v. Wintzingerode-Knorr, Friedrich Wasmuth Lotar: Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität einer anaeroben, Trichlorbenzol-dechlorierenden Mischkultur
Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität einer anaeroben, Trichlorbenzol-dechlorierenden Mischkultur
Dissertation

zu Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl. Biol. Friedrich Wasmuth Lotar Frhr. v. Wintzingerode-Knorr ,

geboren am 20.8.1970 in Wolfsburg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J. Rabe

Gutachter:
1. Prof. Dr. B. Friedrich
2. Prof. Dr. Dr. U. B. Göbel
3. Prof. Dr. E. Stackebrandt

Tag der mündlichen Prüfung: 1. Juli 1999

Schlagwörter:
Trichlorbenzol, anaerobe Dechlorierung, Flußsediment, Mischkultur, 16S-rDNA, PCR, Polynukleotidsonden, Dehalobacter, nifH-Gen, anaerobe Selenatreduktion

ZUSAMMENFASSUNG

Chlorbenzole sind aufgrund ihrer weiten Verbreitung in Industrie und Landwirtschaft und ihrer geringen chemischen Reaktivität sowie guten Fettlöslichkeit ubiquitäre Umweltkontaminanten, die sich in der Nahrungskette anreichern. Eine natürliche, mikrobielle Dechlorierung dieser Verbindungen ist von besonderem Interesse, da die Toxizität chlorierter Benzole mit der Anzahl der Chlorsubstituenten steigt. Im Gegensatz zu Mono- und Dichlorbenzol, die durch aerobe Laborreinkulturen dechlorierbar sind, werden höher chlorierte Benzole bevorzugt unter anaeroben Bedingungen in Mischkulturen mit unbekannter Spezieszusammensetzung dechloriert. Bioreaktoren, in denen solche undefinierten Mischkulturen kontinuierlich kultiviert werden, sind eine vielversprechende Technik bei der Behandlung Chlorbenzol-kontaminierter Abwässer. Aufgrund der unbekannten Zusammensetzung der Population muß die mikrobielle Aktivität jedoch als ”black box“ betrachtet werden, was eine direkte Steuerung und Optimierung solcher Bioreaktoren erschwert. Zur Bestimmung der mikrobiellen Diversität einer in ihrer Zusammensetzung unbekannten, Trichlorbenzol(TCB)-dechlorierenden Bioreaktorkultur wurde aufgrund der bekannten Limitierungen kulturabhängiger Methoden die kulturunabhängige, vergleichende Sequenzanalyse direkt amplifizierter und klonierter 16S-rDNA gewählt. Die durch eine neuentwickelte Hybridisierungsmethode wesentlich vereinfachte Analyse der 16S-rDNA-Genbibliotheken erlaubte eine phylogenetische Klassifizierung der in der TCB-dechlorierenden Mischkultur abundanten Mikroorganismen (Bakterien und Archaea) und zeigte das Auftreten von 51 bakteriellen 16S-rDNA-Klonfamilien, mit einem weiten phylogenetischen Spektrum und teilweise enge Verwandtschaften zu anaerob dechlorierenden Dehalobacter spp. oder zu unkultivierten Bakterien eines vergleichbaren Biotops. Dieser Diversität stand eine dominierende Methanosaeta-ähnliche Klonfamilie innerhalb der Archaea gegenüber. Die aus der phylogenetischen Klassifizierung abgeleiteten metabolischen Eigenschaften einiger Bakterien und Archaea der TCB-dechlorierenden Mischkultur konnten durch gezielte Anreicherung und in-vitro Kultivierung bzw. die kulturunabhängige Sequenzanalyse funktioneller Gene bestätigt werden. Die dargestellten Ergebnisse lassen eine spezifische Zusammensetzung der TCB-dechlorierenden Mischkultur vermuten und geben Hinweise auf Indikatororganismen, die ein Monitoring und eine damit verbundene Effizienzsteigerung der anaeroben TCB-Dechlorierung im Bioreaktor ermöglichen könnten.

Keywords:
Trichlorobenzene, anaerobic dechlorination, river sediment, mixed bacterial culture, 16S rDNA, PCR, polynucleotide probes, Dehalobacter, nifH gene, anaerobic selenate reduction

ABSTRACT

Due to their widespread application in industry and agriculture and their chemical stability chlorobenzenes (CB) are ubiquitous pollutants in soil, sediments, and aquifers. Since toxicity of CBs increases with the number of chlorine substituents, microbial dechlorination of CBs is of major interest. In contrast to di- and monochlorobenzenes (DCB and MCB) higher chlorinated benzenes are more resistant to aerobic dechlorination. However, for these compounds reductive dechlorination by different anaerobic microbial communities is well known. Bioreactors inoculated with complex dechlorinating anaerobic microbiota seem to be promising technologies for bioremediation of CB-contaminated aquifers. Several studies showed the efficiency of such bioreactors in treating chloroaromatic contaminated wastewaters. However, due to the unknown species diversity microbial activity had to be treated as a ”black box“ and direct optimization was hampered. To determine the microbial diversity of an anaerobic consortium in a fluidized bed reactor used for dechlorination of trichlorobenzene (TCB) I employed comparative sequence analysis of 16S rRNA genes after direct PCR-amplification and cloning from community DNA since culture-based methods have shown to be strongly biased. The application of a new hybridization based screening approach for bacterial 16S rDNA clone libraries drastically simplified the analysis and allowed the phylogenetic classification of the abundant bacteria and archaea. A total of 51 bacterial 16S rDNA clone families were found, which showed a wide distribution among the main bacterial phyla. Several bacterial 16S rDNA clone families were closely related to anaerobic, dechlorinating Dehalobacter spp. and to yet-uncultured bacteria of a similar habitat. In contrast to the high bacterial diversity archaeal 16S rDNA clone libraries were clearly dominated by a Methanosaeta concilii-like clone family. Some yet-uncultured bacteria and archaea of the TCB-dechlorinating consortium were sufficiently closely related to studied organsims that reasonable physiological hypotheses could be formulated. These hypotheses were confirmed by either cultivation of the respective organism or by culture-independent sequence analysis of specific functional genes. The results suggest a specific community structure of the TCB-dechlorinating consortium and give evidence for indiator organisms. Moleculargenetic monitoring of these indicator organisms might allow the optimization of the continous TCB-dechlorination in the fluidized bed reactor.


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur mikrobiellen Diversität einer anaeroben, Trichlorbenzol-dechlorierenden Mischkultur
Danksagung
Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1.1.Chlorbenzole in der Umwelt
1.2.Mikrobielle Dehalogenierung chlororganischer Verbindungen
1.3.Einsatz mikrobieller Konsortien in Bioreaktoren zur anaeroben Dechlorierung chlororganischer Verbindungen
1.4.Kulturunabhängige, molekulare Analyse mikrobieller Diversität
1.5. Ziel der Arbeit
1.6.Analyseschema
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1.Material
2.1.1.Anaerobes, Trichlorbenzol-dechlorierendes Konsortium
2.1.2.Chemikalien
2.1.2.1.Fotochemikalien
2.1.2.2.DNA-Marker
2.1.2.3.Kits
2.1.2.4.Oligonukleotide
2.1.3.Puffer und Lösungen
2.1.4.Nährmedien
2.1.4.1. Nährmedien zur Anzucht von Referenzstämmen
2.1.4.2.Nährmedien zur Anreicherung und Isolierung von Bakterien
2.1.4.2.1.Aerob-Medien
2.1.4.2.2.Anaerob-Medien
2.1.4.3. Medien für rekombinante E. coli Stämme
2.2.Methoden
2.2.1.Anreicherung und Isolierung von Bakterien aus Bioreaktormaterial
2.2.1.1.Entnahme von Bioreaktormaterial zur Anreicherung und Isolierung von Bakterien
2.2.1.2.Isolierung fakultativ aerober Bakterien
2.2.1.3.Isolierung anaerober Bakterien
2.2.1.3.1.Isolierung nitratreduzierender Bakterien
2.2.1.3.2.Isolierung selenatreduzierender Bakterien
2.2.2.Stammhaltung
2.2.3.Präparation von Nukleinsäuren
2.2.3.1.Entnahme von Bioreaktormaterial zur DNA-Präparation
2.2.3.2.Präparation von DNA aus Bioreaktormaterial
2.2.3.3.Präparation von DNA aus mikrobiellen Reinkulturen
2.2.3.4.Präparation von Plasmid-DNA aus rekombinanten E. coli-Zellen (Mini-Prep)
2.2.3.5.Präparation von Nukleinsäuren aus rekombinanten E. coli-Zellen für die Slot-Blot Hybridisierung (Colony Slot-Blot)
2.2.4.Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
2.2.4.1.Agarosegele
2.2.4.2.Polyacrylamidgele
2.2.5.Quantitative Analyse von Nukleinsäuren
2.2.6.In-vitro Amplifizierung von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.2.6.1.PCR-Amplifizierung der 16S-rDNA aus Bakterien-Reinkulturen
2.2.6.2.PCR-Amplifizierung der 16S-rDNA aus Archaea-Reinkulturen
2.2.6.3.PCR-Amplifizierung von 16S-rDNA aus Konsortiums-DNA
2.2.6.4.PCR-Amplifizierung von nifH-Genfragmenten aus Konsortiums-DNA
2.2.6.5.PCR-Amplifizierung klonierter DNA
2.2.6.6.PCR-Amplifizierung und DIG-Markierung von 16S-rDNA-Fragmenten
2.2.6.7.Direkte Aufreinigung PCR-amplifizierter DNA
2.2.7.Klonierung PCR-amplifizierter DNA
2.2.7.1.TA-Klonierung
2.2.7.2.LIC-Klonierung
2.2.7.2.1.Präparation des PCR-Produktes
2.2.7.2.2.Präparation des Plasmid-Vektors
2.2.7.2.3.T4-DNA-Polymerase Behandlung
2.2.7.2.4.Klonierung und Transformation
2.2.7.3.Anlage von 16S-rDNA Genbibliotheken aus Konsortiums-DNA
2.2.7.4.Anlage von nifH-Genbibliotheken aus Konsortiums-DNA
2.2.8.DIG-Markierung von Oligonukleotiden
2.2.9.Sequenzierung von DNA
2.2.10.Vergleichende 16S-rDNA Sequenzanalyse
2.2.11.Vergleichende Sequenzanalyse abgeleiteter nifH-Genprodukte (NifH-Sequenzen)
2.2.12.Filter-Hybridisierungen
2.2.12.1.Dot-Blot
2.2.12.2.Slot-Blot (Colony-Slot-Blot)
2.2.12.3.Hybridisierung mit DIG-markierten DNA-Sonden
2.2.13.In-situ-Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden
2.2.13.1.Fixierung von Zellmaterial
2.2.13.2.Hybridisierung
2.2.13.3.Nachweis fluoreszenzmarkierter Zellen
3 ERGEBNISSE
3.1.Charakterisierung des TCB-dechlorierenden Konsortiums durch Analyse von 16S-rDNA-Genbibliotheken
3.1.1.DNA-Extraktion und Anlage der 16S-rDNA-Genbibliotheken
3.1.2.Analyse der 16S-rDNA-Genbibliotheken A und B durch Hybridisierung mit DIG-markierten rDNA-Fragmenten
3.1.3.Bestimmung artifizieller, chimärer 16S-rDNA-Sequenzen
3.1.4.Phylogenetische Klassifizierung der SJA-Klonsequenzen durch vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse
3.1.5.Zusammensetzung der 16S-rDNA-Genbibliotheken C und D und phylo-genetische Klassifizierung der Klonsequenzen durch vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse
3.1.6.Zusammensetzung der 16S-rDNA-Genbibliotheken E-H und phylogenetische Klassifizierung einzelner Klonsequenzen durch vergleichende 16S-rDNA-Sequenzanalyse.
3.2.Charakterisierung des TCB-dechlorierenden Konsortiums durch vergleichende Analyse abgeleiteter NifH-Sequenzen.
3.3.Gezielte Isolierung und Kultivierung von Bakterien des TCB-dechlorierenden Konsortiums.
3.3.1.Isolierung und Charakterisierung fakultativ aerober und nitratreduzierender Bakterien
3.3.2.Isolierung und Charakterisierung selenatreduzierender Bakterien
3.4.Nachweis bisher nicht kultivierter Bakterien des TCB-dechlorierenden Konsortiums mittels 16S-rRNA-gerichteter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
4 DISKUSSION
4.1.Bestimmung mikrobieller Diversität mittels kulturunabhängiger, molekulargenetischer Methoden
4.1.1.Einfluß experimenteller Faktoren auf die Bestimmung der mikrobiellen Diversität des TCB-dechlorierenden Konsortiums mittels direkter, PCR-vermittelter Analyse ribosomaler RNA-Gene
4.1.2.Analyse bakterieller rDNA-Genbibliotheken mittels Hybridisierung mit PCR-amplifizierten, DIG-markierten rDNA-Fragmenten
4.1.3.Rückschlüsse auf den Metabolismus der unkultivierten Mikroorganismen des TCB-dechlorierenden Konsortiums nach vergleichender 16S-rDNA-Sequenzanalyse
4.2.Ergänzende Untersuchungen zum Metabolismus einzelner Mikroorganismen des TCB-dechlorierenden Konsortiums
4.2.1.Isolierung fakultativ aerober sowie nitratreduzierender Bakterien
4.2.2.Isolierung selenatreduzierender Bakterien
4.2.3.Molekulargenetischer Nachweis stickstofffixierender Mikroorganismen
4.3.Einfluß der Kultivierungsbedingungen auf die Dechlorierungsleistung und Populationszusammensetzung des TCB-dechlorierenden Konsortiums
4.4.Ausblick
Bibliographie LITERATURVERZEICHNIS
Anhang A ANHANG
Anhang A Publikationen
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tab. 1.2.1 Anaerobe Bakterien, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur metabolischen Dechlorierung aus der Umwelt isoliert wurden (erweitert nach El Fantroussi et al., 1998).
Tab. 2.1.1.1 Betriebsbedingungen des Wirbelschichtreaktors zum Zeitpunkt der Probennahmen.
Tab. 2.1.2.4.1 Sequenzen und Zielregionen der verwendeten Oligonukleotide.
Tab. 2.2.6.3.1 Primerkombinationen und Reaktionsprofile unterschiedlicher PCR-Typen für die Amplifizierung von 16S-rDNA aus Konsortiums-DNA.
Tab. 2.2.7.3.1 PCR-Ansätze, Template-DNA und Klonierungsmethoden der 16S-rDNA Genbibliotheken.
Tab. 2.2.7.4.1 Aus Konsortiums-DNA angelegte nifH-Genbibliotheken.
Tab. 3.1.2.1 Durch Hybridisierung mit DIG-markierten rDNA-Fragmenten und Sequenzierung ermittelte SJA-Klonfamilien.
Tab. 3.1.4.1 Sequenzhomologien zwischen SJA-Sequenzen und ihren nächsten phylogenetischen Verwandten.
Tab. 3.1.4.2 16S-rDNA-Sequenzhomologien zwischen SJA- und SJB-Klonen der Klonfamilie SJA-19 und Vertretern der Gattung Dehalobacter.
Tab. 3.1.5.1 Sequenzhomologien zufällig ausgewählter MCONC-negativer SJC- und SJD-Klone zu ihren phylogenetisch nächsten Verwandten.
Tab. 3.1.6.1 Häufigkeiten einzelner Klonfamilien in den 16S-rDNA-Genbibliotheken A, B und E-H.
Tab. 3.2.1 Identitäten zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der SN-Klone und bekannten, mikrobiellen NifH-Proteinsequenzen*.
Tab. 3.3.1.1 16S-rDNA-Sequenzhomologien der acht partiell sequenzierten OLA- und RNA-Isolate mit den Isolaten OLB-1 und OLB-2.
Tab. 3.3.2.1 16S-rDNA-Homologiegruppen selenatreduzierender Isolate.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1.1 Strukturdarstellung chlorierter Benzole mit industrieller Anwendung. Die isomeren Formen des 1,2-Dichlorbenzols (1,3-DCB und 1,4-DCB) und die des 1,2,3-Trichlorbenzols (1,2,4-TCB und 1,3,5-TCB) sind nicht gezeigt
Abb.1.2.1 Graphische Darstellung der bei anaeroben oder fakultativ anaeroben Mikroorganismen beobachteten Strategien zur Dechlorierung chloraliphatischer (Alkyl-) und chloraromatischer (Aryl-) Verbindungen.
Abb. 2.1.1.1 Schematische Darstellung des anaeroben Wirbelschichtreaktors zur kontinuierlichen Kultivierung des TCB-dechlorierenden Konsortiums (B. Selent, Technische Universität Berlin).
Abb. 3.1.1.1 Analyse des Gesamt DNA-Extraktes mittels Agarosegelelektrophorese. [1] Gesamt-DNA der Probennahme vom 31.1.95 (5 µl). Die DNA oberhalb des weißen Pfeils wurde eluiert und für die PCR-Amplifizierung verwendet. [2] DNA-Marker II (1 µl). Die Größe der Fragmente ist in bp angegeben.
Abb. 3.1.2.1 Dot-Blot-Hybridisierung der aufgereinigten Plasmid-DNA von SJA-Klonen (A-C) und SJB-Klonen (D und E) mit dem PCR-amplifizierten, DIG-markierten rDNA-Fragment des Klones SJA-103. Die rDNA-Inserts der Klone SJA-8, -69, -100, -102 und SJA-182 wurden sequenziert (Tab. III.2.2.1). Die Sequenzhomologien zwischen 96.4 und 98.1% zeigten die Zugehörigkeit zu einer Klonfamilie, die nach dem vollständig sequenzierten Klon SJA-102 benannt wurde. Die schwachen Hybridisierungssignale der Klone SJB-69 und SJB-146 wurden als negativ gewertet.
Abb. 3.1.4.1 Sekundärstruktur der aus rDNA-Klon SJA-88 abgeleiteten 16S-rRNA-Sequenz. Dargestellt sind die E. coli-Positionen 566 bis 884 mit den variablen Regionen V4 und V5. Kanonische Basenpaare (Watson-Crick Paarung) sind mit Linien verbunden, G:U-Basenpaare sind mit Punkten, A:G-Basenpaare sind mit offenen Kreisen und andere nichtkanonische Paarungen mit ausgefüllten Kreisen verbunden. Tertiäre Interaktionen zwischen einzelnen Nukleotiden (E. coli Position 575:880) und Nukleotidpaaren (E. coli Positionen 570-571:865-866) sind mit dickeren, langen Linien verbunden. Jede zehnte Position ist mit einem Strich markiert und jede 50ste nummeriert. Gegenüber der E. coli 16S-rRNA abweichende Nukleotide sind farbig markiert (modifiziert nach Gutell et al., 1994).
Abb. 3.1.4.2 Phylogenetische Beziehung repräsentativer SJA-Klone zu bakteriellen 16S-rRNA-Sequenzen. Die Analyse basierte auf dem Vergleich von 1228 Positionen. Aus dem zugrundeliegenden Sequenzalignment wurden mittels einer mit dem ARB-Programmpaket definierten Konsensusmaske hypervariable Bereiche bzw. unsichere Positionen ausgeschlossen. Die 16S-rRNA-Sequenzen von Methanosaeta concilii (X16932) und Thermoplasma acidophilum (M20822) wurden als Bezugsgruppe gewählt. Klonsequenzen, die in einer unabhängigen Studie (Dojka et al., 1998) aus einem kontaminierten Grundwasser isoliert wurden, tragen die Benennungen WCHB1, WCHA1 oder WsCH. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 1000-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind nicht markiert. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.
Abb. 3.1.4.3 Phylogenetische Klassifizierung von 144 untersuchten SJA-Klonsequenzen. [H/A] Holophaga/Acidobacterium Phylum. [GNS] Grüne schwefelfreie Bakterien. [NGC] Gram-positive Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt. [Alpha] alpha-Proteobakterien. [Beta] beta-Proteobakterien. [Gamma] gamma-Proteobakterien. [Delta] delta-Proteobakterien. [HGC] Gram-positive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt. [GS] Grüne Schwefelbakterien. [Un.] Unbekannte Zuordnung. [TM6] Phylum Cluster TM6 (Rheims et al., 1996). [OP10] Phylum Cluster OP10 (Hugenholtz et al., 1998). [WS1] Phylum Cluster WS1 (Dojka et al., 1998).
Abb. 3.1.5.1 Dot-Blot Hybridisierung mit der Oligonukleotidsonde MCONC. [A] In den obersten vier Reihen sind die PCR-amplifizierten rDNA-Inserts von 26 SJC-Klonen und in den übrigen Reihen die von 38 SJD-Klonen aufgetragen. Die mit einem Stern gekennzeichneten Felder markieren Positionen ohne DNA. Die mit A bis J gekennzeichneten Klone wurden sequenziert. A: SJC-11b; B: SJC-23b; C: SJC-92b; D: SJC-101a; E: SJC-111a; F: SJC-108a; G: SJC-125a; H: SJC-129a; I: SJC-131a; J: SJC-117a. [B] Mitgeführte Kontroll-rDNA. Methanococcus voltae DSM 1537, Haloferax volcanii DSM 3757, Methanosarcina mazei DSM 2053, Methanosaeta thermophila DSM 3870, Methanosaeta concilii DSM 3671, Methanosarcina barkeri DSM 800.
Abb. 3.1.5.2 Phylogenetisches Dendrogram zweier SJC/D-Klone, die kein Hybridisierungssignal mit der Oligonukleotidsonde MCONC zeigten. Die 16S-rDNA-Sequenzen von Methanosarcina barkeri DSM 800T und M. mazei DSM 2053T wurden in dieser Arbeit bestimmt (Accession numbers AJ012094 und AJ012095). Die 16S-rRNA-Sequenz von Methanococcus jannaschii (M59126) diente als Bezugsgruppe. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 100-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind nicht markiert. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.
Abb. 3.2.1 Nach der Neighbor-Joining Methode generiertes phylogenetisches Dendrogramm der aus nifH-Genfragmenten abgeleiteten Proteinsequenzen (SN-Sequenzen). Die Analyse beruhte auf dem Vergleich partieller NifH-Proteinsequenzen (113 Aminosäuren; Pos. 17-129, Azotobacter vinelandii [P00459]) kultivierter Bakterien und Archaea sowie zweier bisher nicht kultivierter Mikroorganismen (TKY-Sequenzen; Ohkuma et al., 1996). Die Sequenzen von vier Chlorophyll Eisen Proteinen wurden als Bezugsgruppe einbezogen. Die Benennung der Sequenzcluster erfolgte nach Chien und Zinder (1994). In Klammern sind zusätzliche identische Klonsequenzen angegeben. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 100-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind unmarkiert. Ein nach der Parsimony-Methode generiertes Dendrogramm zeigte ein identisches Verzweigungsmuster. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.
Abb. 3.3.1.1 Phylogenetische Beziehung der Isolate OLB-1, OLB-2 und RNA-111 innerhalb der Gattung Pseudomonas basierend auf dem Vergleich nahezu vollständiger 16S-rDNA-Sequenzen (min. 1400 bp). Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 200-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Die Klone SJA-38 und SJA-64 wiesen einen Sequenzunterschied von zwei bzw. einer Base gegenüber der 16S-rDNA des Isolates OLB-1 auf (E. coli Position 41-1501). Demgegenüber waren die Klonsequenzen SJA-67 und SJA-129 lediglich zu 97.5 bzw. 97.8% homolog mit der 16S-rDNA des Isolates OLB-2. Der Maßstab verdeutlicht 1% Sequenzunterschied.
Abb. 3.3.2.1 Kolonien selenatreduzierender Bakterien auf einer Agarplatte mit SN-Medium nach mehrwöchiger Inkubation. Ausgefallenes, elementares Selen verursacht die auftretende Rotfärbung.
Abb. 3.3.2.2 Phylogenetische Beziehung fünf repräsentativer selenatreduzierender Isolate. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrap-Analyse mit 100-facher Replikation überprüft. Signifikante Verzweigungspunkte (Bootstrapwerte >74%) sind mit einem schwarzen Punkt markiert. Verzweigungspunkte mit Bootstrapwerten zwischen 50 und 74% sind mit einem Kreis markiert. Nicht aufgelöste Verzweigungspunkte sind unmarkiert. Die 16S-rDNA-Sequenz von Methanobacterium formicicum dient als Außengruppe. Der Maßstab verdeutlicht 10% Sequenzunterschied.
Abb. 3.4.1 In-situ-Hybridisierung von Biofilmmaterial mit den für die Klonfamilien SJA-118 und SJA-186 spezifischen Oligonukleotidsonden 118+ und 186+. Ein zum gleichen Zeitpunkt entnommener Aufwuchskörper diente als Ausgangsmaterial für die Anlage der Genbibliothek E (2.12.96). Die Hybridisierung mit den Cy3-markierten Oligonukleotidsonden erfolgte als Doppelhybridisierung mit der FITC-markierten, bakterienspezifischen Oligonukleotidsonde EUB338 bei einer Formamidkonzentration von 23%. [A1] Phasenkontrastaufnahme einer Biofilmflocke. [A2] Epifluoreszenzaufnahme des gleichen Bildausschnittes nach Hybridisierung mit Sonde Cy3-118+. [B1] Phasenkontrastaufnahme einer weiteren Biofilmflocke. [B2] Epifluoreszenzaufnahme des gleichen Bildausschnittes nach Hybridisierung mit Sonde Cy3-186+. Bereiche der Biofilmflocke, die ein Fluoreszenzsignal der spezifischen Sonden zeigten, wiesen auch ein Signal der FITC-markierten Sonde EUB338 sowie ein DAPI-Signal auf (Daten nicht gezeigt).
Anhang 3: Anaerobes Wachstum des selenatreduzierenden Isolats Se-34 in SNS04-Medium. X-Achse: Zelldichte gemessen als OD600 Y-Achse: Menge gebildeten Selens in µg/g Zellmasse.

[Titelseite] [Danksagung] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [Bibliographie] [Anhang] [Selbständigkeitserklärung] [Lebenslauf]

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