zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biologe Martin Wieske,
geboren am 12.11.1963 in Leeden

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J. Rabe

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann, Berlin
2. Prof. Dr. Matthias Gaestel, Halle
3. Prof. Dr. Joachim Behlke, Berlin

Tag der mündlichen Prüfung: 22. September 1998

Abstract

HSP25 is a member of the ubiquitous family of small heat shock proteins belonging to the big class of stress proteins. It is related to acquiring of cellular thermotolerance, can act as molecular chaperone, is able to inhibit polymerization of actin in vitro and can form high molecular weight complexes. In this thesis the isolation, structural and functional characterization of this protein as well as its abundance in different tissues of rats suffering on pathological forms of hypertension is analyzed:

• A method for rapid isolation of HSP25 out of Ehrlich-ascites-tumor (EAT) was established. From isolated HSP25 low and high molecular weight material could be obtained.
• Analysis of high molecular weight complexes by means of electron microscopy and analytical ultracentrifugation results in a structural model characterized by a cylindrical structure composed of four stacked rings each containing eight HSP25 monomers.
• High-molecular weight complexes of recombinant HSP25 are organized as compact globular structures. Electron microscopic investigations of different mutants and of in vitro phosphorylated HSP25 show a connection between phosphorylational status and supramolecular organization of the protein: the higher the degree of phosphorylation the smaller are the HSP35-complexes.
• By means of electron microscopy and fluorescence spectroscopy it could be shown that only native HSP25 from EAT but not recombinant HSP25 nor HSP25 mutants inhibit polymerization of actin. This is in agreement with recent results showing that only unphosphorylated native HSP25 monomers are active inhibitors of actin polymerization.
• Two HSP25 derived peptides could be identified as competent inhibitors of actin polymerization. This is the first experimental evidence for a specific interaction of HSP25 sequences with actin. This interaction is dependent on the phosphorylational status as confirmed by phosphorylated HSP25 peptides.
• Preliminary results with cellulose bound peptide libraries indicate an interaction of HSP25 with an exposed loop in actin domain IV, an area involved in actin-actin interactions.
• HSP25 is of medical relevance because of its increased synthesis in a bright variety of pathological processes. Investigations on different animal models of hypertension show an enhanced accumulation of HSP25 in the right ventricle.
• A model is presented summing up the structure-function relationships of HSP25.

Keywords:
heat shock proteins, hsp25, structure, actin, peptides

Zusammenfassung

HSP25 ist ein Vertreter der ubiquitär verbreiteten kleinen Hitzeschockproteine, einer Familie innerhalb der großen Klasse der Streßproteine. Es ist an der Vermittlung von zellulärer Streßtoleranz beteiligt, besitzt Chaperoneigenschaften, hemmt die Actinpolymerisation in vitro und ist in der Lage, supramolekulare Komplexe auszubilden. Die hier vorgelegte Arbeit befaßte sich mit der Isolierung, der strukturellen und funktionellen Charakterisierung des Proteins und seinem Vorkommen in verschiedenen Geweben von Ratten mit pathologisch erhöhtem Blutdruck:

• Es wurde eine Methode zur schonenden Isolierung von HSP25 aus Ehrlich-Ascites-Tumor (EAT) etabliert. Daraus konnte niedrig- und hochmolekulares Material gewonnen werden.
• Unter Anwendung elektronenmikroskopischer und hydrodynamischer Methoden konnte für die hochmolekularen Komplexe des nativen HSP25 ein Strukturmodell abgeleitet werden. Es ist durch eine zylinderförmige Struktur aus vier gestapelten Ringen mit je acht HSP25-Monomeren charakterisiert.
• Hochmolekulare Komplexe des rekombinanten HSP25 liegen demgegenüber als kompakte globuläre Strukturen vor. Elektronenmikroskopische Analysen verschiedener Mutanten und von phosphoryliertem HSP25 zeigen, daß die HSP25-Komplexe mit zunehmender Phosphorylierung kleiner werden. Dies belegt einen Zusammenhang zwischen dem Phosphorylierungszustand des Proteins und seiner supramolekularen Organisation.
• Mittels Elektronenmikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß nur natives HSP25 aus EAT, aber nicht rekombinantes HSP25 oder HSP25-Mutanten die Actinpolymerisation hemmen. Dies bestätigt den Befund, daß nur unphosphorylierte native HSP25-Monomere für die Inhibierung der Actinpolymerisation verantwortlich sind.
• Es konnten zwei HSP25-Peptide identifiziert werden, die eine Hemmung der Actinpolymerisation auslösen. Damit konnte erstmals experimentell nachgewiesen werden, daß bestimmte Sequenzabschnitte von HSP25 eine spezifische Wechselwirkung mit Actin eingehen. Mit Hilfe phosphorylierter HSP25-Peptide konnte die Abhängigkeit dieser Reaktion vom Phosphorylierungszustand bestätigt werden.
• Vorläufige Ergebnisse mit Zellulose-gebundenen Peptid-Bibliotheken deuten auf eine Wechselwirkung von HSP25 mit einem exponierten Loop in Actin-Domäne IV hin, einem Bereich, der an Actin-Actin-Wechselwirkungen beteiligt ist.
• HSP25 hat aufgrund seiner verstärkten Synthese bei vielen pathologischen Prozessen eine medizinische Relevanz. Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen zeigen, daß es bei Hypertonie-belasteten Herzen verstärkt im rechten Ventrikel akkumuliert wird.
• Es wird ein Modell vorgestellt, in dem die Struktur-Funktions-Beziehungen für HSP25 zusammengefaßt sind.

Schlagwörter:
Hitzeschock-Proteine, Struktur, Actin, Peptide

Tabellenverzeichnis
Tab. 1:	Aufreinigungsschritte bei der Actin-Präparation
Tab. 2:	Pippetierschema für 10 SDS-Gradientengele bzw. 2 Sammelgele
Tab. 3:	Bilanz einer repräsentativen HSP25-Präparation Eine typische Präparation umfaßte etwa 8 x 109 EAT-Zellen.
Tab. 4:	Statistische Auswertung der Partikelgrößen von HSP25-Wildtyp und -Mutanten Ausgewertet wurde der einer Fläche von 1 µm² entsprechende Bereich einer repräsentativen elektronenmikroskopischen Aufnahme der jeweiligen Mutante. Insgesamt wurden 3156 (wt), 4838 (S15D), 6363 (S78,82D), 8113 (S15,78,82D) bzw. 7709 (HSP25-P) Komplexe detektiert. Die fünf Klassen mit der größten Anzahl von Partikeln jeder HSP25-Spezies sind grau unterlegt.
Tab. 5:	Peptid-Bibliothek der HSP25-Sequenz Peptid 1 repräsentiert den N-Terminus und Peptid 22 den C-Terminus des Proteins. Die Peptide haben überlappende Enden von 4-7 Aminosäuren und wurden bis auf die Peptide 1, 2 und 10 als 15mer synthetisiert. Die nicht mit Nachbarpeptiden überlappenden Regionen sind durch Fettdruck hervorgehoben.
Tab. 6:	Vergleich der vom Maus HSP25 Peptid 11 abgeleiteten Sequenzen Die Peptide wurden entsprechend der HSP25-Sequenz verschiedener Spezies (Maus, Mensch und Huhn) und der Maus B-Crystallin-Sequenz synthetisiert. N- bzw. C-terminale Verkürzungen oder Verlängerungen, ausgehend vom Peptid 11 der Maus, spiegeln sich in der Bezeichnung der Peptide wider. Die Nummern geben die Position der N-terminalen (links) und der C-terminalen (rechts) Aminosäuren der Peptide im Protein an. Die Effektivität der Peptide im Actinpolymerisationsexperiment ist durch relative Werte im Vergleich zum Peptid 11 angegeben. Die Angaben in Klammern beziehen sich auf die phosphorylierte Variante des Peptids (P). Die jeweils phosphorylierten Serinreste sind in der Sequenz durch Unterstreichung und Fettdruck markiert.
Tab. 7:	Hydrodynamische Parameter einiger HSP25-Peptide Mth = theoretisches Molekulargewicht, Mex = experimentell bestimmtes Molekulargewicht, s = Sedimentationskoeffizient, D = Diffusionskoeffizient, = partielles spezifisches Volumen, f/f0 = Reibungsverhältnis, V = Volumen
Tab. 8:	Sequenzen der mit HSP25 wechselwirkenden Actin-Peptide Aufgelistet sind die Sequenzen der detektierten Peptide wie in Abb. 3.15 dargestellt. Die Nummern entsprechen den Peptiden der Actin-Bibliothek (siehe Tab. 7.3 im Anhang). Die Konsensusmotive der beiden detektierten Sequenzbereiche sind durch Einrahmung her-vorgehoben.
Tab. 10:	Gehalt an HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von normotonen (WKY) und spontan hypertensiven Ratten (SHRSP) Die Mengen sind Mittelwerte von jeweils drei Tieren. Die relative Menge an HSP70 in den Proben bezieht sich auf die in 10 µl EAT-Standard enthaltene Menge an HSP70.
Tab. 11:	Gehalt an HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von Goldblatt-operierten (2K1C) und scheinoperierten Sprague-Dawley-Ratten (SD) Die Mengen sind Mittelwerte von jeweils drei Tieren. Die relative Menge an HSP70 in den Proben bezieht sich auf die in 10 µl EAT-Standard enthaltene Menge an HSP70.
Tab. 12:	Tier- und Herzgewichte von TGR(mREN2)27- und Sprague-Dawley-Ratten (SD)
Tab. 13:	Gehalt an HSP25 und HSP70 in Ventrikeln von TGR(mREN2)27- und Sprague-Dawley-Ratten (SD) Die Zahl in Klammern gibt die Anzahl der gemittelten Werte wieder. Die relative Menge an HSP70 in den Proben bezieht sich auf die in 10 µl EAT-Standard enthaltene Menge an HSP70.
Tab. 14:	Relative Unterschiede im HSP-Gehalt von Herzgewebe und Aorta zwischen normotonen und hypertonen Ratten der drei Hypertonie-Modelle Zugrunde gelegt wurden die Mittelwerte der Mengen an HSP25 bzw. HSP70, wie sie in den Tabellen 3.7 bis 3.9 aufgelistet sind. Bezugspunkt ist jeweils der Mittelwert der Proben der normotonen Tiere. n.b. = nicht bestimmt.
Tab. 15:	Abkürzungen der Aminosäuren
Tab. 16:	Sequenzen der Zellulose-gebundenen HSP25-Peptid-Bibliothek (HSP25 der Maus)
Tab. 17:	Sequenzen der Zellulose-gebundenen Actin-Peptid-Bibliothek (humanes -Skelett-muskel-Actin)

Abbildungsverzeichnis
Abb. 3.1:	FPLC-Chromatogramme der Aufreinigungsschritte des nativen HSP25 Trennung der Präparate nach: A, DEAE52-Säule; B, Hydroxylapatit-Säule; C, Mono Q-Säule. In den Elutionsprofilen sind die Absorption der Eluate bei 280 nm (\|[boxh ]\|) und der Verlauf des Gradienten (---) aufgezeichnet. Die gekennzeichneten Flächen im Elutionsprofil markieren die zur weiteren Aufreinigung verwendeten Fraktionen. Dabei entspricht jede senkrechte Linie einer Fraktion.
Abb. 3.2:	Proteinmuster der Proben und Nachweis von HSP25 nach den einzelnen Reinigungsschritten SDS-PAGE (oben) und Western-Blot (unten) der Präparate nach der Lyse der EAT-Zellen (Bahn 1), Ammoniumsulfat-Fällung (Bahn 2), DEAE-Zellulose-Säule (Bahn 3), Hydroxylapatit-Säule (Bahn 4) und Mono Q-Säule (Bahn 5). Der Pfeil markiert die Position der HSP25-Bande.Abb. 1:
Abb. 3.3:	Elektronenmikroskopische Darstellung von nativem HSP25 A, niedermolekulares HSP25. B, HSP25-Komplexe. Die Meßbalken weisen eine Länge von 50 nm auf. Vergrößerung 235.000 x.
Abb. 3.4:	Ergebnisse der Strukturanalyse der negativ kontrastierten HSP25-Komplexe A, Galerie charakteristischer Ansichten von HSP25-Komplexen. Die Ansichten entsprechen aufsummierten und gemittelten Einzelbildern. B, Die ersten 12 Eigen-Bilder, die bei der Bildverarbeitung generiert wurden. Die Symmetrie-Eigenschaften des Datensatzes treten in der mittleren und unteren Reihe zutage.
Abb. 3.5:	Grafiken zur Bestimmung der Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten Alle Diffusionsexperimente wurden bei einer Drehzahl von 6.000 U/min durchgeführt. XWP steht für den Betrag der Verbreiterung der wandernden Grenzschicht am 16 bzw. 84%-Wert des Plateaus. A, Bestimmung des Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten des Überstands der HSP25-Präparation. Die Rotorgeschwindigkeit für die Sedimentation betrug 40.000 U/min. B, Bestimmung des Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten von Fraktion 2. Die Rotorgeschwindigkeit für die Sedimentation betrug 30.000 U/min. C, Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten von Fraktion 2 () und 3 (). Die Trennung der beiden Fraktionen war nach ca. 50 min möglich. Die Rotorgeschwindigkeit betrug 20.000 U/min. D, Bestimmung des Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten von Fraktion 4. Die Rotorgeschwindigkeit für die Sedimentation betrug 20.000 U/min.
Abb. 3.6:	Strukturmodell für die aus EAT-Zellen aufgereinigten HSP25-Komplexe Modelle der dreidimensionalen Struktur der HSP25-Komplexe mit den dazugehörigen experimentell (ohne Klammern) und rechnerisch (in Klammern) bestimmten Parametern. Die Dimension [F] steht für 10-7cm2/s, _ für Durchmesser und h für Höhe. n.b. = nicht bestimmt.
Abb. 3.7:	Elektronenmikroskopische Darstellung von rekombinantem murinem HSP25 A, HSP25-Wildtyp. B, HSP25-C18-Mutante. Die Proteinkonzentration betrug bei beiden Präparaten 0,1 mg/ml. Die Meßbalken weisen eine Länge von 50 nm auf. Vergrößerung 270.000 x.
Abb. 3.8:	Elektronenmikroskopische Darstellung von rekombinantem menschlichem HSP25 A, HSP25-Wildtyp. B, HSP25-S15D. C, HSP25-S78,82D. D, HSP25-S15,78,82D. E, phosphoryliertes wt-HSP25. Die Proteinkonzentration betrug bei allen Präparaten 0,1 mg/ml. Die Meßbalken weisen eine Länge von 50 nm auf. Vergrößerung 270.000 x.
Abb. 3.9:	Hemmung der Actinpolymerisation durch kHSPs und HSP25-Mutanten A, Actinpolymerisation (50 µg/ml G-Actin = 1,16 µM) ohne (Kurve 1) oder mit 4,3 µg/ml (= 0,1 µM) Actin-Keimen (Kurve 2). B, Actinpolymerisation (50 µg/ml G-Actin) unbeeinflußt (Kurve 1) oder in Anwesenheit eines zweifachen molaren Überschusses an nativem HSP25 (Kurve 2). C, Actinpolymerisation (50 µg/ml G-Actin) unbeeinflußt (Kurve 1) oder in Anwesenheit eines 20-fachen molaren Überschusses an humanem HSP25 (Kurve 3), murinem HSP25-C18 (Kurve 2, nur 10-facher Überschuß) bzw. humanem HSP25-S15,78,82D (Kurve 4).
Abb. 3.10:	Einfluß von HSP25 Peptid 6 und 11 auf die Actinpolymerisation A, Actinpolymerisation (2µM G-Actin) in Abwesenheit (Kurve 1) oder Anwesenheit von 16 µM Peptid 11 (Kurve 3) oder 16 µM Peptid 6 (Kurve 2). B, Actinpolymerisation in Anwesenheit von 0-, 4-, 8-, 12- und 16- fachem molaren Überschuß von Peptid 6 zu G-Actin (2 µM), Actinpolymerisation in Anwesenheit von 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 und 10-fachem molaren Überschuß von Peptid 11 zu G-Actin (2 µM). D, prozentuale Hemmung der Actinpolymerisation bei verschiedenen molaren Verhältnissen von Peptid 6 () und Peptid 11 () zu G-Actin. Die Daten ergeben sich aus dem Anstieg der in Teil B und C dargestellten Kurven.
Abb. 3.11:	Darstellung des Einflusses von HSP25 Peptid 11 auf die Actinpolymerisation mittels Elektronenmikroskopie A, Actinpolymerisation (1 µM) in Abwesenheit (A) und in Anwesenheit von 10 µM Peptid 11 (B). Die Meßbalken weisen eine Länge von 200 nm auf. Vergrößerung, x 90 000.
Abb. 3.12:	Einfluß verschiedener Peptid 11-Abkömmlinge auf die Actinpolymerisation A, Actinpolymerisation (2 µM G-Actin) ohne Peptide (Kurve 1) oder in Gegenwart von 80 µM der verkürzten Peptide 11N3 (Kurve 2), 11C6 (Kurve 3), 11N2 (Kurve 4), 11N9 (Kurve 5), 11C4 (Kurve 6), 11N6 (Kurve 7) und 11N1 (Kurve 8). B, Actinpolymerisation (2 µM G-Actin) ohne Peptide (Kurve 2) oder in Gegenwart von 40 µM der zu Peptid 11 homologen Peptide des B-Crystallins (11B, Kurve 1), des menschlichen HSP25 (11Hu, Kurve 3), des HSP25 des Huhns (11Ch, Kurve 5) und des Zufallspeptids (11rm, Kurve 4) sowie in Gegenwart von 80 µM des Huhn-Peptids (11Ch, Kurve 6). C, Actinpolymerisation (2 µM G-Actin) ohne Peptide (Kurve 1) oder in Gegenwart von 20 µM der verlängerten Peptide 11Hu+N16P (Kurve 2), 11Hu+N16 (Kurve 3), 11B+N15P (Kurve 4) 11+N16P (Kurve 5), 11+N16 (Kurve 6) und 11B+N15 (Kurve 7). Die Kurven sind Repräsentanten aus 3 bis 5 unabhängigen Versuchen.
Abb. 3.13:	Vergleich der Sequenzen von Maus-, Mensch- und Huhn-HSP25 sowie von Maus-B-Crystallin. Alle Sequenzen stammen aus der SWISSPROT Datenbank. Sie wurden mit dem Programm MSA (Lipman et al., 1989) aligniert und von Hand nachgebessert. In der Consensus-Reihe sind die Reste, die in allen vier Sequenzen identisch sind, mit Großbuchstaben und die Reste, die in drei von vier Sequenzen identisch sind, mit Kleinbuchstaben vertreten. Die geschlossenen Pfeile deuten auf die Phosphorylierungsstellen des murinen HSP25 und der offene Pfeil auf die zusätzliche Phosphorylierungsstelle beim menschlichen HSP25. Die Peptid 6 und 11 umfassenden und getesteten Sequenzen sind durch Fettdruck hervorgehoben. Das Doppelkreuz kennzeichnet den Beginn der konservierten -Crystallin-Domäne (de Jong et al., 1993; Caspers et al., 1995) und die Sterne die hoch konservierten Regionen nach Singh et al. (1995). Die Quellen der Sequenzen sind: Mus musculus-HSP25 (Gaestel et al., 1989) korrigiert von Gaestel et al. (1993), Homo sapiens-HSP25 (Hickey et al., 1986) korrigiert von Carper et al. (1990), Gallus gallus-HSP25 (Miron et al., 1991) und Mus musculus-B-Crystallin (Datenbanknummer P23927).
Abb. 3.14:	Konzentrationsverteilungskurven von Actin und Peptid 11 Radiale Konzentrationsverteilungen von Actin und Peptid 11 bei einem 5-fachen molaren Überschuß an Peptid unter Sedimentations-Gleichgewichts-Bedingungen, aufgezeichnet bei 280 nm (), 285 nm () und 290 nm (). Die partiellen Konzentrationen des Actin/Peptid-Komplexes (Kurve 1), der freien Actins (Kurve 2) und des freien Peptids (Kurve 3 ) für die bei 280 nm aufgezeichnete Konzentrationsverteilung wurden wie in Kapitel 2.8 beschrieben ermittelt.
Abb. 3.15:	Nachweis von HSP25 nach der Inkubation auf der Actin-Membran Die Nummern entsprechen den Peptiden der Actin-Bibliothek (siehe Tab. 7.3 im Anhang).
Abb. 3.16:	Nachweis von HSP25 in Gewebeproben von normotonen (WKY) und spontan hypertensiven Ratten (SHRSP) Western-Blots der getesteten Gewebe. N = normoton (WKY-Tier), H = hyperton (SHRSP-Tier).
Abb. 3.17:	Nachweis von HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von normotonen (WKY) und spontan hypertensiven Ratten (SHRSP) Western-Blots der Gewebeproben. In der jeweils unteren Reihe ist der HSP25-Nachweis und in der oberen Reihe der HSP70-Nachweis gezeigt. Die fünf Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 7,8 ng bis 19,6 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt.
Abb. 3.18:	Nachweis von HSP25 in linken (l.) und rechten (r.) Ventrikeln von Goldblatt-operierten (2K1C) und scheinoperierten Sprague-Dawley-Ratten (SD) nach verschiedenen Zeiten Western-Blots der Gewebeproben. Die drei Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 9,8 ng bis 31,3 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt.
Abb. 3.19:	Nachweis von HSP25 und HSP70 in Gewebeproben von Goldblatt-operierten (2K1C) und scheinoperierten Sprague-Dawley-Ratten (SD) Western-Blots der Gewebeproben 4 Wochen nach der Operation. In der jeweils unteren Reihe ist der HSP25-Nachweis und in der oberen Reihe der HSP70-Nachweis gezeigt. Die 5 Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 7,8 ng bis 19,6 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt.
Abb. 3.20:	Nachweis von HSP25 und HSP70 in Ventrikeln von TGR(mREN2)27- und Sprague-Dawley-Ratten (SD) Western-Blots der Gewebeproben. In der jeweils unteren Reihe ist der HSP25-Nachweis und in der oberen Reihe der HSP70-Nachweis gezeigt. Die 5 Standards weisen einen HSP25-Gehalt von 7,8 ng bis 19,6 ng im EAT-Zell-Lysat auf. Der Absolutgehalt an HSP70 wurde nicht bestimmt. Jeweils zusammengehörende Präparate einer Ventrikelprobe zur Doppelbestimmung der HSP25-Menge sind durch einen Balken gekennzeichnet.
Abb. 4.1:	Struktur von monomerem Actin Darstellung der Kontaktstellen des Actin-Monomers nach Kabsch et al. (1990) mit anderen Monomeren im Actinfilament (modifiziert auf der Grundlage einer Zeichnung von dos Remedios und Moens, 1995). Die schwarzen Bänder repräsentieren die Kontaktstellen und die weißen Zahlen darin deuten die Aminosäuren an, die den Anfangs- und Endpunkt der Kontakte bilden. Die durchgezogene Linie kennzeichnet die Trennung der sogenannten `großen´ (links) von der `kleinen´ (rechts) Untereinheit. Die gestrichelten Linien markieren die Aufteilung dieser Untereinheiten in die vier Domänen. Die Pfeile deuten auf die Bereiche des Actin-Moleküls, die nach den Ergebnissen des Peptid-Epitop-Scannings als Interaktionsbereiche mit HSP25 in Frage kommen.
Abb. 4.2:	Modell der Struktur-Funktionsbeziehungen von HSP25 Erläuterungen siehe Text.

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