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2  Einleitung

In der vorliegenden Arbeit werden die Methoden und Ergebnisse experimenteller Unter-­suchungen zum Differenzierungspotential von Zellen aus dem Knochenmark bzw. dem Blut der adulten Maus vorgestellt. Im Rahmen der zwischen Mai 1999 und April 2000 durchgeführten Versuche wurde speziell der Frage nachgegangen, ob Zellen des hämatopoetischen Systems dazu in der Lage sind, unter geeigneten in vitro-Bedingungen sowie nach Knochenmark­transplantation in vivo zu GFAP-exprimierenden Astrozyten zu differenzieren, und in vitro die Fähigkeit besitzen, die morphologischen Charakteristika residenter ZNS-Mikroglia zu entwi­ckeln. Um einen Beitrag zur Beantwortung dieser Fragen leisten zu können, wurden unterschied­liche experimentelle Ansätze gewählt, die auf der genetischen Markierung von Knochenmarkzellen und konsekutiv ihren Abkömmlingen (Leukozyten) mit dem grün fluores­zierenden Protein (GFP) beruhten. Die in vivo-Experimente bedienten sich des Modells der hete­rologen Knochenmarktransplantation der Maus mit GFP-markiertem Donorknochenmark. Die oben formulierte Frage nach dem Differenzierungspotential der transfizierten Zellen bezieht sich hier demnach auf zirkulierende Knochenmarkabkömmlinge, deren Schicksal nach Einwanderung ins Zentralnervensystem es zu untersuchen galt. Die in vitro Versuche hingegen wurden mit GFP-markiertem Knochenmark (whole bone marrow) durchgeführt, das neben hämatopoetischen Zellen auch Elemente anderer Zellreihen enthält. Aussagen über das Differenzierungsverhalten dieser Zellen müssen diesem Umstand Rechnung tragen. Im folgenden Abschnitt der Einleitung soll zuerst auf Eigenschaften und Verwendbarkeit von GFP näher eingegangen werden. Nach­folgend wird, soweit erforderlich, der gegenwärtige Erkenntnisstand über Morphologie und Funktion der von den genannten Fragestellungen berührten Zelltypen dargestellt: Astrozyten und Mikroglia (Abschnitte 2.2 und 2.3). Durch Transplantations- und Zellkultur-Experimente hat in jüngster Zeit die Hypothese neue Unterstützung erfahren, dass Zellen des adulten hämatopoeti­[Seite 10↓]schen Systems ein Differenzierungspotential besitzen, welches u. a. die Differenzierung in Zell­typen des ZNS einschließt (Abschnitt 2.4). Abschließend werden die zellulären pathophysiologischen Vorgänge nach transienter fokaler cerebraler Ischämie skizziert und in ihrer möglichen Bedeutung für das Differenzierungspotential einwandernder hämatogener Zellen dargestellt (Ab­schnitte 2.5 und 2.6).

2.1 GFP als biologischer Zellmarker

GFP (green fluorescent protein) ist ein fluoreszierendes Proteinmolekül, das in Zoelenteraten wie z. B. der pazifischen Qualle (Aequoria victoria) vorkommt und dort auch kloniert wurde (Tsien 1998). Es wurde in den sechziger Jahren entdeckt (Shimomura 1962) und als akzessori­sches Protein zu einem weiteren chemilumineszenten Protein, Aequorin, beschrieben. GFP ver­mittelt in der pazifischen Qualle die Konversion des von Aequorin emittierten blauen Lichtes in die für das Tier typische Grünfluoreszenz. Die biologische Bedeutung dieses Energietransfers (emission shift) ist noch ungeklärt. Das natürlich vorkommende GFP besteht aus 238 Aminosäu­ren und enthält einen chromophoren Imidazolring (aus Ser-Tyr-Gly), dessen Exzitati­onsspektrum bei 395 nm einen ausgeprägten und bei 475 nm einen kleineren Gipfel aufweist. Der Peak des Emissionsspektrums liegt bei 508 nm. GFP ist ein Dimer. Die Struktur eines jeden Monomers besteht in einem zylindrisch angeordneten β-Faltblatt, in dessen Inneren eine axial verlaufende Alpha-Helix die Chromophore trägt. Seit 1992 besteht die Möglichkeit der klonalen Expression des GFP-Gens in E. coli (Prasher 1992), wodurch gezeigt werden konnte, dass es auch diejenige Information enthält, welche für die erst posttranslational erfolgende Synthese des chromophoren Zentrums erforderlich ist. Das natürlich vorkommende GFP aus Aequoria weist einige physikochemische Eigenschaften auf, die für seine Verwendung im medizinisch­biologischen Bereich von Nachteil sind: Die Proteinfaltung wird bei Temperaturen über 20 °C [Seite 11↓]zunehmend gestört; sodann neigt das Protein bei höheren Konzentrationen zur Aggregation, und der bei 395 nm liegende Hauptexzitationsgipfel macht die Verwendung von ultraviolettem Licht erforderlich, was negative Auswirkungen sowohl auf das Auge des Untersuchers als auch auf die mit GFP markierte Gewebeprobe selbst haben kann. Aus diesen Gründen wurden mehrere, meist durch Punktmutationen konstruierte Proteinvarianten entwickelt, bei deren Verwendung die ge­nannten Probleme nicht oder zumindest weniger zum Tragen kommen. Innerhalb dieser Gruppe von Mutanten zeichnet sich besonders EGFP (E = enhanced) durch deutlich verbesserte Fluo­reszenzeigneschaften aus. Zwei Punktmutationen, die den Ersatz von Ser65 durch Threonin (S65T) und von Phe64 durch Leucin (F64L) zur Folge haben, bedingen sowohl ein mehrfach verstärktes Fluoreszenzsignal bei 37 °C als auch die Akzentuierung des zweiten Exzita­tionsmaximums, das zudem von 475 nm hin zu etwa 489 nm verschoben ist (Patterson 1997). Der Emissionsgipfel von EGFP liegt bei 508 nm und ermöglicht die einfache Detektion markier­ter Zellen. Aufgrund der Möglichkeit, GFP/EGFP als funktionelles Transgen in Säugerzellen zu exprimieren (Chalfie 1994), hat das Protein überragende Bedeutung für die Markierung von Zel­len, besonders aber als Marker für den Transfer anderer Gene erlangt. GFP ist intrazellulär im Cytoplasma und im Nucleus lokalisiert, was die homogene Markierung des gesamten Zelleibes zur Folge hat und besonders auch Aussagen über die Cytomorphologie erlaubt. Nucleolus und vesikuläre Zellorganellen bleiben im Rahmen der GFP-Expression ausgespart. GFP ermöglicht die direkte fluoreszenzmikroskopische oder durchflusszytometrische Detektion von Zellen in Echtzeit, so dass andere Kennzeichnungsverfahren mit immunhistochemischer Visualisierung des Markerantigens nicht erforderlich sind. Darüber hinaus bietet GFP - nach erfolgter Protein­faltung - den Vorteil einer relativ großen Stabilität gegenüber physikalischen und chemischen Noxen, da die dreidimensionale Struktur des Moleküls den nah dem geometrischen Zentrum gelegenen Imidazolring (s. o.) eng umhüllt und z. B. vor Sauerstoffradikalen schützt. Zahlreiche und regelmäßig angeordnete Wasserstoffbrückenbindungen bedingen eine weitgehende Thermo[Seite 12↓]­stabilität der Sekundär- und Tertiärstrukturen. Diese physikochemischen Eigenschaften erklären die lange Lebensdauer des GFP-Signals in vivo und in vitro (Yang 1996).

2.2 Astrozyten und das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP)

Die nicht-neuronalen Zellelemente des Zentralnervensystems von Säugetieren werden als Neu­roglia bezeichnet. Der Begriff „Glia“ wurde von Rudolf Virchow geprägt und bedeutet in An­lehnung an das griechische Adjektiv γλισχροσ (= klebrig, zäh) „Leim“ oder „Kitt“, was dem dichten und faserigen Charakter des interneuronalen Gewebes Rechnung trägt. Astrozyten bilden zusammen mit Oligodendrozyten die Gruppe der makroglialen Zellen in Gehirn und Rücken­mark. Zur Neuroglia des ZNS werden außerdem Mikrogliazellen sowie im weiteren Sinn Epen­dymozyten, Pituizyten, retinale Müller-Zellen und die Bergmann’schen Zellen im Kleinhirncortex gezählt (Zenker 1994). Im intakten Gewebeverband sind reife Astrozyten stern­förmig und besitzen einen großen, runden und zentral gelegenen Nucleus. Vom Zellkörper gehen nach allen Richtungen unterschiedlich lange Cytoplasmafortsätze aus. Entsprechend der Mor­phologie dieser Fortsätze werden fibrilläre und protoplasmatische Astrozyten unteschieden, wo­bei in Abhängigkeit von Lokalisation und Funktionszustand fließende Übergänge zwischen beiden Formen anzunehmen sind. Fibrilläre Astrozyten sind reich an cytoplasmatischen Interme­diärfilamenten; sie weisen dünne, unverzweigte Fortsätze auf und sind schwerpunktmäßig in der weißen Substanz lokalisiert, wo sie mit den Enden ihrer Pseudopodien in Wechselwirkung mit den im Marklager verlaufenden neuronalen Fasern treten. Protoplasmatische Astrozyten besitzen meist kürzere Fortsätze mit größerem Kaliber, die in variablem Ausmaß verzweigt sein können. Diese Zellen finden sich vorwiegend in der grauen Substanz des ZNS, d. h. in enger Nachbar­schaft zu Nervenzellen in den kortikalen und subkortikalen Kerngebieten. An der Oberfläche von Gehirn und Rückenmark bilden astrozytäre Endfüßchen die Membrana limitans gliae superficia­[Seite 13↓]lis, die nur durch eine Basalmembran von der Pia mater getrennt ist und sich entlang der penet­rierenden Blutgefäße als Membrana limitans gliae perivascularis in die Tiefe des Gewebes hin­ein forsetzt (Zenker 1994). Astrozyten wird eine zentrale Bedeutung für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Gewebestruktur des ZNS zugeschrieben. Aufgrund ihrer Fähigkeit, direkten Kontakt mit den übrigen Zellelementen einzugehen, tragen sie in ana­tomisch-mechanischer wie in physiologisch-funktioneller Hinsicht wesentlich zum Netzwerk aus Nerven- und Gliazellen bei. Astrozyten spielen eine wichtige Rolle für die lokale Ionenhomö­ostase im ZNS. Mit ihren zahlreichen Fortsätzen lagern sie sich an neuronale Perikarya, Axone und Synapsen an und sind über verschiedene Transportmechanismen in der Lage, Kaliumionen aus dem Extrazellulärraum aufzunehmen, die dort im Gefolge ständiger neuronaler Depolarisationsvorgänge akkumulieren. Eine weitere regulative Funktion erfüllen Astrozyten, indem sie A­minosäuren und (Ko-)Transmitter, die aus synaptischen Verbindungen herausdiffundieren, wieder aus dem Mikromilieu eliminieren. Zugleich synthetisieren sie selbst Botenstoffe und Re­zeptormoleküle, um aktiv an der elektrochemischen Signalvermittlung teilzunehmen: Parallel zur Aktivität benachbarter Synapsen können calciumabhängige Signalkaskaden in Astrozyten detek­tiert werden, die zur Freisetzung von z. B. Glutamat führen und auf diesem Wege wiederum den intrazellulären Calciumgehalt der synaptischen Strukturen modifizieren (Vesce 1999, Carmigno­to 2000). Die Endfüßchen von Astrozytenfortsätzen umhüllen kleine und kleinste Blutgefäße im Gehirn (s. o.), von deren Endothel sie nur durch eine Basallamina getrennt sind. Die räumliche Nähe dieser Strukturen erleichtert es den Astrozyten, Nährstoffe aus dem Blut aufzunehmen und an die benachbarten Nervenzellen weiterzuleiten (del Zoppo 2000), so dass sie zumindest im perivaskulären Bereich auch eine nutritive Funktion für Neuronen erfüllen. Astrozyten sind prin­zipiell proliferationsfähig und in der Lage, mit ihrem biosynthetischen Apparat auf Umgebungs­reize zu reagieren. Nachdem gezeigt werden konnte, dass Astrozyten sowohl Antigene prä­sentieren als auch proinflammatorische Cytokine freisetzen können (Aschner 1998, Ridet 1997), [Seite 14↓]wird ihnen eine wichtige Funktion für die Immunabwehr des ZNS zugeschrieben. Damit spielen sie eine große Rolle nicht nur bei infektiösen und autoimmunen, sondern auch im Rahmen trau­matischer und ischämischer Prozesse im Zentralnervensystem. Die zelluläre Reaktion von Astro­zyten nach fokaler cerebraler Ischämie soll in Abschnitt 2.6. ausführlich besprochen werden. GFAP bildet das wesentliche Intermediärfilament in reifen Astrozyten des zentalen Nervensys­tems von Säugetieren. Es ist ein komplex strukturiertes Polypeptid aus 430 (Nager) oder 432 (Mensch) Aminosäuren, besitzt ein Molekulargewicht von ca. 49 kD und gehört zur Gruppe der Zytoskelettproteine. GFAP wurde 1969 entdeckt (Eng 1970) und hat als immunhistochemischer Marker für Astrozyten und gliale Hirntumoren in den letzen Jahrzehnten weitreichende Bedeu­tung erlangt, da einerseits das Molekül hochspezifische antigene Epitope aufweist und anderer­seits GFAP-enthaltende Astrozyten in den verschiedensten Hirnarealen lokalisiert sind. Allerdings wird das Protein nicht spezifisch von ZNS-Astrozyten exprimiert (Eng 2000); Immu­noreaktivität für GFAP findet sich – wenn z. T. auch schwächer ausgeprägt – in unreifen Oligo­dendrozyten, nicht-myelinisierenden Schwann-Zellen (Barber 1982, Jessen 1985), retinalen Müller-Zellen (Björklund 1985), Kupffer-Stern-Zellen der Leber (Gard 1985), gliaähnlichen Zellen des Plexus myentericus Auerbach, Zellen der Zirbeldrüse sowie in Zellen verschiedener nicht-glialer Tumoren (Hypophysenadenome, Nierenzellkarzinom, Meningeom). Innerhalb des ZNS adulter Organismen variieren Expression von und Gehalt an GFAP zwischen Astrozyten verschiedenen Typs und unterschiedlicher Lokalisation (Kalman 1989, McLendon 1994): So exprimieren in der grauen Substanz vorwiegend die protoplasmatischen Astrozyten GFAP, wäh­rend dies im Album fast ausschließlich bei fibrillären Astrozyten der Fall ist. Bestimmte Areale weisen besonders starke Immunoreaktivität für GFAP auf, z. B. die Bergmann-Glia der Kleinhirnrinde, die subependymal gelegenen Astrozyten sowie die aus astrozytären Zellfortsätzen ge­bildete Membrana limitans glia superficialis an der Hirnoberfläche. Die Intensität des GFAP­Signals in Astrozyten ist nicht proportional mit dem GFAP-Gehalt der Zellen korreliert; viel­[Seite 15↓]mehr kann die Verstärkung der Immunoreaktivität z. B. bei pathologischen Prozessen unter an­derem auf einer Dissoziation der Intermediärfilamente beruhen, durch die eine größere Anzahl von Epitopen freigelegt wird (McLendon 1994). Bereits an dieser Stelle soll darauf hingewiesen werden, dass die immunhistochemische GFAP-Färbung am Gewebepräparat – anders als in vitro – nur eine eingeschränkte Sensitivität besitzt, so dass aus methodischen Gründen immer von der Existenz GFAP-negativer Astrozyten ausgegangen werden sollte (McLendon 1994, Korr 1994). Sowohl beim Menschen als auch bei Nagern lässt sich nachweisen, dass die GFAP-Expression in Astrozyten im Laufe des Lebens langsam zunimmt (Nichols 1993). Die gegenwärtigen Erkennt­nisse über die Funktion von GFAP sind vor allem mit Hilfe verschiedener Modelle gewonnen worden, die auf der funktionellen Ausschaltung dieses Intermediärfilaments beruhen (GFAP­Knockout-Mäuse sowie antisense-Studien mit Blockierung der GFAP-Synthese/Translation durch gegensinnige RNA-Oligonukleotide). Demnach hat GFAP wesentlichen Anteil an der Formation eines intakten Zytoskeletts, insbesondere der Ausbildung und Stabilisierung von Zell­fortsätzen (Weinstein 1991), die wiederum eine zentrale Rolle für Zell-Zell-Interaktion und Blut-­Hirn-Schranke spielen. Astrozyten GFAP-defizienter Mäuse (Knockouts) weisen hinsichtlich dieser Funktionen schwere Störungen auf. Elektrophysiologische Untersuchungen an Hippocam­pusneuronen solcher Tiere zeigten veränderte elektrische Eigenschaften der Nervenzellmembra­nen, so dass ein Zusammenhang zwischen der funktionellen Integrität astrozytärer Zellfortsätze und der synaptischen Erregungsübertragung angenommen wird (McCall 1996, Vesce 1999). Die massiv gesteigerte Synthese von GFAP in Astrozyten ist ein hervorstechendes Kennzeichen der reaktiven Astrogliose. Diese zelluläre Reaktion tritt unspezifisch im Gefolge praktisch jeder Ge­webeschädigung im ZNS auf und führt mittelfristig zur Entstehung einer gliösen Narbe im Läsi­onsgebiet (s. Abschnitt 2.6). Neben die Bedeutung des GFAP in der Immunhistochemie ist seit 1985 eine Vielzahl von experimentellen Möglichkeiten getreten, die sich durch die Klonierung des für GFAP kodierenden Gens ergeben haben (Lewis 1984). Das GFAP-Gen liegt bei Men­[Seite 16↓]schen und Nagern in einer einzigen Kopie vor und ist auf Chromosom 17q21 (human) bzw. 11 (murin) lokalisiert (Bongcam-Rudloff 1991, Bernier 1988). Die Gen- und Promotersequenzen weisen bei Mensch, Maus und Ratte weitgehende Homologien auf (z. B. Mensch-Maus 87%); eine entsprechend große Übereinstimmung findet sich unter den drei Spezies in bezug auf mRNA und Proteinsequenz (vgl. Brenner 1994). Die Regulation der Transskription erfolgt durch einen basalen Promoter, der eine TATA-Box enthält und 29 bp oberhalb der Initiationsstelle liegt, im Falle des GFAP-Gens aber die besondere Eigenschaft besitzt, durch Synergismus mit einem weiter unterhalb davon lokalisierten Element eine deutlich verstärkte Transskription in Gang zu setzen. Die Kenntnis der relevanten Gen- und Promotersequenzen erlaubt den gezielten Transfer von Reportergenen in murine Oozyten, so dass verschiedene transgene Mausmodelle entwickelt worden sind, in denen das jeweilige Transgen unter der Kontrolle des basalen GFAP­Promoters spezifisch in Astrozyten exprimiert wird (Mucke 1993, Brenner und Messing 1996, Zhuo 1997, Nolte 2001).

2.3 Mikroglia

Die Bezeichnung „Mikroglia“ wird zumeist für Zellen des Zentralnervensystems verwendet, die parenchymatös gelegen sind und im gesunden Gewebe einen länglichen Zellkörper besitzen, von dem mehrere dünne Zellfortsätze ausgehen. Diese teilen sich wiederum in kleinere Verzweigun­gen auf. Der Nucleus ist klein, ebenfalls länglich-oval und wird von einem Zytoplasmasaum um­geben. Mikrogliazellen mit dieser Morphologie werden auch als resident bzw. ramifiziert bezeichnet; sie kommen bei Säugetieren in allen Regionen des Zentralnervensystems vor. Erst­mals wurden sie 1932 von Astrozyten und Oligodendrozyten abgegrenzt (del Rio Hortega 1932). Einige Autoren weiten den Begriff der Mikroglia auf eine Zellpopulation aus, die perivaskulär lokalisiert ist und sich morphologisch von parenchymatösen Mikrogliazellen unterscheidet (Be­[Seite 17↓]cher 2000). Perivaskuläre Zellen sind nicht mit Perizyten zu verwechseln und sind vom Hirnpa­renchym durch eine Basalmembran getrennt. Im folgenden soll der Mikrogliabegriff in seiner engeren Bedeutung Anwendung finden und sich nur auf parenchymatöse Zellen beziehen. Mikrogliazellen weisen phänotypisch sowie funktionell einige Gemeinsamkeiten mit Blutmono­zyten und Gewebemakrophagen auf. Zum einen exprimieren sie bereits im nicht aktivierten Zu­stand Antigene, die ansonsten nur auf hämatogenen Zellen zu finden sind, so z. B. CD45, CD11b oder CD64 (vgl. Ulvestad 1994)1. Zum anderen sind sie nach adäquater Stimulation durch Erre­gerantigene, endogene Proteinprodukte oder untergegangene Zellen dazu in der Lage, zahlreiche Chemokine freizusetzen, phagozytotisch aktiv zu werden und Oberflächenmoleküle zu exprimie­ren, die ebenfalls für aktivierte Makrophagen charakteristisch sind. Beim Übergang von der ra­mifizierten zur reaktiven Form nehmen die Zellen zudem eine runde Morpologie an. Aufgrund der Expression des MHC-II-Moleküls können (humane) Mikrogliazellen zu den Antigen­präsentierenden Zellen innerhalb des ZNS gerechnet werden (Becher 2000). Mit diesen Eigen­schaften stellt die Mikroglia eine wichtige Grundlage für die Entstehung sowohl einer unspezifi­schen als auch einer spezifischen Immunantwort in Gehirn und Rückenmark dar. Der histologische Ursprung von Mikrogliazellen ist bis heute nicht abschließend geklärt. In der Lite­ratur findet sich überwiegend die Ansicht, dass sie im Gegensatz zu Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten mesodermaler Herkunft sind. Hierfür sprechen einerseits die Gemeinsamkei­ten mit Zellen des mononukleären Phagozytensystems (MPS), die sich sowohl auf die Funktion als auch auf die Antigenexpression beziehen. Diese gehen so weit, dass Mikrogliazellen seit ihrer Erstbeschreibung als residente Makrophagen des ZNS betrachtet werden (del Rio Hortega 1932, Banati 1991), die wie z. B. Kupffer-Stern-Zellen in der Leber einen gewebespezifischen Phäno­typ ausprägen. Zudem konnte gezeigt werden, dass bis in die frühe Postnatalzeit hinein Monozy­[Seite 18↓]ten-ähnliche Zellen aus dem Blut ins ZNS einwandern und sich dort zu amöboiden, später rami­fizierten bzw. residenten Mikrogliazellen differenzieren (Ling 1979, Perry 1988). Demgegenüber stützt sich die Hypothese eines neuroektodermalen Ursprungs der Mikroglia auf Arbeiten, die die Enstehung zumindest Mikroglia-ähnlicher Zellen aus neuroepithelialen bzw. astrozytären Kultu­ren dokumentierten, in denen myelomonozytäre Antigene ursprünglich nicht präsent waren (Hao 1991, Richardson 1993). Im adulten Gehirn sind Mikrogliazellen prinzipiell teilungsfähig; sie weisen eine enorm lange Lebenszeit sowie eine niedrige Umschlagsrate (turnover) auf. Die Auf­rechterhaltung einer konstanten Population wird zum einen durch lokale Proliferation gewähr­leistet (Alliott 1991, Lawson 1992). Zum anderen sind in den letzten Jahren Erkenntnisse darüber gewonnen worden, dass sich Mikrogliazellen im adulten ZNS auch unter physiologi­schen Bedingungen weiterhin aus dem Blut rekrutieren, was die Annahme ihrer hämatogenen Herkunft zusätzlich unterstützt. In Transplantationsexperimenten mit genetisch markiertem Kno­chenmark konnte an adulten Nagern auch in eigenen Studien gezeigt werden, dass sich hämato­gene Zellen an der ständigen Erneuerung perivaskulärer Zellen beteiligen (Hickey 1988, Lassmann 1993, Kennedy 1997, Bechmann et al. 2001), aber auch weiter ins Parenchym ein­wandern (de Groot 1992, Eglitis 1997, Kennedy 1998, Ono 1999, Brazelton 2000, Priller et al. 2001), dort mikroglial-monozytäre Marker exprimieren (de Groot 1992, Eglitis 1997, Brazelton 2000, Priller et al. 2001) und ramifizieren (de Groot 1992, Priller et al. 2001). Demgegenüber fanden sich in post-mortem Untersuchungen an Gehirnen von Patienten, die eine geschlechtsdif­ferente Knochenmarktransplantation erhalten hatten, zwar Donorzellabkömmlinge im Paren­chym und im perivaskulären Raum, ramifizierte Zellmorphologien wurden jedoch nicht beobachtet (Unger 1993). Auch wenn diese in vivo-Experimente größtenteils nur den hämatoge­nen, nicht aber den eindeutig monozytären Ursprung einer Mikroglia-Subpopulation nahelegen, spricht doch einiges dafür, dass es reife Monozyten sind, die ins ZNS einwandern und sich dort ensprechend differenzieren. Lawson et al. zeigten in vivo durch Tritium-Thymidin-Markierung [Seite 19↓]proliferierender Zellen, dass der Turnover F4/80-positiver Mikroglia zu etwa 45-53% durch die Einwanderung von monozytären Vorläufern zustande kommt, die ebenfalls F4/80 exprimieren (Lawson 1992, Kennedy und Abkowitz 1998). Ferner lassen sich Blutmonozyten, Milz­makrophagen und Mikrogliazellen, die separat auf Astrozyten kultiviert werden, morphologisch, immunhistochemisch und elektrophysiologisch nicht voneinander unterscheiden; alle drei Zell­typen nehmen in der Kokultur die ramifizierte Morphologie residenter Mikrogliazellen an (Sie­vers 1994a, Sievers 1994b, Schmidtmayer 1994, Wilms 1997).

2.4 Differenzierungspotential von Stammzellen aus dem Knochenmark

2.4.1 Differentielle Flexibilität von Stammzellen

Nach traditionellem Verständnis sind multipotente oder adulte Stammzellen in ihrem Differen­zierungspotential auf das Spektrum der in „ihrem“ jeweiligen Organ oder Gewebe vorkommen­den Zellen beschränkt. Diese Sichtweise impliziert, dass organspezifische Stammzellen sich gemäß eines früh determinierten genetischen Programms entwickeln, welches ausschließlich in diesem einen Organ bzw. Gewebe zum Tragen kommt und durch zelluläre Umgebungsbedin­gungen oder andere Einflüsse nicht mehr umzukehren ist. Hierfür sprechen zahlreiche Befunde, so z. B. die Beobachtung, dass sich undifferenzierte embryonale Gewebeanteile nach ihrer Ver­pflanzung in andere anatomische Regionen des Embryos entsprechend ihres Herkunftsortes wie­terentwickeln und nicht ihrer neuen Umgebung „entgegendifferenzieren“ (Anderson 2001). Ein analoges Phänomen findet sich im klinischen Vorkommen versprengter Gewebeanteile in ver­schiedenen Organen (z. B. Struma ovarii) oder auch bei embryonalen Tumoren. Dieses Konzept ist durch neuere Forschungsergebnisse in Frage gestellt worden. Es wurden Arbeiten vorgelegt, die erste Hinweise dafür liefern, dass die Flexibilität bzw. Plastizität adulter Stammzellen in be­[Seite 20↓]zug auf den Phänotyp ihrer Abkömmlinge weitaus größer sein könnte als bisher angenommen (Lemischka 1999, Morrison 2000). Hierbei handelt es sich sowohl um in vitro-Studien als auch um tierexperimentelle Arbeiten, von denen letztere zumeist auf Transplantationsversuchen ba­sierten (systemische Knochenmark- bzw. Stammzelltransplantation oder direkte intraparenchy­matöse Injektion/Infusion von Zellen). Als Kriterien einer erfolgten „Transdifferenzierung“ dienen vorwiegend die Zellmorphologie sowie die Expression zell- oder linienspezifischer Anti­gene. Unter den in vivo-Arbeiten weisen z. B. einige auf eine wechselseitige Plastizität von Stammzellen aus Knochenmark und Skelettmuskulatur hin. Es konnte einerseits gezeigt werden, dass Donor-Knochenmarkzellen sich in die Skelettmuskulatur der Empfängertiere integrierten (Gussoni 1999, Ferrari 1998). Andererseits konnte die Fähigkeit von Myozyten zur Repopulation des hämatopoetischen Systems dokumentiert werden (Jackson 1999). Von besonderem Interesse ist die Beobachtung, dass die Flexibilität von Stammzellen eine Differenzierung in Zelltypen einschließen könnte, die sich normalerweise von einem anderen Keimblatt herleiten als die Stammzelle selbst. So fanden sich nach Transplantation angereicherter hämatopoetischer Stammzellen in zahlreichen Organen bestrahlter Rezipienten Hinweise auf eine epitheliale Um­differenzierung hämatogener Zellen, so z. B. in Leber (Petersen 1999, Lagasse 2000), Ösopha­gus, Darm, Lunge und Haut (Krause 2001). Eine Reihe weiterer Experimente ergab Hinweise auf die Fähigkeit von Knochenmarkstammzellen bzw. ihren Abkömmlingen, einen neuronalen oder astrozytären Phänotyp anzunehmen (in vivo: Eglitis 1997, Eglitis 1999, Azizi 1998, Kopen 1999, Mezey 2000, Brazelton 2000, Chen 2000a, Chen 2000b, Li 2000, Li 2001, Priller et al. 2001; in vitro: Woodbury 2000, Sanchez-Ramos 2000). Im folgenden Abschnitt soll hierauf aus­führlich eingegangen werden. Auch für die potentielle Umkehrbarkeit einer solchen „Transdiffe­renzierung“, von neuralen Stammzellen hin zu Zellen des hämatopoetischen Systems, liegen Hinweise vor (Bartlett 1982, Bjornson 1999). Die Fähigkeit neuraler Stammzellen, sich zu Zel­len aller drei Keimblätter zu differenzieren, wurde anhand chimärer Embryonen (Maus, Hühn­[Seite 21↓]chen) dokumentiert (Clarke 2000). Diese Befunde werden allerdings teilweiwse von Morshead et al. relativiert und durch in vitro möglicherweise auftretende genetische oder epigenetische Ver­änderungen erklärt (Morshead 2002).

2.4.2 Knochenmark als Quelle potentiell transdifferenzierender Stammzellen

Im Hinblick auf zukünftige Therapieoptionen stellt Knochenmark eine vergleichsweise leicht zugängliche Quelle von Stammzellen dar. Es wird angenommen, dass adultes Knochenmark mindestens zwei Arten von multipotenten Stammzellen enthält, die beide mesenchymalen Ur­sprungs sind und jeweils zur Aufrechterhaltung unterschiedlicher Zellsysteme innerhalb des Knochenmarkorgans beitragen: hämatopoetische Stammzellen sowie stromale Stammzellen. Letztere repopulieren die Zellen des Knochenmarkstromas. Stromale Zellen (marrow stromal cells/MSC) stellen eine heterogene Zellpopulation dar, die sich u. a. aus Fibroblasten, Retiku­lumzellen, dendritischen Zellen und Adipozyten zusammensetzt. In hämatopoetisch aktivem Knochenmark proliferieren diese Zellen nicht und erfüllen im Zusammenspiel mit den Zellen des blutbildenden Systems wichtige myelosupportive und immunologische Funktionen. Bei systemi­scher Infusion oder Injektion von Knochenmarkzellen in myeloablativ bestrahlte Empfängertiere muss davon ausgegangen werden, dass ein heterogenes Gemisch aus hämatopoetischen und stromalen Zellen einerseits sowie mehr und weniger differenzierten Zellen andererseits übertra­gen wird. Die Zuordnung von Knochenmarksabkömmlingen in den Organen der Chimären zu einer der beiden genannten Stammzellarten ist daher nicht ohne weiteres möglich, weshalb die möglichst weitgehende Aufreinigung und Spezifizierung der transplantierten Zellen ein wichti­ges Postulat für Transplantationsexperimente darstellt2. Murine hämatopoetische Stammzellen [Seite 22↓](HSC) kommen mit einer Häufigkeit von etwa 1 zu 100.000 Zellen im Knochenmark vor (Harri­son 1990). Sie lassen sich mittels der Durchflusszytometrie prospektiv anreichern, indem aus dem entnommenen Knochenmarkgemisch Zellen mit den Phänotypen AA4+Sca-1+c-­Kit+Lin(KTSL)-/low oder Sca-1+c-Kit+Thy1.1low Lin(KTSL)-/low isoliert werden3, wobei die Spezi­fität der Prozedur von der Anzahl der hinzugezogenen Antigene abhängt (Spangrude 1988, Cheshier 1999, Terskikh 2001). Eine hämatopoetische Ur-Stammzelle konnte bisher noch nicht eindeutig abgegrenzt werden (vgl. Gage 2000). Angereicherte HSC mit anhaltender Fähigkeit zur Selbsterneuerung besitzen ein hohes und nachhaltiges Repopulationspotential, was sich daran zeigt, dass zur erfolgreichen Rekonstitution lethal bestrahlter Empfängertiere wenige Zellen – bis hin zu einer einzigen (Krause 2001) – ausreichen, während dazu bei Transplantation von Kno­chenmarkgemisch mehr als 100.000 Zellen erforderlich sind. Zahlreiche Transplantationsexpe­rimente haben die Hypothese bestätigt, dass im adulten Organismus Zellen aus der Zirkulation die Blut-Hirn-Schranke passieren und ins Hirngewebe übertreten. Dieser Prozess findet auch unter quasi-physiologischen Bedingungen statt, d. h. ohne ein weiteres Schadensmodell, das über die mit der Transplantation verbundene Bestrahlung hinausgeht. Der am besten untersuchte und am häufigsten reproduzierte Befund besteht im Nachweis perivaskulärer Zellen und parenchymatöser Mikroglia, die anhand ihrer Markierung als von Donorzellen abstammend erkannt werden können. Im Abschnitt 2.3. wurde auf diesen Sachverhalt ausführlicher eingegangen. Die Differenzierung hämatopoetischer Zellen über die Keimblattbarriere hinweg wurde erstmals von Eglitis und Mezey (1997) beschrieben, die nach Transplantation stammzell­defizienter Mäuse mit retroviral markiertem oder gegengeschlechtlichem Knochenmark sowohl makroglial als auch mikroglial umdifferenzierte Donorzellen im Hirnparenchym fanden, wobei sich dieser Befund auf die Expression des mikroglial-monozytären Antigens F4/80 bzw. von GFAP stützt. In einem ähnlichen Modell mit Tranplantation neugeborener Mäuse wurden im Großhirn der Chimären [Seite 23↓]Donorzellabkömmlinge detektiert, die neuronale Antigene wie NeuN, Neuronen-spezifische E­nolase (NSE) und GFAP exprimierten (Mezey 2000a, Mezey 2000b). Mit Ausnahme des Nach­weises einer Kolokalisation von GFAP und GFP konnte dieser Befund auch an adulten Mäusen bestätigt werden, die keinen hämatopoetischen Stammzelldefekt aufwiesen (Brazelton 2000). Stromale Knochenmarkzellen sind im Gegensatz zu den meisten Zellen der Hämatopoese in Kul­tur adhärent, eine Eigenschaft, die in zahlreichen Protokollen für ihre Isolierung ausgenutzt wird (Friedenstein 1968, Azizi 1998, Colter 2001). Allerdings teilen sie dieses Verhalten mit Monozy­ten; von diesen können sie aufgrund der fehlenden Expression des monozytären Antigens CD11b separiert und auf diese Weise immunodepletiert werden (Kopen 1999). Weitere Methoden der Isolierung stromaler Knochenmarkzellen sind beschrieben worden, darunter die Dichtegradien­tenzentrifugation (Pittenger 2000, Sanchez-Ramos 2000) sowie die Immunodepletion auf Basis der negativen Immunoreaktivität für Sca-1 bei murinen Zellen (Sanchez-Ramos 2000). Aus adul­tem Knochenmark konnten multipotente stromale Stammzellen (auch: mesenchymale Stammzel­len oder CFU-fibroblastic) isoliert werden (Friedenstein 1968), die unter den entsprechenden Zellkulturbedingungen die Fähigkeit besitzen, sich in Knorpel-, Knochen-, Fett-, Bindegewebs- ­oder Stromazellen zu differenzieren (Friedenstein 1968, Friedenstein 1974, Bianco 1988, Kopen 1999). Ausgereifte Stromazellen (Adipozyten, Chondrozyten oder Retikulumzellen) besitzen sowohl in vivo als auch in vitro das Potential, sich ineinander umzuwandeln (Bianco 1988, Ben­nett 1991). Humane stromale Zellen erwiesen sich nach Injektion ins Striatum von Ratten als ähnlich migrationsfähig wie implantierte neurale Stammzellen und Astrozyten; zudem riefen sie keine lokale Immunantwort hervor und differenzierten sich nicht in mesenchymale Zellarten (Azizi 1998). Nach intraventrikulärer Infusion ins Gehirn neugeborener Mäuse fanden sich im­munodepletierte stromale Stammzellen bzw. ihre Nachkommenschaft in allen Hirnregionen ein­schließlich neurogenetisch relevanter Areale; einige Zellen in Striatum und Hirnstamm zeigten darüber hinaus Immunoreaktivität für GFAP und gelegentlich auch Neurofilament (Kopen1999). [Seite 24↓]Sca-1-negative Knochenmarkzellen exprimieren in Kultur auf fetalen Neuronen (Maus, Ratte) vereinzelt astrozytäre oder neuronale Marker (Sanchez-Ramos 2000). CD11b- und CD45­negative stromale Zellen nahmen in Kultur die Morphologie ausgereifter Neuronen an und exprimierten Antigene wie NSE, Tau, NeuN und trkA, nicht aber GFAP (Woodbury 2000). Zu­sammenfassend muss davon ausgegangen werden, dass die Fähigkeit stromaler Stammzellen, sich in Zellen neuroektodermalen Typs umzuwandeln, sowohl in vitro als auch in vivo noch nicht abschließend geklärt ist. Bevor in Abschnitt 2.6. ausführlich auf die Frage eingegangen wird, inwieweit die fokale cerebrale Ischämie als Läsionsmodell zu neuen Erkenntnissen über das Dif­ferenzierungspotential vonStammzellen aus dem Knochenmark beitragen kann, sollen im fol­genden die zellulären Reaktionen auf eine lokal begrenzte ischämische Schädigung des ZNS im Überblick dargestellt werden.

2.5 Zelluläre Reaktionen nach fokaler cerebraler Ischämie

Es existieren verschiedene Tiermodelle zur Erforschung der Pathomechanismen, die im Rahmen einer cerebralen Ischämie in Gang gesetzt werden und das Ausmaß sowohl des strukturellen als auch des funktionellen Residualschadens bestimmen. Auch wenn diese Modelle die Bedingun­gen des ischämischen Schlaganfalls beim Menschen immer nur unvollständig abbilden, konnten weitreichende Erkenntnisse über die zellulären Abläufe gewonnen werden, die als Folge der Blutflussunterbrechung auftreten und mit entsprechender Vorsicht auch für die humane Situation angenommen werden können (Garcia 1984, McAuley 1995). Bei dem im tierexperimentellen Teil der vorliegenden Arbeit verwendeten Versuchsmodellen handelt es sich um eine transiente bzw. permanente fokale cerebrale Ischämie, bei der mittels eines in die A. carotis interna einge­führten Fadens die Durchblutung des gesamten Mediastromgebietes vorübergehend bzw. dauer­haft unterbrochen wird (Hara 1997). In Abhängigkeit von der Ischämiedauer ergeben sich [Seite 25↓]Infarktareale verschiedener Größe. Aufgrund von regionalen Unterschieden hinsichtlich Durch­blutung und Kollateralversorgung sind bei der fokalen Ischämie bestimmte Gewebeareale stärker und andere wiederum schwächer vom Perfusionsdefizit betroffen. Dort, wo die Durchblutungs­störung ausreichend lange anhält, wird die Schwelle der letalen Zellschädigung überschritten, und es kommt aufgrund eines akuten Substratmangels zum nekrotischen Untergang erst der Neu­ronen und später aller übrigen Zellen (Pannekrose). In diesem Bereich (core bzw. Infarktkern) beträgt die Blutflussreduktion mindestens 85%; nach MCAO erstreckt er sich auf die lateralen Basalganglien und den angrenzenden somatosensorischen Cortex (Lipton 1999). Daran angren­zend liegt eine Übergangszone (Penumbra), in der die Abnahme der Perfusion (auf < 40%) vor­erst nur eine subletale, d. h. potentiell reversible Nervenzellschädigung nach sich zieht, während die übrigen Zelltypen kaum oder gar nicht in Mitleidenschaft gezogen werden (Hossmann 1995). Die fokale cerebrale Ischämie löst eine inflammatorische Reaktion aus, an der hämatogene, mak­ro- und mikrogliale Zellen beteiligt sind. Besonders für die Penumbra wird ihr – zumindest teil­weise - ein schädigender Effekt zugeschrieben, der noch lange nach Beginn der Reperfusion den progredienten Untergang funktionell wichtiger Gewebselemente unterhält und damit zur weite­ren Ausbreitung des Infarktes beiträgt. Zahlreiche experimentelle Strategien zielen darauf, diese lokale Entzündungsreaktion pharmakologisch einzudämmen und klinisch verwendbare Kandida­ten für eine neuroprotektive Therapie des cerebrovaskulären Insults auszumachen. Im Kontext der vorliegenden Arbeit von größerer Bedeutung sind Ansätze, die auf der systemischen oder intracerebralen Transplantation potentiell transdifferenzierender Zellen beruhen und auf diesem Wege die Regeneration des geschädigten Gewebes zu fördern versuchen.

2.5.1 Neuronen

Unterschiedliche Nervenzellpopulationen differieren hinsichtlich ihrer Vulnerabilität gegenüber [Seite 26↓]einem ischämisch bedingten Substratmangel. Dieses Phänomen wird auch als Pathoklise be­zeichnet und spiegelt die funktionelle bzw. metabolische Heterogenität von Nervenzellen unter­schiedlicher Lokalisation wider. Wie andere Zellen auch, reagieren Neuronen auf eine letale Zellschädigung mit ihrem nekrotischen oder apoptotischen Untergang. Nekrose und Apoptose sind nach fokaler Ischämie gemeinsam auftretende Prozesse. Apoptotische Neuronen dominieren in Bereichen mit primär weniger gravierender Zellschädigung, sind also wesentlich zahlreicher in der Penumbra zu finden als in der core-Region. Unspezifische Auslöser des „programmierten Zelltodes“ sind u. a. NO, freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies, erhöhtes intracelluläres Calcium, verminderte mitochondriale Aktivität, Desintegration der Mikrotubuli und die Freiset­zung von Cytochrom-c aus Mitochondrien (Lipton 1999). Eine zusätzliche Rolle spielen Cytoki­ne und Neurotoxine, die im Rahmen der Aktivierung von Leukozyten und Gliazellen sezerniert werden (Linnik 1993, Li 1995, Braun 1996, Stoll 1998).

2.5.2 Leukozyten

Die Einwanderung von Leukozyten ins Hirnparenchym nach fokaler cerebraler Ischämie ist als Diapedeseprozess beschrieben worden, der durch die enge Wechselwirkung von Endothelzellen und Leukozyten gekennzeichnet ist (Garcia 1994, Ritter 2000). Bei erhaltener Minimalperfusion wird er sowohl durch permanente als auch durch eine transiente Ischämie in Gang gesetzt; bei letzterer läuft er verstärkt erst nach Einsetzen der Reperfusion ab (Ritter 2000). Unter dem Ein­fluss sogenannter L-Selectine auf Leukozyten kommt es zum rolling, bei dem sich die Zellen an die Gefäßwand anlagern. Zytokine aus dem ischämisch und inflammatorisch geschädigten Endo­thel induzieren die leukozytäre Expression verschiedener Adhäsionsmoleküle bzw. Integrine, welche die Verbindung zwischen Leukozyten und Endothel verstärken (adhesion). Durch Inter­zellularspalten zwischen den Endothelzellen treten die Leukozyten schließlich ins Parenchym [Seite 27↓]über (migration). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Einsetzen der Ischämie werden unter­schiedliche Leukozytenpopulationen vorzugsweise rekrutiert. Auf diese Weise erhält die Beteili­gung hämatogener Zellen an der lokalen Entzündungsreaktion ein zeitliches Muster: Am Anfang steht dabei die innerhalb der ersten 12 Stunden einsetzende Einwanderung vorwiegend neutrophiler Granulozyten in den Infarktkern (Clark 1993), an die sich nach 1 bis 3 Tagen eine von zahlreichen Monozyten/Makrophagen dominierte Abräumphase anschließt, in der allerdings hämatogene und mikrogliale Reaktion ineinandergreifen.

2.5.3 Mikroglia

Mikrogliazellen sind sowohl an der spezifischen als auch an der unspezifischen Immunantwort im Zentralnervensystem beteiligt. Sie sind in der Lage, apoptotische oder geschädigte Zellen in ihrer unmittelbaren Umgebung zu erkennen und daraufhin eine inflammatorische Reaktion anzustoßen (Devitt 1998). Im aktivierten Zustand sind Mikrogliazellen zuerst durch den Verlust ihrer ramifizierten Morphologie und eine gesteigerte Proliferationstätigkeit gekennzeichnet (Streit 1988). Im weiteren Verlauf wird die Freisetzung von Chemokinen initiiert und graduell gestei­gert, wobei sich das Ausmaß der Aktivierung im Spektrum der sezernierten Effektorstoffe wider­spiegelt. Die überwiegend proinflammatorisch wirksamen Zytokine fördern die Permeabilisation der Blut-Hirn-Schranke sowie den weiteren Leukozyteneinstrom aus dem Blut; gleichzeitig kommt es zur Ausschüttung direkt zytotoxischer Substanzen wie TNF und reaktiver Sauerstoff­spezies (vgl. Becher 2000). Schließlich werden Mikrogliazellen wie Makrophagen phagozyto­tisch aktiv, können aber von diesen dann weder morphologisch noch immunhistochemisch eindeutig unterschieden werden, da sie zugleich weitgehend identische intrazelluläre und memb­ranständige Marker exprimieren (Perry 1993, George 1994). Schroeter et al. (1997) konnten an Monozyten-depletierten Ratten zeigen, dass die phagozytäre Umwandlung residenter Mikroglia­[Seite 28↓]zellen der Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut um einige Tage vorausgeht, d. h. schon unmittelbar nach Beginn der Ischämie einsetzt. Nach Ergebnissen von Kato et al. kann davon ausgegangen werden, dass Mikrogliazellen innerhalb von Minuten aktiviert werden und damit die früheste nicht-neuronale Zellpopulation darstellen, die auf die Ischämie bzw. auf den Unter­gang benachbarter Neurone reagiert (Kato 1996). Noch nicht endgültig geklärt ist die Frage, zu welchen Anteilen Zellen beiderlei Herkunft am lokalen Geschehen beteiligt sind und inwieweit sie sich dabei funktionell unterscheiden.

2.5.4 Astrozyten

In der Penumbra reagieren subletal geschädigte Astrozyten primär unspezifisch mit zellulärer Hypertrophie, Proliferation und Steigerung ihrer biosynthetischen Aktivität (Smith 1997). In diesem Zustand werden sie als reaktive Astrozyten bezeichnet; mit Blick auf den gesamten Pro­zess spricht man von reaktiver (Astro-)Gliose. Der Übergang von der ruhenden zur aktivierten Zelle äußert sich u. a. in der massiv gesteigerten Synthese von unspezifischen Intermediärfila­menten wie GFAP, S100-beta und Vimentin (Boyes 1986, Vijayan 1990). Nach fokaler cerebra­ler Ischämie bildet sich rasch ein signalintensiver Astrozytenwall um das Infarktgebiet herum, während in der core-Region ab dem ersten bis zweiten Tag praktisch kein GFAP mehr nach­weisbar ist (Chen 1993, Li 1995). Die Hochregulation von Zytoskelettproteinen in Astrozyten ist vom Alter des Organismus und von der räumlichen Distanz zum Läsionsort abhängig. Bei neu­geborenen Nagern sind Ausdehnung und Intensität des GFAP-Signals deutlich geringer als bei adulten Tieren (Ridet 1997). Zu den unspezifischen Kennzeichen reaktiver Astrozyten gehört die mäßig erhöhte Expression von Rezeptoren für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF (Reilly 1996) und den Epidermalen Wachstumsfaktor EGF (Nieto-Sampredo 1988) als Ausdruck der gesteigerten Responsivität gegenüber der inflammatorisch veränderten Umgebung (Dorf 2000). [Seite 29↓]Einen direkten Einfluss auf das lokale Mikromilieu stellt die verstärkte Synthese und ggf. Sekre­tion von Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Enzymen und Adhäsionsmolekülen durch reaktive Astrozyten selbst dar. Hierzu gehören z. B. die vorwiegend proinflammatorisch wirkenden Inter­leukin-1 (IL-1), IL-6 und Tumornekrosefaktor α (TNF-α, Morganti-Kossmann 1992, Yu 2000), während TGF-beta (transforming growth factor), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet derived growth factor), IGF-I (insuline-like growth factor) und verschiedene FGF-Typen auf die weitere Astrogliose und eventuell sogar auf die Regeneration beschädigter Axone Einfluss neh­men, neuroprotektiv wirken oder den Wiedereintritt von Neuronen in den Zellzyklus induzieren (Bressler 1985, Kniss 1988, Morrison 1988). Die Glianarbe als mechanische Barriere stellt ein Hindernis für axonales Wachstum dar, schottet allerdings zugleich das verletzte Areal vom umgebenden gesunden Gewebe ab, so dass dieses wiederum vor einer weiteren Ausbreitung des krankhaften Prozesses geschützt ist. Versuche mit astrozytär-neuronalen Mischkulturen haben gezeigt, dass Astrozyten unter dem Einfluss von IL-1β Neurotoxine freisetzen. Trotzdem konnte in den letzten Jahren Evidenz dafür gesammelt werden, dass eine reaktive Gliose als Teilprozess der komplexen inflammatorischen Reaktion unter bestimmten Umständen die neuronale Regene­ration nicht nur fördert, sondern überhaupt erst möglich macht (Ridet 1997). Dafür spricht zum einen die gesteigerte Expression der oben genannten neurotrophen Faktoren durch reaktive Astrozyten; zum anderen werden von diesen Zellen auch verstärkt Adhäsionsmoleküle und ext­razelluläre Matrixproteine gebildet, deren permissiver Effekt auf das axonale Wachstum hinrei­chend dokumentiert werden konnte (Rutishauser 1996, Malhotra 1994, Aubert 1995, Chauvet 1996).


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2.6  Cerebrale Ischämie und Zelldifferenzierung

Cramer und Chopp (2000) widmeten eine ausführliche Übersichtsarbeit der Fragestellung, in­wieweit das Muster der funktionellen Erholung sowie die zellulären Reaktionen nach cerebraler Ischämie Parallelen zur normalen Entwicklung des Zentralnervensystems aufweisen. Anhand klinischer, funktionell-kernspintomographischer und tierexperimenteller Befunde werden zahl­reiche Gemeinsamkeiten zwischen Regeneration und Ontogenese zusammengetragen und disku­tiert. Für die vorliegende Arbeit von Interesse ist die Beobachtung, dass in ischämisch geschädigtem Hirngewebe Proteine wie z. B. Nestin exprimiert werden, die im adulten ZNS nicht oder kaum vorkommen und normalerweise eine Rolle im Rahmen der Entwicklung des Nervensystems spielen (Li 1999). Reaktive Astrozyten weisen also immunzytochemisch Ge­meinsamkeiten mit unreifen fetalen oder adulten Astrozyten auf, indem sie embryonale Marker ausprägen (Rutishauser 1996, Aubert 1995, Li 1999). Es besteht Unklarheit darüber, inwieweit sie durch einen Dedifferenzierungsprozess reifer Astrozyten entstehen oder aus unreiferen Vor­läuferzellen hervorgehen. Ohne eindeutige zelluläre Zuordnung konnten vor allem in der Pen­umbra Proteine identifiziert werden, die mit regenerativen Prozessen wie Synapto- oder Angiogenese assoziiert sind.Hierzu zählen u.a. Synaptophysin, dessen Hochregulation mit einer gesteigerten Anzahl an Synapsen sowohl in der ischämischen als auch in der nicht-ischämischen Hemisphäre korreliert (Stroemer 1998), der Gefäßendothel-abhängige Wachstumsfaktor (VEGF) als angionetisch wirksamer Faktor (Hayashi 1997) sowie die bereits genannten Wachstumsfakto­ren FGF (Finklestein 1990) und EGF. Mit diesen Beobachtungen korreliert die Annahme, dass das ischämiebedingt veränderte Umgebungsmilieu im Gehirn die Differenzierung der aus dem Blut einwandernden Zellen begünstigen kann. Die entsprechenden Experimente wurden zumeist an Ratten durchgeführt. Eglitis et al. unterzogen die Versuchstiere fünf bis sechs Wochen nach systemischer Knochenmarktransplantation einer transienten fokalen cerebralen Ischämie und [Seite 31↓]beschrieben das Vorkommen GFAP-positiver hämatogener Zellen in beiden Großhirnhemisphä­ren (Eglitis 1999). Dabei war der relative Anteil dieser Zellen an allen Astrozyten in der ischä­mischen Hemisphäre (4,7%) größer als auf der gegenüberliegenden Seite (1,8%). Eine weitere Arbeitsgruppe markierte Knochenmarkzellen mit Bromodesoxyuridin (BrdU) und brachte sie durch direkte intrastriatale Injektion oder durch Infusion in die ipsilaterale A. carotis interna (Li 2001) an den Ort des Infarkts. Bei den dabei verwendeten Zellen handelte es sich entweder um Knochenmarksgemisch (Chen 2000a) oder um stromale Knochenmarkzellen, die mittels ihrer Adhäsionseigenschaft isoliert worden waren (Chen 2000b, Li 2000, Li 2001). In einer Arbeit wurden sogar stromale Knochenmarkzellen der Ratte in das ischämische Striatum adulter Mäuse transplantiert (Li 2000). In allen Fällen fanden die Autoren im Gehirn BrdU-markierteDonorzel­len, die anhand ihrer Immunoreaktivität für NeuN und das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (MAP2, Li 2001) bzw. GFAP als Neurone bzw. Astrozyten identifiziert werden konnten.


Fußnoten und Endnoten

1 Expression von CD45 (common leukocyte antigen, OX1) kennzeichnet alle kernhaltigen reifen Blutbestandteile, CD11b (OX42) wird von allen Zellen der myelomonozytären Reihe einschließlich der Mikroglia exprimiert.

2 Dabei ist in Betracht zu ziehen, dass stromale Donorzellen wegen der relativ hohen Strahlenresistenz des Knochenmarkstromas im Rezipienten nur eine geringe Repopulationschance haben (vgl. Polli 2000).

3 Sca-1 = stem cell antigen 1, entspricht CD34 beim Menschen (Donelly 2001).



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28.09.2004