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Kapitel 5. Zusammenfassung

Hitzeschockproteine übernehmen im Organismus sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Streß wichtige Funktionen zur Aufrechterhaltung des zellulären Stoffwechsels. HSP25 ist ein Vertreter der ubiquitär verbreiteten kleinen Hitzeschockproteine, die aufgrund der konservierten -Crystallin-Domäne eine eigene Familie innerhalb der großen Klasse der Streßproteine bilden. Es ist an der Vermittlung von zellulärer Streßtoleranz beteiligt, besitzt Chaperoneigenschaften und ist in der Lage, die Actinpolymerisation zu inhibieren. HSP25 ist außerdem gekennzeichnet durch seine Fähigkeit, supramolekulare Komplexe auszubilden. Die hier vorgelegte Arbeit befaßte sich mit der Isolierung, strukturellen und funktionellen Charakterisierung des Proteins und seinem Vorkommen in verschiedenen Geweben bei Tiermodellen mit pathologisch erhöhtem Blutdruck.

Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Methode etabliert, die eine relativ schnelle und schonende Isolierung von HSP25 aus Ehrlich-Ascites-Tumor ermöglicht. Isoliertes HSP25 konnte in mehrere Fraktionen aufgetrennt werden, die sich in bezug auf ihren Assoziationsgrad unterschieden. Durch die Kombination von elektronenmikroskopischen und hydrodynamischen Methoden konnte für die hochmolekularen Komplexe des nativen HSP25 ein Strukturmodell abgeleitet werden. Dieses Modell ist durch eine zylinderförmige Struktur charakterisiert, die aus vier gestapelten Ringen besteht, wobei die einzelnen Ringe je acht HSP25-Monomere enthalten. Die Ähnlichkeit dieser Komplexe mit dem prokaryotischen GroEL-Komplex läßt vermuten, daß die Chaperonaktivität von HSP25 in vergleichbarer Weise durch eine Bindung des Substratproteins im Inneren der Komplexe initiiert wird. Weitere Versuche, möglichst mit Hilfe der Kryomikroskopie, sollten zur weiteren Verfeinerung der dreidimensionalen Struktur dieser HSP25-Komplexe unternommen werden.

Die hochmolekularen Komplexe des rekombinanten HSP25 liegen demgegenüber als kompakte globuläre Strukturen vor. Elektronenmikroskopische Analysen verschiedener Phosphorylierungs-Mutanten und des in vitro phosphorylierten rekombinanten HSP25 zeigten, daß die HSP25-Komplexe mit zunehmender Phosphorylierung kleiner werden. Vollständig (dreifach) phosphoryliertes menschliches HSP25 bildet keine hochmolekularen Komplexe mehr. Diese Ergebnisse bestätigen den Zusammenhang zwischen dem Phosphorylierungszustand des Proteins und seiner supramolekularen Organisation.

HSP25 wechselwirkt mit dem Zytoskelettsystem der Zelle. Es ist in der Lage, die Actinpolymerisation zu hemmen und wird mit der Stabilisierung des Mikrofilamentsystems der Zelle in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Untersuchung wurden verschiedene kHSPs hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Actinpolymerisation zu inhibieren, getestet. Mittels Elektronenmikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß das native HSP25 der Maus in der Lage ist, die Polymerisation von Actin zu inhibieren. Rekombinantes HSP25 der Maus und des Menschen, B-Crystallin aus Kaninchen sowie die verschiedenen

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Zur genaueren Analyse dieser Funktion wurde eine Peptidbibliothek von murinem HSP25 synthetisiert. Es konnten zwei Peptide identifiziert werden, die ähnlich wie das Gesamtprotein in der Lage sind, die Actinpolymerisation zu hemmen. Die von den Peptiden umfaßten Regionen enthalten die Aminosäuren 43 bis 57 (Peptid 6: WSQWFSAAGWPGYVR) und 92 bis 106 (Peptid 11: IRQTADRWRVSLDVN). Eine 50%-ige Hemmung der Actinpolymerisation wird bei Peptid 6 bei einem 10-fachen und bei Peptid 11 bei einem 2,5-fachen molaren Überschuß zum Actin erreicht. Diese Peptide stellen die bislang effektivsten Peptide mit dieser Funktion dar. Die Resultate belegen erstmals eine direkte Interaktion zwischen HSP25 und Actin. Mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifuge konnte zudem eine spezifische Wechselwirkung zwischen Actin und Peptid 11 nachgewiesen werden.

Durch die Verwendung N-terminal verlängerter Peptid 11-Varianten konnte der Einfluß der Phosphorylierung von einem bzw. zwei Serinen auf die Aktivität der Peptide bestimmt werden. Die phosphorylierten Peptide wiesen im Vergleich zu den unphosphorylierten Varianten immer eine signifikant schlechtere Hemmung der Actinpolymerisation auf. Damit ist es gelungen, die phosphorylierungsabhängige Eigenschaft des gesamten Proteins, als Inhibitor der Actinpolymerisation zu fungieren, mit einem kleinen Teilstück nachzuvollziehen und die Abhängigkeit dieser Reaktion vom Phosphorylierungszustand zu belegen.

Vorläufige Ergebnisse mit Zellulose-gebundenen Peptid-Bibliotheken deuten auf eine Wechselwirkung der Peptid 11-Sequenz von HSP25 mit einem exponierten Loop in Actin-Domäne vier hin. Dieser Bereich ist an Actin-Actin-Kontakten bei der Filamentbildung beteiligt und könnte den Angriffspunkt für die Hemmung der Polymerisation durch HSP25 darstellen. Weitere Untersuchungen mit Actin-Peptiden aus Regionen, die für eine Interaktion in Frage kommen, sollten zur Identifizierung der Interaktionsbereiche zwischen HSP25 und Actin beitragen können.

HSPs haben aufgrund ihrer verstärkten Synthese bei vielen pathologischen Prozessen eine medizinische Relevanz. Untersuchungen an Tiermodellen der Hypertonie ergaben für HSP25 einen hohen Gehalt in muskulösen Geweben, in der Nebenniere und in der Lunge. HSP70 ist besonders stark in der Nebenniere vertreten. Im Zusammenhang mit den Wechselwirkungen zwischen HSP25 und Actin deutet das konstitutive Vorkommen von HSP25 im Herzmuskel auf eine Funktion des Proteins bei der Organisation des kontraktilen Apparats und des Zyto-skeletts hin. Eine deutlich erhöhte Expression von HSP25 konnte bei hypertonen Tieren von zwei Modellen im Bereich der rechten Herzkammer beobachtet werden. Die Bedeutung der HSP25-Akkumulation in diesem Bereich sollte durch weitere Untersuchungen aufgeklärt werden. Außerdem sprechen die unterschiedliche Veränderungen im Gehalt von HSP25 und

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Die unterschiedlichen Funktionen von HSP25 sind an Veränderungen hinsichtlich der supramolekularen Organisation und des Phosphorylierungszustandes des Proteins gekoppelt. In einem Modell werden diese Struktur-Funktions-Beziehungen für HSP25 bei der Stabilisierung von Actinfilamenten, der Spaltung von Actinfilamenten, der Hemmung der Actinpolymerisation und der Chaperonfunktion zusammengefaßt.

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