dieser Peptide sind in Tab. 3.6 zusammengestellt. Viermal wurden einzelne Peptide und zweimal mehrere nebeneinander liegende Peptide, also überlappende Sequenzen detektiert. Die Markierung war am intensivsten bei den Peptiden 79 und 99, also in der Mitte der von Peptid 78-80 und 97-100 gebildeten Sequenzbereiche. Die Konsensusmotive dieser Sequenzbereiche umfassen die Aminosäuren 158-168 und 198-204 im Actinmolekül.

Abb. 3.15: Nachweis von HSP25 nach der Inkubation auf der Actin-Membran
Die Nummern entsprechen den Peptiden der Actin-Bibliothek (siehe Tab. 7.3 im Anhang).

Tab. 8: Sequenzen der mit HSP25 wechselwirkenden Actin-Peptide
Aufgelistet sind die Sequenzen der detektierten Peptide wie in Abb. 3.15 dargestellt. Die Nummern entsprechen den Peptiden der Actin-Bibliothek (siehe Tab. 7.3 im Anhang). Die Konsensusmotive der beiden detektierten Sequenzbereiche sind durch Einrahmung her-vorgehoben.

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3.4 HSP25- und HSP70-Gehalt in Organen normotoner und hypertoner Ratten

3.4.1 Spontan hypertensive Ratten

Bei drei SHRSP-Tieren (hyperton) und drei WKY-Kontrolltieren (normoton) wurden zunächst verschiedene Organe auf ihren Gehalt an HSP25 getestet, um erste Hinweise auf unterschiedliche Mengen bei gesunden und an Bluthochdruck leidenden Tieren zu bekommen. Es wurden Gewebeproben aus Niere, Nebenniere, quergestreifter Muskulatur, Aorta, Lunge, Leber, Vorhof, linkem Ventrikel, rechtem Ventrikel, Kleinhirn, Cortex und Hypothalamus untersucht. Abb. 3.16 zeigt den Nachweis von HSP25 auf Western-Blots dieser Proben von jeweils einem normotonen und einem hypertonen Tier. Erste Hinweise für eine unterschiedlich starke Expression von HSP25 ergeben sich hieraus für Nebenniere, Aorta, Lunge, Leber und Herz. Es wird deutlich, daß in den Muskelgeweben HSP25 relativ stark vertreten ist. In der Niere und im Hirngewebe konnte HSP25 nur in sehr geringen Mengen oder gar nicht nachgewiesen werden. Für die weiteren Untersuchungen beschränkte sich die Analyse auf die Herzbereiche rechter Ventrikel, linker Ventrikel und Vorhof sowie Aorta, Nebenniere und Lunge. Analysiert wurde sowohl der Gehalt an HSP25 als auch an HSP70.

Abb. 3.16: Nachweis von HSP25 in Gewebeproben von normotonen (WKY) und spontan hypertensiven Ratten (SHRSP)
Western-Blots der getesteten Gewebe. N = normoton (WKY-Tier), H = hyperton (SHRSP-Tier).

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Abb. 3.17: Nachweis von HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von normotonen (WKY) und spontan hypertensiven Ratten (SHRSP)
Western-Blots der Gewebeproben. In der jeweils unteren Reihe ist der HSP25-Nachweis und in der oberen Reihe der HSP70-Nachweis gezeigt. Die fünf Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 7,8 ng bis 19,6 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt.

Abb. 3.17 zeigt die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse von spontan hypertensiven Ratten sowohl für HSP25 als auch für HSP70. Die Auswertung der Blots mittels Densitometrie und der Vergleich mit den Standards ist in Tab. 3.7 zusammengefaßt (zur Vorgehenswiese bei der Quantifizierung siehe Kapitel 2.4.2). Für HSP25 wurden über die Eichung des Standards Absolutwerte ermittelt. Für HSP70 wurde nur die relative Veränderung berechnet.

Es zeigt sich, daß im rechten Ventrikel und in der Nebenniere der spontan hypertensiven Ratten ein deutlicher Anstieg des HSP25-Gehaltes im Vergleich zu den Kontrollen auftritt. Demgegenüber ist in der Aorta ein Rückgang des HSP25-Gehaltes zu verzeichnen. In den anderen Geweben bleibt der HSP25-Gehalt mehr oder weniger konstant. Bei dem Gehalt an HSP70 sind ebenfalls im rechten Ventrikel und in der Nebenniere deutliche Änderungen zu

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Tab. 10: Gehalt an HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von normotonen (WKY) und spontan hypertensiven Ratten (SHRSP)
Die Mengen sind Mittelwerte von jeweils drei Tieren. Die relative Menge an HSP70 in den Proben bezieht sich auf die in 10 µl EAT-Standard enthaltene Menge an HSP70.

		HSP25				HSP70
	Menge in µg/g Feuchtgewicht				relative Menge
	WKY		SHRSP		WKY		SHRSP
Aorta	37,2	± 3,6	23,5	± 4,0	0,06	± 0,01	0,09	± 0,00
Vorhof	38,5	± 8,9	31,5	± 5,1	0,14	± 0,01	0,14	± 0,02
rechter Ventrikel	9,8	± 0,2	23,0	± 0,3	0,36	± 0,13	0,19	± 0,01
linker Ventrikel	24,4	± 5,7	26,0	± 3,6	0,19	± 0,01	0,22	± 0,03
Nebenniere	22,2	± 3,1	31,4	± 5,7	0,32	± 0,03	0,51	± 0,04
Lunge	57,2	± 4,3	52,8	± 2,0	0,13	± 0,03	0,12	± 0,05

3.4.2 Goldblatt-operierte Ratten

Die Goldblatt-Operation kann unter anderem nach der 2kidney-1clip-Methode (2K1C) durchgeführt werden, bei der durch Abklemmen der Nierenarterie die Blutzufuhr zu einer Niere zeitweise unterbrochen wird und dadurch ein Bluthochdruck induziert wird. Sprague-Dawley-Ratten (SD), bei denen diese Operation durchgeführt wurden, repräsentieren das zweite untersuchte Modell der Hypertonie. Auch bei diesen Tieren wurden die Herzbereiche rechter Ventrikel, linker Ventrikel und Vorhof sowie Aorta, Nebenniere und Lunge auf ihren Gehalt an HSP25 und HSP70 untersucht. Zunächst wurde in einem Vorversuch getestet, innerhalb welchen Zeitraumes nach der Operation eine Änderung in dem Gehalt an HSP25 nachweisbar ist. Darum wurden die linken und rechten Ventrikel je eines scheinoperierten und eines Goldblatt-operierten Tieres nach einer Woche und je zwei nach vier Wochen analysiert. In Abb. 3.18 sind die Western-Blots dieser Untersuchung dargestellt. Ein deutlicher Unterschied zwischen den Proben der scheinoperierten und denen der 2K1C-operierten Tiere ist nur in dem

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Nach diesen Ergebnissen wurden auch die anderen Organe von Tieren untersucht, bei denen die Operation 4 Wochen zurücklag. In Abb. 3.19 sind die Western-Blots dieser Versuche gezeigt und in Tab. 3.8 ist die densitometrische Auswertung der Banden dieser Blots zusammengefaßt. Es ergibt sich ein ähnliches Bild wie bei den spontan hypertensiven Tieren. Vor allem die erhöhte Menge von HSP25 im rechten Ventrikel der hypertonen Tiere findet sich, wie schon bei den Vorversuchen, auch bei diesen Proben. In diesem Fall gingen damit allerdings auch gesteigerte Werte für HSP70 einher. In allen anderen untersuchten Geweben fanden sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den normotonen und den hypertonen Tieren. Die absoluten Mengen an HSP25 im Herzen waren denen der SHRSP-Tiere sehr ähnlich, aber in der Aorta und in der Lunge fielen sie hier nur etwa halb so groß aus.

Abb. 3.18: Nachweis von HSP25 in linken (l.) und rechten (r.) Ventrikeln von Goldblatt-operierten (2K1C) und scheinoperierten Sprague-Dawley-Ratten (SD) nach verschiedenen Zeiten
Western-Blots der Gewebeproben. Die drei Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 9,8 ng bis 31,3 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt.

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Abb. 3.19: Nachweis von HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von Goldblatt-operierten (2K1C) und scheinoperierten Sprague-Dawley-Ratten (SD)
Western-Blots der Gewebeproben 4 Wochen nach der Operation. In der jeweils unteren Reihe ist der HSP25-Nachweis und in der oberen Reihe der HSP70-Nachweis gezeigt. Die 5 Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 7,8 ng bis 19,6 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt.

Tab. 11: Gehalt an HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von Goldblatt-operierten (2K1C) und scheinoperierten Sprague-Dawley-Ratten (SD)
Die Mengen sind Mittelwerte von jeweils drei Tieren. Die relative Menge an HSP70 in den Proben bezieht sich auf die in 10 µl EAT-Standard enthaltene Menge an HSP70.

		HSP25				HSP70
	Menge in µg/g Feuchtgewicht				relative Menge
	SD		2K1C		SD		2K1C
Aorta	15,4	± 2,1	16,0	± 1,9	0,03	± 0,00	0,03	± 0,00
Vorhof	30,7	± 3,6	31,3	± 8,1	0,21	± 0,14	0,18	± 0,02
rechter Ventrikel	17,7	± 0,9	23,5	± 1,4	0,08	± 0,01	0,16	± 0,03
linker Ventrikel	22,4	± 6,3	20,6	± 2,2	0,12	± 0,06	0,11	± 0,03
Nebenniere	24,5	± 2,9	22,5	± 2,5	0,80	± 0,08	0,68	± 0,17
Lunge	27,4	±3,3	28,8	±1,8	0,06	± 0,02	0,10	± 0,05

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3.4.3 Transgene Ratten mit zusätzlichem Renin-Gen

Da für HSP25 in den beiden bisher getesteten Tiermodellen für die Hypertonie ein deutlich gesteigertes Vorkommen nur im rechten Ventrikel festgestellt wurde, blieb der Nachweis von Streßproteinen in diesem Modell auf den rechten und den linken Ventrikel beschränkt. Die zur Verfügung stehenden Tiere waren ca. zwei Monate alt und als Kontrolle dienten Ratten vom Sprague-Dawley-Stamm (SD). Um das Ausmaß präparationsbedingter Unterschiede in der Menge des nachgewiesenen Proteins abschätzen zu können, wurden hier von jedem Ventrikel der drei Kontroll- und drei transgenen Tiere zwei Präparate aufgearbeitet wie in Kapitel 2.4.1 beschrieben. Die Ergebnisse des Nachweises von HSP25 und HSP70 in den Ventrikeln von TGR(mREN2)27- und SD-Tieren sind in Abb. 3.20 dargestellt. Zwischen den beiden Präparaten der gleichen Gewebeprobe finden sich keine gravierenden Unterschiede. Das bestätigt die Zuverlässigkeit der angewendeten Methodik. Im Gegensatz zu den beiden anderen Modellen des Bluthochdrucks ist hier im rechten Ventrikel kein signifikanter Unterschied zwischen den normotonen und hypertonen Tieren festzustellen. Die Absolutwerte für HSP25 bewegen sich mit 28 bis 30 µg/g FG im gleichen Bereich wie bei den anderen Modellen (Tab. 3.10). Interessanterweise sind bei den TGR(mREN2)27-Tieren die relativen Herzgewichte Herzgewicht/Tiergewicht, Tab. 3.9) nicht wesentlich höher als bei den SD-Kontrolltieren.

Abb. 3.20: Nachweis von HSP25 und HSP70 in Ventrikeln von TGR(mREN2)27- und Sprague-Dawley-Ratten (SD)
Western-Blots der Gewebeproben. In der jeweils unteren Reihe ist der HSP25-Nachweis und in der oberen Reihe der HSP70-Nachweis gezeigt. Die 5 Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 7,8 ng bis 19,6 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt. Jeweils zusammengehörende Präparate einer Ventrikelprobe zur Doppelbestimmung der HSP25-Menge sind durch einen Balken gekennzeichnet.

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Tab. 12: Tier- und Herzgewichte von TGR(mREN2)27- und Sprague-Dawley-Ratten (SD)

Tier	Tiergewicht (g)	Herzgewicht (g)	Herzgewicht/Tiergewicht (%)
SD-1	223	1,03	0,46
SD-2	225	1,00	0,44
SD-3	215	1,02	0,47
TGR(mREN2)27-1	282	1,10	0,39
TGR(mREN2)27-2	250	1,20	0,48
TGR(mREN2)27-3	260	1,27	0,49

Tab. 13: Gehalt an HSP25 und HSP70 in Ventrikeln von TGR(mREN2)27- und Sprague-Dawley-Ratten (SD)
Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl der gemittelten Werte wieder. Die relative Menge an HSP70 in den Proben bezieht sich auf die in 10 µl EAT-Standard enthaltene Menge an HSP70.

		HSP25				HSP70
	Menge in µg/g Feuchtgewicht				relative Menge
	SD		TGR(mREN2)27		SD		TGR(mREN2)27
rechter Ventrikel	28,4	± 2,5 (3)	30,0	± 2,8 (9)	0,27	± 0,05 (3)	0,18	±0,10 (9)
linker Ventrikel	28,1	± 6,1 (6)	30,0	± 2,5 (6)	0,10	± 0,02 (6)	0,11	±0,03 (6)

Eine Zusammenfassung der Unterschiede im HSP-Gehalt von Herzgeweben und Aorta zwischen normotonen und hypertonen Ratten der drei Modelle findet sich in Tab. 3.11. Die Analyse der Gewebeproben ergibt signifikante Unterschiede in der Expression von HSP25 zwischen den normotonen und den hypertonen Tieren der jeweiligen Tiermodelle vor allem im Bereich der rechten Herzkammer. Der Gehalt an HSP25 ist bei den spontan hypertensiven Ratten und bei den 2K1C-Tieren um ca. 30 bis 130% erhöht und erreicht Werte von 23 bis 30 µg/g Feuchtgewicht. Ähnliche Werte liegen für den linken Ventrikel bei allen Modellen vor, aber ohne eine erkennbare Steigerung bei den hypertonen Tieren. Bei den transgenen Tiere konnte zwar keine deutlich gesteigerte HSP25-Akkumulation im rechten Ventrikel beobachtet werden, jedoch liegen die Absolutwerte hier mit 30 µg/g Feuchtgewicht ebenso hoch wie bei den anderen Modellen. Der Gehalt an HSP25 im Vorhof war bei den untersuchten Modellen immer ca. 50% höher als in den Ventrikeln. Bei den Proben aus der Aorta und der Lunge war der HSP25-Gehalt sehr uneinheitlich. Hier ließ sich keine Beziehung zwischen dem physiologischen Zustand des Tieres und der Menge an HSP25 erkennen.

Für HSP70 ergab sich ebenfalls kein einheitliches Bild bei dem Nachweis des Gehaltes in den verschiedenen Geweben unter jeweils normotonen und hypertonen Bedingungen. Auffällig ist der hohe relative Gehalt an HSP70 in den Nebennieren und die Verminderung des Gehaltes in

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Tab. 14: Relative Unterschiede im HSP-Gehalt von Herzgewebe und Aorta zwischen normotonen und hypertonen Ratten der drei Hypertonie-Modelle
Zugrunde gelegt wurden die Mittelwerte der Mengen an HSP25 bzw. HSP70, wie sie in den Tabellen 3.7 bis 3.9 aufgelistet sind. Bezugspunkt ist jeweils der Mittelwert der Proben der normotonen Tiere. n.b. = nicht bestimmt.

	linker Ventrikel			rechter Ventrikel			Vorhof			Aorta
Modell	HSP25	HSP70		HSP25	HSP70		HSP25	HSP70		HSP25	HSP70
WKY/SHRSP	1,06	1,13		2,36	0,53		0,82	0,95		0,63	1,39
SD/2K1C	0,92	0,89		1,33	1,99		1,02	0,85		1,04	1,02
SD/TGR(mREN2)27	1,07	1,11		1,06	0,65		n.b.	n.b.		n.b.	n.b.

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