[Seite 91↓]

6  Diskussion

Ziel der in dieser Arbeit vorgestellten Versuche war es zu untersuchen, ob adulte murine Kno­chenmarkzellen unter den gewählten experimentellen Bedingungen die Fähigkeit zur Differen­zierung in GFAP-positive Astrozyten besitzen. Die im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Ergebnisse lassen für die hier gewählten experimentellen Bedingungen eine ein­deutig negative Antwort auf diese Frage zu, da in keinem der durchgeführten Versuche eine Ex­pression von GFAP durch Knochenmarkzellen oder ihre Abkömmlinge gezeigt werden konnte. Im Hinblick darauf, dass seit 1997 mehrere Arbeiten publiziert worden sind, deren Kernaussage im Widerspruch zu unserem Resultat steht, soll im folgenden auf Fragen der methodischen Ver­gleichbarkeit sowie auf mögliche Gründe für diese Diskrepanz eingegangen werden.

1.

Die durchgeführten Tierexperimente basierten auf dem Modell einer transgenen Maus, die GFP unter der Kontrolle des humanen GFAP-Promoters exprimiert (Nolte 2001). Aufgrund der Tat­sache, dass GFAP im Zentralnervensystem mit hoher Spezifität von Astrozyten exprimiert wird, kann bei diesen transgenen Tieren von einer konstitutiven GFP-Expression ausschließlich durch astrozytäre Zellen ausgegangen werden. Dieser Sachverhalt wird in zahlreichen anderen transge­nen Mausmodellen ausgenutzt, bei denen das jeweilige Reportergen durch den humanen Promo­ter für GFAP kontrolliert wird (Brenner 1994, Brenner und Messing 1996, Holland und Varmus 1998). Die Verwendbarkeit des GFP-Gens als Teil eines transgenen Konstrukts wurde u. a. von Fuss et al. gezeigt, die das Gen einer GFP-Variante unter der Kontrolle des Proteolipid-Protein-­Promoters in ausgereiften Oligodendrozyten zur Expression bringen konnten (Fuss 2000). Nahe­zu ubiquitäre Expression von GFP weist die β-Actin/GFP-transgene Maus auf, die von Okabe et [Seite 92↓]al. entwickelt wurde und als Knochenmarksdonor für einen Teil der von uns durchgeführten Zellkulturexperimente fungierte (Okabe 1997, Kawakami 1999). Ein transgenes Modell, bei dem GFP-S65T ebenfalls unter die Kontrolle des humanen GFAP-Promoters gestellt ist, wurde von Zhuo et al. beschrieben (Zhuo 1997). Der Vorteil der spezifischen Expression von GFP in Astro­zyten besteht zum einen in der Möglichkeit, die Zellen z. B. in vitalen Schnittpräparaten direkt zu identifizieren und sie morphologisch oder elektrophysiologisch zu studieren. Zum anderen liegen sowohl GFAP als auch GFP in Astrozyten cytoplasmatisch vor, so dass zelluläre Koloka­lisationen eindeutig festzustellen sind. Nur auf der subzellulären Ebene zeigen die beiden Fluo­reszenzsignale keine vollständige Kongruenz, was damit erklärt werden kann, dass GFAP als Cytoskelettprotein nicht bis in die feinsten Zellfortsätze hinein vorhanden ist, während GFP frei im Cytoplasma vorliegt und auch filigrane Strukturen kontrastiert (Nolte 2001). Zahlreiche in vitro-Arbeiten haben gezeigt, dass der Transfer des GFP-Gens in verschiedenste Säugerzellen keine schädigenden Effekte auf Morphologie, Funktion und Proliferation nach sich zieht (Cheng 1996); das GFP-Signal hat sich zudem in transfizierten oder transgenen Zellen über lange Zeit­räume als stabil erwiesen und wird nicht nach extrazellulär abgegeben. Auch die ubiquitäre oder auf spezifische Zelltypen beschränkte Expression von GFP in transgenen Mäusen hat bisher kei­ne negativen Auswirkungen auf Wachstum und Fortpflanzung der Tiere gezeigt (Zhuo 1997, Okabe 1998, Fuss 2000, Nolte 2001). Im Rahmen der vorgestellten Arbeit wurde Knochenmark aus adulten GFAP/GFP-transgenen Donormäusen in letal bestrahlte, ebenfalls ausgewachsene Wildtyp-Rezipienten transplantiert, um die fragliche astrozytäre Umdifferenzierung hämatogener Zellen nach ihrer Einwanderung ins Gehirn der Chimären zu untersuchen. 94% der transplantier­ten Mäuse überlebten die Phase der Immunosuppresion; bei 76% wurde die erfolgreiche Re­konstitution durch Nachweis des GFP-Gens in genomischer Leukozyten-DNA dokumentiert. Die Tatsache, dass dieser Befund nach sechs bis acht Wochen erhoben werden konnte, spricht für eine normale Kinetik der hämatopoetischen Rekonstitution, da ähnliche Intervalle auch für ande­[Seite 93↓]re Trans-plantationsmodelle angegeben werden (Perry 1992, De Groot 1992, Eglitis 1997, Bra­zelton 2000). Durch genetische Markierung der übertragenen Zellen mit EGFP konnte an zwei Mäusen gezeigt werden, dass diese Zellen bzw. ihre Nachkommenschaft auch tatsächlich aus dem zirkulierenden Blut ins Hirnparenchym übertreten und dort den Phänotyp ruhender Mikroglia sowie perivaskulärer Zellen annehmen (vgl. auch Priller et al. 2001a). Dies erlaubt die qualitative Aussage, dass im Fall der mit transgenem Knochenmark transplantierten Mäuse ein Influx hämatogener Zellen ins Gehirn stattfindet, der potentielle Astrozyten- und Neuronen-­Vorläufer mit großer Wahrscheinlichkeit einschließt: In GFP-Knochenmarkchimären konnten sogar Zellen mit neuronalem Phänotyp im Hirnparenchym nachgewiesen werden (Brazelton 2000, Priller 2001b). Einwanderung und Umwandlung zu perivaskulären und mikroglialen Zel­len belegen ein normales biologisches Verhalten der transgenen Leukozyten, wie es anhand von Transplanta-tionsexperimenten mit ex vivo markierten Knochenmarkzellen beschrieben worden ist (Perry 1992, De Groot 1992, Kennedy 1997, Ono 1999, Nakano 2001). Bei der Untersuchung der Hirne der für die weiteren Versuche verwendeten Donoren fiel auf, dass die Expression von GFP durch Astrozyten große regionale Unterschiede aufwies und mitunter auch zwischen be­nachbarten Zellen differierte. Diese Beobachtung war in Übereinstimmung mit den Befunden, die Nolte et al. bei der Charakterisierung des von ihnen entwickelten transgenen Modells erhoben haben (Nolte 2001), und findet ihre Entsprechung auch in der älteren Arbeit über die bereits erwähnte andere GFAP/GFP-transgene Maus (Zhuo 1997). Der Umstand, dass GFP nicht von allen GFAP-positiven Astrozyten in detektierbaren Mengen koexprimiert wird, setzt der Aussa­gefähigkeit der Tranplantationsexperimente theoretische Grenzen: Eine nicht einhundertprozen­tige Sensitivität des Nachweisverfahrens mittels GFP impliziert zumindest die Möglichkeit, dass die makrogliale Transdifferenzierung hämatogener Zellen im ZNS der Knochenmarkchimären zwar stattfindet, aber im Einzelfall nicht detektiert werden kann. Andererseits ist es nur schwer vorstellbar, dass ausnahmslos alle transgenen Blut- oder Knochenmarkzellen, die sich in vivo oder in vitro zu GFAP-exprimierenden Zellen [Seite 94↓]umwandeln, kein nachweisbares GFP-Signal aus­prägen und damit der Detektion entgehen. Ein denkbarer Ansatz, diese Möglichkeit zu überprü­fen, könnte durch den Nachweis des GFP-Gens in GFAP-positiven Zellen mittels in-situ-Hybridisierung geschaffen werden. Einige der GFP-exprimierenden Zellen im Hirnparenchym der transgenen Donoren, besonders im Thalamus, zeigten keine oder nur geringe Immunoreakti­vität für GFAP. Auch dieser Befund stimmt mit den Beobachtungen von Nolte et al. (Nolte 2001) überein. Da im Rahmen unserer Experimente keinerlei GFP-Expression im Gehirn der GFAP/GFP-transgenen Knochenmark-chimären nachzuweisen war, fällt dieser Aspekt hier nicht weiter ins Gewicht; allerdings stellt er ein prinzipielles Problem für die Arbeit mit GFAP-­transgenen Mäusen dar. Für das Nagerhirn wurde mehrfach beschrieben, dass die GFAP-­Immunoreaktivität inhomogen über alle Regionen verteilt ist und die Sensitivität der GFAP-­Immunfärbung kritisch bewertet werden muss (Kalman und Hajos 1989, McLendon 1994). Das Fehlen des GFAP-Signal in einer Zelle bedeutet demnach nicht notwendigerweise, dass sie kein GFAP enthält. Ein sensitiverer und quantitativer Nachweis des Intermediärfilaments wäre allen­falls auf der Ebene der mRNA möglich. Die Verwendung weiterer astroglialer Marker wie z. B. S100β (Boyes 1986) könnte darüber hinaus Aussagen über andere Astrozytenpopulationen des Zentralnervensystems ermöglichen. Eglitis und Mezey berichteten 1997 erstmals über die Ex­pression von GFAP durch hämatogene Zellen, die nach systemischer Knochenmarktransplantati­on ins Gehirn einwanderten. Die Markierung der Donorzellen erfolgte entweder durch retrovirale Transfektion mit dem bakteriellen neoR-Gen oder wurde durch geschlechtsdifferente Tranplanta­tion weiblicher Tiere mit männlichem Knochenmark erreicht. Die Autoren verwendeten WBB6F1/J-Kitw/Kitw-v -Mäuse als Rezipienten, welche einen genetischen Defekt der hämato­poetischen Stammzellen aufweisen. Dieser Umstand bedingt einen großen Repopulationsvorteil für Wildtyp-Donorzellen aus C57bl6-Mäusen, so dass bereits nach subletaler Bestrahlung hohe Rekonstitutionsraten erzielt werden können. Die Autoren berichten, dass vier Wochen nach [Seite 95↓]Tranplantation mittels einer Kombination aus Immunhistochemie (anti-GFAP) und In-situ-Hybridisation (neoR bzw. Y-Chromosom) die Expression von GFAP durch hämatogene Zellen im Gehirn dokumentiert werden konnte; die Häufigkeit dieses Befundes wird mit 0,5-2% (aller eingewanderten Zellen) beziffert. Die Verwendung stammzelldefizienter Empfängertiere macht dieses Ergebnis nur schwer auf physiologischere Modelle übertragbar, zumal die Autoren keine Angaben über das Alter der Rezipienten machen und dies einen zusätzlichen Aspekt darstellen könnte, der das Differenzierungsspektrum hämatogener Zellen im Sinne einer größeren Permis­sivität beeinflusst. In Anlehnung an ihre Vorbefunde publizierten Mezey et al. die Ergebnisse weiterer Transplantationsexperimente, die ebenfalls auf der Rekonstitution von Empfängertieren mit einem schweren hämatopoetischen Defekt beruhten (Mezey 2000a, Mezey 2000b). Hierbei fand eine PU.1-Knockout-Maus Verwendung, die aufgrund eines fehlenden Transkriptionsfak­tors eine kongenitale Knochenmarksaplasie aufweist. Dies macht die lebensrettende Knochen­marktransplantation unmittelbar nach der Geburt erforderlich. Nach Angaben der Autoren konnten 1 bis 4 Monate nach Rekonstitution mit geschlechtsdifferentem Knochenmark zahlrei­che GFAP-positive Donorzellen im Hirnparenchym sowie in der subependymalen Zone des Ventrikelsystems detektiert werden (Mezey 2000a); 0,3% bis 2,3% der eingewanderten Zellen (Y-Chromosom-positiv) zeigten eine konfokalmikroskopisch verifizierte Kolokalisation mit dem nukleären Marker NeuN (Mezey 2000b), so dass damit erstmals auch ein Hinweis auf die mögli­che neuronale Differenzierung hämatogener Zellen in vivo vorlag. Allerdings ist eine Verallge­meinerung dieses Befundes nicht unproblematisch, da in diesen Versuchen wieder hämatopoetisch schwer insuffiziente – und noch dazu neugeborene – Mäuse als Empfängertiere verwendet wurden. Das Gehirn neonataler Nager unterscheidet sich von dem ausgewachsener Tiere u. a. dadurch, dass das vorherrschende Gewebemilieu stark von Wachstumsfaktoren wie z. B. FGF-2 geprägt ist, die auf die Proliferation von Gliazellen und das Aussprossen neuronaler Zellfortsätze Einfluss nehmen können (Caday 1990). Beide Prozesse laufen im unmittelbar [Seite 96↓]postnatalen Gehirn in weit größerem Ausmaß ab als zu späteren Zeitpunkten. Auch wenn bisher nur einzelne Aspekte dieses Unterschieds geklärt sind, muss davon ausgegangen werden, dass hämatogene Zellen gerade im neonatalen Gehirn einer Vielzahl von Einflüssen ausgesetzt sein könnten, die ihr jeweiliges Differenzierungsspektrum modifizieren. Brazelton et al. transplantier­ten dagegen adulte Rezipienten (Brazelton 2000) und verwendeten dazu Knochenmark aus β-­Actin/GFP-transgenen Donormäusen, welches auch bei einem Teil der Kokulturversuche in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurde (Okabe 1997). 2 bis 3 Monate nach letaler Bestrahlung und Rekonstitution konnte mittels Durchflusszytometrie von Einzelzellsuspensionen aus Hirn­dissektaten gezeigt werden, dass eine große Fraktion der eingewanderten GFP-positiven Zellen keine leukozytären Oberflächenantigene (CD45, CD11b) mehr exprimierte. In der immunhistochemischen Analyse vorwiegend bulbärer Hirnschnitte erwies sich die Mehrheit der GFP-­positiven Zellen im Parenchym als immunoreaktiv für den mikroglialen Marker F4/80, während 0,2-0,3 % neuronenspezifische Proteine wie Neurofilament H und NeuN exprimierten. Es wur­den keine eingewanderten Zellen mit GFAP-Expression detektiert. In der Studie von Nakano et al. waren mehrere Monate nach systemischer Transplantation GFP-transfizierter Knochenmarkzellen in bestrahlte adulte Empfängertiere ebenfalls keine GFAP-positiven Donorzellen im Hirn der Chimären zu finden (Nakano 2001). Einige der eingewanderten Zellen erwiesen sich auf­grund ihrer Immunoreaktivität für Iba-1 als Mikrogliazellen/Makrophagen; Kolokalisationen mit neuronalen und oligodendroglialen Markern waren nicht nachweisbar. Da sowohl Brazelton et al. als auch Nakano et al. keinen Anhaltspunkt für eine Umdifferenzierung der aus dem Blut im­migrierten Zellen zu GFAP-positiven Astrozyten fanden, decken sich ihre Befunde in diesem Punkt mit unserer Beobachtung, dass im Gehirn GFAP/GFP-transgener Knochenmarkchimären weder nach einfacher Transplantation noch nach Transplantation in Kombination mit einer foka­len cerebralen Ischämie GFP-positive Zellen nachweisbar sind. Was die immunhistochemische Analyse betrifft, ist es bei Transplantationsexperimenten generell von [Seite 97↓]Bedeutung, dass sowohl Markierungs- als auch Detektionsverfahren für Donor-zellabkömmlinge eine möglichst genaue zelluläre Kolokalisation von Antigenen zulassen. Dies gilt besonders dann, wenn keine konfo­kalmikroskopische Auswertung der gefärbten Gewebe durchgeführt wird. In den Arbeiten von Mezey et al. und Brazelton et al. sowie im Rahmen unserer Versuche ist die Forderung nach ei­ner weitgehenden Kongruenz der Fluoreszenz- bzw. Farbsignale auf unterschiedliche Weise er­füllt. Während Mezey et al. zumindest für die Neuronenfärbung ein nukleär gelegenes Antigen (NeuN) verwenden und dadurch die Kolokalisation mit dem Y-Chromosom optimieren, ermög­licht in beiden anderen Fällen das cytoplasmatisch lokalisierte GFP eine morphologische Beur­teilung der gesamten Zelle und damit auch etwaiger Überlappungen mit dem jeweiligen spezifischen Zellmarker GFAP oder Neurofilament. Die Kombination aus Zytoskelett- (GFAP) und nukleärer Färbung (In-situ-Hybridisierung des Y-Chromosoms) ist dagegen nicht unproble­matisch, da letztere keine Aussage über die Zellmorphologie erlaubt und nicht mit dem cy­toplasmatischen GFAP-Signal kolokalisiert. Dies gilt nicht nur für die Astrozytenfärbung in den bereits erwähnten Arbeiten von Eglitis und Mezey, sondern auch für eine weitere Studie von Eglitis et al., in der über die relative Häufung GFAP-positiver hämatogener Zellen in der ischä­mischen Hemisphäre von Ratten berichtet wird, die 5,5 Wochen nach Knochenmarktransplanta­tion einer permanenten fokalen cerebralen Ischämie unterzogen wurden (Eglitis 1999). Unter Verwendung konventioneller Fluoreszenz- und Lichtmikroskopie fanden die Autoren bei zwei Tieren nach 48 Stunden Reperfusionszeit 55% mehr Donorzellen in der betroffenen Hirnhälfte als kontralateral, wobei 4,7% der GFAP-positiven Astrozyten auf der Infarktseite das Y-­Chromosom aufwiesen (gegenüber 1,8% auf der gegenüberliegenden Seite). Die aus diesem Er­gebnis entwickelte Hypothese lautet, dass das fokale und perifokale Gewebemilieu nach cerebraler Ischämie das Differenzierungspotential einwandernder Zellen aus dem Blut erweitern und sogar die Transdifferenzierung zu neuroektodermalen Zelltypen ermöglichen könnte. Zur Überprüfung dieser Annahme wurden im [Seite 98↓]Rahmen der vorliegenden Arbeit acht GFAP/GFP-­transgene Knochenmarkchimären einer transienten fokalen cerebralen Ischämie unterzogen. In­nerhalb eines Zeitraums von bis zu 5 Tagen nach der Ischämie wurden keine GFP-­exprimierenden Astrozyten in den Gehirnen dieser Tiere gefunden. Diese Diskrepanz könnte allein dem Umstand zugerechnet werden, dass die Versuche in unterschiedlichen Spezies durch­geführt worden sind. Demgegenüber postuliert eine neuere Studie auch für die adulte Maus, dass sich der fokale Infarkt permissiv auf die astrozytäre Differenzierung von Knochenmarkzellen auswirkt (Li 2000). Vier Tage nach thrombotischem, also permanentem Verschluss der A. ce­rebri media wurden BrdU-markierte stromale Knochenmarkzellen in das ischämische Striatum injiziert. Nach einem Monat erwiesen sich 8% der implantierten Zellen als immunoreaktiv für GFAP, wobei auch hier wieder darauf hinzuweisen ist, dass BrdU als nukleärer Tracer nicht im­mer eindeutig mit GFAP kolokalisiert werden kann. Als wesentliche methodische Unterschiede zu den Arbeiten von Eglitis sowie den hier vorgestellten Experimenten sind allerdings die Ver­wendung stromaler Knochenmarkzellen sowie deren intracerebrale Applikation anzusehen. In der bereits erwähnten Arbeit von Nakano et al. werden die Ergebnisse einer Studie beschrieben, in deren Rahmen Knochenmarkzellen nach Transfektion mit GFP in das Striatum adulter Mäuse injiziert wurden, die zuvor keiner cerebralen Ischämie unterworfen worden waren (Nakano 2001). Die Autoren berichten, dass nach drei Monaten noch zahlreiche GFP-positive Zellen am Injektionsort vorhanden waren, von denen einige Iba-1, GFAP oder CAII (als oligodendroglialen Marker), keine aber NSE koexprimierten. Die intracerebrale Injektion impliziert generell, dass auf diesem Wege auch Zellen ins Hirnparenchym gelangen können, die zwar ein besonders breites Differenzierungsspektrum aufweisen könnten, aber physiologischerweise das Knochenmark nicht verlassen oder nicht zur Überschreitung der Blut-Hirn-Schranke fähig sind. Gerade für stromale Knochenmarkzellen bzw. mesodermale Vorläuferzellen ist bisher nicht geklärt, ob und in welchem Ausmaß sie unter physiologischen Bedingungen im Blut zirkulieren (Bianco 2001). Durch die Besonderheit der direkten intracerebralen Applikation sind auch diejenigen Arbeiten [Seite 99↓]gekennzeichnet, für die stromale Knochenmarkzellen ohne vorherige Ischämie ins Striatum bzw. in den Seitenventrikel von Nagern injiziert wurden (Azizi 1998, Kopen 1999). Während von Azizi et al. lediglich beschrieben wird, dass die implantierten Zellen Teile ihres stromalen Antigenbesatzes verlieren und ein Astrozyten-ähnliches Migrationsverhalten zeigen, fanden Kopen et al. einige Knochenmarkzellen, die GFAP und z. T. auch Neurofilament exprimierten. Allerdings wurden die stromalen Zellen in letzterem Fall in den Seitenventrikel neugeborener Mäuse einge­bracht, in deren Gehirn, wie oben bereits ausgeführt, ein Wachstumsmilieu vorherrscht, das sich aller Wahrscheinlichkeit nach grundlegend von adulter Tieren unterscheidet. Das Problem der intracerebralen Injektion wurde in der Ratte durch die intravenöse oder intraarterielle Infusion BrdU-markierter stromaler Knochenmarkzellen nach fokaler cerebraler Ischämie teilweise um­gangen (Chen 2001, Li 2001). 14 bzw. 35 Tage später fanden die Autoren, dass die übertragenen Zellen in der Periinfarktzone akkumulierten, aber auch in anderen Hirnregionen nachweisbar waren. Ein Teil dieser Zellen in der Penumbra exprimierte GFAP oder neuronale Markerantigene wie NeuN und MAP-2; die Zahlenangaben liegen bei 5 bzw. 10% für GFAP, 1-2% für MAP-2 und 1% für NeuN. In Bezug auf die fragliche astrozytäre Umdifferenzierung von Zellen aus dem Blut bzw. Knochenmark konnten die Ergebnisse von Chen und Li in der GFAP/GFP-transgenen Knochenmarkchimäre nicht bestätigt werden. Da gezeigt wurde, dass die von transgenem Donorknochenmark abstammenden Leukozyten ins Hirn übertreten und in der Infarktzone akkumu­lieren, kann die Divergenz dieser Ergebnisse am ehesten durch methodische Unterschiede erklärt werden. Aus diesen Überlegungen heraus bleibt die Frage der astrozytären Umdifferenzierung hämatogener Zellen im adulten Nagerhirn weiterhin kontrovers, und es wird zusätzlicher Expe­rimente bedürfen, um sie mit hinreichender Sicherheit beantworten zu können. Die Aussagekraft des von uns verwendeten Modells im Hinblick auf weitere Versuche wird durch Experimente gesteigert, in denen die Differenzierung embryonaler neuraler Zellen in GFP-positive Astrozyten nach intrastriataler Transplantation in adulte Wildtyp-Mäuse gezeigt werden konnte (Wehner et al. [Seite 100↓]2003, vgl. auch Renfranz 1991, Gage 1995, Brüstle 1995, Brüstle 1997, Svendsen 1997).

2.

Für die Kokulturversuche wurden native Astrozyten- oder organotypische Hirnschnitt-Kulturen (Slices) mit Knochenmarkzellen beimpft, die entweder konstitutiv GFP exprimierten oder aus GFAP/GFP-transgenen Donortieren stammten. Während eines Zeitraums von 18 Tagen (Astro­zyten-Kokultur) bzw. 8 Tagen (Slice-Kokultur) wurde in keinem der durchgeführten Experimen­te eine astrozytäre Umdifferenzierung von Knochenmarkzellen beobachtet. Dagegen konnte durchgehend belegt werden, dass die applizierten Zellen unter allen Kulturbedingungen nach 5 bis 6 Tagen die Morphologie ruhender Mikroglia annehmen und den mikroglial-monozytären Marker Iba-1 exprimieren. Der Umstand, dass unter Verwendung unterschiedlicher Markie­rungsverfahren von Donor-Knochenmarkzellen in ihrer Aussage gleichartige Ergebnisse erzielt werden konnten, stützt die Verallgemeinerbarkeit der erhobenen Befunde. Die in vitro mit dem EGFP-Gen transfizierten Zellen stellen aufgrund der vorausgegangenen Prästimulations- und Transfektionskultur eine andere Population dar als die transgenen Knochenmarkzellen, die direkt nach Entnahme aus der Donormaus für die Kokultur aufbereitet wurden. Sowohl die in vivo­Vorbehandlung mit 5-Fluorouracil als auch die Prästimulationskultur in Gegenwart von IL-3, IL­6 und SCF dienten der Selektionierung primitiver hämatopoetischer Vorläuferzellen (Bodine 1991). Zum gleichen Zweck wurden nach Abschluss der Transfektion Sca-1-positive Zellen mit­tels MACS extrahiert und angereichert. Da in zahlreichen Protokollen die weitgehende Isolie­rung stromaler Knochenmarkzellen aufgrund ihres adhäsiven Wachstums beschrieben ist (Azizi 1998, Kopen 1999), muss davon ausgegangen werden, dass die auf Astrozyten bzw. OEHSC applizierte Population GFP-transfizierter Knochenmarkzellen nach vier Tagen in vitro nahezu vollständig aus (nicht adhärenten) Zellen der Blutbildung bestand. Auch hier liegt ein Unter­[Seite 101↓]schied zu frisch entnommenem Knochenmark, das ein Gemisch aus hämatopoetischen und stromalen Zellen in reiferen und unreiferen Entwicklungsstadien darstellt.

Der Negativbefund in Bezug auf die Frage der astrozytären Differenzierung GFP-transfizierter Knochenmarkzellen zeigt, dass die mit Kultur, Transfektion und Sortierung verbundenen Manipulationen das Differenzierungspotential dieser Zellen zumindest nicht in Richtung GFAP­exprimierender Astrozyten permissiv beeinflussen konnten.1 Ebenso wenig war unter den ge­wählten Bedingungen das Wechselspiel mit den zellulären und azellulären Einflussfaktoren des jeweiligen Kokulturpartners in der Lage, eine solche Differenzierung zu induzieren. Andererseits konnte die Differenzierung von Knochenmarkzellen zu Mikroglia dokumentiert werden, was gegen einen generellen Verlust der Differenzierungsfähigkeit durch die experimentellen Bedin­gungen spricht. Dies gilt auch für die Versuche, in denen Knochenmark aus β-Actin/GFP­transgenen oder GFAP/GFP-transgenen Mäusen auf Astrozyten bzw. OEHSC kultiviert wurde. Mittels konstitutiver GFP-Expression bzw. BrdU-Markierung konnte gezeigt werden, dass die Knochenmarkzellen in der Kokultur vital blieben und proliferierten. Unter der Prämisse, dass diesmal auch zahlreiche stromale Knochenmarkzellen appliziert wurden (vgl. oben), stehen ge­rade die Beobachtungen in diesen Experimenten im Widerspruch zu der Arbeit von Sanchez­Ramos et al. (Sanchez-Ramos 2000). Diese Gruppe kultivierte murine und humane stromale Knochenmarkzellen in Gegenwart verschiedener Differenzierungsfaktoren oder zusammen mit primären Neuronenkulturen aus dem Mesencephalon fetaler Nager. Die Autoren berichten über das vereinzelte Auftreten GFAP- und NeuN-positiver Knochenmarkzellen nach 7 Tagen in Neu­ronenmedium. In Anwesenheit von brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und all-trans­Retinoinsäure (RA) erwiesen sich bis zu 1% der Zellen als immunoreaktiv für GFAP und [Seite 102↓]0,5% für NeuN; in der Kokultur mit fetalen Neuronen (inkl. BDNF und RA) erhöhten sich diese Werte auf 5-8% (GFAP) und 2-4% (NeuN). Mehrere methodische Aspekte können als potentielle Ursa­che für die Induktion der GFAP-Expression in den stromalen Zellen diskutiert werden. Das von Sanchez-Ramos verwendete Kulturmedium enthielt primär vergleichsweise geringe Mengen an Pferde- und Kälberserum sowie u. a. die Hormone Insulin und Progesteron. Außerdem muss angenommen werden, dass sowohl die Differenzierungsfaktoren BDNF und RA als auch die Kokultur auf fetalen Neuronen einen grundlegend anderen Einfluss auf die Knochenmarkzellen entfalten als die in den hier vorgestellten Experimenten gewählten Bedingungen. Diese waren durch den Verzicht auf Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie durch die Kultur des Knochenmarks auf postnatal gewonnenen Geweben gekennzeichnet.

Die Bedeutung unterschiedlicher Protokolle zur Induktion einer neuroektodermalen Differenzie­rung von Knochenmarkzellen wird dadurch betont, dass Woodbury et al. stromale Knochen­markzellen in Anwesenheit von β-Mercaptoethanol oder Dimethylsulfoxid (DMSO) kultivierten und keine GFAP-positiven Zellen beobachten konnten (Woodbury 2000). Dagegen nahmen die stromalen Zellen unter dem Einfluss der genannten Substanzen innerhalb weniger Stunden Neu­ronen-ähnliche Morphologie an und exprimierten in der Folge unterschiedliche neuronale Mar­ker wie NSE (Neuron-spezifische Enolase), Nestin, Tau und trkA.

Auch im in vitro-Bereich sind weiterführende Experimente erforderlich, um das makrogliale Differenzierungspotential adulter Knochenmarkzellen näher zu charakterisieren und Kulturbe­dingungen zu etablieren, unter denen dieses Potential optimal ausgenutzt werden kann.


[Seite 103↓]

3.

In den beschriebenen Zellkulturversuchen wurde nicht nur das makrogliale, sondern auch das mikrogliale Differenzierungspotential adulter Knochenmarkzellen untersucht. Zahlreiche GFP­exprimierende Knochenmarkzellen – transfiziert oder transgen – entwickelten in der Kokultur auf murinen Astrozyten bzw. organotypischen Hirnschnitten nach weniger als einer Woche eine Morphologie, die mit derjenigen ramifizierter Mikrogliazellen in situ vergleichbar ist. Als mor­phologisches Kriterium der mikroglialen Transformation diente dabei das Vorhandensein min­destens zweier feiner Zellfortsätze, die von einem länglichen Zellkörper ausgehen und sekundäre Verzweigungen aufweisen (del Rio Hortega 1932, Lawson 1990, Sievers 1994a). Zusammen mit dem Befund, dass diese ramifizierten GFP-positiven Zellen ausnahmslos den Mikro­glia/Makrophagen-Marker Iba-1 exprimierten, bilden diese Beobachtungen einen Beitrag zu der nach wie vor nicht abgeschlossenen Debatte um die Herkunft der Mikroglia. Wie in der Einlei­tung bereits ausgeführt, tendiert ein Großteil der entsprechenden Literatur zu der An-nahme, dass sich Mikrogliazellen von der monozytären Zellreihe herleiten. Hierfür sprechen zahlreiche Be­funde, die sowohl in vivo als auch in vitro erhoben worden sind und in deren Kontext die eigenen Ergebnisse im folgenden eingeordnet werden sollen.

Während der Embryonalentwicklung des Gehirns treten Mikrogliazellen als distinkte Zellpopulation mit charakteristischer Morphologie erst auf, nachdem die Vaskularisation der ZNS-Anlage begonnen hat (Juba 19342). Bis in die Postnatalzeit hinein wandern monozytoide Zellen aus den Gefäßen und dem meningealen Gefäßbindegewebe (Boya 1991) ins Parenchym ein. Im murinen Gehirn sind makrophagenähnliche Zellen ab E13 nachweisbar und können perinatal in der ge­[Seite 104↓]samten weißen Substanz detektiert werden (de Groot 1992). Diese sogenannten amöboiden Mikrogliazellen weisen in der frühen postnatalen Phase eine hohe mitotische Aktivität auf, para­doxerweise nimmt aber ihre Zahl nach der ersten Lebenswoche kontinuierlich ab (de Groot 1992, Ling und Wong 1993). Dieses Phänomen korreliert zeitlich mit einem massiven Proliferationsschub der ramifizierten Mikrogliazellen im Hirnparenchym. Ling et al. klärten diesen Zu­sammenhang dahingehend auf, dass Monozyten (auch noch) in der frühen Postnatalzeit aus dem Blut ins Gewebe einwandern, dann das Stadium der amöboiden Mikroglia durchlaufen und schließlich die Morphologie ruhender Mikrogliazellen annehmen (Ling 1979, Leong und Ling 1992). Diese Befunde weisen klar auf den hämatogenen Ursprung der Mikroglia zumindest in der Phase der Ontogenese hin. Sie werden unterstützt durch den Umstand, dass die Existenz von Mikrogliazellen im Gehirn an ein intaktes hämatopoetisches System gebunden ist, da myelo­aplastische PU.1-Knockout-Mäuse zum Zeitpunkt ihrer Geburt über keine Mikroglia verfügen und diese erst nach Knochenmarktransplantation aufweisen (Mezey 2000). Umstritten ist aller­dings nach wie vor die Frage, ob der Influx von Monozyten ins Gehirn und ihre mikrogliale Umwandlung bereits in der Postnatalperiode sistieren oder noch darüber hinaus eine Rolle spie­len. An Knochenmarkchimären bzw. durch Leukozyten-Labelling wurden Erkenntnisse darüber gewonnen, dass auch im adulten Organismus Mikrogliazellen in begrenztem Umfang aus dem Blut rekrutiert werden (de Groot 1992, Lawson 1992, Eglitis 1997, Ono 1999). Dem entspricht die für die vorliegende Arbeit wichtige Beobachtung, dass im Gehirn zweier adulter Mäuse, die mit GFP-transfiziertem GFAP/GFP-transgenen Knochenmark transplantiert wurden, ramifizierte Mikrogliazellen mit Expression von GFP vorhanden waren. Eigene, an GFP­Knochenmarkchimären erhobene Ergebnisse legen sogar nahe, dass die Einwanderung von Mikroglia-Vorläufern ins ZNS der adulten Maus nach Knochenmarktransplantation in einem Ausmaß stattfindet, das über Einzelereignisse weit hinausgeht (Priller et al. 2001a). In vitro wie­sen Monozyten und Makrophagen wesentliche Gemeinsamkeiten mit Mikrogliazellen auf. Beide [Seite 105↓]Zelltypen exprimieren nach Aktivierung ähnliche Antigenmuster (siehe Einleitung) und sind zur Phagozytose fähig. Bereits 1935 wurde beschrieben, dass eine Subpopulation kultivierter Leuko­zyten resident-mikrogliale Morphologie annimmt (Dunning und Furth 19353). Milzmakrophagen und Monozyten ramifizieren in der Kokultur auf Astrozyten nach einiger Zeit und lassen sich weder morphologisch noch elektrophysiologisch von amöboiden Mikrogliazellen unterscheiden, die unter identischen Bedingungen kultiviert werden (Sievers 1994a, Sievers 1994b, Schmidt­mayer 1994, Wilms 1997). Auf Makrophagen aus dem Knochenmark wurde ein Profil memb­ranständiger Ionenkanäle nachgewiesen, das auch für Mikrogliazellen typisch ist (Banati 1991). Der Umstand, dass das Wachstum von Knochenmarkzellen auf Astrozyten oder OEHSC mit der Entwicklung mikroglialer Phänotypen einhergeht, bestätigt die Ergebnisse von Sievers et al., da Knochenmark einerseits Gewebemakrophagen, andererseits aber auch zahlreiche monozytäre Vorstufen enthält. In den Versuchen von Sievers et al. zeigte ein kleiner Teil der applizierten Zellen bereits in der Kultur mit Astrozyten-konditioniertem Medium (d. h. ohne zellulären Un­tergrund) eine Mikroglia-ähnliche Tranformation. Dies war in den hier dargestellten Experimen­ten mit Knochenmarkzellen nicht der Fall, so dass der Interaktion mit den unlöslichen Faktoren aus Astrozyten bzw. organotypischen Hirnschnitten besondere Bedeutung zugeschrieben werden muss. Auf astrozytären Monolayers ist der Anteil ramifizierter Mikroglia/Makrophagen deutlich größer als auf azellulären Substraten (Sievers 1994b, Tanaka 1996); zudem behalten Mikroglia­zellen ihre amöboide Form, wenn sie bei nicht konfluenter Astrozytenkultur in den Zellzwi­schenräumen wachsen (Tanaka 1999). Der Schluss liegt nahe, dass mikrogliale Vorläuferzellen (Monozyten), die in der Embryonal- und Fetalzeit oder auch viel später die Blut-Hirn-Schranke passieren, nicht allein aus sich heraus, sondern nur durch Wechselwirkung mit der intracerebra­len Umgebung zu Mikroglia differenzieren. Werden aktivierte Mikrogliazellen auf OEHSC ap­[Seite 106↓]pliziert, wandern sie in die Schnittkulturen ein und ramifizieren innerhalb weniger Tage (Hailer 1997). In einem vergleichbaren Zeitraum lassen sich identische Beobachtungen an GFP­markierten Knochenmarkzellen machen; bei längerer Dauer der Kokultur verlangsamt sich die­ser Prozess allerdings zusehends. Eine ähnliche Kinetik zeigt das Verhalten der intrinsischen Mikrogliazellen in OEHSC, die innerhalb der ersten Tage in vitro auf das Präparationstrauma reagieren, indem sie eine amöboide Gestalt annehmen. Erst im weiteren Verlauf beginnen sie, sich wieder zu ramifizieren und haben nach etwa 9 Tagen ihre ursprüngliche Morphologie wie­dererlangt (Hailer 1996). Für die vorliegende Arbeit wurden die Knochenmarkzellen erst 5 bis 7 Tage nach Präparation der Slices appliziert, also zu einem Zeitpunkt, an dem die Ramifikation der intrinsischen Mikroglia bereits weit vorangeschritten war. Am dritten Tag nach Beginn der Kokultur zeigten neben den markierten Zellen aber auch die meisten der GFP-negativen, Iba-1­positiven Zellen wieder runde bzw. unverzweigte Morphologien. Dies spricht dafür, dass die Applikation der Knochenmarkzellen einen Stimulus darstellte, der zur erneuten Aktivierung der gewebeständigen Mikroglia führte. Im weiteren Verlauf der Kokultur bis zum 8. Tag nahmen Teile beider Zellpopulationen synchron wieder die Gestalt ramifizierter Mikroglia an. Die Re­versibilität dieser morphologischen Übergänge unterstützt die Annahme, dass es sich bei amö­boiden und ramifizierten Mikrogliazellen auch in vivo nicht um unterschiedliche Zellpopulationen handelt, sondern um einen Zelltypus, der in Abhängigkeit von der jeweiligen Lokalisation und funktionellen Beanspruchung verschiedene Phänotypen ausprägt.


Fußnoten und Endnoten

1 Bianco 2001: How much of the „stemness“ (self-renewal and multipotency) observed in experimental systems is inherent to the cells that we manipulate, and how much is due to the manipulation?

2 Juba A. 1934. Untersuchungen über die Entwicklung der Hortegaschen Microglia des Menschen. Arch Psychiatr Nervenkr 101: 577-592. Zitiert in: Ling und Wong 1993.

3 Dunning HS, Furth J. 1935. Studies in the relation between microglia, histiocytes and monocytes. Am J Pathol 11: 895-919. Zitiert in: Ling und Wong 1993.



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
28.09.2004