v. Wintzingerode-Knorr, Friedrich Wasmuth Lotar: Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität einer anaeroben, Trichlorbenzol-dechlorierenden Mischkultur

47

Kapitel 3. ERGEBNISSE

3.1. Charakterisierung des TCB-dechlorierenden Konsortiums durch Analyse von 16S-rDNA-Genbibliotheken

Nach etwa sechsmonatiger Kultivierung der Mischkultur im Wirbelschichtreaktor wurde im Januar 1995 ein Aliquot dieser Population entnommen und die Gesamt-DNA extrahiert. Die bisher bekannten anaeroben, TCB-dechlorierenden Mischkulturen setzen sich aus Bakterien und methanogenen Archaea, die zu den Euryarchaeota zählen, zusammen (Holliger et al., 1992; Ramanand et al., 1993; Nowak et al., 1996; Middeldorp et al., 1997; Adrian et al., 1998). Um diese Populationen zu erfassen, wurden durch geeignete Primerpaare 16S-rRNA Genfragmente sowohl von Bakterien (etwa 1550 bp Länge) als auch von Euryarchaeota (etwa 1000 bzw. 1400 bp Länge) mittels PCR amplifiziert und in E. coli kloniert. Auf die Verwendung eines universellen Primerpaares, das die simultane Amplifizierung etwa 1000 bp langer 16S-rRNA Genfragmente von Bakterien und Archaea ermöglicht, wurde verzichtet, weil solch kurze Gensequenzen zu Artefakten in der nachfolgenden phylogenetischen Analyse führen können (Stackebrandt und Rainey, 1995). Die Zusammensetzung der 16S-rDNA-Genbibliothek einer mikrobiellen Mischkultur kann durch experimentelle Parameter, wie die Wahl der Primer, die PCR-Zyklen oder die Klonierungsmethode beeinflusst werden (zur Übersicht s. von Wintzingerode et al., 1997). Daher wurden je zwei verschiedene PCR- bzw. Klonierungsmethoden angewandt und die resultierenden rDNA-Genbibliotheken miteinander verglichen (rDNA-Genbibliotheken A,B und C,D). Im Dezember 1996, fast zwei Jahre nach der ersten Probennahme, wurden insgesamt vier Proben entnommen. Ausgehend von extrahierter Gesamt-DNA wurden vier bakterielle 16S-rDNA-Genbibliotheken angelegt (16S-rDNA-Genbibliotheken E-H) und diese mit den bakteriellen rDNA-Genbibliotheken A und B verglichen.

3.1.1. DNA-Extraktion und Anlage der 16S-rDNA-Genbibliotheken

Mit Ausnahme der Probe vom 23.12.96 zeigten alle DNA-Extrakte im Agarose-Gel neben der dominierenden, hochmolekularen DNA-Bande eine Vielzahl an niedermolekularen Degradationsprodukten. Die bräunliche Färbung dieser DNA-Extrakte, sowie die Inhibition der PCR-Amplifizierung bakterieller 16S-rDNA, lassen vermuten, daß die extrahierte DNA mit starken PCR-Inhibitoren, wie etwa


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Huminsäuren, verunreinigt war. Da es sich bei diesen Stoffen um Verbindungen handelt, die im Agarose-Gel eine höhere Wanderungsgeschwindigkeit aufweisen als hochmolekulare DNA (Liesack und Stackebrandt, 1992), konnte DNA mit einer Größe über 9 kb aus einem präparativen Agarose-Gel isoliert und erfolgreich für eine PCR-Amplifizierung prokaryotischer 16S-rDNA eingesetzt werden (Abb. 3.1.1.1).

Abb. 3.1.1.1 Analyse des Gesamt DNA-Extraktes mittels Agarosegelelektrophorese. [1] Gesamt-DNA der Probennahme vom 31.1.95 (5 µl). Die DNA oberhalb des weißen Pfeils wurde eluiert und für die PCR-Amplifizierung verwendet. [2] DNA-Marker II (1 µl). Die Größe der Fragmente ist in bp angegeben.

In allen PCR-Ansätzen (s. 2.2.7.3) wurden ausschließlich DNA-Fragmente der erwarteten Länge amplifiziert. Die Ansätze A, B und E-H (s. Tab. 2.2.7.3.1) ergaben Amplifikate mit einer Länge von je etwa 1550 bp, während im PCR-Ansatz C DNA-Fragmente von etwa 1400 bp und im Ansatz D von etwa 1000 bp Länge amplifiziert wurden. Die Produktausbeuten lagen bei allen PCR-Ansätzen in etwa bei 6 ng/µl, lediglich PCR-Ansatz G (s. 2.2.7.3) mußte durch Ethanolfällung um den Faktor 10 konzentriert werden, um eine nachfolgende Klonierung zu ermöglichen. Bei allen mitgeführten Negativkontrollen (ohne Template-DNA bzw. mit Negativkontrolle der präparativen Gelelektrophorese) waren im Agarose-Gel keine Amplifikationsprodukte sichtbar. Die Klonierung der PCR-Amplifikate erfolgte mittels TA- oder LIC-Klonierung. Im Gegensatz zur Klonierung von PCR-Produkten nach Einfügung von Restriktionsschnittstellen und Spaltung mit Restriktionsendonukleasen (Scharf et al., 1986) wird bei diesen Methoden ein Verlust von 16S-rDNA-Amplifikaten aufgrund von internen Restriktionsschnittstellen vermieden. Eine unter diesem Aspekt


49

ebenfalls mögliche Blunt-End Klonierung der PCR-Produkte wurde aufgrund der im Vergleich zur TA- oder LIC-Klonierung geringeren Effizienz nicht angewendet. Bei den Transformationsansätzen der TA-Klonierung lag die Ausbeute bei 5.6 x 104 - 1 x 105 Zellen/µg DNA. Bei der LIC-Klonierung lag die Ausbeute um den Faktor 2 höher.

3.1.2. Analyse der 16S-rDNA-Genbibliotheken A und B durch Hybridisierung mit DIG-markierten rDNA-Fragmenten

Insgesamt wurden 185 zufällig ausgewählte rekombinante Klone der Genbibliothek A (SJA-Klone) und 176 Klone der Genbibliothek B (SJB-Klone) mittels Dot-Blot-Hybridisierung untersucht. Um die Analyse auf rekombinante Klone zu beschränken, die ein bakterielles 16S-rDNA-Insert enthielten, erfolgte die Hybridisierung mit der Bakterien-spezifischen, 16S-rDNA gerichteten Oligonukleotidsonde 1114F. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (52 °C) zeigten 146 (79%) SJA-Klone und 163 (93%) SJB-Klone ein Signal. Da Oligonukleotid 1114F strangbindend ist (Strangprimer), wurden die Hybridisierungsergebnisse nicht durch Bindung an kontaminierende E. coli 16S-rRNA verfälscht. Die Sequenzierung zufällig ausgewählter 1114F-negativer Klone ergab, daß vier weitere SJA-Klone (SJA-4, -6, -57 und SJA-178) vollständige bakterielle 16S-rDNA-Inserts enthielten. Die rDNA-Inserts dieser Klone wiesen drei Basen Unterschied zur Zielsequenz der Oligonukleotidsonde 1114F auf. Demgegenüber waren fünf 1114F-positive SJA-Klone entweder kontaminiert, enthielten nur ein partielles 16S-rDNA-Insert oder DNA unbekannter Herkunft. Um den für einen Vergleich der beiden bakteriellen Genbibliotheken A und B nötigen Sequenzieraufwand zu reduzieren, war es nötig ein Screening-Verfahren zu entwickeln, das den schnellen Nachweis sehr ähnlicher oder identischer Klonsequenzen ermöglichte. Dies gelang durch die Hybridisierung mit PCR-amplifizierten, DIG-markierten 16S-rDNA-Klonfragmenten. Zunächst wurden DIG-markierte rDNA-Fragmente einiger zufällig ausgewählter SJA-Klone für die Hybridisierung der übrigen SJA-Klone und der SJB-Klone eingesetzt. Anschließend wurden SJA-Klone, die nicht mit einem der erwähnten 16S-rDNA-Fragmente hybridisierten, ausgewählt, um neue DIG-markierte Fragmente zu erstellen. Dieser Vorgang wurde mit insgesamt 29 verschiedenen 16S-rDNA-Fragmenten durchgeführt. Die auf Partialsequenzen (330 bis 1500 bp) beruhende Sequenzanalyse 55 Hybridisierungs-positiver SJA-Klone und fünf positiver SJB-Klone zeigte, daß von 29 getesteten 16S-rDNA-Fragmenten 28 mit identischen oder


50

sehr ähnlichen Klonen hybridisierten (Sequenzhomologien über 95.9%). Lediglich Klon SJA-65 hybridisierte mit Klonen, deren 16S-rDNA-Inserts geringere Sequenzhomologien aufwiesen. Alle verbleibenden SJA-Klone, die kein Hybridisierungssignal zeigten, wurden sequenziert. Dieses kombinierte Vorgehen erlaubte die Identifizierung von 52 Klonfamilien mit Sequenzhomologien über 95.9% in Genbibliothek A, die jeweils nach dem repräsentativen, vollständig sequenzierten SJA-Klon benannt wurden. Die Ergebnisse der Sequenzierungen und Hybridisierungen mit den 16S-rDNA-Fragmenten sind in Tab. 3.2.2.1 zusammengefaßt. Ein Vergleich der Genbibliotheken A und B ergab, daß die Klonfamilien SJA-36, -102 und SJA-186 mehr als ein Viertel aller SJA- und SJB-Klone repräsentierten (28.8% der SJA-Klone und 26.4% der SJB-Klone). Sechzehn Klonfamilien waren in beiden Genbibliotheken mit ähnlich geringen Häufigkeiten zwischen 0.6 and 4.9% vertreten, was zwischen einem und acht positiven Klonen entsprach. Im Gegensatz dazu zeigte Klonfamilie SJA-102 in Genbibliothek A eine hohe Häufigkeit (9.6%) und in Genbibliothek B lediglich eine Häufigkeit von 4.9% und die Klonfamilien SJA-121, -131, und SJA-181 waren bis zu siebenmal häufiger in einer der beiden Genbibliotheken. Neben Klonfamilie SJA-131, die fünf SJA-Klone repräsentierte, konnten fünf einzeln vorkommende SJA-Klonsequenzen nicht in Genbibliothek B nachgewiesen werden. In Abb. 3.2.2.1 ist die repräsentative Hybridisierung mit dem PCR-amplifizierten, DIG-markierten 16S-rDNA-Fragment des Klons SJA-103 gezeigt.

51

Abb. 3.1.2.1 Dot-Blot-Hybridisierung der aufgereinigten Plasmid-DNA von SJA-Klonen (A-C) und SJB-Klonen (D und E) mit dem PCR-amplifizierten, DIG-markierten rDNA-Fragment des Klones SJA-103. Die rDNA-Inserts der Klone SJA-8, -69, -100, -102 und SJA-182 wurden sequenziert (Tab. III.2.2.1). Die Sequenzhomologien zwischen 96.4 und 98.1% zeigten die Zugehörigkeit zu einer Klonfamilie, die nach dem vollständig sequenzierten Klon SJA-102 benannt wurde. Die schwachen Hybridisierungssignale der Klone SJB-69 und SJB-146 wurden als negativ gewertet.


52

Tab. 3.1.2.1 Durch Hybridisierung mit DIG-markierten rDNA-Fragmenten und Sequenzierung ermittelte SJA-Klonfamilien.

Representativer Klon einer Klonfamilie

(vollständige Sequenz)

Häufigkeit in Genbibliothek Aa

Zusätzlich sequenzierte Klone einer Klonfamilieb

Häufigkeit in Genbibliothek Bc

Holophaga/Acidobacterium Phylum

SJA-36

14

(9.6)

SJA-32

SJA-92

SJA-96*

SJA-104

SJA-132 *

SJA-158

SJA-179

(99.8)

(99.1)

(99.7)

(97.6)

(99.4)

(99.5)

(99.2)

16

(9.8)

SJA-87

4

(2.7)

SJA-98

SJA-135*

(100)

(99.5)

2

(1.2)

SJA-149

1

(0.7)

-

 

NDe

 

Grüne schwefelfreie Bakterien

SJA-15

3

(2.1)

SJA-2

SJA-126

(99.4)

(99.4)

2

(1.2)

SJA-35

1

(0.7)

-

 

- d

 

SJA-58

1

(0.7)

-

 

1

(0.6)

SJA-61

1

(0.7)

-

 

-

 

SJA-68

1

(0.7)

-

-

-

 

SJA-101

2

(1.4)

SJA-59*

(98.4)

ND

 

SJA-108

1

(0.7)

-

 

ND

 

SJA-116

2

(1.4)

SJA-127*

(99.7)

ND

 

SJA-117

1

(0.7)

-

 

ND

 

SJA-131

5

(3.4)

SJA-66

(99.7)

-

 

SJA-170

1

(0.7)

-

 

-

 

Gram-positive Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt

SJA-19

6

(4.1)

SJA-40*

SJA-44*

SJA-47*

SJA-50*

(98.8)

(99.7)

(98.5)

(100)

5

(3.1)


53

 

 

 

SJA-139*

SJB-50

SJB-87*

SJB-100*

SJB-131*

SJB-168*

(99.7)

(97.8)

(99.7)

(98.6)

(99.8)

(98.5)

 

 

SJA-29

2

(1.4)

SJA-39

(98.3)

ND

 

SJA-65

5

(3.4)

SJA-20*

SJA-76*

(91.4)

(93.1)

6

(3.7)

SJA-84

1

(0.7)

-

 

ND

 

SJA-112

5

(3.4)

SJA-133*

(99.6)

6

(3.4)

SJA-118

2

(1.4)

SJA-173*

(96.3)

1

(0.6)

SJA-136

1

(0.7)

-

 

ND

 

SJA-143

1

(0.7)

-

 

ND

 

Spirochäten

SJA-102

14

(9.6)

SJA-8

SJA-69*

SJA-100

SJA-182*

(96.4)

(96.7)

(98.1)

(96.4)

8

(4.9)

SJA-168

1

(0.7)

-

-

ND

 

alpha-Untergruppe der Proteobacteria

SJA-9

1

(0.7)

-

 

-

 

SJA-53

7

(4.8)

SJA-1*

SJA-46*

SJA-49*

SJA-70*

SJA-90*

SJA-110*

(98.7)

(99.5)

(99.5)

(98.8)

(99.5)

(99.5)

5

(3.1)

SJA-105

1

(0.7)

-

-

ND

 

beta-Untergruppe der Proteobacteria

SJA-10

1

(0.7)

-

-

ND

 

SJA-21

2

(1.4)

SJA-37

(99.7)

ND

 

SJA-23

1

(0.7)

-

-

ND

 

SJA-52

2

(1.4)

SJA-71*

(99.0)

ND

 

SJA-62

3

(2.1)

SJA-81*

(99.2)

ND

 

SJA-109

2

(1.4)

SJA-144*

(99.7)

ND

 

SJA-155

1

(0.7)

-

-

ND

 

SJA-186

14

(9.6)

SJA-33

SJA-79*

SJA-80*

SJA-91*

(99.8)

(99.5)

(99.7)

(99.7)

19

(11.7)


54

 

 

 

SJA-93*

SJA-128

SJA-134*

SJA-161

SJA-167

(99.5)

(99.6)

(100)

(99.4)

(99.6)

 

 

gamma-Untergruppe der Proteobacteria

SJA-64

4

(2.7)

SJA-38*

SJA-67*

SJA-129*

(99.5)

(96.0)

(96.3)

2

(1.2)

delta-Untergruppe der Proteobacteria

SJA-5

1

(0.7)

-

-

ND

 

SJA-51

1

(0.7)

-

-

ND

 

SJA-63

4

(2.7)

SJA-188

(97.8)

4

(2.5)

SJA-111

3

(2.1)

SJA-146*

SJA-152*

(99.1)

(96.4)

ND

 

SJA-162

1

(0.7)

-

-

ND

 

SJA-172

1

(0.7)

-

-

1

(0.6)

Gram-positive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt

SJA-181

1

(0.7)

-

-

7

(4.3)

Grüne Schwefelbakterien

SJA-28

1

(0.7)

-

-

2

(1.2)

Unbekannte Zuordnung

SJA-88

3

(2.1)

SJA-12*

(99.6)

2

(1.2)

Phylum Cluster WS1

SJA-43

1

(0.7)

-

-

-

 

Phylum Cluster TM6

SJA-4

4

(2.7)

SJA-57

(99.6)

2

(1.2)

Phylum Cluster OP10

SJA-22

1

(0.7)

-

 

-

 

SJA-121

5

(3.4)

SJA-115

(99.9)

1

(0.6)

SJA-171

1

(0.7)

-

-

1

(0.6)

SJA-176

1

(0.7)

-

-

1

(0.6)

a Prozentsatz 1114F-positiver SJA-Klone in Klammern.

b Sequenzhomologien über 95.9% zum repräsentativen Klon definieren eine Klonfamilie.

c Prozentsatz 1114F-positiver SJB-Klone in Klammern.

d Keine positiven Signale.

e ND, nicht bestimmt, da keine Hybridisierung mit rDNA-Fragmenten.

* Nahezu vollständig (>80%) sequenziertes rDNA-Insert.


55

3.1.3. Bestimmung artifizieller, chimärer 16S-rDNA-Sequenzen

Bei der gleichzeitigen PCR-Amplifizierung homologer DNA können Mischsequenzen auftreten, die aus mindestens zwei verschiedenen DNA-Fragmenten bestehen. Diese Artefakte werden als PCR-Chimären bezeichnet und ihr Auftreten täuscht bei der Analyse komplexer mikrobieller Habitate mittels direkt amplifizierter 16S-rDNA eine überhöhte, künstliche Diversität vor (zur Übersicht s. von Wintzingerode et al., 1997). Die Überprüfung aller representativen SJA-Sequenzen auf eine mögliche chimäre Struktur ergab, daß sich Klon SJA-7 aus der 16S-rDNA eines unbekannten Vertreters der Spirochäten (E. coli Position 7 - 500) und der eines Vertreters der Gram-positiven Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt (E. coli Position 501-1541) zusammensetzte. Somit reduzierte sich die Anzahl der repräsentativen SJA-Klone bzw. Klonfamilien in Genbibliothek A auf 51.

3.1.4. Phylogenetische Klassifizierung der SJA-Klonsequenzen durch vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse

Aus Abb. III.1.4.2 und III.1.4.3 wird ersichtlich, daß die phylogenetische Analyse den größten Teil der 51 representativen SJA-Sequenzen bereits bekannten bakteriellen Phyla zuordnet. Etwa 25% der SJA-Sequenzen werden jedoch phylogenetischen Gruppen zugeordnet, die sich überwiegend oder ausschließlich aus unkultivierten Bakterien zusammensetzen (Holophaga/Acidobacterium Phylum [Ludwig et al., 1997]; Phylum Cluster OP10 [Hugenholtz et al., 1998]; Phylum Cluster TM6 [Rheims et al., 1996], Phylum Cluster WS1 [Dojka et al., 1998]). Daneben zeigt Klonsequenz SJA-88 keine nähere Verwandtschaft zu einer der bisher beschriebenen phylogenetischen Gruppen (Tab. 3.1.4.1). Die phylogenetische Sonderstellung dieser rDNA-Sequenz wird durch eine ungewöhnliche Sekundär- und Tertiärstruktur der abgeleiteten 16S-rRNA-Sequenz bestätigt, da die für die Ausbildung eines Pseudoknotens mitverantwortlichen hochkonservierten Nukleotide G570 und C866 (E. coli-Position) gegen A570 und U866 ausgetauscht sind (Abb. 3.1.4.1).


56

Abb. 3.1.4.1 Sekundärstruktur der aus rDNA-Klon SJA-88 abgeleiteten 16S-rRNA-Sequenz. Dargestellt sind die E. coli-Positionen 566 bis 884 mit den variablen Regionen V4 und V5. Kanonische Basenpaare (Watson-Crick Paarung) sind mit Linien verbunden, G:U-Basenpaare sind mit Punkten, A:G-Basenpaare sind mit offenen Kreisen und andere nichtkanonische Paarungen mit ausgefüllten Kreisen verbunden. Tertiäre Interaktionen zwischen einzelnen Nukleotiden (E. coli Position 575:880) und Nukleotidpaaren (E. coli Positionen 570-571:865-866) sind mit dickeren, langen Linien verbunden. Jede zehnte Position ist mit einem Strich markiert und jede 50ste nummeriert. Gegenüber der E. coli 16S-rRNA abweichende Nukleotide sind farbig markiert (modifiziert nach Gutell et al., 1994).


57

Abb. 3.1.4.2 Phylogenetische Beziehung repräsentativer SJA-Klone zu bakteriellen 16S-rRNA-Sequenzen. Die Analyse basierte auf dem Vergleich von 1228 Positionen. Aus dem zugrundeliegenden Sequenzalignment wurden mittels einer mit dem ARB-Programmpaket definierten Konsensusmaske hypervariable Bereiche bzw. unsichere Positionen ausgeschlossen. Die 16S-rRNA-Sequenzen von Methanosaeta concilii (X16932) und Thermoplasma acidophilum (M20822) wurden als Bezugsgruppe gewählt. Klonsequenzen, die in einer unabhängigen Studie (Dojka et al., 1998) aus einem kontaminierten Grundwasser isoliert wurden, tragen die Benennungen WCHB1, WCHA1 oder WsCH. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 1000-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind nicht markiert. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.


58

Abb. 3.1.4.3 Phylogenetische Klassifizierung von 144 untersuchten SJA-Klonsequenzen. [H/A] Holophaga/Acidobacterium Phylum. [GNS] Grüne schwefelfreie Bakterien. [NGC] Gram-positive Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt. [Alpha] alpha-Proteobakterien. [Beta] beta-Proteobakterien. [Gamma] gamma-Proteobakterien. [Delta] delta-Proteobakterien. [HGC] Gram-positive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt. [GS] Grüne Schwefelbakterien. [Un.] Unbekannte Zuordnung. [TM6] Phylum Cluster TM6 (Rheims et al., 1996). [OP10] Phylum Cluster OP10 (Hugenholtz et al., 1998). [WS1] Phylum Cluster WS1 (Dojka et al., 1998).


59

Tab. 3.1.4.1 Sequenzhomologien zwischen SJA-Sequenzen und ihren nächsten phylogenetischen Verwandten.

Klon

Nächster phylogenetischer Verwandte

Accession Nr.

% Homologie

SJA-4

rDNA Klon TM6

X97099

87.6

SJA-5

Myxococcus xanthus

M34114

87.5

SJA-9

rDNA Klon WCHB1-55

AF050531

94.7

SJA-10

"Dechlorimonas agitatus"

AF047462

95.0

SJA-15

rDNA Klon T78

Z94009

81.2

SJA-19

Dehalobacter restrictus

U84497

98.8

SJA-21

Zoogloea ramigera ATCC 19544

D14254

96.7

SJA-22

rDNA Klon WsCH12

AF050622

87.1

SJA-23

Stamm Ben04B

X86071

99.7

SJA-28

Chlorobium limicola

M31769

80.4

SJA-29

Clostridium quercicolum

M59110

86.1

SJA-35

rDNA Klon WCHB1-50

AF050571

94.8

SJA-36

rDNA Klon iii1-8

Z95729

86.5

SJA-43

rDNA Klon WCHA1-48

AF050578

90.3

SJA-51

rDNA Klon WCHB1-27

AF050538

93.6

SJA-52

Rhodocyclus tenuis

D16210

94.4

SJA-53

Thiobacillus sp. strain THI051

D32248

95.9

SJA-58

rDNA Klon WCHB1-05

AF050562

91.0

SJA-61

rDNA Klon WCHB1-57

AF050570

93.7

SJA-62

Variovorax paradoxus

D30793

97.0

SJA-63

rDNA Klon WCHB1-12

AF050534

98.1

SJA-64

Pseudomonas sp. CRE11

U37338

99.6

SJA-65

Clostridium scatologenes

M59104

93.7

SJA-68

rDNA Klon T78

Z94009

83.3

SJA-84

Clostridium quercicolum

M59110

91.0

SJA-87

Holophaga foetida

X77215

94.1

SJA-88

Leptospira borgpetersenii

X17547

83.8

SJA-101

rDNA Klon T78

Z94009

80.4

SJA-102

rDNA Klon WCHB1-91

AF050550

93.4

SJA-105

rDNA Klon WCHB1-55

AF050531

94.2

SJA-108

rDNA Klon WCHB1-05

AF050562

98.0

SJA-109

Rhodocyclus tenuis

D16210

94.6

SJA-111

Geobacter metallireducens

L07834

93.5

SJA-112

Clostridium quercicolum

M59110

90.6

SJA-116

rDNA Klon WCHB1-80

AF050563

91.9

SJA-117

rDNA Klon T78

Z94009

96.8

SJA-118

Desulfosporosinus orientis

Y11570

93.1

SJA-121

rDNA Klon WCHA1-79

AF050575

89.5

SJA-131

rDNA Klon WCHB1-57

AF050570

95.2

SJA-136

Clostridium tyrobutyricum

M59113

85.7

SJA-143

Clostridium quercicolum

M59110

90.5

SJA-149

rDNA Klon C002

AF013515

90.8

SJA-155

rDNA Klon Beta Proteobacterium

AJ001325

95.9

SJA-162

rDNA Klon WsCH54

AF050624

98.0

SJA-168

rDNA Klon WCHB1-40

AF050549

94.6

SJA-170

rDNA Klon WCHB1-05

AF050562

89.9

SJA-171

rDNA Klon WsCH12

AF050622

95.1

SJA-172

Syntrophobacter wolinii

X70905

94.8

SJA-176

rDNA Klon WCHA1-79

AF050575

96.1

SJA-181

Microlunatus phosphovorus

D26169

93.8

SJA-186

Thauera aromatica

X77118

96.9


60

Vertreter bekannter Bakteriengattungen

Keine der ermittelten SJA-Sequenzen war mit einer der in öffentlichen Datenbanken hinterlegten 16S-rRNA-Sequenzen identisch (Tab. 3.1.4.1). Jedoch zeigten die vollständig bestimmten SJA-Sequenzen der Klonfamilien SJA-19, -21, -62, -64 und -186 Homologien zwischen 96.7 und 99.6% zu Vertretern der Gattungen Dehalobacter, Zoogloea, Variovorax, Pseudomonas und Thauera. Weiterhin zeigte Klonsequenz SJA-23 Homologien zwischen 98.3 und 99.7% zu den Isolaten B3 (Kalmbach et al., 1997), Ben04B und Ben05B (Bradford et al., 1996). Die geringen rDNA-Sequenzunterschiede innerhalb der sequenzierten Vertreter der genannten Klonfamilien (bis auf wenige Ausnahmen weniger als 2%, Tab. 3.1.2.1, 3.1.4.1 und 2) lassen vermuten, daß sich für alle rDNA-Sequenzen dieser Klonfamilien ähnlich hohe Homologien ergaben. Legt man zugrunde, daß Vertreter einer Bakteriengattung i.d.R. 16S-rRNA Sequenzhomologien zwischen 97 und 100% aufweisen (Stackebrandt und Goebel, 1994) ist somit anzunehmen, daß etwa 21% der untersuchten SJA-Klone noch nicht-kultivierte oder aber noch nicht-sequenzierte Vertreter bekannter Bakteriengattungen repräsentieren.

Tab. 3.1.4.2 16S-rDNA-Sequenzhomologien zwischen SJA- und SJB-Klonen der Klonfamilie SJA-19 und Vertretern der Gattung Dehalobacter.

16S-rDNA-Sequenzhomologie (%)

 

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

DebRes

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DebRe

99.5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SJA-19*

98.8

98.6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SJA-40

99.4

99.8

98.6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SJA-44*

98.7

98.5

99.7

98.4

 

 

 

 

 

 

 

 

SJA-47

99.2

99.7

98.5

99.7

98.3

 

 

 

 

 

 

 

SJA-50*

98.7

98.5

99.9

98.6

99.7

98.4

 

 

 

 

 

 

SJA-139*

98.6

98.4

99.7

98.3

99.5

98.2

99.7

 

 

 

 

 

SJB-50#

98.9

99.3

97.8

99.3

97.9

99.3

97.8

97.6

 

 

 

 

SJB-87*

98.6

98.4

99.8

98.3

99.6

98.2

99.7

99.6

97.7

 

 

 

SJB-100

99.4

99.9

98.5

99.8

98.4

99.6

98.5

98.2

99.4

98.4

 

 

SJB-131*

98.7

98.4

99.8

98.4

99.5

98.3

99.8

99.6

97.7

99.6

98.3

 

SJB-168

99.4

99.9

98.4

99.7

98.4

99.5

98.3

98.2

99.4

98.3

99.8

98.3

DebRes

Dehalobacter restrictus Stamm PER-K23, DSM 9455T

DebRe

Dehalobacter restrictus Stamm TEA

*

Sequenzen enthalten eine 84 bp Insertion zwischen E. coli Position 75 und 86 (s. 6.1)

#

Partialsequenz, E. coli Position 27-409 und 1034-1524.


61

Gruppierung mit Wurtsmith rDNA-Klonsequenzen

Zahlreiche SJA-Sequenzen stehen in enger phylogenetischer Verwandtschaft zu rDNA-Klonsequenzen, die aus einem anaeroben, Chlororganika-kontaminierten Grundwasser isoliert wurden (Wurtsmith-Habitat; Dojka et al., 1998). Wie aus Tab. 3.1.4.1 ersichtlich, waren für insgesamt neunzehn repräsentative SJA-Sequenzen innerhalb der Proteobakterien, der Spirochäten, der Grünen schwefelfreien Bakterien und den Phylum Clustern OP10 und WS1 (Hugenholtz et al., 1998; Dojka et al., 1998) Wurtsmith rDNA-Sequenzen die nächsten phylogenetischen Verwandten mit Sequenzhomologien zwischen 87.1 und 98.1%. Davon zeigten 13 Klone Sequenzhomologien von mehr als 93.4%. Unter Berücksichtigung der geringen Sequenzunterschiede innerhalb der entsprechenden Klonfamilien gruppieren vermutlich etwa 30% der untersuchten SJA-Sequenzen (44 von 145) mit rDNA-Sequenzen des Wurtsmith Standortes.

3.1.5. Zusammensetzung der 16S-rDNA-Genbibliotheken C und D und phylo-genetische Klassifizierung der Klonsequenzen durch vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse

Rekombinante Klone aus Genbibliothek C und D (SJC- und SJD-Klone) wurden zufällig ausgewählt und die Plasmid-Inserts PCR-amplifiziert. Etwa 75% der ausgewählten Klone enthielten ein Insert der erwarteten Länge. Ein erster Hinweis auf die Zusammensetzung der Genbibliotheken ergab sich durch die vergleichende Sequenzanalyse zufällig ausgewählter Klone. Die ermittelten rDNA-Sequenzen zeigten sehr hohe Homologien zur 16S-rDNA von Methanosaeta concilii (96.5-99.6%). Um die Häufigkeit dieser Klonsequenzen in den Genbibliotheken C und D zu bestimmen, wurde eine Oligonukleotidsonde (MCONC) entwickelt, die spezifisch für M. concilii und die nah verwandten Klonsequenzen war. Von insgesamt 153 SJC-Klonen und 56 SJD-Klonen hybridisierten unter stringenten Bedingungen (54 °C) 136 SJC-Klone (88.8%) und 32 SJD-Klone (57.1%) mit der Oligonukleotidsonde MCONC (Abb. 3.1.5.1). Die Spezifität der Hybridisierung mit MCONC wurde durch das Mitführen geeigneter Kontroll-DNA und bereits sequenzierter Klone in der Dot-Blot-Hybridisierung sichergestellt.


62

Abb. 3.1.5.1 Dot-Blot Hybridisierung mit der Oligonukleotidsonde MCONC. [A] In den obersten vier Reihen sind die PCR-amplifizierten rDNA-Inserts von 26 SJC-Klonen und in den übrigen Reihen die von 38 SJD-Klonen aufgetragen. Die mit einem Stern gekennzeichneten Felder markieren Positionen ohne DNA. Die mit A bis J gekennzeichneten Klone wurden sequenziert. A: SJC-11b; B: SJC-23b; C: SJC-92b; D: SJC-101a; E: SJC-111a; F: SJC-108a; G: SJC-125a; H: SJC-129a; I: SJC-131a; J: SJC-117a. [B] Mitgeführte Kontroll-rDNA. Methanococcus voltae DSM 1537, Haloferax volcanii DSM 3757, Methanosarcina mazei DSM 2053, Methanosaeta thermophila DSM 3870, Methanosaeta concilii DSM 3671, Methanosarcina barkeri DSM 800.

Aufgrund der Dominanz Methanosaeta concilii-ähnlicher Klone in den Genbibliotheken C und D wurden nur wenige MCONC-negative Klone analysiert. Fünf von sechs zufällig ausgewählten MCONC-negativen SJC- und SJD-Klonen zeigten nach vergleichender 16S-rDNA-Sequenzanalyse die höchsten Ähnlichkeiten zu Vertretern der Gattungen Methanosarcina bzw. Methanobacterium, während ein Klon (SJC-92b) die höchste Homologie zu einer rDNA Klonsequenz des Wurtsmith Standortes aufwies (Dojka et al., 1998) (Abb. 3.1.5.2 und Tab. 3.1.5.1).


63

Abb. 3.1.5.2 Phylogenetisches Dendrogram zweier SJC/D-Klone, die kein Hybridisierungssignal mit der Oligonukleotidsonde MCONC zeigten. Die 16S-rDNA-Sequenzen von Methanosarcina barkeri DSM 800T und M. mazei DSM 2053T wurden in dieser Arbeit bestimmt (Accession numbers AJ012094 und AJ012095). Die 16S-rRNA-Sequenz von Methanococcus jannaschii (M59126) diente als Bezugsgruppe. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 100-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind nicht markiert. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.

Tab. 3.1.5.1 Sequenzhomologien zufällig ausgewählter MCONC-negativer SJC- und SJD-Klone zu ihren phylogenetisch nächsten Verwandten.

Klon Nr.

Nächster phylogenetischer Verwandter

Accession Nr.

Homologie (%)

SJC-108a

rDNA Klon ABS4 (Methanosarcina-ähnlich)*

Y15387

98.8

SJC-92b**

rDNA Klon WCHD3-02

AF050616

89.7

SJC-133b#

rDNA Klon ABS4 (Methanosarcina-ähnlich)

Y15387

99.1

SJD-108

Methanobacterium formicicum

M36508

99.8

SJD-115

Methanobacterium formicicum

M36508

99.8

SJD-116

Methanobacterium formicicum

M36508

97.4

*

Partialsequenz, E. coli Position 145-881. Daher keine Einbettung in Abb. III.1.5.2

**

Partialsequenz, E. coli Position 112-637 und 807-1351

#

Partialsequenz, E. coli Position 8-876


64

3.1.6. Zusammensetzung der 16S-rDNA-Genbibliotheken E-H und phylogenetische Klassifizierung einzelner Klonsequenzen durch vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse.

Im Dezember 1996, etwa zwei Jahre nach der ersten Probennahme und nach etwa viermonatigem kontinuierlichem Betrieb des Bioreaktors, wurden erneut insgesamt vier Proben entnommen. Die Probennahmen erfolgten vor (2.12.96 und 16.12.96) und nach (9.12.96 und 23.12.96) der Zudosierung von nitrathaltigem RAMM-Medium. Ausgehend von extrahierter und aufgereinigter Gesamt-DNA wurden die bakteriellen 16S-rRNA Gene PCR-amplifiziert, anschließend kloniert und vier 16S-rDNA-Genbibliotheken (E-H) mittels TA-Klonierung angelegt. Der Vergleich dieser rDNA-Genbibliotheken mit den bakteriellen rDNA-Genbibliotheken A und B (Januar 1995) sollte die Frage beantworten, ob eine Änderung der Kultivierungsbedingungen die Zusammensetzung der rDNA-Genbibliotheken beeinflußte. Aufgrund der bisherigen Beobachtung, daß etwa 80% der rekombinanten E. coli-Klone nach TA-Klonierung ein rDNA-Insert der erwarteten Länge enthielten, wurden von jeder der Genbibliotheken E-H jeweils 216 rekombinante Klone zufällig für die mit DIG-markierten 16S-rDNA-Fragmenten ausgewählt (SJE-, SJF-, SJG, SJH-Klone). Aus Gründen der Zeitersparnis wurde anstelle der bis dahin durchgeführten Dot-Blot-Hybridisierung die Colony-Slot-Blot-Hybridisierung eingesetzt. Die Hybridisierungen sowohl mit DIG-markierten 16S-rDNA-Fragmenten einzelner SJA-Klone als auch eines SJH-Klones sollten Auskunft über die Häufigkeit der jeweiligen Klonfamilien in den rDNA-Genbibliotheken geben. Wie aus Tab. 3.1.6.1 ersichtlich, wurden Vertreter der Klonfamilie SJA-186 und der Klonfamilien SJA-46 und SJA-118 weder in Genbibliotheken, die die Zeitpunkte vor noch nach einer Zudosierung von Nitrat repräsentierten, nachgewiesen. Demgegenüber wurde die Klonfamilie SJA-19 vor und nach einer Zudosierung und Vertreter der Klonfamilie SJH-171 nach einer Zudosierung von Nitrat nachgewiesen.


65

Tab. 3.1.6.1 Häufigkeiten einzelner Klonfamilien in den 16S-rDNA-Genbibliotheken A, B und E-H.

Hybridisierung mit rDNA-Fragment*

Häufigkeit positiver Klone in 16S-rDNA-Genbibliothek (in %)**

A

B

E

(2.12.96)

F

(9.12.96)

G

(16.12.96)

H

(23.12.96)

SJA-46

4.8

3.1

-

-

-

-

SJA-19

4.1

3.1

ND

4.9 (144)

2.8 (72)

ND

SJA-173

1.4

0.6

- (144)

- (72)

- (72)

-

SJA-186

9.6

11.7

-

-

-

-

SJH-171

-

0.6

- (72)

ND

ND

1.4 (72)

*

Hybridisierung mit DIG-markiertem 16S-rDNA-Fragment des angegebenen Klones.

**

In Klammern in die Anzahl untersuchter Klone angegeben. Bei fehlender Angabe wurden alle 216 Klone hybridisiert.

ND

Hybridisierung nicht durchgeführt.

Bei der Auswertung der Colony-Slot-Blot-Hybridisierungen erwies sich das Auftreten teilweise recht starker Hintergrundsignale bzw. falsch-positiver Hybridisierungssignale als störend. Ursache dafür waren offensichtlich mit der positiv geladenen Nylonmembran (Hybond N+) verbundene Stripping-Probleme. Da ähnliche Probleme ebenfalls bei positiv geladenen Nylonmembranen eines weiteren Herstellers (Boehringer Mannheim) zu beobachten waren, erscheint deren Verwendung für die Hybridisierung von rDNA-Klonen mit DIG-markierten 16S-rDNA-Fragmenten als wenig ratsam. Aufgrund der genannten Probleme wurden bei der Auswertung der Hybridisierungen lediglich sehr starke Signale als positiv gewertet und zusätzlich das Plasmid-Insert mindestens eines positiven Klons teilsequenziert. Dabei ergab ein Vergleich der SJA-19-positiven Klonsequenz SJF-22 mit SJA-19 einen Unterschied von 2 Basen (E. coli Position 611-1541) und der SJH-171-positiven Klonsequenz SJB-63 mit SJH-171 einen Unterschied von drei Basen (E. coli Position 8-1518).


66

3.2. Charakterisierung des TCB-dechlorierenden Konsortiums durch vergleichende Analyse abgeleiteter NifH-Sequenzen.

Eine kulturunabhängige Charakterisierung stickstofffixierender Mikroorganismen des TCB-dechlorierenden Konsortiums erfolgte durch Analyse direkt-amplifizierter nifH-Gene, die ein Schlüsselenzym der Stickstofffixierung, die Dinitrogenase-Reduktase (NifH-Protein), kodieren.

Rekombinante Klone der nifH-Genbibliotheken X,Y und Z wurden zufällig ausgewählt und die Länge der Inserts mittels PCR-Amplifizierung überprüft. Dabei zeigte sich, daß etwa 80% der rekombinanten Klone ein Insert der erwarteten Länge enthielten. Insgesamt wurden 20 nifH-Inserts sequenziert und zu 11 verschiedenen NifH-Proteinsequenzen umgelesen (SN-Sequenzen für Saale, Nitrogen). Jede dieser elf SN-Sequenzen wies vier funktionell wichtige, konservierte Aminosäuren auf, die bisher in allen Dinitrogenase-Reduktasen gefunden wurden (Anhang 1). Dies sind die drei Cysteine Cys-39, Cys-86, und Cys-98 (Azotobacter vinelandii [P00459] Nummerierung) und das konservierte Arginin-101 (Arg-101). Da Cys-98 der Ligandierung der Eisen-Schwefel-Gruppe und Arg-101 der reversiblen Inaktivierung der Nitrogenase-Aktivität durch ADP-Ribosylierung dient (Dean und Jacobson, 1992), repräsentieren vermutlich alle SN-Sequenzen funktionelle Dinitrogenase-Reduktasen. Die vergleichende Sequenzanalyse zeigte, daß keine der SN-Sequenzen identisch war mit einer der in öffentlichen Datenbanken hinterlegten NifH-Proteinsequenzen. Jedoch waren die Aminosäuresequenzen SN-2, SN-4, und SN-16 bzw. SN-40 zu 92 und 93% identisch mit den NifH2- bzw. NifH1-Proteinsequenzen von Methanosarcina barkeri (Tab. III.2.1). Mit Ausnahme der Aminosäuresequenz SN-17, die eine engere Verwandtschaft zu bakteriellen NifH-Sequenzen aufwies, gruppierten alle übrigen SN-Sequenzen mit NifH-Sequenzen methanogener Archaea (Abb. 3.2.1).


67

Tab. 3.2.1 Identitäten zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der SN-Klone und bekannten, mikrobiellen NifH-Proteinsequenzen*.

NifH-Sequenzidentität (%)

 

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

1. SN-2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. SN-4

99

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. SN-8

54

54

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. SN-10

53

53

98

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. SN-12

58

58

61

61

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. SN-13

50

50

56

56

62

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. SN-16

99

98

55

54

57

50

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8. SN-17

67

67

49

48

54

52

67

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9. SN-33

54

54

60

60

65

60

54

54

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10. SN-40

67

66

47

46

55

51

68

66

51

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

11. SN-42

53

53

99

98

61

55

53

46

60

44

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12. MetBa2

93

92

52

50

55

49

92

69

55

63

49

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

13. MetBa1

66

66

44

43

52

51

67

66

49

92

42

63

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

14. MetTh1

65

65

49

48

55

51

66

66

52

72

46

64

68

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

15. AzoVi1

68

68

54

53

56

56

69

82

55

66

51

67

65

66

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

16. DesGig

76

75

54

52

56

52

75

71

58

65

51

76

63

63

67

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

17. FraSpe

65

65

50

49

58

53

64

75

52

67

48

65

67

61

80

65

 

 

 

 

 

 

 

 

 

18. KlePne

67

67

52

52

55

53

68

85

54

65

50

67

63

66

93

67

78

 

 

 

 

 

 

 

 

19. RhiLeg

69

69

53

51

52

50

69

81

54

64

51

67

64

59

78

64

79

74

 

 

 

 

 

 

 

20. PleBof

48

48

50

50

46

46

49

47

48

50

49

44

49

45

49

47

44

47

47

 

 

 

 

 

 

21. MetTh2

54

54

59

59

62

59

54

55

65

53

59

53

52

51

56

53

55

54

53

50

 

 

 

 

 

22. AzoTol

60

60

45

44

47

44

61

78

48

58

44

60

58

59

76

59

72

78

85

41

45

 

 

 

 

23. MetJan

60

60

56

55

61

52

61

62

58

59

55

57

56

59

61

63

58

60

59

50

57

55

 

 

 

24. TKY1

53

53

53

53

60

54

53

47

68

49

54

53

50

50

52

49

50

50

47

47

61

41

50

 

 

25. TKY19

49

49

64

63

57

54

49

45

57

46

64

47

44

43

48

49

44

47

47

49

52

42

54

53

 

26. MetIva

57

57

52

52

57

55

58

54

53

56

50

55

54

53

56

52

52

54

55

48

53

47

64

48

51

* Die Berechnung erfolgte anhand des in Anhang 2 gezeigten Alignments. Die maximalen Sequenzidentitäten sind fett markiert. AzoVi1, Azotobacter vinelandii NifH1; MetBa2, Methanosarcina barkeri NifH2; MetBa1, M. barkeri NifH1; MetTh1, Methanococcus thermolithotrophicus NifH1; DesGig, Desulfovibrio gigas; FraSpe, Frankia sp. strain FAC1; KlePne, Klebsiella pneumoniae; RhiLeg, Rhizobium leguminosarum; PleBof, Plectonema boryanum Chlorophyll Eisen Protein frxC; MetTh2, Methanococcus thermolithotrophicus NifH2; AzoTol, Azoarcus tolulyticus Stamm Td-1; MetJan, Methanococcus jannaschii; TKY1, PCR-Klon TKY1 (Ohkuma et al., 1996); TKY19, PCR-Klon TKY19 (Ohkuma et al., 1996), MetIva, Methanobacterium ivanovii.


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Abb. 3.2.1 Nach der Neighbor-Joining Methode generiertes phylogenetisches Dendrogramm der aus nifH-Genfragmenten abgeleiteten Proteinsequenzen (SN-Sequenzen). Die Analyse beruhte auf dem Vergleich partieller NifH-Proteinsequenzen (113 Aminosäuren; Pos. 17-129, Azotobacter vinelandii [P00459]) kultivierter Bakterien und Archaea sowie zweier bisher nicht kultivierter Mikroorganismen (TKY-Sequenzen; Ohkuma et al., 1996). Die Sequenzen von vier Chlorophyll Eisen Proteinen wurden als Bezugsgruppe einbezogen. Die Benennung der Sequenzcluster erfolgte nach Chien und Zinder (1994). In Klammern sind zusätzliche identische Klonsequenzen angegeben. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 100-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind unmarkiert. Ein nach der Parsimony-Methode generiertes Dendrogramm zeigte ein identisches Verzweigungsmuster. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.


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3.3. Gezielte Isolierung und Kultivierung von Bakterien des TCB-dechlorierenden Konsortiums.

Ausgehend von der phylogenetischen Klassifizierung einzelner 16S-rDNA-Klonsequenzen und den daraus abgeleiteten möglichen metabolischen Eigenschaften (s. Diskussion) wurde versucht, drei Organismengruppen gezielt aus der Mischkultur des Bioreaktors anzureichern und zu kultivieren.

  1. Fakultativ aerobe, acetat- oder benzoatverwertende Bakterien
  2. Nitratreduzierende, acetatverwertende Bakterien
  3. Selenatreduzierende Bakterien

Alle Anreicherungsansätze führten zu einer Reihe von Reinkulturen, die mittels vergleichender 16S-rDNA-Sequenzanalyse charakterisiert wurden.

3.3.1. Isolierung und Charakterisierung fakultativ aerober und nitratreduzierender Bakterien

Insgesamt wurden jeweils zwei Reinkulturen gewonnen, die aerobes Wachstum auf OLA- bzw. OLB-Agarmedium zeigten. Sie wurden nach dem entsprechenden Anreicherungsmedium OLA-1 und OLA-2 bzw. OLB-1 und OLB-2 benannt. Desweiteren wurden sieben Reinkulturen gewonnen, die anaerobes Wachstum auf RNA-Agarmedium zeigten. Sie wurden RNA-111, RNA-112, RNA-212, RNA-1131, RNA-2111, RNA-3121 und RNA-3111 benannt. Die Reduktion von Nitrat in den flüssigen Anreicherungskulturen mit RNA-Medium konnte durch das Absinken der Nitratkonzentration von ursprünglich über 500 mg/ml bis unter die Nachweisgrenze der verwendeten Merck-Teststäbchen (10 mg/ml) gezeigt werden. Für die nachfolgende Charakterisierung dieser Isolate wurden die nahezu vollständigen 16S-rRNA Gene der Isolate mit den Primerkombinationen TPU1/RTU8 oder TPU1-M13F/RTU8-M13R PCR-amplifiziert und anschließend sequenziert. Die Verwendung der Primerkombination TPU1-M13F/RTU8-M13R ermöglichte den Einsatz der universellen Primer M13(21)F und M13(24)R in der DNA-Sequenzierung was aufgrund der standardisierbaren Reaktionsbedingungen eine wesentliche Vereinfachung gegenüber der Verwendung spezifischer rDNA-Primer darstellte. Die vergleichende Analyse der nahezu vollständigen 16S-rDNA-Sequenzen von drei Isolaten zeigte die enge Beziehung mit Vertretern der Gattung Pseudomonas innerhalb der gamma-Untergruppe der Proteobakterien (Abb. 3.3.1.1).


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Abb. 3.3.1.1 Phylogenetische Beziehung der Isolate OLB-1, OLB-2 und RNA-111 innerhalb der Gattung Pseudomonas basierend auf dem Vergleich nahezu vollständiger 16S-rDNA-Sequenzen (min. 1400 bp). Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 200-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Die Klone SJA-38 und SJA-64 wiesen einen Sequenzunterschied von zwei bzw. einer Base gegenüber der 16S-rDNA des Isolates OLB-1 auf (E. coli Position 41-1501). Demgegenüber waren die Klonsequenzen SJA-67 und SJA-129 lediglich zu 97.5 bzw. 97.8% homolog mit der 16S-rDNA des Isolates OLB-2. Der Maßstab verdeutlicht 1% Sequenzunterschied.

Die vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse der verbleibenden acht Isolate basierte aufgrund der geringen Sequenzunterschiede mit den Isolaten OLB-1 bzw. OLB-2 lediglich auf Partialsequenzen (Tab. 3.3.1.1).

Tab. 3.3.1.1 16S-rDNA-Sequenzhomologien der acht partiell sequenzierten OLA- und RNA-Isolate mit den Isolaten OLB-1 und OLB-2.

Isolat

Sequenzierte 16S-rRNA E. coli Positionen

Höchste Homologie mit Isolat

Sequenzhomologie (%)

OLA-1

337-1518

OLB-2

99.7

OLA-2

298-1486

OLB-1

99.8

RNA-112

1122-1520

OLB-2

99.2

RNA-212

971-1518

OLB-2

99.4

RNA-1131

540-1502

OLB-2

100

RNA-2111

30-1512

OLB-2

99.8

RNA-3111

489-1512

OLB-2

99.2

RNA-3121

592-1512

OLB-2

99.9


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3.3.2. Isolierung und Charakterisierung selenatreduzierender Bakterien

Insgesamt wurden 25 Reinkulturen (Se-Isolate) gewonnen, die neben anaerobem Wachstum auf nitrathaltigem Medium (SN- oder SNS-Medium) auch auf SS0.1-, SS0.4-, S40S0.4- oder SSGY0.4-Agarplatten Zellwachstum zeigten und eine deutliche Rotfärbung der Kolonien aufwiesen (Abb. 3.3.2.1). Dabei war auffällig, daß besonders bei nitrathaltigem Medium diese Rotfärbung erst einige Zeit nach dem Auftreten makroskopisch sichtbarer Kolonien beobachtet werden konnte. Beim Überimpfen von Zellmaterial zeigte sich, daß die Rotfärbung der Kolonien entweder aus einem roten Niederschlag im Agar herrührte, wobei die Kolonien weißlich/farblos waren, oder aber das Zellmaterial selbst rötlich gefärbt war. Mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß dieser rötliche Niederschlag durch elementares, wasserunlösliches Selen verursacht wurde. Dazu wurde der Festanteil einer Flüssigkultur (Isolat Se-34) durch Zentrifugation abgetrennt und Selen in dem gewaschenen Pellet qualitativ und quantitativ bestimmt (s. Anhang 3). Durch diesen Ansatz war es zugleich möglich den Zusammenhang zwischen Zellwachstum und gebildetem Selen zu bestimmen und somit Hinweise auf eine mögliche Selenat-Respiration zu erhalten (s. Diskussion).

Abb. 3.3.2.1 Kolonien selenatreduzierender Bakterien auf einer Agarplatte mit SN-Medium nach mehrwöchiger Inkubation. Ausgefallenes, elementares Selen verursacht die auftretende Rotfärbung.

Die vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse von 14 Isolaten ergab eine Einteilung in fünf rDNA-Homologiegruppen (Tab. 3.3.2.1). Wie aus Abb. 3.3.2.2 ersichtlich, zeigten die fünf repräsentativen Isolate keine nähere phylogenetische Verwandschaft zu einer der SJA-Sequenzen oder zu Sequenzen bereits bekannter selenatrespirierenden Bakterien wie Thauera selenatis oder “Geospirillum barnesii“ (s. Diskussion). Jedoch wiesen die 16S-rDNA-Sequenzen der Isolate OLB-1 und Se-41 eine 100%ige Übereinstimmung auf.


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Abb. 3.3.2.2 Phylogenetische Beziehung fünf repräsentativer selenatreduzierender Isolate. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 100-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind unmarkiert. Die 16S-rDNA-Sequenz von Methanobacterium formicicum dient als Außengruppe. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.

Tab. 3.3.2.1 16S-rDNA-Homologiegruppen selenatreduzierender Isolate.

rDNA-Homologiegruppe*

Isolate**

Sequenzierte E. coli 16S-rRNA-Positionen

Se-32

-

-

Se-34

Se-31

28-921

 

Se-35

67-1100

 

Se-36

43-1053

 

Se-45

54-966

Se-41

Se-7

105-1060

 

Se-33

29-1249

Se-1111

-

-

Se-3111

Se-1311A

601-1505

 

Se-13111

90-1440

*

Die Isolate mit vollständig bestimmter 16S-rDNA-Sequenz sind angegeben.

**

Alle Isolate einer Homologiegruppe besitzen 100% Homologie mit dem repräsentativen Isolat.


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3.4. Nachweis bisher nicht kultivierter Bakterien des TCB-dechlorierenden Konsortiums mittels 16S-rRNA-gerichteter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Für den Nachweis bisher nicht kultivierter Bakterien mittels 16S-rRNA-gerichteter FISH wurden zwei SJA-Klonfamilien ausgewählt, die entweder mit sehr hoher (SJA-186) oder sehr geringer Häufigkeit (SJA-118) in den rDNA-Genbibliotheken A und B vertreten waren. Um die von den Klonfamilien SJA-118 und SJA-186 repräsentierten Bakterien mittels 16S-rRNA-gerichteter FISH in Bioreaktormaterial nachzuweisen, wurden die Oligonukleotidsonden 118+ und 186+ entwickelt. Im computergestützten Vergleich mit über 5000 16S-rRNA-Sequenzen waren beide Sonden ausschließlich zu Vertretern der jeweiligen Klonfamilien vollständig komplementär. Die Spezifität dieser Sonden gegenüber den restlichen SJA-Klonen wurde in der Dot-Blot-Hybridisierung getestet. Beide DIG-markierten Sonden hybridisierten unter stringenten Bedingungen (50 °C, 6 x SSC) nur mit Klonen der jeweiligen Klonfamilien (Daten nicht gezeigt). Die Sonde 118+ wies mindestens drei Basenfehlpaarungen mit den 16S-rRNA-Sequenzen einer Reihe gram-positiver Bakterien auf (Rhodococcus spp., Oenococcus spp., Bacillus spp.). Auf die Verwendung dieser Bakterien als Negativkontrolle in der In-situ-Hybridisierung wurde verzichtet, da die Penetration der Oligonukleotide durch die Zellwand Gram-positiver Bakterien häufig erschwert ist und es somit zu falsch-negativen Ergebnissen kommen kann (Roller et al., 1994; Schuppler et al., 1998). Stattdessen wurde das Gram-negative Bakterium Flectobacillus major eingesetzt, dessen 16S-rRNA-Sequenz vier Basenfehlpaarungen mit der Sonde 118+ aufwies. Die Sonde 186+ zeigte mindestens zwei Basenfehlpaarungen mit den 16S-rRNA-Sequenzen einer Reihe Gram-negativer Bakterien. Als Negativkontrolle für die In-situ-Hybridisierung wurde Burkholderia cepacia eingesetzt (zwei Basenfehlpaarungen).

Bei einer Formamidkonzentration von 23% im Hybridisierung-Puffer zeigten beide fluoreszenzmarkierten Sonden (118+ und 186+) keine Signale bei den mitgeführten Kontrollstämmen. Beide Sonden zeigten jedoch in Biofilmmaterial, das von bewachsenen Polyurethanschaumkörpern abgelöst wurde (Probennahme 2.12.96), unter stringenten Bedingungen ein deutliches Fluoreszenzsignal (Abb. III.4.1). Eine Bestimmung der Keimzahl mittels 16S-rRNA-gerichteter FISH erwies sich allerdings als schwer durchführbar, da im mikroskopischen Bild keine typischen bakteriellen Einzelzellen sondern meist flockenartig zusammengelagerte Aggregate sichtbar


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waren. Diese Signale waren nicht immer eindeutig von Autofluoreszenzsignalen verunreinigender Partikel zu unterscheiden. Desweiteren erwies sich die Ablösung des Aufwuchses von den Polyurethanschaumkörpern mittels Vortexen oder Abziehen mit einer Pipette als problematisch, da beides i.d.R. zu einer Zerstörung des gewachsenen Biofilms führte. Auch Semidünnschnitte von zuvor in wasserlöslichem Kunststoff eingebetteten Biofilmmaterial führten nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Aus den genannten Gründen wurde daher vorerst auf eine weitergehende Untersuchung des Bioreaktormaterials mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verzichtet.

Abb. 3.4.1 In-situ-Hybridisierung von Biofilmmaterial mit den für die Klonfamilien SJA-118 und SJA-186 spezifischen Oligonukleotidsonden 118+ und 186+. Ein zum gleichen Zeitpunkt entnommener Aufwuchskörper diente als Ausgangsmaterial für die Anlage der Genbibliothek E (2.12.96). Die Hybridisierung mit den Cy3-markierten Oligonukleotidsonden erfolgte als Doppelhybridisierung mit der FITC-markierten, bakterienspezifischen Oligonukleotidsonde EUB338 bei einer Formamidkonzentration von 23%. [A1] Phasenkontrastaufnahme einer Biofilmflocke. [A2] Epifluoreszenzaufnahme des gleichen Bildausschnittes nach Hybridisierung mit Sonde Cy3-118+. [B1] Phasenkontrastaufnahme einer weiteren Biofilmflocke. [B2] Epifluoreszenzaufnahme des gleichen Bildausschnittes nach Hybridisierung mit Sonde Cy3-186+. Bereiche der Biofilmflocke, die ein Fluoreszenzsignal der spezifischen Sonden zeigten, wiesen auch ein Signal der FITC-markierten Sonde EUB338 sowie ein DAPI-Signal auf (Daten nicht gezeigt).


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