v. Wintzingerode-Knorr, Friedrich Wasmuth Lotar: Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität einer anaeroben, Trichlorbenzol-dechlorierenden Mischkultur

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Kapitel 4. DISKUSSION

4.1. Bestimmung mikrobieller Diversität mittels kulturunabhängiger, molekulargenetischer Methoden

Bisher ist nur ein geringer Teil der in der Umwelt vorkommenden Bakterien und Archaea als in-vitro Reinkultur zugänglich. Lediglich 0.1-15% der mikrobiellen Populationen in komplexen Habitaten, wie Boden, Fluß- und Meeressediment oder Belebtschlamm sind mit den bisher bekannten Methoden der Anreicherung und Isolierung kultivierbar, wie ein Vergleich mit den mikroskopisch bestimmten Keimzahlen ergibt (Amann et al., 1995). Der Grund für diese von Staley und Konopka (1985) als ”great plate count anomaly“ bezeichnete Diskrepanz, die zu einer Verzerrung unseres Umweltbildes führt, ist die unzureichende Kenntnis natürlicher Interaktionen in mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die die Wahl entsprechender physiologischer Bedingungen im Labor und somit eine erfolgreiche in-vitro Kultivierung erschwert. Für die Bestimmung der mikrobiellen Diversität eines komplexen Habitats sind somit kulturabhängige Methoden allein nicht ausreichend; vielmehr ist ein experimentelles Vorgehen erforderlich, das alle bisher kultivierten aber auch die nicht kultivierten Mikroorganismen erfaßt.

Die Entwicklung molekulargenetischer Techniken wie die in-vitro Amplifikation und Klonierung von Nukleinsäurefragmenten sowie deren Sequenzierung ermöglicht heute eine kulturunabhängige Charakterisierung auf molekularer Ebene. Seit den grundlegenden Arbeiten von Carl Woese (zur Übersicht s. Woese, 1987) werden vor allem ribosomale RNAs oder die kodierenden Gene für eine phylogenetische Klassifizierung bzw. molekulare Typisierung von Mikroorganismen eingesetzt. Aufgrund ihrer zentralen Bedeutung in der Nukleinsäuretranslation sind diese Moleküle ubiquitär verbreitet und besitzen eine weitgehend konservierte Struktur. In der Primärstruktur wechseln sich stark konservierte Bereiche, die bei nahezu allen Organismen identisch sind, mit weniger stark oder kaum konservierten, variablen Bereichen ab, die meist ausreichend Sequenzunterschiede aufweisen, um einzelne Spezies zu unterscheiden. Die Verwendung von Oligonukleotidprimern, die gegen stark konservierte Bereiche der rRNA-Gene gerichtet sind, erlaubt die PCR-Amplifikation und anschließende Klonierung der rRNA-Gene nahezu aller Vertreter der Bakterien und Archaea. Diese universelle Amplifikation ermöglicht auch eine Analyse von bisher unkultivierten Organismen und damit bedeutet dieser Ansatz eine


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neue Qualität bei der Beschreibung mikrobieller Diversität in komplexen Ökosystemen (Göbel, 1995). So zeigten etwa Untersuchungen an Boden (Liesack und Stackebrandt, 1992; Bornemann et al., 1996), Torf (Rheims et al., 1996), Belebtschlamm (Schuppler et al., 1995; Snaidr et al., 1997), heißen Quellen (Barns et al., 1994; Hugenholtz et al., 1998) oder einer Parodontitis-Läsion (Choi et al., 1994), daß sich die Mehrzahl mikrobieller Lebensgemeinschaften nahezu vollständig aus bisher unkultivierten Bakterien bzw. Archaea zusammensetzen. Zahlreiche dieser nur anhand der rDNA-Sequenz charakterisierten Mikroorganismen sind phylogenetisch nah mit bereits bekannten Mikroorganismen verwandt und lassen sich bestehenden Taxa zuordnen. Nicht selten repräsentieren rDNA-Sequenzen jedoch unkultivierte Mikroorganismen neuer Taxa, für die bisher keine oder nur wenige kultivierte Vertreter beschrieben wurden (Hugenholtz et al., 1998a). Auch aus dem hier untersuchten TCB-dechlorierenden Konsortium wurden rDNA-Sequenzen isoliert (SJA-4, SJA-22, SJA-43, SJA-121, SJA-171 und SJA-176), die sich solchen als Phylum Cluster bezeichneten Entwicklungslinien zuordnen lassen. Aufgrund der enormen phylogenetischen Diversität bzw. Vielfalt mikrobieller 16S-rDNA-Sequenzen ist der sog. ”top-to-bottom-approach“ (Amann et al., 1995) zur Analyse komplexer mikrobieller Habitate als eine Ergänzung, nicht aber als Ersatz der vergleichenden Sequenzanalyse direkt amplifizierter 16S-rRNA-Gene zu sehen. In diesem Ansatz werden gruppenspezifische, 16S-rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden, die Taxa unterschiedlicher Hierarchien erfassen, in der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung eingesetzt, um eine schnelle Analyse mikrobieller Populationen zu ermöglichen. Es ist jedoch zu beachten, daß die Entwicklung gruppenspezifischer Sonden immer auf einem Datensatz bereits bekannter rRNA-Sequenzen basiert. Somit gestattet auch die simultane Verwendung von Sonden mit gestaffelter Spezifität (z.B. Gattungs- und Spezies-Spezifität) lediglich den Nachweis bekannter rRNA-Sequenzen und kann höchstens durch das Ausbleiben eines Doppelnachweises einen indirekten Hinweis auf die Anwesenheit neuer, unbekannter Mikroorganismen geben. Demgegenüber ermöglicht die Verwendung hochkonservierter Amplifikationsprimer bei der PCR die Erfassung nahezu aller mikrobiellen 16S-rDNA-Sequenzen die durch nachfolgende Klonierung und Sequenzierung eindeutig phylogenetisch klassifiziert werden können.


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4.1.1. Einfluß experimenteller Faktoren auf die Bestimmung der mikrobiellen Diversität des TCB-dechlorierenden Konsortiums mittels direkter, PCR-vermittelter Analyse ribosomaler RNA-Gene

Obwohl die PCR-vermittelte Analyse ribosomaler RNA-Gene zur Charakterisierung mikrobieller Reinkulturen inzwischen zu einer Standardmethode geworden ist (Weisburg et al., 1991; Stackebrandt et al., 1992), treten bei der kulturunabhängigen Analyse von Mischpopulationen eine Reihe von Problemen auf, die zu einer fehlerhaften Bestimmung der mikrobiellen Diversität führen können (zur Übersicht s. von Wintzingerode et al., 1997). Neben der Inhibition der PCR-Amplifikation durch koextrahierte Kontaminanten, wie etwa Huminsäuren und der Bildung artifizieller PCR-Produkte sind dies vor allem die unterschiedlichen Amplifikations- und Klonierungseffizienzen einzelner rDNA-Moleküle. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, diese Fehlermöglichkeiten zu umgehen bzw. zu reduzieren. So diente die Isolierung hochmolekularer DNA aus der Gesamt-DNA Präparation zum einen der Abtrennung PCR-inhibierender Kontaminanten, zum anderen konnte damit die Verwendung fragmentierter Template-DNA, die die Bildung von Sequenzchimären in der nachfolgenden PCR-Amplifizierung der 16S-rDNA forciert, verhindert werden (Pääbo et al., 1990; Liesack et al., 1991). Diese artifiziellen PCR-Produkte, die aus der rDNA zweier Organismen zusammengesetzt sind, können auch als Folge einer unvollständigen Strangsynthese während der PCR-Elongationsschritte entstehen (Wang und Wang, 1996). Ihre Häufigkeit läßt sich durch eine Verlängerung der


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Elongationszeit während der PCR deutlich reduzieren (Meyerhans et al., 1990; Wang und Wang, 1996). Daher wurden für die Amplifizierung ribosomaler DNA von Bakterien und Euryarchaeota aus der Gesamt-DNA des TCB-dechlorierenden Konsortiums Elongationszeiten zwischen zwei und fünf Minuten gewählt. Bei einer Syntheseleistung der TaqDNA-Polymerase von 60-125 Nukleotiden/s (Gelfand, 1992) und einer Amplikonlänge zwischen 1000 und 1550 bp entspricht dies einer mindestens vierfachen Erhöhung der nötigen Elongationszeit. Unter den 52 untersuchten vollständig sequenzierten SJA-Klonen wurde eine chimäre Sequenz nachgewiesen, was einer Häufigkeit von etwa 2% entspricht. In vergleichbaren Untersuchungen komplexer mikrobieller Habitate wurden Sequenzchimären mit Häufigkeiten zwischen 5.4 und 8.6% nachgewiesen (Choi et al., 1994; Godon et al., 1997). Die geringere Frequenz chimärer rDNA-Sequenzen in der vorliegenden Arbeit könnte die Folge der Verwendung hochmolekularer DNA und der Verlängerung der Elongationszeit in der PCR sein. Denkbar ist aber auch, daß mit dem verwendeten CHECK_CHIMERA-Programm bzw. dem Vergleich phylogenetischer Dendrogramme, denen überlappende Bereiche der 16S-rRNA zugrunde lagen, nicht alle chimären Sequenzen erkannt wurden (Robison-Cox et al., 1995). Neben dem Auftreten von Sequenzchimären, die eine unnatürlich hohe Diversität vortäuschen, kann die bevorzugte Amplifizierung und/oder Klonierung einzelner rDNA-Moleküle zu einer Überrepräsentation in den angelegten Genbibliotheken führen. Die Ursachen für eine bevorzugte PCR-Amplifizierung können vielfältig sein. Neben der Genomgröße und der Anzahl der rrn-Genkopien (Farrelly et al., 1995), sind die Wahl der Amplifikationsprimer (Suzuki und Giovannoni, 1996; Rainey et al., 1994, Hansen et al., 1998), der G+C-Gehalt der rDNA (Reysenbach et al., 1994) und die Konzentration der Template-DNA (Chandler et al., 1997) als mögliche Ursache beschrieben. Die Gründe für eine bevorzugte Klonierung von rDNA, wie sie von Rainey et al. (1994) berichtet wird, sind weitgehend unbekannt. Die Vielzahl der experimentellen Faktoren, die eine Überrepräsentation einzelner rRNA-Gene in einer Genbibliothek bewirken können, erschweren die Entwicklung eines weitgehend fehlerfreien Ansatzes und damit einer der Wirklichkeit entsprechenden Beschreibung des Biotops. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher für die PCR-Amplifizierung und Klonierung der 16S-rDNA von Bakterien und Euryarchaeota jeweils zwei verschiedene Ansätze gewählt und die resultierenden Genbibliotheken miteinander verglichen. Die Analyse der Genbibliotheken A und B zeigte, daß geringe Unterschiede in den PCR-Bedingungen und die Verwendung verschiedener Klonierungssysteme die Repräsentanz einiger rDNA-Sequenzen beeinflußten jedoch nicht zu einer generell unterschiedlichen Zusammensetzung führten. Ein signifikanter Einfluß der experimentellen Faktoren auf die Struktur der Genbibliotheken C und D konnte ebenfalls nicht beobachtet werden, wenngleich Unterschiede von etwa 30% in der Häufigkeit der dominierenden Methanosaeta concilii-ähnlichen rDNA-Sequenzen zu beobachten waren. Diese Ergebnisse stimmen mit unabhängigen Untersuchungen überein, die zeigen, daß die Analyse von 16S-rDNA-Genbibliotheken keine exakte Quantifizierung der Gesamtpopulation, sondern die Charakterisierung der abundanten Mikroorganismen eines komplexen mikrobiellen Ökosystems erlaubt (Cary et al., 1997; Snaidr et al., 1997).


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4.1.2. Analyse bakterieller rDNA-Genbibliotheken mittels Hybridisierung mit PCR-amplifizierten, DIG-markierten rDNA-Fragmenten

Aufgrund der komplexen Zusammensetzung der rDNA-Genbibliotheken A und B mußte als Ergänzung zur Sequenzierung einzelner Klone eine geeignete Screening-Methode gefunden werden. Üblicherweise werden zu diesem Zweck entweder gruppen- und klonspezifische Oligonukleotidsonden in der Dot-Blot-Hybridisierung eingesetzt (Liesack und Stackebrandt, 1992; Rheims et al., 1996; Snaidr et al., 1997) oder die Klone mittels Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) untersucht (Weidner et al., 1996). Die Verwendung von Oligonukleotiden erfordert jedoch zum einen die arbeitsaufwendige Optimierung der individuellen Hybridisierungsbedingungen, zum anderen müssen für die Entwicklung klonspezifischer Oligonukleotidsonden bereits eine Reihe von Klonsequenzen bekannt sein. Die RFLP-Analyse hingegen ist verglichen mit der Hybridisierung mit klonspezifischen Oligonukleotidsonden weniger spezifisch. Aus diesem Grund wurde die Hybridisierung mit PCR-amplifizierten, DIG-markierten rDNA-Fragmenten zum Nachweis identischer oder sehr ähnlicher rDNA-Klone entwickelt. Diese Methode besitzt die folgenden Vorteile: (i) mit einer Ausnahme hybridisierten die getesteten rDNA-Fragmente lediglich mit rDNA-Klonen, die eine Sequenzübereinstimmung von über 95.9% besaßen. Dies erlaubte einen präzisen Vergleich der beiden Genbibliotheken A und B. (ii) Die Entwicklung spezifischer Sonden erforderte keinen zusätzlichen Sequenzieraufwand. (iii) Für alle getesteten rDNA-Fragmente konnten nahezu identische Hybridisierungs- und Waschbedingungen gewählt werden.

4.1.3. Rückschlüsse auf den Metabolismus der unkultivierten Mikroorganismen des TCB-dechlorierenden Konsortiums nach vergleichender 16S-rDNA-Sequenzanalyse

Wie in nahezu allen vergleichbaren Untersuchungen komplexer mikrobieller Ökosysteme ist keine der SJ-Klonsequenzen mit einer der in öffentlichen Datenbanken hinterlegten 16S-rRNA-Sequenzen identisch. Jedoch wurde eine Reihe der Klonsequenzen phylogenetischen Gruppen bereits beschriebener kultivierbarer Organismen zugeordnet, die einen identischen oder zumindest sehr ähnlichen Energiemetabolismus zeigen. In Analogie ist daher anzunehmen, daß die bisher nur durch ihre 16S-rDNA-Sequenz charakterisierten, unkultivierten Organismen ebenfalls diese physiologischen Eigenschaften besitzen. So repräsentiert die Klonfamilie SJA-


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186 wahrscheinlich unkultivierte Vertreter der Gattung Thauera. Bei den beiden bisher beschriebenen Spezies T. aromatica und T. selenatis handelt es sich um fakultativ anaerobe, denitrifizierende bzw. selenatreduzierende Bakterien (Anders et al., 1995; Macy et al., 1993; Song et al., 1998). Die Klonfamilien SJA-21, SJA-62 und SJA-23 repräsentieren jeweils Vertreter der durch einen aeroben bzw. fakultativ anaeroben Energiemetabolismus charakterisierten Gattungen Zoogloea (Shin et al., 1993), Variovorax (Willems et al., 1991) und einer taxonomisch noch nicht definierten Gruppe aerober Bakterienisolate (Bradford et al., 1996; Kalmbach et al., 1997). Neben den genannten SJA-Klonfamilien, die der beta-Unterklasse der Proteobacteria zugeordnet wurden, repräsentierten alle SJA-Sequenzen der gamma-Unterklasse unkultivierte Vertreter der Gattung Pseudomonas, deren beschriebene Spezies meist fakultativ anaerob sind (Palleroni, 1992). Vermutlich sind aerobe oder fakultativ aerobe Bakterien an einer Absenkung des Redoxpotentials im Wirbelschichtreaktor beteiligt, indem sie zugeführtes Acetat und Methanol oxidieren. Im Gegensatz zu SJA-Sequenzen, die der beta- und gamma-Unterklasse der Proteobacteria zugeordnet sind, gruppierten Sequenzen der delta-Unterklasse und der Gram-positiven Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt mit den 16S-rRNA-Sequenzen strikt anaerober Bakterien (z.B. Syntrophus spp., Syntrophobacter spp., Geobacter spp., Clostridium spp., Dehalobacter spp.). Von besonderem Interesse erscheint die enge Verwandtschaft der Klonfamilie SJA-19 mit den bisher beschriebenen Vertretern der Gattung Dehalobacter. Sowohl D. restrictus Stamm PER-K23 als auch das Isolat TEA wachsen durch die reduktive Dechlorierung von Tetra- oder Trichlorethen (Holliger et al., 1993 und 1998; Wild et al., 1996). Die Fähigkeit zum anaeroben Wachstum durch Dechlorierung chlororganischer Verbindungen ist auf die Vertreter bestimmter Gattungen wie etwa Desulfomonile, Desulfitobacterium, Dehalobacterium und Dehalobacter beschränkt. Es ist somit denkbar, daß die durch die Klonfamilie SJA-19 repräsentierten Bakterien an der anaeroben Dechlorierung von TCB beteiligt sind.

Neben dem Nachweis von SJA-Klonsequenzen, die mehr oder weniger nah mit bereits bekannten bakteriellen Genera verwandt sind, gruppierten etwa 50% der untersuchten SJA-Sequenzen mit 16S-rRNA-Genen bisher nicht kultivierter Bakterien. Mehr als ein Zehntel der SJA-Sequenzen wurde dem Holophaga/Acidobacterium Phylum zugeordnet. Diese erst kürzlich beschriebene phylogenetische Gruppe besteht zum überwiegenden Teil aus offenbar ubiquitär verbreiteten unkultivierten Umweltbakterien, die in unterschiedlichen Böden,


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Süßwassersedimenten oder Torf gefunden wurden (Ludwig et al., 1997; Kuske et al., 1997; Rheims et al., 1996). Ein derart weitgestreutes Vorkommen läßt vermuten, daß die Vertreter des Holophaga/Acidobacterium Phylums ein breites physiologisches Spektrum besitzen. Besonders interessant ist die enge phylogenetische Verwandtschaft zwischen zahlreichen SJA-Sequenzen und unkultivierten Bakterien eines kontaminierten, anaeroben Grundwassers, in dem eine in-situ Biodegradation chlorierter und nichtchlorierter Kohlenwasserstoffe beobachtet wurde (Wurtsmith-Standort; Dojka et al., 1998). Das Auftreten nah verwandter Bakterien in anaeroben, dechlorierenden Konsortien reflektiert möglicherweise ähnliche physiologische Prozesse, bei der Dechlorierung chlororganischer Verbindungen.

Inwieweit die beobachtete hohe Diversität bakterieller 16S-rDNA-Sequenzen ein generelles Merkmal anaerober, TCB-dechlorierender Konsortien ist, muß weitgehend unbeantwortet bleiben, da vergleichbare Untersuchungen nicht publiziert sind. Unabhängige Studien an Bioreaktoren, in denen aromatische Verbindungen abgebaut werden, zeigen jedoch einen direkten Zusammenhang zwischen bakterieller Diversität und der Konstruktion des Reaktors (Stoffels et al., 1998). Wurde der Aromatenabbau in Fermentatoren durchgeführt, in denen das Zellwachstum in der flüssigen Phase erfolgte, zeigte sich eine sehr begrenzte Diversität verglichen mit dem Abbau in einem Tropfkörperbioreaktor mit immobilisierter Biomasse. Auch in Wirbelschichtreaktoren liegen die Mikroorganismen immobilisiert als Biofilm vor, was vermuten läßt, daß beide Reaktortypen die Ausbildung komplexer Bakteriengemeinschaften, die durch gute Immobilisierbarkeit und Langzeitstabilität gekennzeichnet sind, begünstigen. Die Beobachtung einer hohen bakteriellen Diversität in dem 1,2-Dichlorpropan-dechlorierenden Konsortium eines anaeroben Wirbelschichtreaktors unterstützt diese Vermutung (C. Schlötelburg, mündliche Mitteilung).

Im Gegensatz zur Komplexität der bakteriellen rDNA-Genbibliotheken waren die Euryarchaeota-spezifischen rDNA-Genbibliotheken klar von einer M. concilii-ähnlichen Klonfamilie dominiert (88.8% der SJC- bzw. 57.1% der SJD-Klone). Auch in der Wurtsmith-Untersuchung (Dojka et al., 1998), in der eine Archaea-spezifische rDNA-Genbibliothek untersucht wurde, dominierten M. concilii-ähnliche Klonsequenzen (81% aller untersuchten Klone). Die einzige bisher bekannte Form der Energiegewinnung innerhalb der Gattung Methanosaeta ist die aceticlastische Methanogenese (Whitman et al., 1992), was auf einen ebenfalls aceticlastischen


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Phänotyp der bisher unkultivierten M. concilii-ähnlichen Archaea schließen läßt. Das niedrige Redoxpotential von -300 mV im Wirbelschichtreaktor und die kontinuierliche Zuführung von Acetat unterstützen diese Vermutung. Die charakterisierten, nicht M. concilii-ähnlichen Euryarchaeota-Klonsequenzen des TCB-transformierenden Konsortiums repräsentierten mit einer Ausnahme unkultivierte Methanosarcina- und Methanobacterium-ähnliche Archaea. Ebenso wie Vertreter der Gattung Methanosaeta gewinnen Methanosarcina spp. Energie aus einer aceticlastischen Methanogenese (Whitman et al., 1992). Zusätzlich können eine Reihe kultivierter Vertreter der Gattungen Methanosarcina und Methanobacterium bei Mangel an gebundenem Stickstoff diazotroph wachsen (Lobo und Zinder, 1992), was die Fähigkeit zur Fixierung molekularen Stickstoffs auch für die unkultivierten Vertreter vermuten läßt. Das Vorkommen methanogener Archaea ist für eine Reihe anaerober, TCB-dechlorierender Konsortien beschrieben (Holliger et al., 1992; Ramanand et al., 1993; Nowak et al., 1996; Middeldorp et al., 1997; Adrian et al., 1998). Im Wirbelschichtreaktor spielen diese Organismen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung des auf den Polyurethanschaumkörpern immobilisierten Biofilms, wie dies bereits für anaerobe Bioreaktoren abweichender Bauart gezeigt wurde (Veiga et al., 1997).

4.2. Ergänzende Untersuchungen zum Metabolismus einzelner Mikroorganismen des TCB-dechlorierenden Konsortiums

Die kulturunabhängige, vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse erlaubt die phylogenetische Einordnung bisher unkultivierter Bakterien und Archaea. Da die 16S-rDNA-Phylogenie keine direkten Aussagen über die phänotypischen Eigenschaften des jeweiligen Mikroorganismus erlaubt, muß der rRNA-Ansatz durch die Charakterisierung spezifischer, funktioneller Gene und/oder eine in-vitro Kultivierung ergänzt werden, um genauere Aussagen über die Funktion der Mikroorganismen in ihrem jeweiligen Habitat treffen zu können. Bisher sind zwei Fälle beschrieben, in denen die phylogenetische Klassifizierung eine gezielte in-vitro Kultivierung von bisher unkultivierten Mikroorganismen gestattete. Kane et al. (1993) konnten ein sulfatreduzierendes Bakterium, dessen 16S-rDNA-Sequenz zuvor in einer rDNA-Genbibliothek nachgewiesen worden war, aus einem anaeroben Laborreaktor anreichern und isolieren. Dabei entsprach die Zusammensetzung des Kultivierungsmediums den physiologischen Eigenschaften des phylogenetisch


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nächsten kultivierbaren Verwandten. Mit einem abweichenden methodischen Ansatz isolierten Huber et al. (1995) ein hyperthermophiles Archaeon aus Wasser- und Sedimentproben einer heißen Quelle. Nach kulturunabhängiger, vergleichender 16S-rDNA-Sequenzanalyse wurde eine klonspezifische Oligonukleotidsonde entwickelt, die eine Bestimmung der Zellmorphologie des entsprechenden Organismus mittels FISH ermöglichte. So konnten typisch geformte Zellen mit Hilfe einer lasergestützten Zellseparierungseinheit (”Optical Tweezer“) aus Anreicherungskulturen abgetrennt und kultiviert werden. Wenngleich der zweite Ansatz eine elegante Alternative zur traditionellen Gewinnung von Reinkulturen darstellt, ist er doch wesentlich durch die Zellmorphologie von Bakterien und Archaea limitiert, die nur in wenigen Fällen eine eindeutige Identifizierung zuläßt. Demgegenüber erlaubt der ständig wachsende 16S-rRNA-Sequenzdatensatz bereits kultivierter Bakterien und Archaea eine immer genauere phylogenetische Zuordnung auch unkultivierter Mikroorganismen und ermöglicht somit immer genauere Hypothesen zur Physiologie dieser Organsimen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht die hypothetischen Aussagen zur Physiologie einiger unkultivierter Bakterien und Archaea des TCB-dechlorierenden Konsortiums durch gezielte kulturabhängige Anreicherung und Isolierung bzw. den kulturunabhängigen Nachweis spezifischer, funktioneller Gene zu bestätigen.

4.2.1. Isolierung fakultativ aerober sowie nitratreduzierender Bakterien

Die vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse ergab Hinweise auf die Anwesenheit einer Reihe bisher unkultivierter, aerober bzw. fakultativ aerober, nitratreduzierender Bakterien der Gattungen Pseudomonas, Zoogloea, Thauera und Variovorax im TCB-dechlorierenden Konsortium. Unter den Kultivierungsbedingungen im Bioreaktor gewinnen diese Organismen wahrscheinlich Energie aus der aeroben Oxidation des zugeführten Acetats und/oder Methanols und tragen somit zu einer Absenkung des Redoxpotentials bei. Obwohl im Bioreaktor keine erkennbare Umsetzung von Benzol erfolgt, ist dennoch eine Oxidation durch aerobe Bakterien denkbar. Für eine selektive Vermehrung fakultativ aerober Organismen wurden daher Anreicherungskulturen angesetzt, in denen Acetat und Benzoat, aufgrund der gegenüber Benzol besseren Wasserlöslichkeit und geringeren Toxizität, als Kohlenstoff- und Energiequelle dienten. Aus diesen Anreicherungskulturen gelang es, Bakterien zu isolieren, die nach der vergleichenden 16S-rDNA-Sequenzanalyse alle der Gattung Pseudomonas zugeordnet werden konnten. Ein Vergleich mit den


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SJA-Klonsequenzen zeigte lediglich eine Base Unterschied zwischen der 16S-rDNA-Sequenz des Isolats OLB-1 und der Klonsequenz SJA-64.

Zur Isolierung nitratreduzierender Bakterien, wurden anaerobe Anreicherungskulturen mit Nitrat und Acetat als einzigem verfügbarem Elektronenakzeptor bzw. Kohlenstoffquelle angesetzt. Analog zur aeroben Anreicherung konnten auch aus diesen Kulturen nur Pseudomonas-ähnliche Bakterien isoliert werden, die jedoch mit keiner der Pseudomonas-ähnlichen SJA-Sequenzen identisch waren. Wenn auch die Isolierung eines breiteren Spektrums von Organismen mit den gewählten Anreicherungsbedingungen nicht möglich war, so zeigt doch die Übereinstimmung zwischen Isolat OLB-1 und Klon SJA-64, daß die in-vitro Kultivierung eines bisher unkultivierten Bakteriums (SJA-64) erfolgreich war. Dieses Ergebnis belegt, daß die PCR-vermittelte 16S-rDNA Analyse unkultivierter Bakterien bei ausreichend hohen Sequenzhomologien (>99%) geeignet ist, Aussagen über den Energiemetabolismus noch unkultivierter Bakterien zu gestatten.

4.2.2. Isolierung selenatreduzierender Bakterien

Im TCB-transformierenden Konsortium konnten nach kulturunabhängiger, phylogenetischer Analyse unkultivierte, Thauera-ähnliche Bakterien nachgewiesen werden. Die zwei bisher beschriebenen Spezies dieser Gattung sind fakultativ anaerobe, denitrifizierende Bakterien. Thauera aromatica nutzt unter denitrifizierenden Bedingungen aromatische Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle (Anders et al., 1995; Song et al., 1998), wohingegen T. selenatis fakultativ durch Selenat-Respiration, d.h. die respiratorische Reduktion von Selenat zu elementarem Selen, wachsen kann (Macy et al., 1989 und 1993). Wenngleich die Fähigkeit von Mikroorganismen unter anaeroben Bedingungen Selenat und Selenit zu elementarem Selen zu reduzieren bereits mehrfach beschrieben ist (Oremland et al., 1989; Steinberg und Oremland, 1990; Steinberg et al., 1992), so sind doch mit ”Geospirillum barnesii “, Stamm SES-3 (Oremland et al., 1994), Enterobacter cloacae, Stamm SLD1a-1 (Losi und Frankenberger, 1997), Bacillus sp., Stamm SF-1 (Fujita et al., 1997) und B. arsenicoselenatis (Blum et al., 1998) nur vier weitere bakterielle Reinkulturen bekannt, die eine Selenat-Respiration durchführen können. Die Begrenzung des selenatrespirierenden Phänotyps auf einige Organismen ließen eine engere Korellation zwischen 16S-rRNA-Phylogenie und Physiologie vermuten. Daher wurde für die im TCB-dechlorierenden Konsortium auftretenden, unkultivierten


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Thauera-Vertreter ein T. selenatis-ähnlicher Energiemetabolismus angenommen, der eine selektive Anreicherung unter selenatrespirierenden Bedingungen aussichtsreich erscheinen ließ. Mit Hilfe des für T. selenatis beschriebenen Kultivierungsmediums (Macy et al., 1989) konnten mehrere Isolate gewonnen werden, die unter anaeroben Bedingungen elementares Selen bildeten. Die damit verbundene Reduktion von Selenat kann entweder, wie für Wolinella succinogenes und Desulfovibrio desulfuricans beschrieben, kometabolisch oder als Selenatrespiration erfolgen (Macy et al., 1989; Tomei et al., 1992 und 1995). Drei Beobachtungen sprechen für eine respiratorische Selenatreduktion durch die isolierten Reinkulturen. (i) Die Bildung elementaren Selens erfolgte auch in Kulturen, denen lediglich Acetat und Methanol bzw. Selenat als potentielle Kohlenstoff- und Energiequelle bzw. Elektronenakzeptor zugefügt waren. (ii) Wie bei Isolat Se-34 nachgewiesen, korreliert die Menge an gebildetem Selen mit dem Zellwachstum. (iii) Die Bildung von elementarem Selen erfolgte bei Selenatkonzentrationen zwischen 20 und 40 mM. Eine kometabolische, anaerobe Selenatreduktion wird jedoch nur bis zu einer Selenatkonzentration von maximal 10 mM beobachtet (Tomei et al., 1992 und 1995). Ein Vergleich der 16S-rDNA-Sequenzen von 14 der 25 Isolate ergab weder eine nähere phylogenetische Verwandtschaft zu den bekannten selenatrespirierenden Bakterien noch zu den beschriebenen SJA-Klonsequenzen. Die hohe phylogenetische Diversität der Isolate zeigt vielmehr, daß die gewählten Anreicherungsbedingungen nicht selektiv für eine bestimmte phylogenetische Gruppe waren. Dies läßt vermuten, daß die Fähigkeit zur anaeroben Selenatrespiration innerhalb der Bacteria wesentlich weiter verbreitet ist, als man dies aus der geringen Anzahl der Isolate bisher vermuten konnte. Dieses Beispiel verdeutlicht, daß eine auf der 16S-rRNA-Phylogenie eines unkultivierten Mikroorganismus basierende Kultivierungsstrategie nur dann erfolgreich sein kann, wenn es gelingt, aus den physiologischen Eigenschaften der kultivierbaren Verwandten selektive Wachstumsbedingungen abzuleiten. Es zeigt weiterhin, daß molekulargenetische Analysen mikrobieller Diversität stets von Kultivierungsbemühungen begleitet sein sollten, um Aussagen zur Funktion der jeweilgen Mikroorganismen treffen zu können.


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4.2.3. Molekulargenetischer Nachweis stickstofffixierender Mikroorganismen

Wie bereits am Beispiel der selenatreduzierenden Bakterien ausgeführt (s. 4.2.3), kann die in-vitro Kultivierung eines nur phylogenetisch charakterisierten Mikroorganismus durch eine geringe Korrelation zwischen 16S-rRNA-Phylogenie und Physiologie erschwert sein. Versuche zur selektiven Anreicherung und Isolierung sind jedoch auch limitiert, wenn der unkultivierte Mikroorganismus phylogenetisch einer Gruppe schwer kultivierbarer Bakterien oder Archaea zugeordnet wurde. So zeigen beispielsweise nahezu alle nitrifizierenden oder methanotrophen Bakterien und viele Vertreter der methanogenen Archaea aufgrund langer Generationszeiten und komplexer Nährstoffansprüche in Laborkulturen ein geringes Zellwachstum. Diese Organismen besitzen einen spezialisierten Metabolismus der durch die direkte Identifizierung der funktionellen Gene kulturunabhängig nachgewiesen werden kann. Holmes et al. (1995) nutzten diesen Ansatz durch Nachweis des für die große Untereinheit der Methanol-Dehydrogenase kodierenden Gens, um die 16S-rDNA-basierende Analyse methanotropher Bakterien zu ergänzen. In einer vergleichbaren Arbeit wurde das Strukturgen amoA der Ammonium-Monooxygenase zur Überprüfung der kulturunabhängigen Analyse ammoniumoxidierender Bakterien in Belebtschlamm verwendet (Juretschko et al., 1998). Im TCB-dechlorierenden Konsortium konnten die 16S-rDNA-Sequenzen methanogener, Methanosarcina-ähnlicher Archaea nachgewiesen werden. Da eine Reihe von Methanosarcina spp. diazotroph wachsen können (Lobo und Zinder, 1992), ist ein stickstofffixierender Phänotyp der unkultivierten Vertreter denkbar. Eines der Schlüsselenzyme der Stickstofffixierung, die Dinitrogenase-Reduktase (NifH-Protein), bietet sich zur Ergänzung 16S-rDNA-basierender Untersuchungen an, da die NifH-Phylogenie im wesentlichen mit der der 16S-rDNA übereinstimmt (Hennecke et al., 1985; Ueda et al., 1995). So konnten im TCB-dechlorierenden Konsortium NifH-Proteinsequenzen nachgewiesen werden, die sowohl mit der typischen, molybdenhaltigen (NifH2) als auch der alternativen Dinitrogenase-Reduktase (NifH1) nahezu identisch waren und die funktionell wichtigen Aminosäuren enthielten. Dies ist als sicherer Hinweis auf die Anwesenheit bisher unkultivierter, diazotropher Methanosarcina spp. zu werten und bestätigt somit die aus der 16S-rDNA-Phylogenie abgeleitete Vermutung zum Metabolismus dieser Organismen. Der molekulargenetische Nachweis des diazotrophen Phänotyps erleichtert möglicherweise eine Isolierung dieser Organismen, da die Verwendung eines Methanosarcina-Kultivierungsmediums, das


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keinen gebundenen Stickstoff enthält, eine sehr selektive Anreicherung gewährleisten sollte.

Die Analyse der übrigen NifH-Proteinsequenzen des TCB-transformierenden Konsortiums zeigte eine unerwartet hohe Diversität stickstofffixierender methanogener Archaea. Wenngleich die nahezu identischen Sequenzen SN-8, SN-10 und SN-42 möglicherweise von einem Organismus stammen und unterschiedliche Genkopien repräsentieren, wie dies für Paenibacillus azotofixans beschrieben ist (Rosado et al., 1998), so läßt sich doch vermuten, daß die Euryarchaeota-Diversität nicht durch die untersuchten rDNA-Sequenzen der Euryarchaeota-spezifischen rDNA-Genbibliotheken allein bestimmt werden kann.

4.3. Einfluß der Kultivierungsbedingungen auf die Dechlorierungsleistung und Populationszusammensetzung des TCB-dechlorierenden Konsortiums

Die Analyse undefinierter mikrobieller Konsortien ist zwar geeignet die ökologischen Faktoren zu bestimmen, die eine anaerobe TCB-Dechlorierung beeinflussen, sie gibt jedoch wenig Auskunft über den biochemischen Mechanismus dieses Prozesses. Dennoch läßt sich aufgrund unabhängiger Untersuchungen vermuten, daß die schrittweise anaerobe Dechlorierung von TCB zu DCB, MCB und Benzol durch reduktive Dehalogenierung in einem anaeroben respiratorischen Prozess erfolgt (zur Übersicht s. Holliger und Schraa, 1994; Wohlfarth und Diekert, 1997). In diesem Fall dienen die chlorierten Benzole als terminale Elektronenakzeptoren und die Gegenwart alternativer Elektronenakzeptoren wie Sulfat oder Nitrat kann die Dechlorierungsleistung verringern (zur Übersicht s. Mohn und Tiedje, 1992). Bei der anaeroben, mikrobiellen Dechlorierung TCB-belasteter Wässer (z.B. Grund- oder Prozesswasser) können diese Aspekte von wesentlicher Relevanz sein, da mit einer Reihe potentieller Elektronenakzeptoren zu rechnen ist. Aus diesem Grund wurde der Einfluß von Nitrat auf die TCB-Dechlorierung im anaeroben Wirbelschichtreaktor untersucht. Es zeigte sich, daß die Zudosierung von Nitrat mit einem starken Anstieg des Redoxpotentials und einem Abfall der Dechlorierungsleistung verbunden war und dieser Effekt teilweise umkehrbar war, wenn dem Reaktor erneut Mineralsalzmedium ohne Nitrat zugeführt wurde. Ansätze zur Quantifizierung des TCB-dechlorierenden Konsortiums in diesen Kultivierungsphasen konnten nicht befriedigen. Eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit klonspezifischen


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Oligonukleotidsonden (”full-cycle-rRNA-analysis“; Amann et al., 1995; Snaidr et al., 1997; Schuppler et al., 1998) erlaubte zwar den Nachweis von Bakterien der Klonfamilien SJA-186 und SJA-118 im Bioreaktor vor der Zuführung von Nitrat, jedoch verhinderten die mit der Immobilisierung des TCB-transformierenden Konsortiums verbundenen Probleme, wie Zellaggregation und Autofluoreszenz, eine quantitative Analyse. Auch die Untersuchung von rDNA-Genbibliotheken, die den Zustand des Konsortiums jeweils vor und nach der Zudosierung von Nitrat repräsentierten, ergab keine Aufschlüsse über etwaige Verschiebungen innerhalb der Population, da drei der fünf gewählten SJA-Klonfamilien in keiner der Genbibliotheken E, F, G und H wiedergefunden werden konnten.

Der Nachweis von Vertretern der Klonfamilien SJA-19 und SJH-171 im TCB-transformierenden Konsortium etwa zwei Jahre nach der ersten Probennahme und die Regenerationsfähigkeit der Mischkultur nach erneuter Zudosierung von Mineralsalzmedium ohne Nitrat lassen jedoch vermuten, daß die Zusammensetzung des Konsortiums durch die Zuführung von Nitrat nicht nachhaltig gestört wurde und es nicht zu einer signifikanten Austragung wichtiger Mitglieder der Population aus dem Wirbelschichtreaktor kam.

4.4. Ausblick

In der vorliegenden Untersuchung eines anaeroben, aus Saalesediment angereicherten, TCB-dechlorierenden Konsortiums wurde durch kulturunabhängige und kulturabhängige Methoden eine hohe bakterielle Diversität nachgewiesen. Da vergleichbare Untersuchungen anaerober, TCB-dechlorierenden


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Konsortien bisher nicht publiziert sind, muß die Frage, inwieweit es sich dabei um ein generelles Merkmal solcher Populationen handelt, unbeantwortet bleiben. Die vielfältigen hypothetischen und nachgewiesenen energiemetabolischen Fähigkeiten der Bakterien erklären die Fähigkeit des untersuchten TCB-dechlorierenden Konsortiums kurzfristige Störungen, wie etwa ein Ansteigen des Redoxpotentials im Wirbelschichtreaktor, auszugleichen. Diese begrenzte Selbstregulation ist besonders bei einer Behandlung komplexer Abwässer von Vorteil. Der Nachweis bisher unkultivierter Dehalobacter spp. mit einem vermuteten dechlorierenden Phänotyp und die auffällige Übereinstimmung mit der in einem Chlororganika-kontaminierten, anaeroben Grundwasser (Wurtsmith-Standort; Dojka et al., 1998) beobachteten mikrobiellen Diversität zeigen die spezifische Struktur des TCB-dechlorierenden Konsortiums und geben Hinweise auf mögliche Indikatororganismen, die in weiteren reduktiv dechlorierenden Konsortien auftreten. So konnten kürzlich sowohl Dehalobacter-ähnliche als auch mit SJA- und Wurtsmith-Klonen verwandte rDNA-Sequenzen aus 1,2-Dichlorpropan-dechlorierenden, anaeroben Konsortien isoliert werden (C. Schlötelburg, mündliche Mitteilung). Die 16S-rDNA-basierende Analyse einer größeren Zahl reduktiv dechlorierender Konsortien wird genauere Aussagen über das Vorhandensein einer spezifischen Populationsstruktur erlauben. Ein quantitativer Nachweis von Indikatororganismen gestattet eine Korrelation der Zellzahl mit der Dechlorierungsaktivität und erlaubt somit ein Monitoring komplexer Mischkulturen, deren Verwendung besonders bei der Dechlorierung industrieller Abwässer aussichtsreich ist (Flora et al., 1994; Boucquey et al., 1995). Methodisch würden sich hierzu im Wirbelschichtreaktor aufgrund der geschilderten Probleme bei der FISH eine quantitative Hybridisierung direkt extrahierter rRNA oder eine quantitative RT-PCR anbieten (Stahl et al., 1988; Felske et al., 1998).
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