v. Wintzingerode-Knorr, Friedrich Wasmuth Lotar: Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität einer anaeroben, Trichlorbenzol-dechlorierenden Mischkultur

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Kapitel 1. EINLEITUNG

1.1. Chlorbenzole in der Umwelt

Die chlorierten Derivate des Benzols bilden eine Gruppe chemisch stabiler, farbloser, angenehm riechender Verbindungen. Die sechs Wasserstoffatome des Benzolringes können durch Chlor substituiert werden, was zur Bildung zwölf verschiedener Chlorbenzole führt.

Seit 1909 erfolgt die industrielle Produktion von Chlorbenzolen. Nach dem Verbot der kommerziellen Nutzung von Hexachlorbenzol, das hauptsächlich als aktive Substanz in Fungiziden eingesetzt wurde, besitzen heute ausschließlich die Mono-, Di- und Trichlorbenzole eine industrielle Anwendungen. Die jährlich in den USA hergestellten 168000 bzw. 96700 Tonnen Mono- bzw. Dichlorbenzol (Stand 1989) werden für die Synthese chemischer Substanzen wie Chlornitrobenzol, Diphenylether und Sulfonpolymere eingesetzt oder dienen als Intermediate bzw. Lösungsmittel in der Produktion von Pestiziden, Pharmazeutika und Kunststoffen. Trichlorbenzole werden vornehmlich für die Herstellung von Farbstoffen, Pestiziden und dielektrischen Flüssigkeiten oder als Farbstoffträger in der Textilfärbung verwendet (USEPA, 1994).

Abb. 1.1.1 Strukturdarstellung chlorierter Benzole mit industrieller Anwendung. Die isomeren Formen des 1,2-Dichlorbenzols (1,3-DCB und 1,4-DCB) und die des 1,2,3-Trichlorbenzols (1,2,4-TCB und 1,3,5-TCB) sind nicht gezeigt


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Chlorbenzole gelangen sowohl auf direktem Weg bei der Anwendung chlorbenzolhaltiger Produkte wie Holzschutzmittel, Raumluftdeodorants oder Lösungsmittel als auch indirekt durch prozessbedingte Leckagen bei der Herstellung und Weiterverarbeitung in die Umwelt. Daneben kann ein diffuser Eintrag bei der Behandlung von Abwässern und kontaminierten Böden sowie der Verbrennung von Altöl erfolgen (USEPA, 1994). Die hohen Produktionszahlen, vielfältigen Emissionsquellen und eine geringe Reaktivität bzw. biologische Abbaubarkeit führen zu einer ubiquitären Kontamination der Umwelt mit Chlorbenzolen. So werden chlorierte Benzole in Grund- und Oberflächenwässern, in Sedimenten, in landwirtschaftlich genutzten Böden und in der Atmosphäre gefunden (Williams et al., 1997; Oliver und Nicol, 1982; Wang et al., 1995; Hermanson et al., 1997).

Alle chlorierten Verbindungen des Benzols sind in Wasser schwer löslich und besitzen eine gute Fettlöslichkeit, die mit dem Chlorierungsgrad zunimmt. Dies führt zu einer Bioakkumulation in pflanzlichem und tierischem Gewebe (Oliver und Nicol, 1982; Beyer, 1996; Tam et al., 1996). Beim Menschen erfolgt eine Aufnahme über die Nahrung oder die Haut. Bei einer Untersuchung zur Belastung von US-Bürgern mit 1,4-DCB zeigten 98% der Probanden nachweisbare Mengen 1,4-DCB bzw. des Metaboliten 2,5-Dichlorphenol in Blut- und Urinproben (Hill et al., 1995). Diese Bioakkumulation von Chlorbenzolen ist mit einer Toxizität verbunden, die sich in Tier- und Zellkulturversuchen z.B. durch eine Reduktion der Wachstumsrate (Chaisuksant et al., 1998) und eine karzinogene Wirkung zeigt (Bomhard et al., 1988; Canonero et al., 1997; Gustafson et al., 1998). Sowohl Bioakkumulationsfaktoren als auch Toxizität steigen mit zunehmendem Chlorierungsgrad (Malle, 1984; USEPA, 1994).

1.2. Mikrobielle Dehalogenierung chlororganischer Verbindungen

Chlorierte organische Verbindungen antropogenen Ursprungs gelten unter natürlichen Bedingungen als schwer abbaubar. Dabei wird die Abbaubarkeit sowohl von der Anzahl als auch der Position der Chlorsubstituenten beeinflusst. Aufgrund der Elektronegativität des Chloratoms ist eine Oxidation des Kohlenstoffgerüstes durch Sauerstoff erschwert. Dies gilt vor allem für chlororganische Verbindungen mit mehr als einem Chlorsubstituenten. Hinzu kommt, daß bei chlorierten Benzolen die Resonanzenergie des Benzolringes eine Verkürzung der Kohlenstoff-Chlor Bindung und damit eine Erhöhung der Bindungsstärke bewirkt. Dennoch kann die Chlor-


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Kohlenstoff Bindung unter aeroben Bedingungen durch eine Reihe von Enzymen gespalten werden (zur Übersicht s. Fetzner und Lingens, 1994).

So können etwa sowohl chloraliphatische als auch chloraromatische Kohlenwasserstoffe durch Halidohydrolasen nach der folgenden Formel hydrolytisch gespalten werden (Fetzner und Lingens, 1994; Janssen et al., 1994):

R-Cl + H2O rarr R-OH + H+ + Cl -

Die Chlor-Kohlenstoff Bindung kann aber auch durch nukleophilen Angriff eines Thiols in einer Alkyl-Transferase-Reaktion übertragen werden. Ein gut untersuchtes Beispiel ist die Glutathion-S-Transferase-Reaktion, bei der der Alkylrest auf Glutathion übertragen wird (Fetzner und Lingens, 1994):

R-Hal + X-H rarr R-X + H+ + Cl -

Für chlorierte Benzole sind zwei aerobe Dechlorierungsreaktionen beschrieben. Bei der ”oxygenolytischen Dechlorierung“ wird durch Anlagerung von Sauerstoff ein unstabiles Diol gebildet, das durch spontane Chlorideliminierung zum Chlorcatechol rearomatisiert (Beil et al., 1997):

Cl4-Benzol + O2 + 2H rarr Cl4-C6-2OH rarr Cl3-Catechol + H+ + Cl -

intermediäres Diol

Bei der ”Dechlorierung nach Spaltung des aromatischen Ringes“ erfolgt keine spontane Dechlorierung des intermediären Diols sondern eine Dehydrogenierung zum Cl4-Catechol. Dieses wird anschließend durch erneute Oxygenierung unter Aufspaltung des aromatischen Ringes dechloriert (Potrawfke et al., 1998). Neben Untersuchungen zum aeroben Abbau von MCB (Nishino et al. 1992) und DCB (Spain und Nishino,1987) ist bisher eine aerobe Dechlorierung höher chlorierter Benzole für 1,2,4-TCB (van der Meer et al., 1987), 1,2,3,4-TeCB (Potrawfke et al., 1998) und 1,2,4,5-TeCB (Beil et al., 1997) beschrieben.


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Unter anaeroben Bedingungen können chloraliphatische und chloraromatische Kohlenwasserstoffe durch eine reduktive Spaltung der Chlor-Kohlenstoff Bindung dechloriert werden (reduktive Dechlorierung). Die reduktive Dechlorierung erfolgt entweder kometabolisch oder metabolisch in einer spezifischen Reaktion, die mit einem Energiegewinn für die Zelle verbunden ist. Bisher sind zwei Formen einer metabolischen, reduktiven Dechlorierung unter anaeroben Bedingungen beschrieben: (i) Die reduktive Abspaltung des Chlorsubstituenten von C2 und C3 Halokarbonsäuren wird von einer phototrophen Assimilierung der gebildeten Karbonsäure gefolgt. Dieses phototrophe Wachstum mit chlorierten aliphatischen Verbindungen ist bisher lediglich bei einigen schwefelfreien Purpurbakterien beobachtet worden (McGrath und Harfoot, 1997). (ii) Die reduktive Dechlorierung erfolgt als respiratorischer Prozeß, die sog. Halorespiration. Dabei dient die chlorierte Verbindung als terminaler Elektronenakzeptor in einer anaeroben Atmungskette (Wohlfarth und Diekert, 1997). Neben der reduktiven Dechlorierung ist die Alkyl-Transfer Reaktion als zweite anaerobe Dechlorierungsreaktion beschrieben (s. Abb. I.2.1). Sie ist ebenso wie die Halorespiration und das anaerobe, phototrophe Wachstum auf Halocarbonsäuren ein metabolischer Prozeß (Wohlfarth und Diekert, 1997).

Reduktive Dechlorierung

Als reduktive Dechlorierung bezeichnet man die Abspaltung eines Chlorsubstituenten von einem Kohlenstoffgerüst unter gleichzeitiger Übertragung von Elektronen. Nach Mohn und Tiedje (1992) kann die reduktive Dechlorierung durch zwei verschiedene chemische Mechanismen erfolgen: (i) Bei der Hydrogenolyse wird ein Chlorsubstituent durch ein Wasserstoffatom ersetzt. (ii) In der vicinalen Reduktion oder Dihaloelimination werden zwei Chlorsubstituenten von benachbarten Kohlenstoffatomen einer aliphatischen Verbindung abgespalten und eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen gebildet. Während die vicinale Reduktion nur für die kometabolische Umsetzung von 1,2-Dichlorethan zu Ethen durch methanogene Archaea beschrieben ist, wird eine Vielzahl chlorierter Alkyl- und Arylverbindungen durch eine Hydrogenolyse reduktiv dechloriert (zur Übersicht s. Holliger und Schraa, 1994). Holliger und Schraa (1994) postulieren, daß eine Arylhydrogenolyse und somit auch die reduktive Dechlorierung chlorierter Benzole, ausschließlich metabolisch als Halorespiration verläuft. Demgegenüber kann eine


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Alkylhydrogenolyse sowohl kometabolisch als auch metabolisch erfolgen. Eine gute Zusammenfassung der zahlreichen anaeroben oder fakultativ anaeroben Bakterien und Archaea, die eine kometabolische Alkylhydrogenolyse durchführen, wird durch Holliger und Schraa (1994) und El Fantroussi et al. (1998) gegeben. Die reduktive Dechlorierung ist als initaler Schritt in der anaeroben Degradation chlororganischer Verbindungen anzusehen (Sharak-Genthner et al., 1989; Häggblom et al., 1996). Diese Biodegradation ist mit Ausnahme der oben genannten Assimilierung chlorierter Karbonsäuren durch phototrophe Bakterien das Ergebnis einer Syntrophie, d.h. einer engen Interaktion zwischen verschiedenen Mikroorganismen zum wechselseitigen Nutzen. Das am besten untersuchte Beispiel ist das anaerobe Wachstum einer definierten methanogenen Mischkultur mit 3-Chlorbenzoat (zur Übersicht s. Mohn und Tiedje, 1992). Dieses Konsortium besteht neben dem dechlorierenden Bakterium Desulfomonile tiedjei aus dem Benzoat-vergärenden Bakterium Stamm BZ-2 und dem H2-verbrauchenden methanogenen Archaeon Methanospirillum sp. In syntropher Wechselwirkung erfolgt die reduktive Dechlorierung von 3-Chlorbenzoat durch D. tiedjei, die Vergärung des gebildeten Benzoats durch Stamm BZ-2 und ein Verbrauch des aus der Benzoatvergärung gebildeten Wasserstoffs sowohl durch D. tiedjei als auch durch Methanospirillum sp. Durch den kontinuierlichen Verbrauch von Wasserstoff wird wiederum der für die Benzoatvergärung notwendige niedrige Wasserstoffpartialdruck gewährleistet. Methanospirillum sp. bzw. D. tiedjei nutzen den Wasserstoff als Elektronendonor für die Bildung von Methan bzw. die reduktive Dehalogenierung. Zwischen beiden Organsimen herrscht kein Wettbewerb um Wasserstoff, vielmehr stimuliert ihre Kombination die Benzoatvergärung und somit die Wasserstoffbildung. Neben diesen Nährstoffflüssen wird die Synthese und Bereitstellung von Vitaminen durch Stamm BZ-2 und Methanospirillum sp. vermutet, die eine Dechlorierung durch D. tiedjei ermöglichen.

Alkyl-Transfer Reaktion

Diese anaerobe Dechlorierungsreaktion ist nur für die zwei strikt anaeroben, homoacetogenen Bakterien Dehalobacterium formicoaceticum, Stamm DMC (Mägli et al., 1996) und ”Acetobacterium dehalogenans“, Stamm MC (Traunecker et al., 1991) beschrieben. Diese Organismen nutzen Di- bzw. Chlormethan als Energie- und Kohlenstoffquelle, indem sie die Alkylgruppe der chlorierten Methane auf Kohlendioxid übertragen. Vermutlich stehen auch Organismen, die eine Alkyl-


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Transfer Reaktion durchführen in syntropher Wechselwirkung mit begleitenden nicht dechlorierenden Mikroorganismen. Dies wird aus der wesentlich längeren Wachstumszeit von D. formicoaceticum gegenüber der ursprünglichen Zweikomponentenkultur DC deutlich, aus der D. formicoaceticum isoliert wurde (zur Übersicht s. El Fantroussi et al., 1998).

Abb.1.2.1 Graphische Darstellung der bei anaeroben oder fakultativ anaeroben Mikroorganismen beobachteten Strategien zur Dechlorierung chloraliphatischer (Alkyl-) und chloraromatischer (Aryl-) Verbindungen.


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Im Gegensatz zu Mikroorganismen, die chlororganische Verbindungen kometabolisch dechlorieren, können solche, die eine metabolische Dechlorierungsreaktion durchführen, gezielt angereichert und kultiviert werden. Aufgrund der syntrophen Wechselwirkungen zwischen anaeroben dechlorierenden Bakterien und begleitenden Mikroorganismen, den allgemeinen technischen Schwierigkeiten bei der Kultivierung anaerober Bakterien und der Toxizität sowie geringen Wasserlöslichkeit einiger chlororganischer Verbindungen ist jedoch die Zahl entsprechender Isolate gering (s. Tab. 1.2.1). Die Isolierung einer halorespirierenden Reinkultur, die chlorierte Benzole als terminalen Elektronenakzeptor nutzt, ist bisher nicht publiziert. Wenngleich in den letzten drei Jahren wichtige Erkenntnisse zur Biochemie der Halorespiration und Alkyl-Transferase Reaktion gesammelt werden konnten (zur Übersicht s. Wohlfarth und Diekert, 1997), existieren nahezu keine publizierten Daten zur Genetik der beteiligten Enzymsysteme.

Tab. 1.2.1 Anaerobe Bakterien, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur metabolischen Dechlorierung aus der Umwelt isoliert wurden (erweitert nach El Fantroussi et al., 1998).

Organismus

Chlor-Verbindunga

Referenz

Desulfomonile tiedjei

3-CBe

DeWeerd et al. (1990)

Desulfitobacterium dehalogenans

3-Cl-4-OHPA; 2,4-DCP

Utkin et al. (1994)

Desulfitobacterium sp., PCE1

2,4,6-TCP; PCE

Gerritse et al. (1996)

Desulfitobacterium hafniense

3-Cl-4-OHPA

Christiansen und Ahring (1996)

Desulfitobacterium chlororespirans

3-Cl-4-OHPA; 2,3-DCP

Sanford et al. (1996)

Desulfitobacterium frappieri

PCP

Bouchard et al. (1996)

Isolat TT4B

PCE, TCE

Krumholtz et al. (1996)

Isolat 2 CP-1

2-CP

Cole et al. (1994)

Dehalospirillum multivorans

PCE

Scholtz-Muramatsu et al. (1995)

Dehalobacter restrictus

PCE

Holliger et al. (1998)

Dehalobacter sp., TEA

PCE, TCE

Wild et al. (1996)

Dehalococcoides ethenogenes

PCE

Maymó-Gatell et al. (1997)

Acetobacterium dehalogenans“ *

CM

Traunecker et al. (1991)

Dehalobacterium formicoaceticum *

DCM

Mägli et al. (1996)

aCBe: Chlorbenzoat. 3-Cl-4-OHPA: 3-Chlor-4-Hydroxyphenylacetat. CP: Chlorphenol. DCP: Dichlorphenol. TCP: Trichlorphenol. PCE: Tetrachlorethen. TCE: Trichlorethen. CM: Chlormethan. DCM: Dichlormethan. *: Diese Stämme führen eine Alkyl-Transferase Reaktion durch.


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1.3. Einsatz mikrobieller Konsortien in Bioreaktoren zur anaeroben Dechlorierung chlororganischer Verbindungen

Undefinierte mikrobielle Mischkulturen, die im folgenden als mikrobielle Konsortien bezeichnet werden, sind bereits in zahlreichen Untersuchungen zur anaeroben Dechlorierung von chlororganischen Verbindungen mittels Bioreaktoren eingesetzt worden. So konnten etwa die in der anaeroben Abwasserbehandlung häufig eingesetzten UASB-Reaktoren (”Upflow Anaerobic Sludge Blanket“) zur anaeroben Dechlorierung chlorierter Phenole verwendet werden, nachdem sie mit Anreicherungskulturen bzw. adaptierten Sedimenten oder Klärschlämmen inokuliert wurden (zur Übersicht s. Christiansen et al., 1995). Weitere Arbeiten beschreiben den Einsatz immobilisierter mikrobieller Konsortien in einem Wirbelschichtreaktor (Flora et al., 1994) und einem Festbettreaktor (Boucquey et al., 1995) zur anaeroben Dechlorierung von Chlorphenolen bzw. eines Gemisches chloraliphatischer Verbindungen. In diesen Untersuchungen und in der Arbeit von Woods et al. (1989) erfolgte die anaerobe Dechlorierung in wässrigen Lösungen, die die Zusammensetzung industrieller Abwässer imitierten. Mikrobielle Konsortien sind für eine Dechlorierung industrieller Abwässer oder kontaminierter Grundwässer möglicherweise besser geeignet als Reinkulturen dechlorierender Mikroorganismen, da diese nach längerer Betriebszeit der Bioreaktoren durch autochthone Mikroorganismen verdrängt werden können (Massol-Deyá et al., 1997; Jones et al., 1998). Die unbekannte Zusammensetzung mikrobieller Konsortien kann jedoch den Einsatz bei der Dechlorierung einschränken, da das aktive Konsortium als undefiniertes System oder ”black box“ betrachtet werden muß und so eine gezielte Steuerung oder Optimierung der Bioreaktoren erschwert ist.

In der Literatur sind eine Reihe anaerober mikrobieller Konsortien beschrieben, die chlorierte Benzole reduktiv dechlorieren (Bosma et al., 1988; Holliger et al., 1992; Ramanand et al., 1993; Nowak et al., 1996; Middeldorp et al., 1997). Die kontinuierliche Kultivierung in einem Bioreaktor ist bisher jedoch nur für eines dieser Konsortien beschrieben (Nowak, 1994; Nowak et al., 1996). Die mikrobiologische Analyse dieser Bioreaktorkultur ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit.


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1.4. Kulturunabhängige, molekulare Analyse mikrobieller Diversität

Der Begriff ”Biodiversität“ umschreibt in seiner einfachsten Definition die Vielfalt aller Lebensformen, d.h. die der meist einzelligen Mikroorganismen und der mehrzelligen höheren Organismen. Unsere bisherigen Einsichten in biologische Diversität beruhen jedoch überwiegend auf der Analyse höherer Lebensformen und klammern die Vielfalt mikrobiellen Lebens nahezu vollständig aus. Dies wird am eindruckvollsten durch die etwa 500.000 beschriebenen Insektenspezies dokumentiert, denen nur etwa 5000 beschriebene nicht-eukaryotische Mikroorganismen gegenüberstehen (Bull et al., 1992; Pace, 1997). Die Gründe für unsere unzureichende Kenntnis mikrobieller Diversität liegen zweifelsohne in der geringen Größe von Mikroorganismen und dem Mangel an unterscheidbaren Morphotypen, so daß eine mikroskopische Differenzierung nicht gelingt. Die in-vitro Kultivierung von Mikroorganismen ermöglicht zwar eine weitreichende phänotypische und genotypische Charakterisierung und Identifizierung, führte jedoch in der Vergangenheit zu der Verzerrung natürliche mikrobielle Populationen ausschließlich anhand der Fraktion in-vitro kultivierter Vertreter zu beschreiben. Daß dies eine extreme Unterschätzung mikrobieller Diversität bedeutet, wird beispielsweise durch die häufig beobachtete Differenz zwischen Direkt- und Lebendzellzahlbestimmung und die zahlreichen, anhand ihres auffälligen Morphotyps charakterisierten, unkultivierten mikrobiellen Symbionten von Termiten (To et al., 1980) oder anaeroben Ciliaten (Fenchel et al., 1977) belegt. Amann et al. (1995) schätzen den Anteil bisher kultivierter Mikroorganismen in meso- bis eutrophen Habitaten wie Sedimenten, Boden oder Belebtschlamm auf 0.1-15%. Lediglich für das oligotrophe Habitat Trinkwasser ist dieser Prozentsatz wesentlich höher (Kalmbach et al., 1997). Solche Schätzungen sind in guter Übereinstimmung mit den Untersuchungen zur genotypischen Diversität von Mikroorganismen mittels DNA-DNA Hybridisierungsraten, die allein in einigen Boden- und Sedimentproben die Anwesenheit von 4000-10000 genomisch unterschiedlichen Mikroorganismen zeigen (Torsvik et al., 1990 und 1998). Diese Zahl übersteigt die Anzahl bisher kultivierter Bakterien und Archaea um das doppelte. Die offenkundigen Limitierungen der seit Jahrzehnten angewandten kulturabhängigen Identifizierungsmethoden haben zu der paradoxen Situation geführt, daß trotz der ökonomischen Bedeutung von Mikroorganismen z.B. in der industriellen Biotechnologie oder Medizin unser Verständnis mikrobieller Diversität ausgesprochen gering ist (Bull et al., 1992).


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Die von Zuckerkandl und Pauling (1965) angeregte und von Carl Woese und Mitarbeitern konsequent umgesetzte vergleichende Analyse ribosomaler RNA’s, vor allem der 16S-rRNA, hatte die Entwicklung einer molekularen, auf der Phylogenie der Organismen basierenden Systematik zur Folge (zur Übersicht s. Woese, 1987). Die 16S-rRNA stellt aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer funktionellen Konstanz und ihrer Unterteilung in Sequenzdomänen mit variierenden Substitutionsraten einen idealen molekularen Zeitmesser dar. Bereits in den siebziger Jahren erfolgte auf der Basis sog. Oligonukleotidkataloge die Einteilung aller Organismen in die drei Hauptentwicklungslinien Bacteria, Archaea (die zusammen auch als Prokaryoten bezeichnet werden) und Eucarya (zur Übersicht s. Woese, 1987; Stackebrandt, 1992). Bei dieser Methode werden die nach einer spezifischen Spaltung der 16S-rRNA durch Ribonuclease T1 entstehenden Oligonukleotide sequenziert und die erhaltenen Sequenzen mit denen anderer Organismen verglichen. Durch die Oligonukleotidkatalogisierung gelang Anfang der achtziger Jahre die erste 16S-rRNA-Sequenzanalyse eines in-vitro nicht kultivierbaren, symbiontischen Prokaryoten (Seewaldt und Stackebrandt, 1982). Dabei nutzten die Autoren das exklusive Vorkommen von Prochloron in seinem Wirt und den hohen rRNA-Gehalt mikrobieller Zellen für eine direkte Isolierung und Sequenzierung der 16S-rRNA. Die Entwicklung der direkten rRNA-Sequenzierung mittels reverser Transkriptase (Lane et al., 1985) sowie molekularbiologischer Methoden zur Klonierung und Sequenzierung von DNA ermöglichten eine Weiterentwicklung dieses Ansatzes und die Ausdehnung auf mikrobielle Mischpopulationen. In ihrem Artikel ”The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences“ entwickelten Pace et al. (1986) anhand zahlreicher Beispiele ein generelles Konzept zur kulturunabhängigen Bestimmung mikrobieller Diversität und markierten damit den Beginn der durch Akkermans et al. (1994) definierten ”molekularen Ökologie“. Die Analyse der 16S-rRNA unkultivierter Mikroorganismen erfolgte zunächst entweder durch Filterhybridisierung direkt extrahierter rRNA (Stahl et al., 1988), direkte rRNA-Sequenzierung (Pace et al., 1986), shot-gun-Klonierung genomischer DNA und anschließender Analyse der rekombinanten E. coli-Klone mit einem rDNA-Insert (Pace et al., 1986; Schmidt et al., 1991) oder reverser Transkription der direkt isolierten 16S-rRNA und anschließender Klonierung der cDNA in E. coli (Weller und Ward, 1989). Die Einführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Entwicklung zahlreicher 16S-rDNA Amplifizierungs- und Sequenzierprimer (Weisburg

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et al., 1991) bedeutete eine wichtige methodische Erleichterung, da nun die für die 16S-rRNA kodierenden Gene direkt aus genomischer DNA amplifiziert und anschließend kloniert werden können und somit eine reverse Transkription oder ein aufwendiges Screening genomischer Genbibliotheken umgangen wird (Giovannoni et al., 1990). In den letzten Jahren wurde die PCR-vermittelte Analyse ribosomaler RNA durch zahlreiche methodische Ergänzungen variiert bzw. erweitert. Muyzer et al. (1993) adaptierten die Denaturierende Gradienten Gelelektrophorese (DGGE) zur Auftrennung PCR-amplifizierter rDNA-Fragmente, um so den arbeitsintensiven Klonierungsschritt zu umgehen. Daneben wurden Verfahren entwickelt, die in Ergänzung zur DNA-Sequenzierung eine schnelle Analyse von rDNA-Genbibliotheken ermöglichen, wie etwa die Hybridisierung mit sog. gruppenspezifischen Oligonukleotidsonden (Liesack und Stackebrandt, 1992), die Verwendung spezifischer rDNA-Polynukleotidsonden (von Wintzingerode et al., 1999) oder die Analyse rekombinanter Klone mittels Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) (Weidner et al., 1996). Ein weiterer wichtiger Schritt war die Entwicklung der 16S-rRNA-gerichteten In-situ-Hybridisierung (DeLong et al., 1989; Amann et al., 1990), die eine Quantifizierung der lediglich durch rRNA-Sequenzen charakterisierten unkultivierten Mikroorganismen in ihrem Habitat erlaubt und mit der PCR-vermittelten rRNA-Analyse in dem Konzept der ”full-cycle-rRNA-analysis“ zusammengefasst ist (Amann et al., 1995). In Verbindung mit dem hohen Automatisierungsgrad der DNA-Sequenzierung ermöglichten diese technischen Neuerungen die Untersuchung einer Vielzahl unterschiedlicher mikrobieller Mischpopulationen, z.B. aus Waldböden (Liesack und Stackebrandt, 1992; Bornemann und Triplett, 1997), Ackerböden (Bornemann et al., 1996; Engelen et al., 1998), Torf (Rheims et al., 1996), Belebtschlamm (Schuppler et al., 1995; Snaidr et al., 1997, Juretschko et al., 1998), heißen Quellen (Barns et al., 1994; Hugenholtz et al., 1998), Parodontitis-Läsionen (Choi et al., 1994) oder aus Chlororganika-kontaminierten Habitaten (Dojka et al., 1998; von Wintzingerode et al., 1999). Die vergleichende Analyse der in diesen Untersuchungen ermittelten 16S-rRNA Sequenzen zeigte übereinstimmend die große Diskrepanz zwischen der durch mikrobielle Reinkulturen repräsentierten 16S-rDNA-Vielfalt und der natürlichen Diversität. Wenngleich die PCR-vermittelte Analyse ribosomaler RNA, wie jeder methodische Ansatz, eine Reihe von Fehlermöglichkeiten beinhaltet (zur Übersicht s. von Wintzingerode et al., 1997), so ermöglicht sie jedoch durch die phylogenetische

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Charakterisierung der einzelnen Organismen natürlicher mikrobieller Populationen die Erstellung eines Grundgerüstes, an dem sich weitere (molekulare) Untersuchungen orientieren können. Pace (1997) plädiert für die systematische Bestimmung mikrobieller Diversität in ausgewählten, chemisch unterschiedlich definierten Habitaten, um so u.a. zu klären, inwieweit sich mikrobielle Populationen zur Kartierung und zum Monitoring bio/geochemischer Prozesse eignen. Die Realisierung eines solchen ”Umwelt-Genomprojektes“ erscheint mit Blick auf den hohen Automatisierungsgrad der DNA-Sequenzierungstechnologie möglich und würde sicherlich einen Meilenstein in der mikrobiellen Ökologie darstellen.


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1.5. Ziel der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der mikrobiellen Diversität einer bisher nicht charakterisierten, anaeroben, Trichlorbenzol-transformierenden Mischpopulation (Konsortium) durch eine kulturunabhängige vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse.

Den ersten Schritt stellte die Anlage von 16S-rDNA-Genbibliotheken dar, die einen möglichst repräsentativen Querschnitt der in dem Konsortium vorkommenden Mikroorganismen geben. Auf der Grundlage der in diesen Genbibliotheken enthaltenen 16S-rDNA-Sequenzen sollte durch rechnergestützte Sequenzanalyse und Datenbankabgleich eine phylogenetische Klassifizierung der im Konsortium vorkommenden Bakterien und Archaea erfolgen.

Ein wichtiger Punkt dieser Arbeit war es, aus den phylogenetischen Beziehungen zu bereits bekannten Mikroorganismen, Rückschlüsse auf die Physiologie der Mikroorganismen des Konsortiums zu ziehen.

Die Überprüfung dieser Hypothesen wurde durch die gezielte Isolierung von Reinkulturen und deren anschließende Charakterisierung mittels vergleichender 16S-rDNA-Sequenzanalyse sowie die kulturunabhängige vergleichende Sequenzanalyse spezifischer, funktioneller Gene angestrebt.

Ziel dieses mehrdimensionalen Ansatzes war es, ein möglichst genaues Bild der mikrobiellen Diversität des Trichlorbenzol-transformierenden Konsortiums zu erhalten, das als Basis für weiterführende Untersuchungen zur anaeroben, mikrobiellen Transformation von Chlorbenzolen dienen sollte.


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1.6. Analyseschema


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