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2.  Materialien und Methoden

2.1. Materialien

Sofern nicht anders angegeben, wurden Chemikalien der Reinheitsgrade “p.a.“ bzw. “reinst“ der Firmen ALDRICH, BAKER, FLUKA, GIBCO, MERCK, ROTH, SIFIN und SIGMA verwendet. Alle Lösungen wurden in Aqua bidest. angesetzt. Die Medien und Pufferlösungen wurden autoklaviert (20 Minuten, 120°C) oder steril filtriert (0,2 µm).

2.2. Verwendete Myr5- und Rho-Konstrukte

Die für die Untersuchungen verwendeten Myr5-Konstrukte erhielten wir von Prof. Martin Bähler, Institut für Allgemeine Zoologie und Genetik, Westfälische Wilhelms-Universität, Schlossplatz 5, 48149 Münster. Die Myr-5-Konstrukte besitzen C-terminal ein HA-tag (tag = Markersequenz) und unterscheiden sich von Myr5 wie folgt:

Der Sequenz der verwendeten Konstrukte RhoA, RhoB und RhoC wurde N-terminal eine VSV-Sequenz vorangestellt. Diese kodiert für 11 Aminosäuren des vesicular stomatis virus glycoprotein, und wird vom monoklonalen Antikörper P5D4 erkannt (74).

2.3. Bakterienstämme

Verwendete Shigellen-Stämme:

2.4. Zellkultur

Verwendete Zelllinie: HeLa-Zellen

HeLa-Zellen sind Zellen eines stark wachsenden Zervixkarzinoms, die seit 1951 in Gewebekultur gezüchtet werden. Die Patientin Henrietta Lacks, von deren Zervixkarzinom diese Zellen abstammen, gab dieser Zelllinie ihren Namen (78).

Die Einsaat der HeLa-Zellen erfolgte in einer Konzentration von 2x105/ml in 100 mm Gewebekulturschalen (GREINER) in 15 ml MEM (minimal essential medium with glutamine; GIBCO) mit 10% FKS (fötales Kälberserum; GIBCO). Nach 2 Tagen Bebrütung der Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 waren sie konfluent gewachsen. Nach Ablösung der Zellen durch 3,5 ml Trypsin ()wurden die Zellen in 9,5 ml MEM aufgenommen und anschließend 4 Minuten bei 125xg zentrifugiert. Daraufhin wurden der Überstand abgenommen, die Zellen in 2 ml MEM resuspendiert und zum Auszählen der Zellen ein Tropfen der Suspension auf eine Zählkammer aufgetragen. Nach Auszählung und Ermittlung der HeLa-Zell-Konzentration in der Suspension konnten nun die Volumina berechnet werden, die zur korrekten Konzentrationseinstellung für die Weiterzucht oder für geplante Experimente benötigt wurden.

Trypsin (50 ml):

5 ml

5 ml

40 ml

Trypsin-Lösung 2,5% (GIBCO)

EDTA-Lösung ()

H2O


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EDTA-Lösung für Trypsin:

6,85 mM

1,37 M
26,8 mM
81 mM
147 mM

EDTA
NaCl
KCl
Na2HPO4, 12xH2O
KH2PO4

2.5.  Transfektion von HeLa-Zellen

Einen Tag vor der Transfektion erfolgte die Einsaat der HeLa-Zellen mit einer Konzentration von 1x105 /ml in eine 6-Loch-Platte (FALCON), die pro Vertiefung 2 ml Medium (MEM + 10% FKS) sowie ein steriles 22x22 mm Deckgläschen enthielt. Nach 16-20 stündiger Bebrütung der Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 wurde 2-4 Stunden vor der Transfektion das Medium gewechselt. Das Volumen des Transfektionsansatzes betrug pro Vertiefung 250 µl. Das Pipettierschema lautete wie folgt:

- 9 µg DNA/Vertiefung

- 12,5 µl 2,5 M CaCl2 /Vertiefung (Endkonzentration: 125 mM)

- auf 125 µl/Vertiefung mit Aqua bidest. auffüllen

- unter kräftigem Schütteln (damit kleinste Präzipitate gebildet werden) tropfenweise doppelt

konzentriertes BBS () 125 µl/Vertiefung zugeben (Endkonzentration: 1x BBS)

- Doppelt konzentriertes BBS (pH 6,95):

 

50 mM

280 mM

1,5 mM

N,N-bis[2-Hydroxyethyl]-2-aminoethanesulfonic acid (BES)

NaCl

Na2HPO4

Dieser Ansatz wurde 15-20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und anschließend tropfenweise auf die HeLa-Zellen pipettiert (250 µl/Vertiefung). Während der nun folgenden 20-24 Stunden Bebrütung der Zellen bei 37°C und 5% CO2 erfolgte die Aufnahme der Präzipitate. Nach 3x Waschen mit MEM folgte die Zugabe neuen Mediums auf die Zellen. Nach weiteren 15-20 Stunden war die Expression der Proteine optimal und damit dies die günstigste Zeit für darauffolgende Experimente.


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2.6.  Infektion

Einer Infektion von HeLa-Zellen ging meist eine Transfektion voraus (siehe 2.5.). War dies nicht der Fall, so wurden die HeLa-Zellen 20-24 Stunden vor der Infektion mit einer Konzentration von 3x 105/ml in eine 6-Loch-Platte mit 2 ml Medium/Vertiefung und einem Deckgläschen/Vertiefung eingesät. Unmittelbar vor der Infektion wurden die Zellen 3x mit MEM sowie 1x mit PBS () gewaschen.

Die Shigella flexneri-Stämme wurden in TSB (tryptic soy broth; FLUKA) kultiviert. Bei den Stämmen SC301 bzw. SC300 wurde dem TSB Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml als Selektionsmarker für pIL-22 und beim Stamm SC301 zusätzlich noch Kanamycin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml zur Sicherung des Virulenzplasmides zugesetzt. Nach Inokulation am Abend vor der Infektion und anschließender 15-20 stündiger Anzucht im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 Runden pro Minute (rpm) konnte eine 1: 100 Verdünnung hergestellt werden, welche sich nach weiteren 3 Stunden Inkubation im Schüttelinkubator in einer exponentiellen Phase befand. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch bei 600 nm. Eine Extinktion von 1 entsprach einer Konzentration von ca. 4x108 Bakterien/ml. Die je nach Experiment benötigten Volumina dieser Verdünnung wurden 10 Minuten bei 5100xg und RT zentrifugiert. Das Pellet wurde im entsprechenden Volumen MEM (4°C) aufgenommen und bis zur Infektion auf Eis gelagert.

2.6.1. Infektion mit Shigella flexneri SC301 oder SC300

2 ml des jeweiligen Shigella flexneri-Stammes (Konzentration 6x107/ml MEM) wurden auf die Zellen gegeben und anschließend 45 Minuten bei RT inkubiert, um den Bakterien die Anheftung an die Zellen zu ermöglichen. Die Infektion der Zellen erfolgte in 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37°C. Danach wurden die Zellen 4x mit PBS gewaschen und anschließend mit Paraformaldehyd () fixiert.

2.6.2. Infektion mit Shigella flexneriM90T, BS176 oder SC560

Die Infektion erfolgte mit einer Bakterienkonzentration von 3x107/ml bei Infektion mit M90T bzw. BS176 und 4x107/ml bei Infektion mit SC560. Nach Zugabe der 4°C kalten Bakteriensuspension auf die Zellen wurden die Bakterien aufgrund der fehlenden Adhärenz 10 Minuten bei 1500xg und RT auf die Zellen zentrifugiert und anschließend für die Infektion [Seite 18↓]30 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Bei einer Infektion mit den Shigella flexneri-Stämmen M90T oder BS176, z.B. für Zytoskelettdarstellungen, folgte anschließend 4x Waschen mit PBS und die Fixierung mit Paraformaldehyd. Bei einer Infektion mit dem Stamm SC560 für die quantitativen Invasionsexperimente wurde nach der Inkubation im Wasserbad das Medium abgezogen, 3x mit MEM gewaschen und frisches Medium mit 50 µg/ml Gentamicin zugesetzt. Danach wurden die Zellen weitere 2 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubiert, anschließend 6x mit MEM gewaschen und daraufhin mit Paraformaldehyd fixiert. Gentamicin wird von den HeLa-Zellen nicht aufgenommen, so dass nur intrazelluläre Shigellen überleben.

PBS: Es wurde immer 1x PBS verwendet. Dazu wurde eine 1: 10 Verdünnung von 10x PBS hergestellt.

10x PBS:

18 mM

NaH2PO4

 

126 mM

Na2HPO4, 2x H2O

 

1,5 M

NaCl

Paraformaldehyd: 3,7 g Paraformaldehyd wurden in 20 ml H2O gegeben und auf 50-60°C erwärmt. Nun wurde tropfenweise 10 M NaOH zugegeben, bis sich Paraformaldehyd vollständig gelöst hatte. Nach Abkühlen auf RT wurden 10 ml 10x PBS zugegeben. Der Ansatz wurde anschließend mit H2O auf 100 ml aufgefüllt, aliquotiert und bei
–20°C aufbewahrt.

2.7. Färbungen

2.7.1. Immunfluoreszenzfärbung

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde für Zytoskelettdarstellungen und die quantitativen Invasionsexperimente eingesetzt.

∙ Verwendete Primärantikörper und Verdünnungen in PBS, (Hersteller):

∙ Verwendete Sekundärantikörper und Fluoreszenzfarbstoffe: siehe Tab. 2

Tab. 2: Übersicht der verwendeten Sekundärantikörper und Fluoreszenzfarbstoffe.

 

Anregung

Emission

Verdünnung in 1xPBS

Hersteller

anti-Maus-Fluoreszein (FITC)

492 nm

520 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Maus-Texas Red (TR)

596 nm

623 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Maus-Cy 3

553 nm

575 nm

1: 200

DIANOVA

anti-Kaninchen-Fluoreszein

492 nm

520 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Kaninchen-Texas Red

596 nm

623 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Kaninchen-Cy 3

553 nm

575 nm

1: 200

DIANOVA

BODIPY FL Phallacidin

505 nm

512 nm

1: 10

MOLECULAR PROBES

Phalla­cidin wurde erst luftgetrocknet und anschließend in 1x PBS oder im Sekundäranti­körperansatz verdünnt.

Die auf Deckgläschen gewachsenen Zellen wurden 20 Minuten mit 3,7% Paraformaldehyd bei RT fixiert und anschließend zur Neutralisation der Aldehydgruppen mindestens 5 Minuten in 0,1 M Glyzin bei RT inkubiert. Daraufhin folgte die 5 minütige Permeabilisierung mit 0,1% Triton-X-100 in PBS. Zwischen den einzelnen Schritten wurden die Zellen jeweils 3x mit PBS gewaschen. Nach Zugabe der Primärantikörper gegen das HA- bzw. VSV-tag (40µl/Deckgläschen) erfolgte die 20-minütige Inkubation in einer feuchten Kammer bei RT. Zur Darstellung von Shigellen, z.B. für die quantitativen Invasionsexperimente, wurde der anti-LPS-Shigella flexneri-Kaninchen Antikörper verwendet. Die Zellen wurden dann erneut 3x mit PBS gewaschen. Für die indirekte Immunfluoreszenz wurden nun die Zellen mit den Sekundärantikörpern (40µl/Deckgläschen) wiederum in einer feuchten Kammer für mindestens 20 Minuten bei RT inkubiert. Nach dem zweiten Färbeschritt wurden die Deckgläschen 3x mit PBS gewaschen und möglichst blasenfrei auf einem Objektträger in Mowiol () eingebettet. Nach 10- minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Präparate bei 4°C aufbewahrt.


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Mowiol: 2,4 g Mowiol 4-88 (HOECHST) wurden mit 6 g Glyzerol und 6 ml H2O gemischt und für mindestens 2 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden 12 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 8,5, zugegeben und die Lösung erst 10 Minuten auf 50°C erwärmt, dann 15 Minuten bei 5000xg zentrifugiert und schließlich aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bei –20°C.

2.7.2. GIEMSA-Färbung

Wir führten im Vorfeld der quantitativen Invasionsassays Experimente zur Optimierung der Infektionseffizienz mit dem Stamm SC560 durch. Dabei verwendeten wir zur Darstellung von intrazellulären Shigellen die weniger zeitaufwendige GIEMSA-Färbung.

Die auf Deckgläschen gewachsenen Zellen wurden dabei 1 Minute mit 100% Ethanol fixiert. Nach Absaugen des Ethanols wurden die Zellen getrocknet, 2x mit PBS gewaschen und 20 Minuten lang mit GIEMSA-Lösung gefärbt.

2.8. Mikroskopieren

Zum Betrachten der Präparate und zum Anfertigen der Fotos wurden das Inverse Mikroskop Axiovert 135, ZEISS, verwendet.

Für die Fotodokumentation wurde der Kodak Ektachrome, Elite II, ASA 400, Farbdiafilm, verwendet.

2.9. DNA-Transformation, -Gewinnung, -Reinigung und -Präzipitation

2.9.1.  Herstellung kompetenter E.coli-Zellen

Um E.coli-Zellen kompetent, das heißt sie aufnahmebereit für freie DNA zu machen, wurde das nachfolgend beschriebene Verfahren verwendet.

E.coli-DH5 α-Zellen wurden in Luria Bertani broth (LB; FLUKA) inokuliert und für 16-20 Stunden im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Dann wurde eine 1/100 Verdünnung hergestellt und diese weitere 3 Stunden im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Nun wurden die Bakterien 10 Minuten bei 2600xg und 4°C abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 5 ml 100 mM CaCl2 aufgenommen. Nach einer Inkubation von 20 Minuten auf Eis wurde der Ansatz 10 Minuten bei 2600xg und 4°C


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zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde nun in 2 ml 125 mM CaCl2 suspendiert. Dazu wurden dann 500 µl Glyzerol gegeben und die Bakterien anschließend bei –80°C gelagert.

2.9.2. DNA-Transformation in E.coli-DH5 α -Zellen

Die Transformanden wurden über eine Plasmid-kodierte Ampicillin-Resistenz selektiert. Dazu wurden die bei –80°C gelagerten, kompetenten E.coli-Zellen (siehe 2.9.1) auf Eis aufgetaut. Dann wurde zu 100 µl Bakterienlösung ca. 2 µg DNA zugegeben und für mindestens 20 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend kam der Ansatz für exakt 2 Minuten in ein 42°C warmes Wasserbad. Nun wurden 900 µl LB zugegeben. Nach einer Stunde bei 37°C im Wärmeblock wurde der Ansatz 2 Minuten bei 15800xg und RT zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl LB aufgenommen, die Bakteriensuspension auf eine LB-Ampicillin-Platte () ausgespatelt und für 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 0,9% CO2 inkubiert. Da sich auf dem Plasmid, das die DNA enthielt, z.B. das Gen für Myr5, auch eine Sequenz befand, die für eine Ampicillin-Resistenz kodierte, selektierte die LB-Ampicillin-Platte zugunsten derjenigen Bakterien, die dieses Plasmid und somit die DNA aufgenommen hatten. Von der Platte wurden dann Einzelkolonien abgenommen und jeweils in 10 ml LB mit 100 µg/ml Ampicillin überimpft. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm wurden zu 900 µl dieser Bakteriensuspension 300 µl Glyzerol gegeben und die Bakterien bei –80°C gelagert.

LB-Ampicillin-Platte: Einem Liter H2O wurden 20 g LB und 13 g Agar zugegeben und anschließend autoklaviert. War der Ansatz auf ca. 50°C abgekühlt, wurden ihm 2 ml Ampicillin (50 mg/ml; SIGMA) zugesetzt und schließlich die Platten gegossen.

2.9.3. DNA-Gewinnung

Zur DNA-Gewinnung wurden die Bakterien in ca. 400 ml LB inokuliert und ca. 20 Stunden im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Nach Abzentrifugation der Bakterien bei 3200xg wurde die DNA unter Verwendung eines kommerziellen Plasmid-Präparationssystems (QIAGEN - maxi bzw. midi prep) aus den Bakterien gewonnen. Dabei wurde nach der Lyse der Bakterien die Plasmid-DNA mittels Salzfällung von der chromosomalen DNA getrennt. Die Reinigung der Plasmid-DNA erfolgte durch eine [Seite 22↓]Anionenaustauschchromatographie. Dabei wurde im ersten Schritt bei geringer Salzkonzentration die Plasmid-DNA an die Säule gebunden, während Proteine und Bakterienreste die Säule passierten. Nach zwei Waschschritten wurde dann die Plasmid-DNA bei hoher Salzkonzentration eluiert. Nach der Präzipitation der DNA mit Isopropanol und Entsalzung mit 70% Ethanol wurde die DNA in Aqua bidest. aufgenommen. Anschließend wurde die DNA-Konzentration am Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.

2.9.4.  DNA-Reinigung mittels Phenol-Chloroform-Extraktion

Dieses Verfahren dient zur Trennung von Proteinen und DNA und beruht auf den unterschiedlichen hydrophilen bzw. hydrophoben Eigenschaften von Proteinen und DNA.

Die in Wasser gelöste DNA wurde, um Verluste beim Pipettieren von sehr kleinen Volumina zu vermeiden, mit 1x TE () auf 300 µl aufgefüllt. Diesem Ansatz wurden 300 µl Phenol (4°C) zugegeben und dann 2 Minuten gemixt. Dabei lösten sich die Proteine in der hydrophoben Phase des Phenols. Die DNA hingegen verblieb in der hydrophilen Phase. Zur Trennung der beiden Phasen erfolgte eine Zentrifugation von 15 Minuten bei 15800xg und 4°C. Die obere, klare, wässrige Phase, in der die DNA gelöst war, wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert. Zum abgenommenen Überstand wurde im Verhältnis 1: 1 ein Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25: 24: 1; 4°C, FLUKA) gegeben und dann wieder 2 Minuten gemixt. Dabei lösten sich noch vorhandene Proteine und das Phenol aus dem ersten Schritt in der hydrophoben Phase, wohingegen die DNA wiederum in der wässrigen Phase verblieb. Daraufhin wurde wieder 15 Minuten bei 15800xg und 4°C zentrifugiert und der hydrophile Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert. Dazu wurde dann Chloroform, RT, im Verhältnis 1: 1 gegeben und erneut 2 Minuten gemixt. Da sich das in der hydrophilen Phase verbliebene Phenol im hydrophoben Chloroform löste, diente dieser Schritt auch der Reinigung der hydrophilen Phase vom Phenol. Nach 5 minütiger Zentrifugation bei 15800xg und RT konnte der Überstand, mit der darin gelösten DNA, in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert werden. Anschließend folgte meist eine Ethanolpräzipitation (siehe 2.9.5).

TE-Puffer (pH 8,0):

100 mM

10 mM

Tris-HCl

EDTA


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2.9.5.  Ethanolpräzipitation

Die Ethanolpräzipitation diente dem Ausfällen der DNA. Ihr ging immer eine Phenol-Chloroform-Extraktion voraus.

Beim ersten Schritt der Präzipitation wurde dem zuletzt abgenommenen Überstand der Phenol-Chloroform-Extraktion (siehe 2.9.4) 1/10 von dessen Ausgangsvolumen an 3 M Natriumazetat, pH 5,2, zugesetzt. Dieser Lösung wurde nun das Zweifache ihres Volumens an 100% Ethanol (–20°C) zugegeben. Bei einem Ausgangsvolumen des Überstandes aus 2.9.4. von z.B. 300 µl wurde diesem somit 30 µl Natriumazetat sowie 660 µl 100% Ethanol (–20°C) zugesetzt. Nach vorsichtigem Wenden dieses Ansatzes war bei größeren Mengen an DNA oft schon mit bloßem Auge ein DNA-Präzipitat erkennbar. Der Ansatz wurde bei –20°C über Nacht inkubiert, tags darauf 15 Minuten bei 15800xg und –2°C zentrifugiert und anschließend der Ethanol-Überstand abgenommen. Dem DNA-Pellet wurde dann zum Waschen 1 ml 70% Ethanol (–20°C) zugegeben. Es folgte wiederum eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 15800xg und -2°C. Der Abnahme des Überstandes und der Zugabe von 200 µl 100% Ethanol (–20°C) zur DNA schloss sich eine 10 minütige Zentrifugation für 10 Minuten bei 15800xg und –2°C an. Der Überstand wurde erneut abpipettiert und das DNA-Pellet getrocknet, bis es glasig aussah. Die Zugabe von 100% Ethanol war sinnvoll, da dieses wesentlich schneller vollständig an der Luft verdampfte als 70% Ethanol und somit die Zeit zum Trocknen der DNA erheblich verkürzte. Das DNA-Pellet wurde anschließend in Aqua bidest. aufgenommen, wobei das Volumen an zugesetztem Wasser von der ungefähren DNA-Menge abhing. Die Konzentration an DNA wurde dann am Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.

2.10. Herstellung des Myr5-VSV-tag-Konstruktes

Um Myr5 und das GAP-negative Myr5-250 parallel darstellen zu können, musste eines der beiden Konstrukte mit einem neuen tag versehen werden. Dazu wurde von Prof. Martin Bähler, Institut für Allgemeine Zoologie und Genetik Münster, das mit einem Flag-tag versehene Myr5 im Vektor pUHD 310/311 (Myr5-Flag) bezogen. Aus diesem Konstrukt Myr5-Flag wurde die für das Flag-tag kodierende Sequenz über die Schnittstellen der Enzyme NdeI (sticky end; MBI/FERMENTAS) und Eco32I (blunt end; MBI/FERMENTAS) ausgeschnitten und anschließend eine kurze Doppelstrang-DNA, die für ein VSV-tag kodierte [Seite 24↓]und durch Hybridisierung von zwei Oligonukleotiden (EUROGENTEC, Sequenz siehe Abb. 17) hergestellt wurde, über die gleichen Schnittstellen wieder einkloniert.

2.10.1. Schema der Vorgehensweise

2.10.2. Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Folgende Überlegungen und Berechnungen gingen dem Restriktionsansatz voraus:

  1. 1 Einheit (unit) einer Restriktionsendonuklease schneidet 1 µg einer 3,5 kb langen DNA in einer Stunde zu 99%. Dies entspricht einer 1-fachen Restriktion. Geschnitten wurden 20 µg einer 9,2 kb langen DNA (Myr5-Flag in pUHD 310/311) in 2 Stunden mit einer 12-fachen Restriktion. Somit wurden 60 Einheiten beider Enzyme benötigt.[Seite 25↓]
  2. Die Restriktionsenzyme wurden mindestens 1/20 verdünnt, da sich bei Glycerol­konzentration von > 5% die Aktivität der Enzyme erfahrungsgemäß verringert.
  3. Buffer R (MBI/FERMENTAS), den beide Enzyme zum Schneiden benötigten, musste im Ansatz 1-fach vorliegen.
  4. BSA (bovines serum albumin; MBI/FERMENTAS), das die Effizienz der Enzyme steigerte, musste im Ansatz eine Konzentration von 0,1 mg/ml aufweisen.
  5. Als Kontrolle wurden je 2 µg der DNA nur mit NdeI bzw. Eco32I geschnitten. Anhand der Kontrollen konnte bei der sich anschließenden Elektrophorese beurteilt werden, ob beide Enzyme das Plasmid geschnitten hatten.

Somit ergab sich folgender Ansatz: siehe Tab. 3

Tab. 3: Pipettierschema des 1. Restriktionsansatzes.

Gesamtvolumen

DNA
1,27 µg/µl

Buffer R
10-fach

BSA
2 mg/ml

NdeI
10 unit/µl

Eco32I
10 unit/µl

Aqua

300 µl

15,8 µl

30 µl

15 µl

6 µl

6 µl

227,2 µl

30 µl

1,6 µl

3 µl

1,5 µl

0,6 µl

/

23,3 µl

30 µl

1,6 µl

3 µl

1,5 µl

/

0,6 µl

23,3 µl

Zum Schneiden wurden die Proben 2 Stunden lang im Wärmeblock bei 37°C inkubiert und anschließend die Enzyme durch 20 Minuten im Wärmeblock bei 65°C inaktiviert.

2.10.3. Gelelektrophorese

Das ausgeschnittene Fragment (Flag-tag) wurde nun mittels Gelelektrophorese vom Plasmid (pUHD+Myr5) getrennt. Das Verfahren beruht auf den unterschiedlichen Wanderungsge-schwindigkeiten von verschieden großen DNA-Fragmenten im elektrischen Gleichspannungs-feld. Dazu wurde ein 1x TAE (), 1% Agarosegel benutzt. Vor dem Auftragen wurde den Proben TAE, Endkonzentration 1x, und Loading-Buffer (), in Probe 1: 6 verdünnt, zugesetzt (siehe Tab. 4).


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Tab. 4: Ansätze für die Gelelektrophorese.

Probe

Gesamtvolumen

Restrik.-ansatz

1 kb Leiter

50x TAE

Loading-B.

Aqua

NdeI, Eco32I

400 µl

300 µl

/

8 µl

65 µl

27 µl

NdeI

50 µl

30 µl

/

1 µl

8 µl

11 µl

Eco32I

50 µl

30 µl

/

1 µl

8 µl

11 µl

1 kb Leiter

50 µl

/

1,5 µl

1 µl

8 µl

39,5 µl

Die Proben wurden, nach einer Inkubation von 5 Minuten / 70°C, bei 50 Volt ca. 90 Minuten im Gel laufen gelassen und die interessierende Bande unter einer UV-Lampe ausgeschnitten.

50x TAE:

242 g

Tris

 

57,1 ml

100% CH3COOH

 

100 ml

0,5 M EDTA

 

ad 1000 ml

H2O

Loading-Buffer:

0,25%

Xylin-Cyanol

 

0,25%

Bromphenolblau

 

30%

Glyzerol

2.10.4. Gelextraktion, Dephosphorylierung, Präzipitation kleiner DNA-Fragmente

Die Gelextraktion erfolgte nach dem Protokoll “QIAquick Gel Extraction Kit“ von QIAGEN. Nachdem das Gel aufgelöst worden war, wurde bei diesem Verfahren die DNA mit Hilfe einer Silica-Membran vom Gel getrennt. Dabei wurde die DNA im ersten Schritt bei einer hohen Salzkonzentration und bei einem geringen pH-Wert (Zugabe von Natriumazetat) an die Membran gebunden, das Gel jedoch nicht. Nun wurde die DNA gewaschen und anschließend bei geringer Salzkonzentration und einem höheren pH-Wert mit 265 µl Aqua bidest. eluiert. Dann erfolgte am Spektralphotometer bei 260 nm die Konzentrationsbestimmung der DNA. Diese ergab eine Konzentration von 0,026 µg/µl. Bei einem Volumen von 265 µl waren dies also 6,89 µg DNA.

Dem schloss sich eine Phenol-Chloroform-Extraktion sowie eine Ethanolpräzipitation [Seite 27↓](siehe 2.9.4 bzw. 2.9.5) an, wobei die ca. 4 µg DNA in 20 µl Aqua bidest. aufgenommen wurden. Hiernach wurde die DNA nochmals mit NdeI und Eco32I geschnitten. Dies hatte den Sinn, die Anzahl ungeschnittener sowie nur einfach geschnittener Plasmide möglichst gering werden zu lassen. Zum Schneiden wurden von den 20 µl DNA 11 µl (ca. 2,2 µg) eingesetzt und 2 Stunden mit 14-facher Restriktion geschnitten (siehe Tab. 5).

Tab. 5: Pipettierschema des 2. Restriktionsansatzes.

Gesamtvolumen

DNA
0,2 µg/µl

Buffer R
10-fach

BSA
2 mg/ml

NdeI
10 unit/µl

Eco32I
10 unit/µl

Aqua

100 µl

11 µl

10 µl

5 µl

0,8 µl

0,8 µl

72,4 µl

Nach der Enzyminaktivierung folgte eine Dephosphorylierung der DNA mit alkalischer Phosphatase. Dabei wurde nach dem “Protocol for DNA dephophorylation using calf intestine alkaline phosphatase (CIAP)“ (MBI/FERMENTAS) vorgegangen. Hierbei wurden mittels einer Phosphomonoesterase von den DNA-Enden freie Phosphate abgespalten. Da eine Ligation von Doppelstrang-DNA nur möglich ist, wenn mindestens einer der zu ligierenden Stränge ein Phosphat besitzt, konnte anschließend nur eine Ligation zwischen den hybridisierten Oligonukleotiden (siehe Abb. 17), die an ihrem 5`-Ende jeweils phophoryliert waren, und der DNA erfolgen. Eine Religation von nur einfach geschnittenen Plasmiden wurde dadurch ausgeschlossen. Der Dephosphorylierung folgte eine Phenol-Chloroform-Extraktion.

Eine Ligation zwischen den hybridisierten Oligonukleotiden und den beim 2. Schneiden ausgeschnittenen Flag-tag-Fragmenten wurde verhindert, indem diese kleinen Fragmente nach dem Protokoll des DSTM Primer Remover® (MOBITEC) aus dem Ansatz entfernt wurden. Das Verfahren beruht auf der unterschiedlichen Präzipitation kleiner (bis ca. 100 bp) und großer DNA-Fragmente. Die verbliebene DNA wurde in 12 µl Aqua bidest. aufgenommen (Konzentration: 0,125 µg/µl). Eine genaue Konzentrations­bestimmung der DNA wurde aufgrund der geringen DNA-Menge nun nicht mehr durchgeführt.


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2.10.5.  Oligonukleotidhybridisierung

Bei der Hybridisierung bildeten zwei komplementäre einsträngige Oligonukleotide ein doppelsträngiges DNA-Fragment (VSV-tag). Dabei wurden zu 30 µl 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, je 5 µl Oligonukleotid 1 (80 µM, siehe Abb. 17) sowie Oligonukleotid 2 (80 µM, siehe Abb. 17) zugegeben, so dass beide Oligonukleotide im Ansatz 10 µM vorlagen. Dieser Ansatz wurde 10 Minuten bei 90°C inkubiert und dann erst bei RT auf exakt 45°C und anschließend in Eiswasser auf 0°C abgekühlt.

2.10.6. Ligation

Die Ligation erfolgte nach dem Protokoll “Ligation with T4 DNA ligase (with PEG) / 1. DNA insert ligation into plasmid vektor“ (MBI/FERMENTAS).

Pro Ligation wurden 2 µl DNA eingesetzt. Dies entsprach etwa 40 fmol DNA. Da diese DNA-Menge nur eine Schätzung war, wurden verschiedene Verhältnisse zwischen DNA (Vektor) und Oligohybrid gewählt, nämlich 1: 20, 1: 5, 1: 1, 2: 1 und 8: 1. Somit waren die in Tab. 6 dargestellten Ansätze nötig:

Tab. 6: Pipettierschema der Ligationsansätze.

 

Ansatz 1

Ansatz 2

Ansatz 3

Ansatz 4

Ansatz 5

Ansatz 6

Ansatz 7

Ansatz 8

Verhältnis V/O

1 : 20

1 : 5

1 : 1

2 : 1

1 : 8

/

/

/

Vektor

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

/

/

Oligohybrid

2 µl
832 fmol

2 µl
208 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
20,8 fmol

2 µl
5,23 fmol

/

2 µl
41,6 fmol

/

Stammlösung

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

Aqua

/

/

/

/

/

2 µl

2 µl

4 µl

Die Ansätze 6, 7 und 8 dienten als Negativkontrollen, wobei Ansatz 6 ein Maß für die Anzahl an ungeschnittenen Plasmiden lieferte.

Da das Gesamtvolumen pro Ligationsansatz laut Protokoll 20 µl betragen sollte, blieb abzüglich der 2 µl Vektor und 2 µl Oligohybrid pro Ligationsansatz ein Volumen von 16 µl für die übrigen Zusätze. Da diese für jeden Ansatz identisch waren, wurden sie zu einer [Seite 29↓]“Stammlösung“ zusammenpipettiert. Diese wurde nach Protokoll hergestellt, wobei 4 Einheiten T4 DNA Ligase pro Ligation verwendet wurden, weil die Eco32I-Schnittstelle “blunt end“ ligiert werden musste.

Die benötigten Verdünnungen des Oligohybrides (10 µM) in Aqua bidest lauteten wie folgt: siehe: Tab. 7:

Tab. 7: Verwendete Oligohybridverdünnungen für die Ligationsansätze.

 

für Ansatz 1

für Ansatz 2

für Ansatz 3+7

für Ansatz 4

für Ansatz 5

Verdünnung

1 : 24

1 : 96

1 : 480

1 : 960

1 : 3840

Die Proben wurden nun 1 Stunde bei 22°C inkubiert. Dann erfolgte die Transformation. Die dazu benutzten E.coli-DH5 α-Zellen wurde anschließend auf LB-Ampicillin-Platten ausgestrichen und für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Vom Ligationsansatz 2 (V/O=1: 5), bei welchem die meisten Kolonien gewachsen waren, wurden 4 Kolonien abgenommen, auf LB-Ampicillin-Platten fraktioniert ausgestrichen und für 20-24 Stunden bei 37°C inkubiert. Von jeder der 4 Platten wurde dann eine Einzelkolonie in LB inokuliert und tags darauf eine DNA-Präparation (midi prep; QIAGEN) durchgeführt. Mit den gewonnenen DNA`s wurden anschließend HeLa-Zellen transfiziert und mittels einer Immunfluoreszenzfärbung (Primärantikörper: anti-VSV-tag-Maus, Sekundärantikörper: anti-Maus-TR) die Expression des neuen Konstruktes geprüft.


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06.01.2005