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1.  Einleitung

1.1. Bakterien

Bakterien sind einzellige Mikroorganismen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,5-5 µm. Zahlreiche apathogene Bakterienarten besiedeln den Menschen permanent und sind Bestandteil der Normalflora. Diese Normalflora übernimmt beim Menschen eine Reihe von Funktionen. Als Komponente des physiologischen Abwehrsystems bildet sie eine Kolonisationsresistenz und schützt so den Organismus vor einer Besiedlung durch pathogene Erreger.

Ob sich aus einer Kolonisation mit einem pathogenen Erreger eine manifeste Krankheit entwickelt, hängt im Wesentlichen von den pathogenen Eigenschaften des Mikro­organismus und von der Abwehrlage des Wirtes ab. So wird zwischen fakultativ pathoge­nen Erregern, die nur unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. einer geschwächten Ab­wehr­lage des Wirtes, zu einer Infektionskrankheit führen, und obligat pathogenen Erre­gern, deren Anwesenheit nahezu immer eine manifeste Krankheit bedingt, unterschieden.

Um eine Infektion verursachen zu können, müssen zahlreiche pathogene Bakterien zunächst verschiedene physische und biochemische Barrieren überwinden. So stellt etwa die Haut bzw. im Inneren des Körpers die Schleimhaut ein wesentliches Hindernis für pathogene Keime dar. Können sich diese dennoch an die Oberfläche von Epithelzellen anlagern und dort vermehren oder gelingt es ihnen, in tiefere Gewebe einzudringen, so müssen sie sich mit dem Immunsystem des Menschen auseinandersetzen. Dabei sind Phagozyten, z.B. Granulozyten und “Natürliche Killerzellen“, die größere Partikel wie Mikroorganismen, Fremdkörper oder Zelltrümmer eliminieren können, Teil des unspezifischen, zellulären, Antigen-unabhängigen Immunsystems. Zu diesem System gehört auch das Komplementsystem, das fremde Zellen lysieren oder den zur Phagozytose fähigen Zellen zugänglich machen kann. Das unspezifische, angeborene Immunsystem reagiert schnell und ist ein eminent wichtiger, früher Abwehr­mechanismus. Die Aktivierung des spezifischen, humoralen, Antigen-abhängigen Immunsystems, das in erster Linie durch die B- und T-Lymphozyten vermittelt wird, resultiert u.a. in der Bildung von Erreger-spezifischen Antikörpern und Gedächtniszellen. Dieses adaptative System reagiert verzögert und schützt den Organismus im Verlauf von lang andauernden bzw. über das “immunologische Gedächtnis“ bei erneuten Infektionen mit einem Erreger.


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Bakterien können im Wesentlichen in zwei Gruppen unterteilt werden. Zum einen gibt es die große Gruppe der Bakterien, deren Wachstum und Vermehrung auf den extrazellulären Raum beschränkt sind. Dabei kann diese Gruppe noch einmal unterteilt werden in die extrazellulär wachsenden Eitererreger, z.B. Staphylococcus aureus, und die Exotoxinbildner, z.B. Clostridium tetani, deren typisches Krankheitsbild durch die bakteriellen Toxine hervorgerufen wird.

Zum anderen gibt es die Gruppe der fakultativ bzw. obligat intrazellulären Bakterien. Diese haben die Fähigkeit, in Zellen einzudringen und sich in diesen zu vermehren. Dabei erfolgt die Aufnahme der Bakterien in die Zelle auf der einen Seite durch “professionelle“ Phagozyten wie Makrophagen oder Granulozyten. Auf der anderen Seite können diese Bakterien bei Zellen, die nicht zur “professionellen“ Phagozytose fähig sind, wie z.B. Epithelzellen, unter Ausnutzung physiologischer Reaktionskaskaden zelluläre Zytoskelett­veränderungen induzieren, die eine Internalisierung der Bakterien zur Folge haben (1, 2). Die meisten dieser Bakterienarten, z.B. Salmonella typhimurium (3), bleiben intrazellulär von einer Vakuole umschlossen (4, 5). Nur wenige Bakterienarten können diese Vakuole verlassen und sich somit frei im Zytoplasma bewegen und vermehren. Dies wurde bisher nur für drei Bakteriengattungen beschrieben (6). Dazu gehören die obligat intrazellulären Rickettsienarten (7), die u.a. verschiedene Arten des Fleck- und Zeckenbissfiebers verursachen, sowie die fakultativ intrazellulären Listerienarten (8) und Shigellen (9, 10).

Rickettsien, Listerien und Shigellen besitzen zahlreiche Virulenzfaktoren, die ihnen eine Besiedlung des intrazytoplasmatischen Raumes ermöglichen. Etwa um sich intrazytoplas­matisch bewegen und vermehren zu können, interagieren Shigellen und Listerien mit wirtseigenen Molekülen, die in Abwesenheit des Parasiten physiologische Funktionen in der Zelle erfüllen. Ein Beispiel hierfür liefert die intrazytoplasmatische Bewegung von Shigella flexneri und Listeria monocytogenes. Diese basiert auf einer bakterieninduzierten, gerichteten Aktinpoly­merisation (11, 12, 13, 14).

Doch obwohl mittlerweile viele dieser bakteriellen Virulenzfaktoren charakterisiert werden konnten, sind die vielfältigen Interaktionen zwischen intrazellulären Bakterien und ihren Wirtszellen bis heute nicht völlig verstanden.

1.2. Shigellen

Shigellen sind Gram-negative, unbegeißelte Stäbchen­bakterien, die für den Menschen pathogen sind. Nach der alten Nomenklatur bildet Shigella eine eigenständige Gattung mit [Seite 7↓]den in Tab. 1 aufgeführten Spezies. Neuerer Nomenklatur zufolge sind Shigellen Klone der Spezies Escherichia coli (15, 16, 17, 18). Aus historischen Gründen und aufgrund der noch nicht weltweit anerkannten neuen Nomenklatur wird in dieser Arbeit die alte Nomenklatur beibehalten.

Tab. 1: Klassifikation der Gattung Shigella, die neueren Nomenklaturen zufolge der Spezies Escherichia coli angehört (15, 16, 17, 18).

Shigellenspezies

Anzahl der Serotypen

Geographische Verbreitung

Shigella flexneri

6

weltweit

Shigella sonnei

1

weltweit

Shigella boydii

18

Vorderasien, Nordafrika

Shigella dysenteriae

13

tropische und subtropische Gebiete

Der Mensch, das einzige bekannte Erregerreservoir, infiziert sich vorwiegend durch die Aufnahme von kontaminiertem Wasser bzw. kontaminierten Lebensmitteln. Bereits eine Infektionsdosis von weniger als 100 Bakterien reicht aus, um eine Shigellose auszulösen (19). Diese auch als bakterielle Ruhr bezeichnete Krankheit entspricht einer Kolitis und wird im Wesentlichen durch die häufigen, stark wässrigen Stuhlentleerungen, die Schleim- und Blutbeimengungen enthalten können und die dadurch hervorgerufenen Symptome des starken Flüssigkeitsverlustes charakterisiert. Bakterielle Exotoxine, wie z.B. das Shiga-Toxin, scheinen nur bei einer Infektion mit Shigella dysenteriae von Bedeutung zu sein (20).

Nach der oralen Aufnahme des Erregers in den Gastrointestinaltrakt werden zunächst kolonständige M-Zellen mit Shigella flexneri infiziert (21, 22). Diese tragen keine Mikrovilli und bilden das Epithel über den Peyer-Plaques, wo sie in enger räumlicher und funktioneller Beziehung zu Lymphozyten und Makrophagen stehen. Die M-Zellen sind für die Aufnahme körperfremden Materials von Bedeutung und dienen einer Reihe von enteroinvasiven Mikroorganismen als Eintrittspforte (23). Shigellen durchwandern die M-Zellen und infizieren benachbarte Makrophagen, die durch Shigellen-induzierte Apoptose abgetötet werden. Dabei wird Interleukin-1 freigesetzt (24, 25). Dieses inflammatorisch und pyrogen wirkende Protein scheint für eine effiziente Infektion bedeutungsvoll zu sein. So wurde gezeigt, dass eine Inhibition der Interleukin-1-vermittelten Signaltransduktion zu einer Verminderung der Bakterienanzahl im infizierten Gewebe führt (21, 26). Die Bakterien [Seite 8↓]können Enterozyten nur vom basolateralen Pol her infizieren (27). Dies kann entweder direkt über unmittelbar angrenzende M-Zellen oder über infizierte Makrophagen erfolgen. Ein zweiter potentieller Mechanismus erlaubt es den Shigellen, die Enterozyten vom basolateralen Pol her zu infizieren. Dabei nutzen die Shigellen die Dehiszenz aus, die polymorphkernige Leukozyten zwischen den Epithelzellen verursachen, wenn sie sich zwischen diese drängen. Diese “Lücke“ ermöglicht es den Bakterien, zwischen die Enterozyten zu gelangen und diese anschließend vom basolateralen Pol her zu infizieren (28). Kürzlich gewonnene Ergebnisse deuten darauf hin, dass Shigellen diesen Mechanismus möglicherweise kontrollieren, indem sie die Migration der polymorphkernigen Leukozyten ins Epithel induzieren. So wurde gezeigt, dass an der apikalen Oberfläche sezernierte Lipopolysaccharide (LPS) von Shigella transzellulär in den basolateralen Interzellulärraum gelangen und dadurch zu einer verstärkten Einwanderung polymorphkerniger Leukozyten ins Epithel führen (29).

Nach der Epithelzellinvasion induzieren die Shigellen die Lyse der Vakuolenmembran (10), wodurch sie sich frei im Zytoplasma der Wirtszelle bewegen und vermehren können. Die Bakterien können von Zelle zu Zelle “wandern“, ohne mit dem extrazellulären Milieu in Kontakt kommen zu müssen und infizieren so auch benachbarte Enterozyten (1, 30). Bei der interzellulären Ausbreitung induzieren Shigellen die Ausbildung von fingerförmigen Protrusionen, die von benachbarten Zellen aufgenommen werden (30). Anschließend erfolgt die Lyse der Doppelmembran, so dass sich die Shigellen wieder frei im Zytoplasma befinden (31).

Bei der intrazellulären Bewegung können zwei unterschiedliche Bewegungsarten beobachtet werden, wobei die eine IcsA-abhängig und die andere IcsA-unabhängig ist (7). IcsA ist ein sezerniertes, bakterielles Protein, das ATP binden kann und in vitro ATPase-Aktivität zeigt (32). Der von diesem Protein abhängige Bewegungstyp ist charakterisiert durch eine an einem Ende des Bakteriums lokalisierte, polarisierte Induktion von Aktinpolymerisation. Diese komplexe, dynamische Zytoskelettstruktur führt zur Ausbildung von Aktinbündeln, die die Bakterien intrazytoplasmatisch vorwärtsschieben (30, 33). Diese IcsA-abhängige Bewegung ist für die Ausbildung einer Erkrankung essentiell. IcsA-negative Mutanten waren nicht mehr in der Lage, eine Shigellose zu verursachen (34). Bei dem anderen, IcsA-unabhängigen Mechanismus, bewegen sich die Shigellen entlang von präexistenten Mikrofilamenten oder Stressfasern (35, 36). Die pathophysio­logische Bedeutung dieses Bewegungstyps ist bisher ungeklärt.


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Die Infektion mit Shigella flexneri erfolgt in sechs Schritten:

  1. orale Aufnahme des Erregers
  2. Epithelzellinvasion
  3. intrazytoplasmatische Vermehrung
  4. Ausbreitung von Zelle zu Zelle
  5. granulozytäre Demarkierung des Infektionsortes
  6. Ausscheidung des Erregers mit dem Stuhl.

1.3. Problemstellung

Intrazelluläre Erreger haben die Fähigkeit entwickelt, in physiologische Vorgänge ihrer Wirtszelle einzugreifen, diese zu steuern und auszunutzen. Die Interaktionen zwischen intrazellulären Parasiten und ihren Wirtszellen sind für die Pathogenität dieser Mikroorganismen von entscheidender Bedeutung. Die Erforschung dieser Prozesse dient somit einerseits der Aufklärung von Pathogenitätsmechanismen und ist dadurch eine Grundlage für die Entwicklung von Strategien zur Bekämpfung und Verhütung dieser Infektionskrankheiten und führt andererseits zu einem besseren Verständnis physiologischer, zellbiologischer Vorgänge innerhalb von eukaryoten Zellen.

Ein Beispiel für eine derartige Interaktion zwischen Wirtszelle und Erreger stellt die Infektion von Epithelzellen durch Shigella flexneri dar. Dabei koordiniert und reguliert Shigella Proteine der Wirtszelle u.a. zur bakteriellen Invasion, zur intrazellulären Bewegung und zur interzellulären Ausbreitung (9, 37, 38). Das Ausnutzen der Wirtszelle kann am Beispiel der Epithelzellinvasion, die ein wesentlicher Virulenzfaktor von Shigella ist (39), besonders gut dargestellt werden. Nach dem Kontakt mit Epithelzellen induziert Shigella über eine gezielte Steuerung zellulärer Proteine die Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur mit Pfeilerarchitektur. Die Pfeiler werden durch zelluläre Protrusionen gebildet und untereinander durch die Zytoplasmamembran verbunden. Schließlich konfluiert die Zytoplasmamembran über dem Bakterium und internalisiert es (9, 40, 41).

Nach dem Kontakt mit der Epithelzellmembran sezernieren Shigellen zunächst vier Ipa-Proteine (invasion plasmid antigen) (42). Während IpaB, IpaC und IpaD essentiell für die bakterielle Invasion sind (43, 44), spielt IpaA eine Rolle bei der Koordination der bakteriell induzierten Zytoskelettveränderungen und erhöht dadurch möglicherweise die Invasionseffizienz (45). IpaD ist ein entscheidender Regulator der bakteriellen Sekretion der [Seite 10↓]Ipa-Proteine (46). IpaB und IpaC bilden im Extrazellulärraum den sogenannten Ipa-Komplex, der die Aufnahme von Bakterien und auch anderen Partikeln induziert (44, 47). So werden mit dem Ipa-Komplex gekoppelte Latexpartikel ebenfalls von Epithelzellen internalisiert (44). Der Proteinkomplex aus IpaB und IpaC führt nach dem initialen Membrankontakt über eine IpaC-abhängige Aktivierung der GTPasen CDC42 und Rac zunächst zur Bildung von Aktinnukleationszonen seitlich sowie unterhalb des bakteriellen Kontaktes (48). Die seitlich der bakteriozellulären Kontaktzone gelegenen Nuklea­tionszonen werden in Abhängigkeit von Rho, einer weiteren GTPase, durch kontinuierliche Aktinpolymerisation zu zellulären Protrusionen, wobei die negativen Enden der Aktinfilamente zum Zellinneren zeigen, während die positiven Enden der Aktinfilamente zur Plasmamembran gerichtet sind (9, 44, 41, 49). Die Nukleationszonen direkt unterhalb des Bakteriums entwickeln sich möglicherweise IpaA-abhängig nicht zu Protrusionen (41, 50).

Die bakteriell induzierte Aktinpolymerisation ist essentiell für die Invasion von Shigella (9, 40). So kann durch Cytochalasin B, einen Inhibitor der Aktinpolymerisation, die bakterielle Invasion gehemmt werden (51). Mehrere Proteine besitzen eine funktionelle Rolle bei diesen bakterieninduzierten Rearrangements des Zytoskeletts, z.B. T-Plastin (41), ein aktinbündelndes Protein, das für die gerichtete Aktinpolymerisation von Bedeutung und für die bakterielle Invasion essentiell ist (41), sowie Ezrin (52) und die bereits genannten GTPasen der Rho-Gruppe Rac, CDC42 und Rho (37, 53).

Rho ist eine GTPase, die für die Organisation des Zytoskelettes allgemein von großer Bedeutung ist. So reguliert Rho u.a. die Bildung von Stressfasern und fokalen Adhäsionsplaques (54, 55, 56). Des Weiteren spielt Rho eine wichtige Rolle im Phospholipidstoff­wechsel (57, 58).

Für die Epithelzellinvasion von Shigella flexneri ist Rho essentiell (37, 59). Dies zeigte sich dadurch, dass bei HeLa-Zellen, die mit dem Rho-spezifischen Inhibitor Clostridium botulinum Exoenzym C3 behandelt wurden (60), eine 87%ige Inhibition der Shigelleninvasion nachgewiesen wurde (37). Während der Invasion wird Rho zur bakteriellen Eintrittsstelle rekrutiert (37). Dort stabilisiert und bündelt Rho filamentäres Aktin (61), das an der bakteriellen Eintrittsstelle aus monomerem Aktin polymerisiert.

Es ist daher notwendig, dass die Rho-Aktivität während der Epithelzellinvasion durch Shigella gezielt gesteuert wird. Rho unterliegt einem Zyklus zwischen einem aktiven und einem inaktiven Zustand. Dieser Zyklus wird durch GTPase-activating proteins (GAP-Proteine), GDP/GTP exchange factors (GEF-Proteine) und guanine nucleotide dissociation [Seite 11↓]inhibitor (GDI-Protein) reguliert. Während GAP-Proteine Rho von einem GTP-gebundenen, aktiven Zustand in einen GDP-gebundenen, inaktiven Zustand überführen, fördern GEF-Proteine die Bildung von GTP-gebundenem, aktiven Rho aus GDP-gebundenem, inaktiven Rho. Ist Rho mit dem GDI-Protein assoziiert, so wird der GDP-gebundene Zustand stabilisiert, was einer Aktivierung von Rho entgegenwirkt (62, siehe Abb. 1).

Abb. 1: Rho-Zyklus zwischen dem GDP-gebundenen, inaktiven Zustand und dem GTP-gebundenen, aktiven Zustand. GEF-Proteine aktivieren Rho, GAP-Proteine inaktivieren Rho. GDI-Protein stabilisiert GDP-gebundenes, inaktives Rho.

Shigella induziert während der Invasion eine Rho-Aktivierung, die essentiell für die Ausbildung der zur Bakterienaufnahme führenden Zytoskelettveränderungen ist (37). Wie die Aktivierung von Rho im Detail erfolgt, ist bisher ungeklärt. Aufgrund der Beobachtung, dass sich die blütenartige Membranstruktur unmittelbar nach der Aufnahme des Bakteriums zurückbildet, kann man annehmen, dass die Rho-Aktivierung zeitlich streng begrenzt ist. Wir vermuteten daher, dass Rho-Antagonisten an der Regulation der Rho-abhängigen Zytoskelettveränderungen funktionell von Bedeutung sein könnten. Im Rahmen der Überlegungen zur Regulation der Rho-Aktivität stellte Myr5, ein nicht konventionelles Myosin, ein mögliches Bindeglied zwischen Rho und dem Zytoskelett dar.


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Myr5 (fifth unconventional myosin from rat) ist das erste bekannte Myosin mit einem GAP-Modul (63). Es ist ein Protein mit einer relativen Molekülmasse von 225 kDa und besteht aus 1980 Aminosäuren (63, siehe Abb. 2).

Abb. 2: Schematische Darstellung des Myr5-Moleküls (63). Die hervorgehobenen Sequenzen sind für Myr5 spezifisch und werden im konventionellen Myosin des Muskels nicht gefunden.

Myr5 konnte in Rattengewebe isoliert werden und gehört zur Myosinklasse IX. In den letzten Jahren sind eine Vielzahl “neuer“ Myosine entdeckt worden. Diese werden in 18 Klassen eingeteilt (64). Dabei wird das Myosin des Muskels, Myosinklasse II, als “konventionelles“ Myosin bezeichnet. Die Myosine der anderen Klassen bilden die Gruppe der sogenannten “nicht konventionellen“ Myosine (65). Alle Myosine haben eine ähnliche Kopf-Region, über die sie ATP-abhängig mit Aktin interagieren. Die Myosine der einzelnen Klassen besitzen jedoch unterschiedliche Schwanz-Regionen, wodurch den nicht konventionellen Myosinen verschiedene Funktionen zukommen. Unter anderem wird den Myosinen eine Beteiligung bei der Zellbewegung (Myosinklasse I), bei der Endo- und Exozytose (Myosinklasse I, V), bei der Phagozytose (Myosinklasse I), beim Intrazellulärtransport (Myosinklasse V, VI) und bei der Signaltransduktion (Myosinklasse I, IX) zugeschrieben (65, 66, 67, 68). Auch für die Sinnesfunktionen Sehen, Hören und Gleichgewichtssinn sind Myosine (Myosinklasse I, III, VI, VII) essentiell (65, 69).


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Charakteristisch für die Myosine der Klasse IX ist die GAP-Domäne in der Schwanz-Region des Proteins. Myr5 kann an Rho binden und Rho sowohl in vitro als auch in vivo mittels des GAP-Moduls inaktivieren (63). Auch für das humane Myosin-IXb und das in Rattengewebe isolierte Myr7, die ebenfalls der Myosinklasse IX angehören und eine hohe Homologie zu Myr5 aufweisen, konnte gezeigt werden, dass sie Rho mittels ihrer GAP-Module inaktivieren können (63, 70, 71, 72).

Ob Myr5 mit Aktin ATP-abhängig interagieren kann, ist bisher nicht eindeutig geklärt. Es gibt jedoch experimentelle Hinweise, die für eine solche Interaktion zwischen Aktin und Myr5 sprechen. So führten Reinhard et al. (63) Co-Sedimentationsexperimente mit dem Ergebnis durch, dass Myr5 ATP-abhängig an Aktin binden kann. Demgegenüber zeigten die von Mooseker et al. (71) durchgeführten Co-Sedimentationsexperimente mit dem humanen Klasse IX-Myosin, Myosin-IXb, eine ATP-unabhängige Aktinbindung. Ob Myr5 und das humane Myosin-IXb tatsächlich auf verschiedene Art und Weise mit Aktin interagieren oder ob die unterschiedlichen Resultate auf die ungleichen experimentellen Bedingungen zurückzuführen sind, bleibt noch zu klären.

Myr5 kann somit sowohl mit Rho als auch mit Aktin interagieren und stellt dadurch eine direkte Assoziation von Rho mit dem Zytoskelett her. Wir vermuteten daher, dass das GAP-Protein Myr5 während der Shigelleninvasion funktionell von Bedeutung sein könnte. So spekulierten wir zum einen, dass Myr5 als aktives Motorprotein für Rho fungieren könnte. Diese Hypothese gründet u.a. auf der Tatsache, dass für das humane Klasse-IX-Myosin, Myosin-IXb, eine aktive Bewegung entlang von Aktinfilamenten beschrieben wurde (71). Zum anderen könnte Myr5 mittels seines GAP-Moduls als Rho-Antagonist funktionell von Bedeutung sein.

Die Zielsetzung dieser Arbeit war es daher, die Bedeutung des Rho-Antagonisten Myr5 bei der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri aufzudecken.


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06.01.2005