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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Isolierung und strukturelle Charakterisierung von HSP25

Streßproteine spielen sowohl im normalen Zellstoffwechsel als auch unter unphysiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle. Um ungünstige Situationen überstehen zu können, benötigen Zellen Mechanismen, mit deren Hilfe sie die lebenswichtigen Funktionen aufrechterhalten oder reparieren können. Ein Teil dieser Aufgaben wird von den Streßproteinen übernommen, indem sie die irreversible Aggregation von denaturierten Proteine verhindern und ihre Rückfaltung in den nativen Zustand unterstützen. Unter physiologischen Bedingungen kommen diese Chaperoneigenschaften der Streßproteine bei der Faltung neu synthetisierter Proteine oder der Translokation von Proteinen zwischen Zellkompartimenten zum Tragen. Auch das kleine Hitzeschockprotein der Säuger (HSP25) zeigt auf zellulärer Ebene eine thermoprotektive Wirkung (Knauf et al., 1992; Landry et al., 1989) und ist in der Lage, als Chaperon zu fungieren (Jakob et al., 1993). Im Gegensatz zu den gut untersuchten Proteinen aus der HSP60-Familie konnte die Quartärstruktur der HSP25-Komplexe bislang nicht aufgeklärt werden. Ein Einblick in die Struktur der Komplexe könnte große Fortschritte bei der Beantwortung der Frage nach dem Mechanismus der Chaperonaktivität bringen. Da bekannt war, daß rekombinant dargestelltes HSP25 in E. coli in inclusion bodies angereichert wird, und somit möglicherweise der nativen Form nur begrenzt ähnelt, wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit zunächst eine schonende Methode zur Aufreinigung des Proteins aus Ehrlich-Ascites-Tumorzellen etabliert. Damit stand für die nachfolgende strukturelle und funktionelle Untersuchungen neben dem rekombinanten Protein auch eine native Form des Proteins zur Verfügung.

Zu Beginn der Arbeiten zur Isolation von HSP25 lagen bereits einige Vorkenntnisse zum Reinigungsverhalten des Proteins vor. Miron et al. (1988) beschrieben die Isolierung von HSP25 aus Truthahnmuskulatur und Benndorf et al. (1992) aus EAT-Zellen. In Anlehnung an diese Arbeiten erfolgte die Isolierung des Proteins durch Ammoniumsulfatfällung und mehrere Chromatographieschritte. HSP25 wurde bis zur Homogenität gereinigt und konnte mittels eines spezifischen Antikörpers identifiziert werden. Wichtig war die Aufreinigung in wenigen Schritten und der Verzicht auf Substanzen, die die native Struktur der HSP25-Komplexe stark beeinflussen könnten, wie z.B. Detergenzien. Daß nicht alle Chromatographie-Techniken für die Isolierung von HSP25-Komplexen geeignet sind, zeigten die Vorarbeiten mit der Mono P-Säule. Das Protein lag nach der Elution von dieser Säule kaum noch in Form größerer Komplexe vor (s_20,W-Wert ca. 6,0) und war außerdem inaktiv bei den Versuchen zur Hemmung der Actinpolymerisation. Verantwortlich für diesen Effekt ist vermutlich eine Denaturierung des Proteins bei der Chromatofokussierung. Im Verlauf des pH-Gradienten wird der isoelektrische Punkt des Proteins durchschritten, d.h. seine Nettoladung beträgt Null. Dies ist ein kritischer Zustand im Hinblick auf das Löslichkeitsverhalten in wäßrigen Medien und kann zu einer Denaturierung und damit zum Ausfallen des Proteins führen. Für eine Empfindlichkeit kleiner

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Im Anschluß an die Aufreinigung des Proteins aus EAT-Zellen erfolgte eine Trennung der hochmolekularen Komplexe von niedermolekularem Material mittels Zentrifugation und Gelfiltration. Damit stand eine Fraktion von nativen HSP25-Komplexen zur Verfügung, die für die strukturelle Charakterisierung geeignet war. Die Struktur der HSP25-Komplexe wurde auf elektronenmikroskopischer Ebene mit Hilfe der Negativkontrastierung und durch die Verwendung der Bildverarbeitungs-Software IMAGIC-5 untersucht. Das Programm erlaubt durch die Verwendung von `Multivariater Statistischer Analyse´ und `Angular Reconstitution´ die Klassifizierung von Projektionen zufällig orientierter Moleküle und die Berechnung der dreidimensionalen Struktur mit hoher Auflösung und wurde schon erfolgreich bei der Rekonstruktion von verschiedenen symmetrischen und asymmetrischen Partikeln aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen angewendet (Dube et al., 1995; Schatz et al., 1995; Serysheva et al., 1995; Stark et al., 1995).

Bei der vorliegenden Untersuchung konnte aufgrund der bevorzugten Orientierung der HSP25-Komplexe keine dreidimensionale Struktur berechnet werden, aber die ringförmige Organisation der Komplexe mit geradzahliger Symmetrie (zwei-, vier- oder achtfach) geht aus den Klassenmitteln der Ansichten klar hervor. Durch den Einsatz hydrodynamischer Methoden konnten die einzelnen Spezies der HSP25-Komplexe weiter charakterisiert werden. Sie sind demnach Mitglieder einer polymer homologen Reihe, deren Struktur vom globulär kompakten Aufbau abweicht. Die Kombination der Daten aus Elektronenmikroskopie, Bildverarbeitung und Hydrodynamik erlaubte die Ableitung eines Modells für den Aufbau von nativem HSP25, bei dem die Komplexe aus vier gestapelten Ringen mit je acht Monomeren bestehen (siehe Abb. 3.6). Die Ergebnisse sind bei Behlke et al. (1995) dargestellt.

Die supramolekularen Komplexe der kHSPs erscheinen bei der elektronenmikroskopischen Analyse im Allgemeinen als globuläre oder Torus-ähnliche Strukturen mit einem Durchmesser von 10-18 nm (Longoni et al., 1990b; Siezen et al., 1978a; Behlke et al., 1991). Für kHSPs wurden Molekulargewichte von ca. 800 kDa beschrieben (Chen et al., 1994; Bentley et al., 1992; Hockertz et al., 1991; Arrigo und Welch, 1987; Spector et al., 1971) und für die Quartärstruktur der kleinen HSPs existiert schon eine Reihe von Modellen. Für B-Crystallin wurde aus spektroskopischen und hydrodynamischen Daten zunächst ein Drei-Lagen-Modell postuliert (Bindels et al., 1979; Siezen et al., 1978b). Die Heterogenität und Dynamik der -Crystallin-Komplexe unter verschiedenen Bedingungen (Siezen et al., 1980; van den Oetelaar et al., 1990) kann jedoch mit diesen Modellen nicht erklärt werden. Aus diesem Grund schlugen Augusteyn und Koretz (1987) eine flexible Micellenstruktur vor, in der alle Untereinheiten gleichmäßig verteilt sind. Schließlich stellte Walsh (1991) einen Kompromiß zwischen dem Drei-Lagen- und dem Micellen-Modell vor, bei dem die innere Lage eine Micelle aus 12 Untereinheiten bildet. Auf der Basis der Beobachtung, daß die rekombinante C-terminale

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Das hier vorgestellte Modell der supramolekularen Struktur von nativem HSP25 weist dagegen Ähnlichkeiten mit den multimeren Komplexen von Hitzeschockproteinen der HSP60-Familie und von Proteasomen auf. Für GroEL aus Eubakterien, TF55 und das Thermosom aus Archaebakterien, HSP60 der Mitochondrien, das Rubisco-bindenden Protein der Chloroplasten und den TCP1-Komplex aus dem Zytosol eukaryotischer Zellen wurde ein Aufbau aus zwei gestapelten Ringen mit je sieben bis neun Molekülen beschrieben (siehe Waldmann et al., 1995, und die darin zitierten Arbeiten). Ähnlich zylinderförmig aufgebaut ist auch das Proteasom, eine ubiquitär vorkommende multikatalytische Protease, die selektiv intrazelluläre Proteine degradiert (zusammengefaßt bei Peters, 1994; Hilt und Wolf, 1996 und Baumeister und Lupas, 1997). Während der hier beschriebenen Arbeiten zur strukturellen Charakterisierung von HSP25 wurde auf der Basis theoretischer Überlegungen auch für -Crystallin ein GroEL-ähnlicher Aufbau vorgeschlagen, bestehend aus 2 ringförmigen Schichten mit der Fähigkeit, entfaltete Proteine in einem Hohlraum in der Mitte zu binden (Carver et al., 1994; Boyle und Takemoto, 1994).

Für die GroE-Chaperone existieren hochaufgelöste Röntgenkristallstrukturen (Braig et al., 1994; Hunt et al., 1996; Mande et al., 1996). Ihre Ringe bestehen aus je 7 Untereinheiten und hier hat man bereits Vorstellungen zur Funktionsweise bei der Proteinfaltung entwickelt (zusammengefaßt bei Fenton und Horwich, 1997). Bei den HSP60-Chaperonen wurden die Substrate, also die zu faltenden Proteine, in der Kavität der Komplexe lokalisiert (Braig et al., 1994; Langer et al., 1992) und im Proteasom findet die Proteindegradation ebenfalls im Inneren der Komplexe statt (Löwe et al., 1995). Analog dazu könnte die postulierte Aktivität bei der Proteinfaltung auch bei HSP25 im Inneren der zylindrischen Struktur lokalisiert sein. Die unterschiedlich starke Kontrastierung, wie sie bei den negativ kontrastierten Präparaten im zentralen Bereich der HSP25-Komplexe zu beobachten war, könnte damit die Folge einer unterschiedlichen `Füllung´ mit Substratproteinen sein.

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Wie schon angedeutet, ist es nicht zu einer Berechnung der dreidimensionalen Struktur des HSP25 auf der Basis der elektronenmikroskopischen Auswertung gekommen, da die vorhandenen Komplexe bevorzugte Orientierungen einnahmen. Eine Ursache dafür ist die verwendete Technik: Bei der Negativkontrastierung können die Partikel mit einer bevorzugten Seite auf den Trägerfolien anheften, z.B. auf Grund ionischer oder hydrophober Wechselwirkungen zwischen bestimmten Regionen der Partikel und den Trägerfolien. In Zukunft ließe sich dieses Problem eventuell mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie lösen. Bei dieser Methode werden die zu untersuchenden Makromolekülen durch schnelles Einfrieren in einer dünnen Schicht vitrifizierten Wassers eingebettet und liegen dann zufällig orientiert vor. Mit Hilfe des IMAGIC-5 Programmes ließe sich von derartigen Präparaten der nativen HSP25-Komplexe eine dreidimensionale Struktur rekonstruieren.

Im Gegensatz zu den aus EAT-Zellen isolierten hochmolekularen HSP25-Komplexen weist die rekombinante Form des Proteins eine kompakte globuläre Struktur auf (Behlke et al., 1991). Ein Grund für die Unterschiede zwischen dem rekombinanten und dem nativen Protein könnten posttranslationale Modifikationen sein, die bei der Expression des Proteins in E. coli nicht geleistet werden können, aber auch präparationsbedingte Unterschiede sind denkbar. Da zur Untersuchung der Bedeutung des Phosphorylierungszustandes für die supramolekulare Struktur der Komplexe nicht genügend natives HSP25 zur Verfügung stand, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Struktur der rekombinanten Proteine von Maus und Mensch sowie verschiedene Mutanten untersucht. Die elektronenmikroskopische und statistische Auswertung der HSP25-Wildtyp-Komplexe zeigte unter Berücksichtigung der Fehlerquellen eine gute Größenübereinstimmung mit dem von Behlke et al. (1991) aufgestellten Modell für diese Komplexe. Die Analyse der Größenverteilung der supramolekularen Komplexe der verschiedenen Mutanten und der in vitro phosphorylierten Variante belegen, daß die Phosphorylierung einen entscheidenden Einfluß auf die Ausbildung dieser Komplexe hat. Während das Wildtyp-Protein hochmolekulare Komplexe relativ homogener Form bildet, werden die Komplexe mit zunehmender Phosphorylierung immer kleiner und unregelmäßiger geformt.

Der Einfluß des Phosphorylierungszustands auf den Oligomerisierungsgrad von kHSPs wurde in vivo schon häufig beobachtet. Die Phosphorylierung von HSP25 korrelierte allerdings in Abhängigkeit vom Zelltyp sowie der Art und dem Zeitpunkt der Stimulierung entweder mit einer Dissoziation oder mit einer Vergrößerung der Komplexe. In menschlichen U251-Gliomzellen führte die Behandlung mit Interleukin 1, TNF- oder Okadasäure sowie chemischer Streß, z.B. durch Arsenit oder Cadmium, zu einer Phosphorylierung und Dissoziation der HSP25-Komplexe (Kato et al., 1994). In Hamster-CCL39-Zellen wurde nach mitogener Stimulierung eine Größenreduktion der Komplexe von transfiziertem menschlichem HSP25 nur im Falle des Wildtyp-Proteins und nicht für eine nichtphosphorylierbare Mutante beobachtet (Lavoie et al., 1995). Demgegenüber beobachteten Mehlen et al. (1994) die Dephosphorylierung und anschließende Anreicherung von kleineren Komplexen mit Molekulargewichten unter 200 kDa in der löslichen Phase des Zytoplasmas bei Serum-frei kultivierten HeLa-Zellen. Nach Stimulation der Zellen durch Serumzugabe kam es zu einer raschen Phos-

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Nach den bisherigen Ergebnissen, einschließlich der hier präsentierten Daten, scheint die Phosphorylierung von HSP25 die Voraussetzung für eine Dissoziation der multimeren Komplexe zu sein. Im zellulären Kontext spielen eventuell andere Faktoren eine zusätzliche regulatorische Rolle, da die Phosphorylierung allein nicht immer ausreichend für diese Strukturänderung ist. Vorstellbar ist auch die Regulation über eine stufenweise Phosphorylierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden für das menschliche HSP25 drei Mutanten mit unterschiedlichem Phosphorylierungsgrad getestet. Hier deutete sich bereits eine graduelle Verkleinerung der Komplexe mit zunehmender Phosphorylierung an, jedoch sind für das menschliche HSP25 mit drei phosphorylierbaren Serinen weitere fünf Varianten der Phosphorylierung denkbar, die für eine weitergehende Analyse zunächst hergestellt werden müßten.

Im Gegensatz zu den Mutanten, die die Phosphorylierung von HSP25 betrafen, war die C-terminal um 18 Aminosäuren verkürzte Mutante in ihrem Oligomerisierungsverhalten kaum verändert. Dieser Bereich hat demnach keinen essentiellen Einfluß auf die Struktur der Komplexe. Nach H1-NMR-Untersuchungen besitzen diese 18 Aminosäuren eine große Flexibilität unabhängig vom übrigen Protein (Carver et al., 1995). Ähnliches wurde auch für -Crystallin festgestellt, nur ist dort das flexible C-terminale Ende acht (A-Crystallin) bzw. zehn (B-Crystallin) Aminosäuren lang (Carver et al., 1990). Mit NMR-Methoden konnte ebenfalls gezeigt werden, daß diese Bereiche des -Crystallins weder an intra- noch an intermolekularen Kontakten beteiligt sind (Le Breton und Carver, 1996; Carver et al., 1990). In der C-terminalen Hälfte der kHSPs sind die Enden im Vergleich zur -Crystallin-Domäne wesentlich weniger konserviert, aber im Allgemeinen sind sie von polarer Natur. Daher postulierten Smulders et al. (1996) und Le Breton und Carver (1996) für das flexible C-terminale Ende eine Rolle bei der Vermittlung der Löslichkeit der überwiegend hydrophoben Proteine. Die gleiche Funktion schlugen Leroux et al. (1997) nach hydrodynamischen, chromatographischen und Quervernetzungs-Studien an einem kleinen HSP aus C. elegans (HSP16-2) vor, da hier zumindest der überwiegende Teil des C-terminalen Endes weder die Multimerisierung noch die Chaperoneigenschaften beeinflußte. Daneben konnten diese Autoren zeigen, daß der nicht konservierte N-terminale Bereich für die Assemblierung der Untereinheiten notwendig ist. Die gleiche Gruppe beschrieb mit einem anderen kHSP aus C. elegans (HSP 12.6) erst kürzlich eine neue Klasse von kHSPs. Dieses Protein stellt das bislang kleinste kHSP dar und ist durch seine extrem kurzen N- und C-Termini gekennzeichnet. Interessanterweise ist HSP12.6 nicht in der Lage, oligomere Komplexe in vivo auszubilden und besitzt scheinbar auch keine Chaperoneigenschaften. Bei der N-terminalen Domäne spricht vor allem ihr hydrophober Charakter für eine Funktion bei der Assemblierung der Proteine zu supramolekularen Komplexen.

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4.2 Hemmung der Actinpolymerisation durch HSP25 und kHSP-Peptide

Die Hemmung der Actinpolymerisation durch HSP25 ist ein besonderer Aspekt der Wechselwirkung von HSP25 mit Actin. In Kapitel 3.3.1 sind Untersuchungen zur Polymerisations-hemmenden Wirkung verschiedener kHSPs beschrieben. Durch den Einsatz der Fluoreszenzspektroskopie und Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, daß in dieser Hinsicht lediglich das aus EAT-Zellen isolierte native HSP25 eine Aktivität aufweist. Weder B-Crystallin noch das rekombinante HSP25 der Maus oder des Menschen sind in der Lage, die Polymerisation von Actin zu inhibieren. Auch die Mutanten weisen keine Aktivität auf. Dies steht in Einklang mit Untersuchungen von Benndorf et al. (1994), die zeigten, daß nur unphosphorylierte Monomere von nativem HSP25 in der Lage sind, die Polymerisation von Actin effektiv zu unterbinden, während phosphoryliertes HSP25 und hochmolekulare HSP25-Komplexe inaktiv sind. Als erste hatten Miron et al. (1991; 1988) die Beobachtung veröffentlicht, daß das aus der Muskulatur von Truthähnen isolierte HSP25 einen inhibitorischen Effekt auf die Polymerisation von Actin hat. Sie beobachteten außerdem eine Verminderung der Aktivität durch die Tendenz des Proteins, unter nichtreduzierenden Bedingungen zu dimerisieren. Sie charakterisierten HSP25 als ein `barbed end capping protein´, also als ein Molekül, das am schnell wachsenden Ende des Actinfilaments bindet und damit die Elongation

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Da es zur Zeit noch keine Daten zur strukturellen Basis der inhibierenden Wirkung von kHSPs auf die Actinpolymerisation gibt, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Peptidbibliothek von HSP25 synthetisiert und auf ihre in vitro Aktivität als Inhibitor der Actinpolymerisation getestet. Durch den Einsatz von Fluoreszenzspektroskopie und Elektronenmikroskopie konnten zwei Polypeptide identifiziert werden, die die Polymerisation von Actin bei einem 10-fachen (Peptid 6: WSQWFSAAGWPGYVR) bzw. 2,5-fachen (Peptid 11: IRQTADRWRVSLDVN) molaren Überschuß zu 50% inhibieren konnten. Die Aktivitäten dieser Peptide liegen damit etwa ein bis zwei Größenordnungen unter den Werten, wie sie schon für das isolierte Protein erhalten wurden (Miron et al., 1991; Benndorf et al., 1994) und etwa eine Größenordnung über der Effektivität eines Dodekapeptides, das die Actin-bindende Sequenz des Cofilins beinhaltet (Yonezawa et al., 1991). Da die Cofilin-Sequenz in mehreren Actin-depolymerisierenden Proteinen gefunden wurde, postulierten die Autoren, daß diese Sequenz ein allgemeines Motiv für diese Funktion darstellt. Die hier identifizierten Bereiche weisen keine Verwandtschaft zu Sequenzen von Actin-depolymerisierenden Proteinen auf, aber innerhalb der kHSPs sind sie konserviert. Diese Sequenzen könnten also ein für die kHSPs spezifisches Motiv für die Wechselwirkung mit Actin sein. In jedem Fall sind die hier beschriebenen Peptide im Hinblick auf ihre Fähigkeit, die Actinpolymerisation zu hemmen, die bislang effektivsten Peptide. Die Spezifität der Interaktion von Peptid 11 mit Actin wird durch die Tatsache bestätigt, daß ein Zufallspeptid mit der gleichen Aminosäurezusammensetzung keine Aktivität zeigt. Auf der anderen Seite konnten die homologen Sequenzen von Mensch und B-Crystallin die Actinpolymerisation nicht inhibieren. Daß die menschliche Sequenz lediglich an einer Stelle von der Sequenz des murinen Peptids abweicht, spricht für die Bedeutung des Glutamins an Position 3 des Maus Peptids. Von den bekannten HSP25-Sequenzen der Säuger (Maus, Ratte, Hamster, Huhn, Hund und Mensch) weist lediglich das menschliche Protein ein Histidin an dieser Stelle auf (siehe auch Sequenzvergleich in Abb. 3.13), sonst ist es immer ein Glutamin. Die Sequenz des menschlichen HSP25 wurde von der cDNA und nicht vom isolierten Protein abgeleitet. Da die Codons für Histidin und Glutamin nur an der dritten Stelle voneinander abweichen, ist nicht auszuschließen, daß die Existenz des Histamins an der dritten Position in Peptid 11 auf einer falschen Bestimmung der Sequenz beruht.

Die vorliegende Untersuchung zeigt, daß die Aktivität sowohl des menschlichen Peptids 11 als auch der entsprechenden B-Crystallin-Sequenz durch eine N-terminale Verlängerung wiederhergestellt werden kann und belegen damit den modifizierenden Einfluß des N-terminal zum Peptid 11 gelegenen Bereiches. In diese Region fallen bei dem murinen HSP25 und B-Crystallin sowie bei dem menschlichen HSP25 ein bzw. zwei phosphorylierbare Serine, wodurch diese Region zusätzlich interessant wird. Durch die Verwendung der verlängerten Peptide mit einer Phosphorylierung an den entsprechenden Serinen konnte ein modulierender Einfluß der Phosphorylierung auf die Funktion als Inhibitor der Actinpolymerisation

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Durch eine Reihe von verkürzten Varianten des Peptids 11 konnte die Stelle der Interaktion von HSP25 mit Actin näher charakterisiert werden. Nach den vorliegenden Untersuchungen sollte das Minimalmotiv eines aktiven Peptids zumindest 6 bis 9 Aminosäuren umfassen und die Sequenzmotive IRQ und DVN enthalten. Im Peptid 11 werden diese beiden Motive durch eine Sequenz von 9 Aminosäuren miteinander verbunden, von denen das Element TAD die wichtigste Rolle als Bindeglied zu spielen scheint. Die Lage des Peptids 11 im Gesamtprotein ist in zweifacher Hinsicht interessant. Erstens ist die Nähe zum phosporylierbaren Serin 86 auffällig - die Bedeutung der Phosphorylierung dieser Aminosäure wurde bereits besprochen - und zweitens liegt Peptid 11 am Beginn der -Crystallin-Domäne, dem konservierten Bereich, der allen kleinen HSPs gemein ist. Damit zeichnet sich eine mögliche Funktion dieser Domäne ab, wenn auch die am höchsten konservierten Bereiche (Singh et al., 1995) nicht in den Bereich von Peptid 11 fallen. Die phosphorylierbaren Serine liegen außerhalb der -Crystallin-Domäne, so daß eine Aufteilung des HSP25-Proteins in einen funktionellen und einen regulatorischen Teil denkbar ist.

Peptid 11 besitzt mit drei Argininen und zwei Aspartaten fünf geladene Aminosäuren, ist darum gut wasserlöslich und könnte eine Reihe von ionischen Wechselwirkungen mit Actin eingehen. Demgegenüber ist Peptid 6 mit seinen fünf aromatischen Aminosäuren sehr hydrophob und wohl nur wegen des endständigen Arginins überhaupt in Wasser löslich. Hier dürfte die Wechselwirkung mit Actin vor allem hydrophober Natur sein. Die Experimente mit Zellulose-gebundenen Peptid-Bibliotheken von Actin ergaben als mögliche Interaktionspunkte von HSP25 vor allem die Aminosäurebereiche 156-168 und 194-208 im Actinmolekül. Interessanterweise sind diese Stellen beide an Monomer-Monomer-Wechselwirkungen bei der Filamentbildung des Actins beteiligt. In Abb. 4.1 ist die Struktur des Actin-Monomers wiedergegeben. In dieser Grafik sind auch die Kontaktstellen mit anderen Monomeren im Actinfilament eingezeichnet. Daraus geht hervor, daß die Aminosäuren 156-168 einen

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Die hydrodynamische Untersuchungen bestätigten die Spezifität der Wechselwirkung zwischen Peptid 11 und G-Actin und ließen außerdem eine Abschätzung der Assoziationskonstante von 3,7 x 10⁵ M^-1 zu. Dies belegt eine schwache, aber signifikante Interaktion von Peptid 11 mit G-Actin. Außerdem sprechen die hydrodynamischen Untersuchungen für die biologische Aktivität des Peptids, da keine Selbstassoziate gefunden wurden.

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Abb. 4.1: Struktur von monomerem Actin
Darstellung der Kontaktstellen des Actin-Monomers nach Kabsch et al. (1990) mit anderen Monomeren im Actinfilament (modifiziert auf der Grundlage einer Zeichnung von dos Remedios und Moens, 1995). Die schwarzen Bänder repräsentieren die Kontaktstellen und die weißen Zahlen darin deuten die Aminosäuren an, die den Anfangs- und Endpunkt der Kontakte bilden. Die durchgezogene Linie kennzeichnet die Trennung der sogenannten `großen´ (links) von der `kleinen´ (rechts) Untereinheit. Die gestrichelten Linien markieren die Aufteilung dieser Untereinheiten in die vier Domänen. Die Pfeile deuten auf die Bereiche des Actin-Moleküls, die nach den Ergebnissen des Peptid-Epitop-Scannings als Interaktionsbereiche mit HSP25 in Frage kommen.

Die hier präsentierten Daten zur Hemmung der Actinpolymerisation durch HSP25-Peptide stellen den ersten direkten Beleg für eine Interaktion von HSP25 mit Actin dar. Bei in vitro Untersuchungen mit isolierten Proteinen kann die Existenz von hochaktiven Proteinen als Kontamination nicht ausgeschlossen werden und in vivo Untersuchungen sind prinzipiell von indirekter Natur. Die Ergebnisse bestätigen die Befunde anderer Untersuchungen, nach denen HSP25 phosphorylierungsabhängig als Inhibitor der Actinpolymerisation fungieren kann. In vivo wird die Regulation des Actinfilamentnetzwerkes neben HSP25 von einer Reihe anderer Proteine beeinflußt. Die Aufklärung der speziellen Funktion von HSP25 im Zusammenspiel mit diesen Proteinen bleibt das Ziel weitergehender Untersuchungen.

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4.3 Vorkommen von HSP25 und HSP70 bei Hypertonie

Veränderungen im Vorkommen von HSPs bei pathophysiologischen Zuständen, wie sie z.B. bei einer ausgeprägten Hypertonie zu erwarten sind, können für klinische Fragestellungen von großem Interesse sein. In einer Reihe von Untersuchungen konnte bereits die Bedeutung von HSPs, insbesondere HSP70, für die Funktion des Herzens unter unphysiologischen Bedingungen nachgewiesen werden (Mestril et al., 1994; Heads et al., 1994; Marber et al., 1995; Plumier et al., 1995; Chi und Mestril, 1996; Mestril und Dillmann, 1995; Suzuki et al., 1997), aber über die Funktion von HSP25 im Herzen ist nur wenig bekannt. In Kapitel 3.4 sind die Ergebnisse des Nachweises von HSP25 und HSP70 in verschiedenen Geweben von drei Tiermodellen der Hypertonie beschrieben. Besonders hoch waren die HSP25-Mengen in den muskulösen Geweben, in der Nebenniere und in der Lunge, also vor allem in Geweben, die besonders viel Actin enthalten oder einen hohen Anteil an Epithelien aufweisen. Eine ähnliche quantitative Verteilung von HSP25 fanden auch Kato et al. (1992) bei der Untersuchung menschlicher Gewebeproben. Deutliche Unterschiede im HSP25-Gehalt zwischen den Geweben aus normotonen und hypertonen Tieren wurden in der Aorta, den Ventrikeln und der Nebenniere festgestellt. Im Vergleich zu anderen Studien liegen die Werte des HSP25-Gehalts im Herzen etwas niedriger als z.B. solche wie sie für adulte Mäuse- (Klemenz et al., 1993) und Rattenherzen (Inaguma et al., 1995) berichtet wurden. Allerdings wurde in diesen Fällen eine weniger effektive Methode der Proteinextraktion verwendet.

Insgesamt war ein deutlich variierender Gehalt an HSP25 in den verschiedenen Herzgeweben zu erkennen, was für eine gewebespezifische Funktion des kleinen HSPs im Herzen spricht. Die ventrikuläre Lokalisation von kHSPs wurde erst kürzlich von Lutsch et al. (1997) mit Hilfe von Immunfluoreszenz- und Immun-Elektronenmikroskopie untersucht. HSP25 konnte in Kardiomyozyten, Endothelzellen und in Zellen der glatten Muskulatur von Blutgefäßen nachgewiesen werden. Interessanterweise wurde B-Crystallin bei dieser Untersuchung nur in den Kardiomyozyten gefunden. Dort waren beide kHSPs in der I-Bande und in der Region der M-Linien lokalisiert. Unterschiedlich stark akkumuliert waren nach dieser Untersuchung HSP25 und B-Crystallin im Herzen auch zu verschiedenen Zeiten der Entwicklung. Diese Befunde sprechen für räumlich und zeitlich getrennte Funktionen dieser beiden kleinen HSPs im Herzen.

Die unterschiedliche Veränderung im Gehalt von HSP25 und HSP70 zwischen den Geweben normotoner und hypertoner Ratten deutet auf eine differentielle Regulation von HSP25 und HSP70 bei der durch Hypertonie ausgelösten Belastung im Herzen. In diesem Zusammenhang ist auch der entgegengesetzte Trend bei der Veränderung des Gehalts an HSP25 im Vergleich zu dem von HSP70 bei den spontan hypertensiven bzw. den Goldblatt-operierten Ratten interessant. Dies läßt vermuten, daß bei diesen Tiermodellen unterschiedliche Mechanismen für die Ausbildung der Hypertonie verantwortlich sind und dadurch auch die Expression von Streßproteinen in unterschiedlichem Maße angeregt wird. Eine differentielle Regulation der

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In dieser Untersuchung wurde eine deutlich erhöhte Expression von HSP25 bei den spontan hypertensiven und den Goldblatt-operierten Tieren im Bereich der rechten Herzkammer beobachtet. Dieser Befund überrascht insofern, als bei einer Hypertonie primär der linke Ventrikel einer verstärkten Belastung ausgesetzt ist. Die biologische Relevanz des gesteigerten Vorkommens von HSP25 in diesem Teil des hypertonen Rattenherzen bleibt zunächst ungeklärt. Erstaunlich ist auch der bei den Kontrolltieren des transgenen Modells sehr hohe Gehalt an HSP25 im rechten Ventrikel. Eine mögliche Ursache könnte im Alter der Tiere liegen. Die Tiere dieses Modells waren mit zwei Monaten noch relativ jung. Es kann zwar als gesichert gelten, daß die transgenen Tiere auch schon in diesem Alter einen erhöhten Blutdruck aufweisen (Mullins et al., 1990), aber ein entwicklungsabhängig relativ hoher HSP25-Gehalt ist für die Kontrolltiere diesen Alters ebenfalls denkbar und würde damit die zu erwartende Steigerung des Gehaltes im rechten Ventrikel bei den transgenen Tieren kompensieren. Dafür sprechen auch neuere Ergebnisse von Lutsch et al. (1997), nach denen der HSP25-Gehalt im Herzgewebe von Ratten mit zunehmendem Alter abnimmt. Allerdings ist nach diesen Untersuchungen der HSP25-Wert der Adulttiere bereits nach etwa 1 Monat erreicht.

Das konstitutive Vorkommen von HSP25 im Herzmuskel steht in Übereinstimmung mit einer wachsende Zahl von Arbeiten, die die Interaktion von HSP25 mit Actin in vivo beschreibt. So zeigten Lavoie et al. (1993a), daß in 3T3-Zellen, die nach einer Transfektion menschliches HSP25 überexprimierten, die Actinfilamentbündel (Streßfibern) eine erhöhte Stabilität gegen einen durch Hitzeschock und Cytochalasin D verursachten Streß aufwiesen. Postuliert man eine direkte Stabilisierung der Actinfilamente durch HSP25, wäre das überexprimierte Protein in diesen Zellen für die gesteigerte Toleranz gegenüber diesen Streßfaktoren verantwortlich. Außerdem scheint nach Untersuchungen von Smoyer et al. (1996) und Welsh et al. (1996) HSP25 durch die Regulation des Actinfilamentsystems an der Aufrechterhaltung und der pathophysiologisch bedingten Umorganisation des Zytoskeletts in Podozyten und in den Sertoli-Zellen der Hoden beteiligt zu sein. Darüber hinaus ist HSP25 in glatten Muskelzellen an der anhaltenden Kontraktion der Muskeln nach Bombesin- oder Proteinkinase C-Stimulation beteiligt, eine Funktion, die durch die Interaktion mit Actin vermittelt werden könnte (Bitar et al., 1991). Die Aufrechterhaltung der morphologischen und funktionellen Integrität des kontraktilen Apparates und des Zytoskeletts könnte demnach auch im Herzen eine Funktion von HSP25 sein.

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4.4 Modell der Struktur-Funktionsbeziehungen von HSP25

Die zur Zeit verfügbaren Daten zeigen, daß HSP25 mit Actin wechselwirken und als Chaperon fungieren kann. Im Einzelnen gehören zu den Funktionen des kleinen Hitzeschockproteins in der Zelle 1.) die Stabilisierung des Mikrofilamentsystems durch die phosphorylierten Monomere, 2.) die Hemmung der Actinpolymerisation durch die unphosphorylierten Monomere und 3.) die Verhinderung der irreversiblen Denaturierung partiell entfalteter Proteine durch die Chaperonaktivität der (unphosphorylierten) hochmolekularen Komplexe. In dem Modell in Abb. 4.2 ist das Zusammenspiel der beteiligten Faktoren bei den verschiedenen Eigenschaften von HSP25 zusammengefaßt.

Da Actin ein wesentlicher Wechselwirkungspartner von HSP25 ist, sollen hier zunächst kurz die wichtigsten Eigenschaften dieses Proteins rekapituliert werden. Actin findet sich in allen eukaryotischen Zellen. In einer typischen tierischen Nichtmuskelzelle macht es ca. 5% der Gesamtproteinmenge aus. Actinfilamente sind essentiell für viele Formen der Beweglichkeit, einschließlich der Muskelkontraktion und für die Struktur und mechanischen Eigenschaften der zytoplasmatischen Matrix. Ohne Actinfilamente könnte sich z.B. eine tierische Zelle nicht auf einer Oberfläche fortbewegen, größere Partikel phagocytieren oder sich teilen. Actin liegt in der Zelle in nahezu gleichen Mengen unpolymerisiert (G-Actin) und in polymerisierter, filamentöser Form (F-Actin) vor (Sheterline et al., 1995). In vitro bleibt Actin nur bei niedriger Ionenstärke (z.B. 0,2 mM Ca²⁺ oder 0,05 mM Mg²⁺) monomer. Eine Anhebung der Ionenstärke auf physiologische Bedingungen (z.B. 2 mM MgCl₂ und 100 mM KCl) führt innerhalb weniger Minuten zu einer Polymerisation des G-Actins zu mehrere Mikrometer langen Filamenten, wie sie z.B. in Abb. 3.11 A dargestellt sind. In der Zelle wird durch Proteine, die an Actin-Monomere binden (z.B. Thymosin und Profilin) verhindert, daß alle Monomere zu Filamenten polymerisieren. Es existiert noch eine große Zahl anderer Actin-bindender Proteine, von denen die meisten an Actinfilamente binden. Man unterteilt sie nach ihren Funktionen bei der Kontrolle der Organisation des Actinnetzwerkes in verschiedene Gruppen. Actin-

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Abb. 4.2: Modell der Struktur-Funktionsbeziehungen von HSP25
Erläuterungen siehe Text.

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Die Interaktion von HSP25 mit Actin auf zellulärer Ebene sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch unter Streß ist inzwischen gut belegt (siehe Kap. 4.31). Zudem beschrieben Lavoie et al. (1993b) den Einfluß der Phosphorylierung von HSP25 auf die Organisation des Zytoskeletts: In Zellen, die konstitutiv HSP25 überexprimierten, war die durch Wachstumsfaktoren induzierte F-Actin-Akkumulation gesteigert, wohingegen die nichtphosphorylierbare Mutante HSP25-S15,78,82G einen negativen Einfluß auf die Actinfilamentbildung hatte. Weitere Beispiele für die Abhängigkeit der protektiven Wirkung von HSP25 vom Phosphorylierungszustand im Hinblick auf die Stabilität des Zytoskeletts finden sich bei Lavoie et al. (1995) und Huot et al. (1996). In beiden Arbeiten wurde gezeigt, daß der protektive Effekt durch die Phosphorylierungs-inkompetenten Mutanten nicht vermittelbar ist.

Nach den hier vorgestellten Untersuchungen zur Struktur und Funktion der HSP25-Mutanten werden durch die zunehmende Phosphorylierung die hochmolekularen HSP25-Komplexe in phosphorylierte niedermolekulare Komplexe oder Monomere überführt. Zur Funktion der phosphorylierten HSP25-Monomere ergeben sich Hinweise aus der Tatsache, daß in hitzegeschockten menschlichen Endothelzellen HSP25 mit Actinfasern assoziiert ist und gleichzeitig der Anteil der phosphorylierten HSP25-Isoformen ansteigt (Loktionova et al., 1996). Da die Stabilisierung der Actinfilamente unter Streßbedingungen von der Phosphorylierbarkeit von HSP25 abhängt, ist denkbar, daß die phosphorylierten monomeren HSP25-Moleküle hierfür verantwortlich sind. In Abb. 4.2 ist die Stabilisierung der Actinfilamente durch phosphoryliertes HSP25 unter Punkt 1 der Funktionen von HSP25 eingezeichnet.

Auch Zhu et al. (1994) konnten zeigen, daß nur die phosphorylierte Isoform von HSP25 mit der (durch Thrombin induzierten) aktiven Zytoskelettfraktion in menschlichen Blutplättchen assoziiert war. Die Autoren dieser Arbeit beobachteten außerdem, daß nach der Aktivierung der Blutplättchen HSP25 zunächst phosphoryliert und dann von Zytoplasma zum sich organisierenden Zytoskelett transloziert wird. Dies spricht für die These, daß HSP25 in der phosphorylierten Form innerhalb der Zelle transportiert wird. Dies kann auch im Zusammenhang mit der häufig beobachteten Relokalisation von HSP25 vom Zytoplasma in den Zellkern von Bedeutung sein (Beaulieu et al., 1989; Arrigo et al., 1988; Wollgiehn et al., 1994). Wie allerdings der Transport geschieht und wie während des Transportes die Aktivität kontrolliert wird, bleibt offen. Hieran sind in der Zelle vermutlich eine Reihe anderer Proteine beteiligt.

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Durch welche Mechanismen die unphosphorylierten HSP25-Monomere vor einer erneuten Assoziation zu hochmolekularen Komplexen geschützt werden, bzw. wodurch die Bildung der HSP25-Komplexe ausgelöst wird, ist bislang unbekannt. Arrigo et al. (1988) konnten zeigen, daß durch einen Hitzeschock die Bildung hochmolekularer Komplexe angeregt wird. In dem Modell in Abb. 4.2 sind die Übergänge zwischen den verschiedenen strukturellen Zuständen von HSP25 dargestellt. Dabei ist ungeklärt, ob diese Übergänge in der dargestellten Abfolge verlaufen oder ob z.B. unphosphorylierte Monomere direkt zu den hochmolekularen Komplexen assemblieren können. Die Dissoziation der Komplexe verläuft, getrieben durch eine zunehmende Phosphorylierung durch die Streß-induzierte Aktivierung der MAPKAP-Kinasen 2 oder 3, in Richtung der phosphorylierten Monomeren. Die MAPKAP-Kinasen sind Teil einer mehrstufigen Signaltransduktionskaskade, von denen ein Zweig mit der Phosphorylierung von HSP25 endet. Damit ist HSP25 ein Teil des Signaltransduktionssystems, durch den die Zelle auf Veränderungen in ihrer Umgebung mit einer Stabilisierung des Actinfilamentsystems reagiert. Durch die nachgeschaltete Dephosphorylierung von HSP25 kann nach dem Überstehen der Streßperiode die normale Flexibilität des Actinskeletts wiederhergestellt werden.

Ob in der anderen Richtung, also hin zu den unphosphorylierten HSP25-Komplexen noch andere Faktoren als die genannten Phosphatasen eine Rolle spielen, sollte Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein. Unter nichtreduzierenden Bedingungen (Miron et al., 1988) und bei oxidativ gestreßten Zellen (z.B. durch H₂O₂, Benndorf und Bielka, 1997) wurde allerdings eine Dimerisierung von HSP25 beobachtet. Die Funktion der HSP25-Dimere ist unbekannt und sie scheinen, wie in Abb. 4.2 dargestellt, eine strukturelle `Sackgasse´ zu bilden. Da die HSP25-Dimere nach Miron et al. (1988) inaktiv bei der Hemmung der Actinpolymerisa-tion sind, könnte die Dimerisierung ein Teilaspekt bei der Regulation des Actinfilamentsystems der Zelle sein. HSP25 kann also als ein Regulator der Organisation des zellulären Actinfilamentsystems am Ende einer Signaltransduktionskaskade betrachtet werden, dessen Aktivität durch den Grad der Phosphorylierung und den Oligomerisierungszustand beeinflußt wird.

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HSP25 ist damit ein Beispiel für ein Protein mit vielfältigen Aufgaben sowohl in gestreßten wie auch in ungestreßten Zellen. Die Komplexität der verschiedenen Funktionen und ihrer Regulation kommt in dem Modell in Abb. 4.2 zum Ausdruck und es sollte das Ziel zukünftiger Untersuchungen sein, weitere Einzelheiten der Struktur-Funktionsbeziehungen dieses interessanten Proteins herauszufinden.

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