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5  Ergebnisse

Im folgenden werden die verwendeten experimentellen Ansätze noch einmal schematisch darge­stellt:


Abbildung 2:Übersicht über die in vivo Experimente



Abbildung 3: Übersicht über die in vitro Experimente


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5.1  Ergebnisse der in vivo - Versuche

5.1.1 Etablierung von GFAP/GFP-Knochenmarkchimären

Die für die Knochenmarkentnahme verwendeten GFAP-GFP-Donormäuse wurden zuvor durch PCR-Analyse von Gewebehomogenisat aus einer Schwanzbiopsie als transgen bestätigt. Unmit­telbar vor der Verwendung des Knochenmarkes wurden diese Tiere noch einmal auf ihre Trans­genität hin untersucht. Die zu diesem Zweck entnommenen nativen Gehirne der Donoren zeigten bereits bei normalem Tageslicht eine grün-gelbe Färbung des Cerebellums, die sich bei Anre­gung mit blauem Fluoreszenzlicht deutlich verstärkte und – mit geringerer Intensität - auf das gesamte Gehirn ausdehnte (Abb. 4 a – c). Zur weiteren mikroskopischen Untersuchung wurden die Hirne in PFA 4% nachfixiert. Im Album und Griseum der Donormäuse fanden sich zahlrei­che sternförmige Zellen mit verzweigten Zellfortsätzen und intensivem GFP-Signal (Abb. 5, 6). Sie wurden aufgrund ihrer immunhistochemisch nachgewiesenen GFAP-Expression als Astrozy­ten identifiziert. Auffällig waren dabei regionale Unterschiede in der Reaktivität der Astrozyten mit anti-GFAP. Auch das GFP-Signal war nicht in allen Zellen von gleicher Intensität (Abb. 6). Beide Befunde wurden von Nolte et al. im Rahmen der Charakterisierung dieses transgenen Mo­dells beschrieben (Nolte 2001). Die gleiche Arbeitsgruppe untersuchte die elektrophysiologi­schen Eigenschaften der GFP-positiven Zellen mittels Patch-clamp-Technik, wobei sich die gemessenen Membranströme als für Astrozyten charakteristisch herausstellten. Bei einem Donortier untersuchten wir auch Blutausstrich und Knochenmark auf die Expression von GFP hin, die in beiden Fällen nicht vorhanden war. In der Zusammenschau belegen diese Daten, dass GFP in den verwendeten transgenen Mäusen spezifisch in Astrozyten exprimiert wird.


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Abbildung 4:
Expression von GFP im Gehirn der GFAP/GFP-transgenen Donormaus. Bei 25-facher Vergrößerung sind im fluo­reszierenden Auflicht zahlreiche GFP-exprimierende Zellen auf der Cortexoberfläche des frisch entnommenen Ge­hirns zu erkennen (a). Die starke Grünfluoreszenz der Kleinhirnrinde (b, Aufsicht und c, Sagittalschnitt, jeweils x25) kommt durch die für das Modell charakteristische intensive Expression von GFP in der Bergmann-Glia zustande.

Abbildung 5:
Charakterisierung der GFAP/GFP-transgenen Donormaus für die Knochenmarktransplantation. In einem nativen Gefrierschnitt (20 µm) des Striatums finden sich zahlreiche Zellen mit intensiver Grünfluoreszenz (a, x200). Die Zellen besitzen ein dichtes Geflecht feiner Zytoplasmafortsätze, in denen das GFP-Signal etwas schwächer ausge­prägt ist als im Zelleib (a, b). Die konfokalen Teilabbildungen b - d (x400) zeigen jeweils die gleiche Zelle: GFP-­Fluoreszenz (b), GFAP-Färbung (c), Überlagerung beider Signale (d).


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Abbildung 6:
Charakterisierung der GFAP/GFP-transgenen Donormaus für die Knochenmarktransplantation. Die Aufnahmen wurden mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie angefertigt und zeigen GFP-positive Astrozyten im Cortex eines drei Monate alten transgenen Tieres (a). Nach immunhisto-chemischer Anfärbung von GFAP (b) und Überla­gerung (c) erweisen sich mehrere Zellen als doppelt markiert (Pfeilspitzen in c). Die Stärke des GFAP-Signals in Astrozyten ist bei in vivo-Färbungen physiologischerweise inhomogen; einige GFP-positive Zellen zeigen eine ge­ringere Immunoreaktivität für GFAP (Pfeile in c). Eine GFAP-positive Zelle exprimiert kein GFP (Stern in c) Die Bilddaten wurden aus einem Gewebesegment von 230 mm x 130 mm x 13 mm Größe errechnet.


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Insgesamt wurden 17Wildtypmäuse des Stammes FVBxC57bl6 mit Knochenmark aus transge­nen Donoren transplantiert. Ein Tier starb wenige Tage nach der Transplantation, während alle übrigen Chimären nach sechs Wochen lebten und im Bluttausstrich eine normale Morphologie der Erythrozyten und Leukozyten aufwiesen. Mittels PCR-Analyse von genomischer Leukozy­ten-DNA wurde zum gleichen Zeitpunkt die Präsenz des transgenen Konstrukts im peripheren Blut aller Tiere überprüft. Lediglich bei 3 Tieren war das Transgen nicht nachweisbar, so dass bei ihnen von einer ungenügenden Repopulation des Knochenmarks durch die applizierten Do­norzellen ausgegangen werden musste. Die 13 verbleibenden Chimären waren Träger des trans­genen Konstrukts in Leukozyten und wurden für die Versuche herangezogen (Abb. 7).

Abbildung 7:
Nachweis des transgenen Konstrukts in Leukozyten aus dem peripheren Blut mittels PCR. Die PCR-Produkte aus einer Transplantationsserie wurden auf einem Agarose-Gel separiert und anschließend mit Ethidiumbromid visuali­siert. Die verwendeten Primer detektierten das GFP-Gen.
Lanes 0 und 15: DNA molecular weight marker (1kb)
Lanes 1 und 2: GFAP/GFP-transgene Donormäuse
Lanes 3, 4, 6 und 9 – 12: Knochenmarkchimären. Das Transgen ist vorhanden.
Lanes 5, 7 und 8: Knochenmarkchimären. Das Transgen ist nicht vorhanden.
Lane 13: Negativkontrolle der spezifischen Genamplifikation (nicht transplantierte Maus).
Lane 14: Negativkontrolle der PCR (ohne DNA).


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Durch den auf diese Weise erbrachten positiven Nachweis der erfolgreichen Rekonstitution blieb allerdings die Frage unbeantwortet, ob bei den chimären Tieren Blutzellen, die sich vom trans­genen Donorknochenmark herleiten, auch dazu in der Lage sind, ins Zentralnervensystem ein­zuwandern. Für die Überprüfung dieser grundsätzlichen Fähigkeit war es erforderlich, ein Transplantationsexperiment mit Knochenmark durchzuführen, bei dem die übertragenen Zellen zuvor - unabhängig vom Transgen - eine stabile Markierung erhalten hatten. Diese Bedingung konnte durch die retrovirale Transfektion des transgenen Donor-Knochenmarks mit EGFP erfüllt werden. Durch Transplantationsversuchen mit GFP-transfiziertem Wildtyp-Knochenmark war bekannt, dass markierte Zellen aus dem Blut weit ins Gehirn der Chimären (C57bl6) einwandern und dort anhand ihres intensiven Fluoreszenzsignals gut detektierbar sind (Priller et al., 2001a). Dieser Prozess findet sowohl kontinuierlich nach Transplantation als auch massiv nach zusätzli­cher cerebraler Ischämie statt. Der Großteil der intraparenchymatös gelegenen Zellen ist stark ramifiziert und zeigt Immunoreaktivität für mikrogliale Marker wie Iba-1 und F4/80 (Abb. 8), was die Hypothese unterstützt, dass sich die Population der Mikrogliazellen auch in der adulten Maus teilweise aus einwandernden Blutzellen rekrutiert.

Abbildung 8:
Mikrogliazellen im Hirnparenchym einer GFP-Knochenmarkchimäre (C57bl6). Vier Wochen nachTransplantation von GFP-transfiziertem Knochenmark (nicht transgen!) erscheinen ramifizierte Donorzellabkömmlinge im Bulbus olfactorius und im weiteren Verlauf auch in anderen Hirnregionen. In diesem Bulbuspräparat sind die GFP-­positiven Zellen stark ramifiziert (a) und exprimieren den Makrophagen-Marker Iba-1 (b, c Überlagerung). Die weiße Färbung der zentralen Cytoplasmabereiche kommt durch Überstrahlungsartefakte zustande. Vergr. x250.


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Aufgrund dieser Befunde konnte davon ausgegangen werden, dass die Markierung von Kno­chenmark per Transfektion mit EGFP ein geeignetes Mittel darstellt, den oben geforderten Be­weis zu erbringen. Nachdem das Knochenmark aus den GFAP/GFP-transgenen Donoren entnommen worden war, wurde ein Teil der Zellen in vitro mit dem EGFP-Gen transfiziert. Das genaue Vorgehen entsprach dabei dem Protokoll, das im Kontext der Zellkulturversuche be­schrieben ist (vgl. Abschnitt 4.3). Es folgten die Aufbereitung und Transplantation der Zellen in 2 letal bestrahlte Rezipienten. Der Erfolg der Transfektion wurde durch Kultur einer kleinen Zellfraktion in Spezialmedium dokumentiert (vgl. Abschnitt 4.3.1.3). Vier Wochen nach Trans­plantation wurden beide Chimären einer fokalen cerebralen Ischämie unterzogen. Durch FACS-­Analyse von Vollblut aus beiden Mäusen konnte der Anteil GFP-exprimierender Zellen an allen Mac-1-positiven Monozyten im peripheren Blut auf 69,3 % bzw. 16,6 % beziffert werden. Die Überlebenszeiten der Tiere nach Ischämie betrugen 5 und 14 Tage. Die fluoreszenzmikroskopi­sche Analyse der Gehirne zeigte in beiden Fällen massive Infiltrate GFP-positiver Zellen im In­farktgebiet, aber auch zahlreiche ramifizierte Zellen in größerer Entfernung zum ischämischen Areal oder auch in der kontralateralen Hemisphäre (Abb. 9). Die Zellen mit mikroglialer Mor­phologie zeigten eine Kolokalisation von GFP und Iba-1 (Abb. 9).

Abbildung 9: Um nachzuweisen, dass hämatogene Zellen nach Repopulation des blutbildenden Systems durch GFAP/GFP-transgene Donorzellen ins Hirnparenchym einwandern, wurden letztere vor der Transplantation mit EGFP transfiziert. Die Abbildungen wurden von Hirnschnittpäparaten zweier Knochenmarkchimären 6 Wochen nach Transplantation und 3 bzw. 5 Tage nach MCAO angefertigt (a – f: Maus Nr. 1, g – i: Maus Nr. 2). Sowohl im infarktfernen ipsilateralen Cortex (a – c, x250) als auch in der striatalen Periinfarktzone (d – f, x400, und g – i, x400) finden sich ramifizierte Zellen im Parenchym, die EGFP und den mikroglialen Marker Iba-1 koexprimieren.

5.1.2 Nativscreening

Zwei der 13 erfolgreich rekonstituierten Knochenmarkchimären wurden ohne weitere Interventi­on 4 Monate nach Transplantation getötet. Nach Entnahme und Aufbereitung der Hirne wurden ausgewählte Schnitte einer immunhistochemischen Gliafärbung (anti-GFAP) unterzogen, die ein normales Verteilungsmuster der Astrozyten in der grauen und weißen Substanz zeigte. Jeder zehnte angefertigte Schnitt wurde unter Einbeziehung beider Hemisphären nach GFP-­exprimierenden Zellen durchsucht. In keinem der analysierten Hirnschnitten aller Tiere fanden sich GFP-positive Zellen.


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5.1.3  Tiere nach fokaler cerebraler Ischämie

In Anlehnung an die Arbeit von Eglitis et al. (Eglitis 1999), in der ein permissiver Effekt der cerebralen Ischämie auf die astrozytäre Differenzierung hämatogener Zellen postuliert wird, wurden acht Knochenmarkchimären 6 bis 12 Wochen nach Transplantation einer fokalen ce­rebralen Ischämie unterzogen. Bei jedem Tier wurde die Abnahme des linkshemisphärischen Blutflusses durch Laser-Doppler-Flowmetrie dokumentiert. Die Okklusion der A. cerebri media dauerte 60 min (n = 6) oder war permanent (n=2); die Reperfusionszeiten betrugen 1 bis 5 Tage. Zur Dokumentation des stattgehabten Infarktes wurde an ausgewählten Kryoschnitten eine Hä­matoxylin-Eosin-Färbung durchgeführt (Abb. 10a, 11a, 11b). Anhand histologischer Kriterien wie Nekrose, Zellhydrops und neuronaler Cytoplasmahypereosinophilie („red neurons“) wurde bei jedem Tier der linksseitige Infarkt bestätigt sowie dessen Ausdehnung auf Striatum und angrenzenden Cortex dokumentiert (Abb. 10a). Die immunhistochemische Färbung (anti-GFAP) weiterer Schnitte zeigte eine im zeitlichen Verlauf deutlich zunehmende Astrogliose der Periinfarktzone, während im nekrotischen Infarktkern die Expression von GFAP drastisch reduziert war (Abb. 10b, 11c). Jeder zehnte Schnitt durch den Infarkt (Frontalebene) wurde einer sorgfäl­tigen fluoreszenzmikroskopischen Suche nach GFP-exprimierenden Zellen unterzogen, wobei neben der infarzierten auch die kontralaterale Hemisphäre Berücksichtigung fand. Weder im Infarktbereich selbst noch in der astrogliotischen Zone oder auf der Gegenseite zeigten sich Zel­len mit GFP-Signal (Abb. 10c, 11d).


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Abbildung 10:
Transiente fokale cerebrale Ischämie. Die MCAO wurde 12 Wochen nach Transplantation mit GFAP/GFP-transgenem Knochenmark durchgeführt und dauerte 60 min. Die Überlebenszeit betrug 2 Tage. Das Infarktareal umfaßt weite Teile des dorsalen Striatums und den angrenzenden Cortex (a, HE, nicht vergrößert). Fluoreszenzmik­roskopisch sieht man, daß das GFAP-Signal im Infarktbereich nahezu vollständig verschwunden ist, während sich perifokal ein Wall aus Astrozyten mit starker GFAP-Antigenität ausgebildet hat (b). Im gleichen Bereich findet sich keine Expression von GFP (c). Vergrößerung x200.

Abbildung 11:
Transiente fokale cerebrale Ischämie. Die Teilabbildungen zeigen Gewebeschnitte aus dem Hirn einer GFAP/GFP-transgenen Knochenmarkchimäre. 12 Wochen nach Rekonstitution wurde das Tier einer MCAO von 60 min Dauer unterzogen. Die Überlebenszeit betrug 5 Tage. (a) läßt die Grenze des vorwiegend striatal lokalisierten Infarktes erkennen (Pfeile, HE, x100), b zeigt einen Ausschnitt aus dem betroffenen Striatum (HE, x200, x = Seitenventrikel). (c) Im Infarktgebiet sind nur Inseln des astrozytären GFAP-Signals erhalten. Im Bereich des Corpus callosum sieht man zahlreiche Astrozyten mit intensivem GFAP-Signal als Ausdruck der perifokalenreaktiven Astrogliose (x100). Im blauen Fluoreszenzlicht ist keine GFP-Expression im selben Schnitt sichtbar (d, x100).


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5.2  Ergebnisse der in vitro-Versuche

5.2.1 Charakterisierung der verwendeten Knochenmarkzellen aus Donormäusen

In den durchgeführten Zellkulturversuchen untersuchten wir das Potential muriner Knochen­markzellen, sich unter den gegebenen Kulturbedingungen in Zellen mit makroglialen oder mikroglialen Charakteristika zu differenzieren. Die dazu verwendeten Knochenmarkzellen ent­stammten drei verschiedenen - darunter zwei transgenen - Donortypen. Die Transfektion von Knochenmarkzellen mit dem Gen für EGFP erfolgte mittels eines murinen Stammzellvirus. In transfizierten Knochenmarkzellen war das EGFP-Signal im Verlauf aller weiteren Experimente stabil; auch nach 18 Tagen der Kokultur auf Astrozyten hatte es von seiner Intensität kaum ein­gebüßt. Hinweise auf eine zytotoxische Wirkung des EGFP-Moleküls auf die transfizierten Zel­len und ihre Abkömmlinge ergaben sich nicht; die erhaltene Proliferationsfähigkeit der Knochenmarkzellen konnte durch die Zunahme der Zahl GFP-positiver Zellen in den nachfol­genden Kokulturversuchen dokumentiert werden. Die Effektivität des Gentransfers wurde durch Kultivierung kleiner Mengen transfizierter Zellen in Methylcellulose-Medium untersucht. Bei der durchlicht- und fluoreszenz-mikroskopischen Auswertung dieser Kulturen fand sich regel­mäßig ein über 80% liegender Anteil der GFP-positiven Zellkolonien an der Gesamtzahl aller entstandenen Kolonien. Da jede isolierte Kolonie als aus einer einzigen Vorläuferzelle hervorge­gangen betrachtet werden kann (Zellklon), ergibt sich ein entsprechend hoher Prozentsatz für die Effektivität der Transfektion. Die als Donortiere verwendeten transgenen Mäuse, bei welchen das GFP-Gen an den β-Actin-Promoter gekoppelt war, zeigten bereits bei der Präparation eine safrangelbe Färbung des Muskel- und Fettgewebes als Hinweis auf die ubiquitäre Expression von GFP. Fluoreszenzmikroskopisch war in verschiedensten Körpergeweben dieser Tiere (Milz, Leber, Gehirn, Blutausstrich, Knochenmark) ein intensives und weitgehend homogen verteiltes [Seite 67↓]GFP-Signal zu beobachten (Abb. 12, 13). Bei der Kultur von Knochenmarkzellen erwies sich GFP als ebenfalls stabil.

Abbildung 12:
Charakterisierung der β-Actin/GFP-transgenen Donormaus. Das Diagramm zeigt das Ergebnis der durchflusszy­tometrischen Analyse von Blutleukozyten eines transgenen Tieres (a). Bei den grün aufleuchtenden Partikeln im Blutausstrich in Teilabbildung b handelt es sich um Thrombozyten; die Erythrozyten der β-Actin/GFP-transgenen Tiere weisen kein GFP-Signal auf.


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Abbildung 13:
Charakterisierung der ß-Actin/GFP-transgenen Donormaus für die Kokultur von Knochenmark auf Astrozyten bzw. organotypischen Hirnschnitten. Im gesamten Gehirn finden sich GFP-positive Zellen unterschiedlicher Morpholo­gie. (a) Palisadenförmig angeordnete (Purkinje-) Zellen in der Kleinhirnrinde, (b) Ramifizierte Zellen im Neocortex (Pfeile), (c) Meningeale (1), ramifizierte (2) und endotheliale Zellen (3) in der Nähe des Seitenventrikels, (d) korti­kale Zellen mit neuronaler Morphologie. Die Aufnahmen stammen aus zwei verschiedenenTieren.Vergrößerung x1000 (a, b), x400 (c, d).
Abbildung 16

FACS-Analyse der GFP- und Sca-1-Expression GFP-transfizierter Knochenmarkzellen nach Entnahme aus der Kokultur mit Virus-Producer-Zellen, d. h. vor Durchführung der Zellseparation mittels MACS. Aus dem vierten Diagramm und der nebenstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass bereits 69,05% der Zellen Sca-1-positiv sind (Summe aus beiden oberen Quadranten).

Das zweite transgene Versuchsmodell bestand in der Kultivierung von Knochenmark aus Mäusen, die EGFP unter der Kontrolle des humanen GFAP-Promoters exprimieren. Auf die Charak­terisierung dieses Modells wurde in Abschnitt 5.1.1. eingegangen. GFP-transfizierte Knochenmarkzellen wurden vor ihrer Verwendung in der Kokultur durch MACS nach der Expression des primitiven Stammzellmarkers Sca-1 aufgetrennt. Vor und nach dieser Prozedur wurde den Zellsuspensionen jeweils eine kleine Probe zur FACS-Analyse entnommen, um den relativen Anteil Sca-1-positiver Zellen zu bestimmen. Bereits vor Durchführung der MACS-­Prozedur betrug dieser in dem Zellgemisch bis zu 69% (Abb. 14), was wir auf das begünstigte Wachstum primitiverer Vorläuferzellen in Gegenwart von IL-3, IL-6 und rSCF während der [Seite 69↓]Prästimulations- und Kokulturphase zurückführten. Die Anreicherung Sca-1-positiver Kno­chenmarkzellen mittels MACS gelang bis auf 85,2 % (Anteil am als Sca-1-positiv bezeichneten Eluat, Abb. 15b). Der relative Anteil Sca-1-negativer Zellen am unfraktionierten Zellgemisch betrug bis zu 31% und konnte mittels MACS auf ca. 60% (FACS-Kontrolle) nahezu verdoppelt werden (Abb. 15a).

Abbildung 14:
FACS-Analyse der GFP- und Sca-1-Expression GFP-transfizierter Knochenmarkzellen nach Entnahme aus der Kokultur mit Virus-Producer-Zellen, d. h. vor Durchführung der Zellseparation mittels MACS. Aus dem vierten Diagramm und der nebenstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass bereits 69,05% der Zellen Sca-1-positiv sind (Sum­me aus beiden oberen Quadranten).


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Abbildung 15:
FACS-Analyse von GFP-transfizierten Knochenmarkzellen nach MACS (gleiche Probe wie in Abbildung 14).Teilabbildung a zeigt die Ergebnisse der Analyse für die vorwiegend Sca-1-negative Fraktion des Eluats: Der Anteil der Sca-1-negativen Zellen beträgt hier 60,93% (Summe aus beiden unteren Quadranten des dritten Dia­gramms). R1: Gate nach Zellgröße, R2: Gate nach Viabilität (Propidiumjodid-Färbung).Teilabbildung b zeigt die Ergebnisse der Analyse für die vorwiegend Sca-1-positive Fraktion des Eluats: Der Anteil der Sca-1-positiven Zel­len beträgt hier 85,2% (Summe aus beiden oberen Quadranten des dritten Diagramms). R1: Gate nach Zellgröße, R2: Gate nach Viabilität (Propidiumjodid-Färbung).


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5.2.2  Differenzierung von Knochenmarkzellen in Kultur auf Astrozyten

Die in einer Dichte von 10.000 Zellen/well auf konfluierenden Astrozyten-Monolayers ausgesä­ten Knochenmarkzellen waren generell überlebensfähig. Die Anzahl der ausgewerteten Experi­mente betrug n = 4 für transfiziertes Knochenmark und jeweils n = 1 im Falle der aus den zwei verschiedenen transgenen Donoren gewonnenen Knochenmarkzellen. Bei jedem Versuchsansatz wurden 5 Zeitpunkte (1, 3, 6, 12 und 18 Tage) und zu jedem Zeitpunkt mindestens 4 wells aus­gewertet. Die vor Anlage der Kokulturen erfolgte Markierung GFP-transfizierter Knochenmark­zellen mit BrdU, das von proliferierenden Zellen inkorporiert wird, diente der Prüfung des Ausmaßes, in dem transfizierte Zellen bzw. ihre Abkömmlinge im Verlauf der Zeit die Expressi­on von GFP herunterregulieren. BrdU-markierte Zellen waren durch ihr nukleäres Fluoreszenz­signal als Knochenmarkzellen kenntlich und kolokalisierten mit dem cytoplasmatisch exprimierten GFP (Abb. 16). Die Anzahl BrdU-immunoreaktiver Zellen in der Kokultur war der der GFP-positiven Zellen im gesamten Verlauf der Kokultur annähernd proportional (Verhältnis 2:1).

Abbildung 16:
Kokultur von GFP-transfizierten und mit BrdU markierten Knochenmarkzellen auf Astrozyten, Tag 6. Die Abbil­dung zeigt drei GFP-exprimierende Zellen (a), von denen zwei ein nukleäres BrdU-Signal aufweisen (b, c). Mehrere BrdU-positive Knochenmarkzellen exprimieren kein GFP. Vergrößerung x 250.


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Die mit GFP transfizierten Knochenmarkzellen erschienen unmittelbar nach Anlage der Kokul­tur zu 100% rund, waren nicht adhärent und zeigten 12 Stunden später Adhäsion an den zellulä­ren Untergrund, ohne bereits morphologische Veränderungen vollzogen zu haben. Nicht adhärente Zellen verschwanden in den ersten zwei Tagen der Kokultur zusehends. Sämtliche GFP-positiven Zellen waren deutlich kleiner als die darunterliegenden, zum großen Teil flächen­haft wachsenden Astrozyten. Innerhalb der ersten 1 bis 3 Tage begannen einzelne Knochen­markzellen Pseudopodien verschiedener Größe zu bilden, d. h. Zellfortsätze, die als wenig erhabene Ausstülpungen des Zelleibes oder als längere Struktur imponierten. Eine große Anzahl von Zellen hatte bereits eine spindelförmige Morphologie angenommen (Abb. 17). Am 6. Tag nach Beginn des Experiments zeigten 8-17von 100 in zwei zufällig gewählten Gesichtsfeldern (x100) ausgezählten GFP-positiven Zellen einen schmalen Zelleib mit zwei oder mehr Zellfort­sätzen, die sich in Sekundärfortsätze verzweigten (Abb. 18), was der klassischen Morphologie ramifizierter Mikrogliazellen in situ entspricht, wie sie von Hortega beschrieben wurde (del Rio Hortega 1932). Daneben fanden sich zahlreiche Zellen mit unverzweigten Fortsätzen, die sich in alle Richtungen erstreckten (Abb. 19). Zu den Untersuchungszeitpunkten 12 und 18 Tage war keine weitere Verzweigung EGFP-exprimierener Zellen im Sinne der Bildung von Tertiärfortsätzen zu verzeichnen. Der Anteil der ramifizierten Zellen lag bei 11-21% (12. Tag) bzw. 10-19% (100 ausgezählte EGFP-positive Zellen in zwei zufällig gewähltenen Gesichtsfeldern, x100). Diese Prozentbereiche gelten sowohl für die Kokultur mit Knochenmarkgemisch, d. h. ohne Auftrennung nach der Expression von Sca-1, als auch für die Kokultur mit einer der beiden Zellfraktionen (Sca-1-positiv und Sca-1-negativ). Nach immunhistochemischer Anfärbung des für Makrophagen und Mikrogliazellen spezifischen Iba-1-Antigens (Imai 1996, Ito 1998) zeigten alle ramifizierten Zellen eine Kolokalisation von EGFP und Iba-1-Texas Red bzw. -Cy-3 (Abb. 18, 20, 21, 22, 23, 24). Der größere Teil der EGFP-exprimierenden Zellen war zu den unterschiedlichen Zeitpunkten von runder oder spindelartiger Form mit bipolaren, z. T. sehr langen [Seite 73↓]Zellfortsätze. Bei einer großen, aber nicht weiter quantifizierten Fraktion der spindelförmigen Zellen fand sich ebenfalls Immunoreaktivität für Iba-1. Morphologie und Immunhistochemie sprechen dafür, dass es sich hierbei um adhärierende monozytäre Zellen handelte. Bei der Kultur von Knochenmark aus transgenen Donortieren, die GFP unter der Kontrolle des β-Actin-Promoters exprimieren, auf astrozytären Monolayers ergaben sich in der Aussage identische Ergebnisse. Ramifizierte Zellen mit GFP-Expression fanden sich in ähnlicher Anzahl allerdings erst ab dem 12. Tag in Kultur (17 von 100 gezählten Zellen), entsprachen in ihrer Morphologie aber den o. g. Mikroglia-ähnlichen Zellen. Wiederum zeigte ein Großteil dieser Zellen Kolokalisation von GFP mit dem Iba-1-Signal (Abb. 25,26).


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Abbildung 17:
Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten. Tag 3 der Kokultur. Die über­wiegende Mehrheit der bei Aussaat sphärischen Knochenmarkzellen hat sich entrundet. Einige Zellen haben bipola­re, z. T. bereits sehr lange Zytoplasmafortsätze ausgebildet und zeigen eine spindelartige Form (Pfeilspitzen in a und d). In Zusammenschau mit ihrer Immunoreaktivität für Iba-1 (b, e) handelt es sich am ehesten um reifere mono­zytäre Zellen, die auch auf azellulären Substraten eine solche Morphologie annehmen. Andere Zellen, ebenfalls positiv für Iba-1 und GFP, besitzen plumpere Zelleiber und Fortsätze (Pfeile in c) oder weisen mehr als zwei Pseu­dopodien auf (Stern in d - f). Vergrößerung x100 (a - c), x400 (d - f).


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Abbildung 18:
Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten. Tag 6 der Kokultur. Zahlreiche GFP-positive Zellen weisen primäre und sekundäre Ramifikationen auf (Pfeile in a, x200). Jede dieser Zellen ist immunoreaktiv für Iba-1 (b) und zeigt eine klare Kolokalisation beider Fluoreszenzsignale (c). Eine ramifizierte Zelle (Pfeilspitze in c) exprimiert zwar Iba-1, nicht aber GFP. Sie leitet sich entweder von kontaminierenden Mikrogliazellen aus der primären Astrozytenkultur oder von nicht transfizierten Knochenmarkzellen her.

Abbildung 19:
Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten(x400), Tag 6. Die abgebildete Zelle besitzt einen entrundeten Zelleib und mehrere Fortsätze, die sich noch nicht weiter aufgezweigt haben. (a) Durchlicht, (b) EGFP, (c) Iba-1, (d) Überlagerung.


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Abbildung 20: Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 12 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Die rechts unten zu erkennende Zelle weist langgestreckte Zytoplasmafortsätze mit kurzen sekundären Verzweigungen auf. Vergr. x400.

Abbildung 21: Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 18 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x200.

Abbildung 22: Kultur transfizierter Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten. Tag 18 der Kokultur. Die in den Teilabbildungen unten dargestellte Zelle besitzt Primär- und Sekundärfortsätze (Pfeile in a ). Nach dieser längeren Kulturphase erscheinen die Fluoreszenzsignale von GFP und Iba-1perinukleär verstärkt und in den Zell­fortsätzen deutlich abgeschwächt. Dieses Phänomen konnte in allen Experimenten beobachtet werden. (a) EGFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x400.


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Abbildung 23:Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 18 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x100. Die abgebildeten Zellen zeigen eine irreguläre Morphologie mit langgestreckten, z. T. spindelförmigen Zytoplasmafortsätzen ohne weitere Ramifikation.

Wurden GFP-transfizierte oder β-Actin/GFP-transgene Knochenmarkzellen auf einem azellulä­ren Substrat - d. h. in unserem Fall auf Polycarbonat – in konditioniertem Astrozytenmedium kultiviert, fanden sich keine über das Stadium der Primärfortsätze hinausgehenden Ramifikation­serscheinungen; die Zellen zeigten bis zum Abbruch der Kultur ausschließlich runde, amöboide oder spindelförmige Morphologien. Insgesamt nahm die Zahl der Zellen während der Kultur auf Polycarbonat progredient ab, was eine Bedeutung der direkten Zellinteraktion auch für das bloße Überleben der Knochenmarkzellen nahelegt. Der oben bereits erwähnte deutliche Größenunter­schied zwischen Knochenmarkzellen einerseits und darunter liegenden Astrozyten andererseits blieb bis zum Ende der Kokulturphase bestehen und zu keinem Zeitpunkt fanden sich GFP-positive Zellen, die das flächenhafte Ausbreitungsmuster protoplasmatischer oder das typische Wachstumsbild fibrillärer Astrozyten zeigten. Nach erfolgter Visualisierung des GFAP-Antigens fand sich keinerlei Kolokalisation von GFP und rotem Fluoreszenzsignal (GFAP, Abb. 26). Aufgrund der unterschiedlichen Größe beider Zelltypen erschien es notwendig auszuschließen, dass die etwaige Immunoreaktivität von Knochenmarkzellen für GFAP im ausgedehnten GFAP-­Signal des Astrozyten-Monolayers „unterging“ bzw. davon überstrahlt wurde. Daher wurden im Rahmen zweier Experimente die Zellen in ausgewählten wells vor der Fixierung mit Trypsin-­[Seite 78↓]Lösung mobilisiert und mittels Zytozentrifugation auf Objektträger aufgebracht. Nach Fixierung und GFAP-Färbung war es nun möglich, auf der Einzelzellebene nach Kolokalisationen zu su­chen. Pro Versuchszeitpunkt wurden 300 GFP-positive Zellen auf eine Kolokalisation mit dem GFAP-Signal hin überprüft (insgesamt also 1500 Zellen bei jedem Experiment), die bei keiner einzigen Zelle vorlag.

Abbildung 24:
Kultur Sca-1-positiver Knochenmarkzellen aus einer ß-Actin/GFP-transgenen Donormaus auf Astrozyten. Tag 12 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x100. Nicht anders als in der Kokultur transfi­zierter Zellen haben zahlreiche Zellen eine ramifizierte Morphologie angenommen und koexprimieren GFP und Iba1. Das GFP-Signal der ß-Actin/GFP-transgenen Zellen ist nach 12 Tagen in vitro noch ebenso intensiv wie im Ge­hirn des Donortiers unmittelbar nach der Perfusion mit PFA (vgl. Abb. 15). Teilabbildung c zeigt in der Bildmitte 3 untereinander liegende Zellen (eine davon mit Primär- und Sekundärfortsätzen), die Iba-1-negativ sind.


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Abbildung 25:
Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 3 der Kokultur. (a) Durchlicht, (b) GFP, (c) GFAP, (d) Überlagerung. Deutlich ist der enorme Größenunterschied zwischen den GFP-positiven Zellen und den darunterliegende Astrozyten. Zu diesem frühen Zeitpunkt der Kokultur haben fast alle Knochenmarkzellen noch eine amöboide Form. Zelluläre Kolokalisation von GFP und GFAP ist nicht erkennbar. Vergrößerung x100.

Abbildung 26: a – c: Kultur transfizierter, Sca-1-neg. Knochenmarkzellen auf Astrozyten, Tag 6 der Kokultur. d – e: Kultur transfizierter, Sca-1-pos. Knochenmarkzellen auf Astrozyten, Tag 12 der Kokultur (x200). Der Größenunter­schied zwischen Knochenmarkzellen einerseits (a) und GFAP-positiven Astrozyten andererseits (b) bleibt deutlich. Zelluläre Kolokalisationen beider Fluoreszenzsignale sind nicht erkennbar (c). Das mehr flächen-hafte GFAP-­Signal bildet den Hintergrund einiger GFP-positiver Zellen, so dass diese nach Überlagerung z. T. gelb erscheinen (c). Um diesen Artefakt zu umgehen, wurden zusätzlich Einzelzellanalysen an zytozentrifugierten Kokulturen durch­geführt (s. Text). Vergrößerung x100.


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Wurden Knochenmarkzellen aus ß-Actin/GFP-transgenen Mäusen auf murinen Astrozyten ko­kultiviert, ergaben sich keine Hinweise auf eine astrozytäre Differenzierung der Knochenmarkzellen: Zu keinem der gewählten Zeitpunkte erfüllten GFP-positive Zellen die dazu als erforderlich gesetzten Kriterien der typischen Morphologie und der Immunoreaktivität für GFAP In der Kokultur von Knochenmark aus GFAP/GFP-transgenen Mäusen, bei denen GFP aus­schließlich in Astrozyten synthetisiert wird, konnte zu keinem Versuchszeitpunkt ein GFP-Signal detektiert werden.

5.2.3 Differenzierung von Knochenmarkzellen in Kultur auf OEHSC

Um die mögliche Ausweitung des Differenzierungsspektrums hämatogener Zellen durch ein annähernd organotypisches Mikromilieu auszutesten, wurde Knochenmark auf vitalen Hirn­schnitten (OEHSC) kultiviert. Die GFP-transfizierten Knochenmarkzellen waren im Vorfeld entsprechend der Expression von Sca-1 selektioniert worden, um Sca-1-positive Stammzellen anzureichern und ihr Diffenzierungsverhalten gesondert zu untersuchen. Die Dauer der Kokultur wurde auf maximal 8 Tage begrenzt, da die Schnittkulturen zuvor bereits eine Woche in vitro gehalten worden waren und sowohl der organotypische Charakter als auch die mechanische In­-tegrität der Slices durch eine langsam zunehmende Astrogliose beeinträchtigt wurden. Die Dicke des Hirnschnittes nahm von 300 μm nach Präparation auf ca. 130-150 μm zum Ende der Kultur­phase ab. Zu jedem der drei Zeitpunkte (3, 5 und 8 Tage in vitro) wurden 4 bis 6 OEHSC mit Knochenmark versehen. Jeder Hirnschnitt wurde so mit Knochenmarkzellen beimpft, dass die applizierte Zellsuspension (5 μl) als Tropfen über dem Gewebe stand und möglichst nicht über dessen Rand hinwegfloss. Es wurden 4 Experimente mit transfiziertem Knochenmark und 1 Ex­periment mit Zellen aus der GFP-β-Actin-transgenen Maus durchgeführt. Die folgenden Ausfüh­rungen gelten für beide Versuchsansätze. Mittels Fluoreszenzmikroskopie der vitalen Kokultur [Seite 81↓]konnte gezeigt werden, dass die GFP-positiven Zellen stark proliferierten (Abb. 29 d und e) und teilweise in die Tiefe des Hirnschnittes einwanderten; die betreffenden Zellen wiesen deshalb eine technisch bedingte Konturunschärfe auf (Abb. 27 d und e, 28 b und c). Die Migration der Knochenmarkzellen konnte später am fixierten und geschnittenen Slice ebenfalls nachvollzogen werden, da GFP-positive Zellen in unterschiedlichen Schnittebenen nachweisbar waren. Bereits vor dem Ende der Kokultur konnte im lebenden Hirnschnitt die fortschreitende Ramifikation von Knochenmarkzellen beobachtet werden (Abb. 28 c, 29 f).


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Abbildung 27: Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Wegen der konvexen Schnittoberfläche haben sich die meisten EGFP-positiven Knochenmarkzellen in den Randbereichen angesammelt (a und b, Tag 3 der Kokultur, x50). Die Teilabbildungen c – e zeigen alle den gleichen Ausschnitt und dokumentieren die Proliferationsfähigkeit der EGFP-markierten Knochenmarkzellen auf dem Slice. (b) Tag 3 der Kokultur, (c) und (d) Tag 3 der Kokultur, (e) Tag 5 der Kokultur. Vergrößerung x200.

Abbildung 28: Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur, vor der Fixierung. Das Gewebe wird im Durchlicht (a) von außen nach innen dunkler, während im blauen Licht (b) die Autofluoreszenz in derselben Richtung zunimmt (a und b zeigen denselben Ausshnitt). Beides wird durch die zum Rand hin abnehmende Dicke des Präparates verursacht. Die GFP-positiven Zellen in b und c wirken teilweise un­scharf, was ihre Einwanderung in tiefere Gewebeschichten widerspiegelt (Pfeilspitzen in c). Die Zahl der Knochen­markzellen hat im Vergleich zum ersten Tag der Kokultur stark zugenommen (b). Die Zellen weisen z. T. Zellfortsätze auf (c).Vergrößerung x200 (a, b), x400 (c).


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Abbildung 29:
Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8. Alle Aufnahmen stammen von vitalen Präparaten. Die Knochenmarkzellen haben massiv proliferiert und konzentrieren sich auf die Furche zwischen Hippocampus und entorhinalem Cortex (a, b, x50). Vertikal zum Schnittrand bilden sie eine Straße im kortikalen Gewebe (c, d, x100). Bei stärkerer Vergrößerung sind diverse, u. a. ramifizierte Zellmorphologien sichtbar (e, x 200und f, x400). Schärfenunterschiede zwischen den Zellen sind durch ihre Migration in die Tiefe des Gewebes bedingt.


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Die nach Fixierung angefertigten Kryoschnitte wurden einer immunhistochemischen Färbung der Antigene Iba-1 (Abb. 30) und GFAP unterzogen. Danach erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Auswertung. GFP-markierte Zellen hatten bereits am 3. Tag der Kokultur feine Zellfortsätze ausgebildet (Abb. 31), die sich bis zum 5. Tag weiter verzweigten (Abb. 32-34) und am Tag 8 in weitgehend unveränderter Form zu finden waren (Abb. 35-40). Alle ramifizierten GFP-positiven Zellen erwiesen sich als immunoreaktiv für den Makrophagen-­Marker Iba-1 und lagen meistens in Gruppen von 2 bis 10 Zellen zusammen. Eine Präferenz dieser Zellcluster für bestimmte Regionen des entorhinal-hippocampalen Gewebeschnittes war nicht offensichtlich; al­lerdings schienen sich die Knochenmarkzellen in einigen Präparaten den vorgegebenen anatomischen Strukturen entsprechend angeordnet zu haben (Abb. 33). Die am 8. Tag fixierten Slicekulturen zeigten eine größere Dichte ramifizierter Mikroglia, was das Abklingen lokaler inflammatorischer Vorgänge reflektieren könnte. Zu allen Zeitpunkten der Kokultur auf OEHSC zeigten die applizierten Knochenmarkzellen keine makrogliale Differenzierung, wie sie bei GFP-­markierten Knochenmarkzellen durch Kolokalisation mit GFAP und bei GFAP/GFP-transgenen Knochenmarkzellen durch Expression von GFP kenntlich wäre (Abb. 41).


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Abbildung 30:
Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC, Tag 3 der Kokultur. Der organotypische Hirnschnitt ist nach der Mikrogliafärbung mit Iba-1-positiven Zellen übersät (a). Teilabbildung b zeigt den gleichen Ausschnitt im blauen Fluoreszenzlicht; im linken oberen Teil ist ein Haufen GFP-exprimierender Zellen zu sehen. Vergrößerung x50.

Abbildung 31:
Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC, Tag 3. Die Zelle in der Bildmitte besitzt einen Sekundärfortsatz (Pfeilspitze) und weist ein deutliches Iba-1-Signal auf (b), das mit GFP kolokalisiert (c). In b und c sind Zellen zu sehen, die zwar Iba-1, nicht aber GFP exprimieren (Pfeile). Am ehesten handelt es sich dabei um intrinsische Mikroglia aus der Hirnschnitt-Kultur. Vergrößerung x250.


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Abbildung 32:
Kultur Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Auf beiden Teilabbildungen sind zahl­reiche ramifizierte GFP-positive Zellen zu sehen. Pfeile in a: Präparatrand. Vergr. x100 (a), x200 (b).

Abbildung 33:
Kultur Sca-1-positiver Knochenmark-zellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Man erkennt GFP-positive Knochen­markzellen entlang der Cortex-Hippocampus-Grenze (a - c). Der überwiegende Teil dieser Zellen kolokalisiert mit Iba-1 (c) und besitzt eine bipolare Form mit schmalen Zytoplasmafortsätzen (Pfeile). Der hohe Ordnungsgrad der der applizierten Knochenmarkzellen deutet auf ihre Integration in die lokalen Strukturen hin und läßt vermuten, dass sie mit ihrer Umgebung in Wechselwirkung stehen. Die Einschübe ina - c zeigen eine Zelle mit unipolar an­setzenden Ramifikationen. Vergrößerung x100, x400.

Abbildung 34:
Kultur Sca-1-neg. Knochenmarkzellen aus einem ß-Actin/GFP-transgenen Donortier auf OEHSC. Tag 5 der Kokul­tur. Die konstitutive GFP-Expression in den Knochenmarkzellen ist mit einem ebenso intensiven Fluoreszenzsignal verbunden wie bei GFP-transfiziertem Knochenmark (a). In einem Cluster von etwa 20 Zellen zeigen die meisten eine Kolokalisation von GFP und Iba-1 (c); einige weisen feine Ramifikationen auf (Pfeile in a - c). Der Rand des Hirnschnittes ist durch Sterne gekennzeichnet (b). Vergrößerung x200.


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Abbildung 35:
Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Es finden sich zahl­reiche GFP-positive Zellen mit primären und sekundären Ramifikationen, die Immunoreaktivität für Iba-1 aufwei­sen (a – c, Vergrößerung x 200). Teilabbildung d zeigt die in a - c mit einem Pfeil markierte Iba-1-positive Zelle in 400-facher Vergrößerung; die haarfeinen Zellfortsätze sind gut zu erkennen.

Abbildung 36:
Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Die Bildreihen a – c inklusive der Einschübe zeigen ramifzierte Zellen mit Zytoplasmafortsätzen, in denen EGFP und Iba-1 weniger intensiv zur Darstellung kommen als im Zelleib und im Bereich des Zellkerns. Dennoch läßt sich die Kolokalisation beider Signale durch Übereinanderlagerung der Einzelbilder nachweisen. Vergrößerung x400.


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Abbildung 37:
Kultur von transfizierten, Sca-1-positiven Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Auch hier finden sich ramifizierte Zellen mit der Morphologie ruhender Mikroglia, die ein Doppelsignal aus GFP und Iba-1 (Texas Red) aufweisen (Pfeil). Vergrößerung x100.


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Abbildung 38: Kultur Sca-1-positiver Knochenmarkzellen aus einem β-Actin/GFP-transgenen Donortier auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Die mit einem Stern markierte Zelle weist feine Ramifikationen auf, die durch das zytosolisch lokalisierte GFP erkennbar sind. GFP kolokalisiert mit dem Mikroglia-Marker Iba-1. Die Intensität des GFP, dessen Expression an die von b -Actin gekoppelt ist, hat im weiteren Verlauf der Kokultur nicht nachgelassen. Vergrößerung x200.

Abbildung 39: Kultur von Knochenmark aus einem β-Actin/GFP-transgenen Donortier auf OEHSC. Tag 8 der Ko­kultur. Nahe dem Rand des Hirnschnittes (Pfeilspitzen in b) sieht man zwei Mikroglia-ähnliche Zellen, die GFP und Iba-1 koexprimieren (Pfeile in a - c). Vergrößerung x200.

Abbildung 40: Kultur von Knochenmark aus einer β-Actin/GFP-transgenen Donormaus. Tag 8 der Kokultur. Die drei abgebildeten Zellen mit (peri)nukleär akzentuiertem GFP-Signal haben lange Zellausläufer ausgebildet und exprimieren das mikrogliale Antigen Iba-1. Vergrößerung x400.


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Abbildung 41: Kultur transfizierter,Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Wie auch in sämtlichen anderen Kokulturexperimenten auf organotypischen Hirnschnitten findet sich hier keine zelluläre Kolokalisation des EGFP-Signals mit GFAP. Die Knochenmarkzellen sind erheblich kleiner als die z. T. nur noch eingeschränkt anfärbbaren Astrozyten innerhalb des Hirnschnittes. Vergrößerung x100.


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28.09.2004