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3.  Ergebnisse

3.1.  Änderung der Zellmorphologie durch Überexpression von Myr5

Für die Untersuchungen wurde Myr5 in den Vektor pUHD kloniert und mit einem Hämagglutinin-Epitop (HA-tag) versehen.Im Rahmen der ersten Untersuchungen wurden HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert. Danach wurde Myr5 mit einem Primärantikörper, der gegen das HA-tag von Myr5 gerichtet war, markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Die Darstellung von Aktin erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin.

Die anschließend beobachteten Veränderungen der Zellmorphologie der HeLa-Zellen waren vom Expressionsniveau von Myr5 abhängig. Während die Zellmorphologie der mit Myr5 schwach und mittelstark transfizierten Zellen denen der nicht transfizierten Zellen glich, konnten bei den stark transfizierten Zellen deutliche Veränderungen der Zellmor­phologie festgestellt werden. Zum einen konnte in den stark transfizierten Zellen eine verminderte Bildung von Stressfasern beobachtet werden, zum anderen bildeten diese Zellen filiforme, längliche Zellausläufer, wodurch sie ein Neuron-ähnliches Aussehen zeigten (siehe Abb. 3).

Abb. 3: Neuronen-ähnliches Aussehen einer Myr5 (rot) überexprimierenden HeLa-Zelle in der Doppelfluoreszenzmikroskopie; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt, nur transfizierte Zellen sind sichtbar; B: Aktin- Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.


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3.2.  Rekrutierung von Myr5 in die Invasionszone und Kolokalisation von Myr5 und Aktin an der bakteriellen Eintrittsstelle

Um die Lokalisation von Myr5 bei der Invasion von eukaryoten Zellen durch Shigella flexneri zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert und anschließend mit Shigellen infiziert. Mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie konnte nun die Verteilung von Myr5 dargestellt werden. Dabei konnte besonders bei Zellen, die mäßig mit Myr5 transfiziert wurden, bei einer Infektion mit dem invasiven Stamm Shigella flexneri SC301 eine erhöhte Konzentration von Myr5 fast ausschließlich in den bakteriellen Eintrittszonen festgestellt werden. In diesen bakteriellen Eintrittszonen wiederum konnte eine bevorzugte Lokalisation von Myr5 in den Spitzen der Protrusionen beobachtet werden, während die tiefere, zellnahe Region der blütenartigen, zellulären Membranstruktur, die sich bei einer Infektion von HeLa-Zellen mit Shigella flexneri am Ort der bakteriellen Invasion bildet (1, 10), keine verstärkte Akkumulation von Myr5 zeigte. Wurde nun die Verteilung von Myr5 mit der von filamentärem Aktin (F-Aktin), welches mit Bodipy-FL-Phallacidin gefärbt wurde, verglichen, konnte für beide Proteine eine Kolokalisation im Bereich der bakteriellen Eintrittsstellen beobachtet werden (siehe Abb. 4). Demgegenüber zeigte Myr5 keine Kolokalisation mit F-Aktin der Stressfasern. Wurden parallel zu Myr5 die Bakterien, welche mit LPS-Antikörpern markiert und mit Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörpern gefärbt wurden, dargestellt, konnten in den Eintrittsstellen Shigellen nachgewiesen werden (siehe Abb. 5). Bei einer Infektion der HeLa-Zellen mit dem nichtinvasiven Stamm Shigella flexneri SC300 war keine Rekrutierung von Myr5 zu beobachten (siehe Abb. 6). Somit kann angenommen werden, dass die Myr5-Rekrutierung ein Teil des bakteriellen Invasionsprozesses ist.


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Abb. 4: Kolokalisation von Myr5 (rot) und Aktin (grün) in den Protrusionen der blüten­artigen Membranstruktur (A und B: identische Bildausschnitte, Seitansicht; C und D: identische Bildausschnitte, Aufsicht) während der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A und C: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B und D: Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.


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Abb. 5: Die parallele Darstellung von Myr5 (rot) und Shigella flexneri M90T (grün) zeigte, dass Myr5 während der bakteriellen Invasion von HeLa-Zellen um Shigella (Pfeil) herum akkumuliert; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundär­antikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, Shigella flexneri M90T wurde mit LPS-Antikörpern markiert und mittels Fluoreszein-gekoppelten Sekundäranti­körpern gefärbt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.

Abb. 6: Negativkontrolle; bei einer Inkubation der HeLa-Zellen mit dem apathogenem Stamm Shigella flexneri SC300 konnte keine Rekrutierung von Myr5 (rot) und Aktin (grün) beobachtet werden; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt, nur transfizierte Zellen sichtbar; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.


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3.3.  Von der Myosin-Funktion unabhängige Myr5-Rekrutierung in die bakterielle Invasionszone

Myosine können mit filamentärem Aktin interagieren. Besonders umfangreich ist die Interaktion zwischen dem konventionellen Muskelmyosin der Myosinklasse II und F-Aktin während der Kontraktion des Skelettmuskels untersucht worden. Dabei wird F-Aktin gegen Myosin verschoben. Die wesentlichen Schritte dieses sogenannten Querbrückenzyklus seien hier in Kurzform dargestellt. Zu Beginn kann das an ein Aktinfilament gebundene Myosin an einer spezifischen Bindungsstelle im Kopfbereich ein Molekül Adenosintriphosphat (ATP) binden. Die dadurch bewirkte Konformationsän­derung in der Myosin-Kopf-Region führt zur Ablösung des Myosins vom Aktin. Nun folgt mittels der ATPase-Aktivität von Myosin die Hydrolyse von ATP zu Adenosindiphosphat (ADP) unter Abspaltung eines Phosphatrestes ([P]). Die dabei frei werdende Energie wird für eine Änderung des Winkels zwischen Kopf-Region und Schwanz-Region des Myosin-Moleküles genutzt. Nach Dissoziation des [P] bindet Myosin nun an einer anderen Stelle an das Aktinfilament. Durch Dissoziation des ADP von der ATP-Bindungsstelle kehrt das Myosin-Molekül im letzten Schritt des Zyklus in seine Ausgangskonformation zurück und bewirkt dadurch eine Verschiebung des Aktinfilaments gegen Myosin.

Die funktionelle Beziehung zwischen Myosin und Aktin und das einheitliche Rekrutierungsmuster von Myr5 und filamentärem Aktin (siehe 3.2.) bei der Epithel­zellinvasion durch Shigella flexneri ließen die Vermutung zu, dass die Rekrutierung von Myr5 mittels seiner Myosin-Funktion entlang von filamentärem Aktin erfolgt. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden HeLa-Zellen mit Myr5-Mutanten, deren Myosin-Funktion durch Punktmutationen inhibiert wurde, transfiziert und anschließend die Rekrutierung bei der Infektion mit Shigellen geprüft. Wäre die Hypothese der Aktin-abhängigen Rekrutierung von Myr5 richtig, so wäre für die Myr5-Mutanten mit inhibierter Myosin-Funktion bei einer Infektion mit Shigella flexneri ein Ausbleiben der Rekrutierung von Myr5 in die bakterielle Invasionszone zu erwarten.

3.3.1.  Myr5-Rekrutierung ist unabhängig von der ATP-Bindung

Die Bindung von ATP an Myosin ist der erste Schritt des Querbrückenzyklus und somit wesentlich für die Interaktion von Myosin und Aktin (79). Wird die ATP-Bindung von Myosin inhibiert, so wird auch die Myosin-Funktion inhibiert (80). Eine derartige Inhibition [Seite 35↓]erfolgte durch eine Punktmutation des Myr5-Gens in dem Bereich, der für die ATP-Bindung von Myr5 kodiert. Eine solche Punktmutation wies die Mutante Myr5-248 auf. Dabei erfolgte in der Kopf-Region von Myr5 ein Austausch der Aminosäure 244 von Glyzin durch Arginin (siehe Abb. 7).

Abb. 7: Schematische Darstellung der Mutante Myr5-248; Farbkodierung der Domänen: siehe Abb. 2

Mit Myr5-248 wurden nun HeLa-Zellen transfiziert und mit Shigella flexneri SC301 infiziert. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte man für Myr5-248 ein Rekrutierungsmuster beobachten, das dem von Myr5 entsprach, nämlich eine bevorzugte Lokalisation in den Spitzen der zellulären Protrusionen, die bei der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri entstehen (siehe Abb. 8). Dieses Ergebnis sprach gegen die aufgestellte Hypothese, dass die Rekrutierung von Myr5 zur bakteriellen Eintrittsstelle mit Hilfe der Myosin-Funktion entlang von Aktin erfolgt. Bei einer Infektion mit dem nichtinvasiven Stamm SC300 konnte keine Rekrutierung von Myr5-248 beobachtet werden.


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Abb. 8: Kolokalisation der ATP-Bindungsstelle negativen Mutante Myr5-248 (rot) mit Aktin (grün) an der bakteriellen Eintrittsstelle (Pfeil) bei der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5-248 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.

3.3.2. Myr5-Rekrutierung ist unabhängig von der ATPase-Aktivität

Atypisches Myr5 besitzt wie das Muskelmyosin (Myosinklasse II) eine ATPase-Aktivität (4). Dabei wird von Adenosintriphosphat (ATP) ein Phosphatrest abgespalten und es entsteht Adenosindiphosphat (ADP). Bei dieser Reaktion wird die zur Wechselwirkung zwischen Aktin und Myosin benötige Energie gewonnen. Bei einer Inhibition dieser ATPase-Aktivität erfolgt somit auch eine Inhibition der Myosin-Funktion des Myosins (81). Bei der Mutante Myr5-225 erfolgte in der Kopf-Region von Myr5 ein Austausch der Aminosäure 295 von Arginin durch Cystein und damit die Ausschaltung der ATPase-Aktivität von Myr5 (siehe Abb. 9).


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Abb. 9: Schematische Darstellung von Myr5-225; Farbkodierung der Domänen: siehe Abb. 2

Nach Transfektion von HeLa-Zellen mit Myr5-225 und anschließender Infektion mit Shigella flexneri SC301 zeigte die Fluoreszenzmikroskopie auch für Myr5-225 ein Rekrutierungs­muster, das dem von Myr5 entsprach, nämlich eine Rekrutierung in die Spitzen der Protrusionen der bakteriellen Eintrittsstelle. Bei einer Infektion mit dem nicht-invasiven Stamm SC300blieb dieses Rekrutierungsmuster von Myr5-225 aus (siehe Abb. 10). Diese Ergebnisse, nämlich die Rekrutierung von Myr5 zur bakteriellen Eintrittsstelle trotz inhibierter ATPase-Aktivität bzw. inhibierter ATP-Bindung (siehe 3.3.), widerlegten somit die Hypothese, dass die durch den Invasionsprozess von Shigella flexneri induzierte Rekrutierung von Myr5 von dessen Myosin-Funktion abhängig ist.

Abb. 10: Kolokalisation der ATPase-negativen Mutante Myr5-225 (rot) mit Aktin (grün) an der bakteriellen Eintrittsstelle bei der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5-225 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; nur transfizierte Zellen sichtbar; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.


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3.4.  Rekrutierungsverhalten von Myr5 und Rho

Rho ist ein kleines regulatorisches Guaninnukleotid-bindendes Protein (G-Protein), welches für die Shigella flexneri-Epithelzellinvasion essentiell ist (37, 59). Während der Zytoskelettveränderungen, die bei der Infektion mit Shigella zur Ausbildung einer blütenähnlichen Membranstruktur an der Eintrittsstelle und schließlich zur Aufnahme des Bakteriums führen, bündelt und stabilisiert Rho filamentäres Aktin (37, 61). Dabei wurden für die verschiedenen Isoformen von Rho unterschiedliche Rekrutierungsmuster beobachtet. Während RhoA in unmittelbarer Nähe um die Bakterien herum akkumuliert, werden RhoB und RhoC in die Protrusionen der blütenähnlichen Struktur rekrutiert (37).

Myr5 besitzt in der Schwanz-Region ein Modul, das Myr5 zu einem GAP-Protein (GTPase activating protein) macht. Diese GAP-Funktion von Myr5 katalysiert eine Reaktion, bei der Rho von einem GTP-gebundenen, aktiven Zustand in einen GDP-gebundenen, inaktiven Zustand überführt wird (63).

Da Myr5 und Rho miteinander interagieren (63) und beide in die bakterielle Invasionszone rekrutiert werden, wurde nun untersucht, inwiefern sich die Rekrutierungsmuster beider Proteine ähneln. Dazu wurden HeLa-Zellen mit Myr5 und RhoA, RhoB, oder RhoC doppeltransfiziert. Dabei fand sich für Myr5 und RhoB bzw. RhoC ein einheitliches Rekrutierungsmuster, nämlich eine Akkumulation in den Protrusionen (siehe Abb. 11 und Abb. 12). Für Myr5 und RhoA konnte jedoch keine Kolokalisation beobachtet werden, da RhoA nicht in den Spitzen der Protrusionen, sondern um die Bakterien herum akkumulierte (siehe Abb. 13).


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Abb. 11: Kolokalisation von Myr5 (grün) und RhoB (rot) in den Protrusionen der bakteriellen Eintrittsstelle während der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, RhoB wurde mit einem gegen sein VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.

Abb. 12: Kolokalisation von Myr5 (grün) und RhoC (rot) in den Protrusionen der bakteriellen Eintrittsstelle während der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, RhoC wurde mit einem gegen sein VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.


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Abb. 13: Parallele Darstellung von Myr5 und RhoA auf einer Ebene. Während RhoA (rot) bei der Epithelzellinvasion von Shigella flexneri um das Bakterium herum akkumuliert (Pfeil), reichert sich Myr5 (grün) in den zellulären Protrusionen (Pfeil) an; A: Myr5 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, RhoA wurde mit einem gegen sein VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.

3.5. Von der GAP-Funktion unabhängige Myr5-Rekrutierung in die bakterielle Invasionszone

Die Proteine Myr5 und RhoB/C wiesen bei der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri ein einheitliches Rekrutierungsmuster auf und können über das GAP-Modul von Myr5 miteinander interagieren. Nun lag es nahe zu prüfen, ob die Interaktion der beiden Proteine über die GAP-Funktion von Myr5 im Zusammenhang mit der einheitlichen Rekrutierung der beiden Proteine steht. Dazu wurde eine Myr5-Mutante benutzt, deren GAP-Funktion durch eine Punktmutation ausgeschaltet wurde. Eine solche Punktmutation wies Myr5-250 auf. Dabei erfolgte in der Schwanz-Region von Myr5 ein Austausch der Aminosäure 1695 von Arginin durch Methionin (siehe Abb. 14).


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Abb. 14: Schematische Darstellung der Mutante Myr5-250; Farbkodierung der Domänen: siehe Abb. 2

Mit dieser Mutante Myr5-250 wurden HeLa-Zellen transfiziert und dann mit Shigellen infiziert. Anschließend erfolgte die Darstellung über indirekte Immunfluoreszenz. Dabei konnte für Myr5-250 genau wie für Myr5 eine Rekrutierung in die Spitzen der Protrusionen der bakteriellen Eintrittsstellen sowie eine Kolokalisation von Myr5-250 und Aktin, das mit Phallacidin gefärbt worden war, beobachtete werden. Allerdings entstand der Eindruck, dass die bakteriellen Invasionsstellen bei den mit Myr5-250 transfizierten Zellen eine etwas andere Form aufwiesen als bei den mit Myr5 transfizierten Zellen. Dabei hatte es den Anschein, als ob die mit der GAP-negativen Mutante transfizierten Zellen weniger Protrusionen aufwiesen, was der Eintrittsstelle eine kleinere, kompaktere Form gab (siehe Abb. 15). Bei einer Infektion mit dem nichtinvasiven Stamm SC300 konnte keine Rekrutierung von Myr5-250 beobachtet werden.


[Seite 42↓]

Abb. 15: Kolokalisation der GAP-negativen Mutante Myr5-250 (rot) mit Aktin (grün) an der bakteriellen Eintrittsstelle (Pfeil) bei der HeLa-Zellinvasion von Shigella flexneri SC301; A: Myr5-250 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; B: identischer Bildausschnitt wie A, Aktin-Darstellung erfolgte mittels BODIPY FL Phallacidin. Weiße Markierung entspricht 10 µm.

3.6.  Einheitliche Rekrutierung von Myr5 und Myr5-GAP

Da der Eindruck entstanden war, dass die bakteriellen Eintrittsstellen bei einer Transfektion der HeLa-Zellen mit der GAP-negativen Mutante Myr5-250 weniger Protrusionen aufwiesen, war es sinnvoll zu prüfen, ob es doch unterschiedliche Rekrutierungsmuster für Myr5 und Myr5-250 gibt. Dafür mussten HeLa-Zellen mit Myr5 und Myr5-250 doppeltransfiziert werden. Da beide Proteine ein HA-tag besaßen, für die parallele Darstellung jedoch unterschiedliche tags benötigt wurden, war es zunächst erforderlich, eines der beiden Proteine mit einem neuen tag zu versehen. Dazu wurde aus dem Konstrukt Myr5-Flag-tag in pUHD 310/311 das Flag-tag über die Schnittstellen NdeI und Eco32I herausgeschnitten. Anschließend wurde über die gleichen Schnittstellen ein hybridisiertes Oligonukleotid wieder einkloniert. Das Ergebnis war Myr5-VSV-tag im Vektor pUHD 310/311. Diese Klonierungsstrategie ist noch einmal in Abb. 16 und Abb. 17 zusammengefasst.


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Abb. 16: Darstellung der Methode zur Herstellung des Konstruktes Myr5-VSV-tag in pUHD 310/311.


[Seite 44↓]

Abb. 17: Sequenzen der VSV-tag-Oligonukleotide

Nun wurden HeLa-Zellen mit Myr5-VSV-tag und Myr5-250-HA-tag doppeltransfiziert und anschließend mit Shigella flexneri SC301 infiziert. Anschließend erfolgte die Darstellung über indirekte Immunfluoreszenz. Dabei zeigte sich eine identische Rekrutierung für Myr5 und die GAP-negative Mutante Myr5-250, so dass sich der zuvor gewonnene Eindruck der unterschiedlichen Rekrutierung nicht bestätigte (siehe Abb. 18).


[Seite 45↓]

Abb. 18: Zweifach belichtete Aufnahme einer mit Myr5 und Myr5-250 doppeltransfizierten HeLa-Zelle; Kolokalisation der beiden Proteine am Invasionsort (Pfeil) von Shigella flexneri SC301; Myr5 (rot) wurde mit einem gegen das VSV-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt; Myr5-250 wurde mit einem gegen das HA-tag gerichteten Antikörper markiert und über einen Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper dargestellt. Weiße Markierung entspricht 10 µm.

3.7.  Verringerung der Infektionseffizienz durch Myr5

Die GTPase Rho ist essentiell für die Shigellen-induzierten Zytoskelett­veränderungen und daher essentiell für den Invasionsprozess von Shigella flexneri (37). Wird Rho spezifisch inhibiert, z.B. mit dem Clostridium botulinum toxin C3 (60), so wird dadurch auch die Shigelleninvasion inhibiert (37).

Myr5 besitzt mittels seiner GAP-Funktion die Eigenschaft, Rho sowohl in vitro (63) als auch in vivo (73) in einen GDP-gebundenen, inaktiven Zustand überführen zu können. Damit ist Myr5 möglicherweise ein physiologischer Inaktivator von Rho. Nun war zu klären, ob Myr5 einen funktionellen Einfluss auf die Invasionseffizienz von Shigella flexneri besitzt.

Dazu wurden quantitative Invasionsexperimente mit Shigella flexneri durchgeführt. Nach der Infektion der HeLa-Zellen wurden extrazelluläre Shigellen mit Gentamicin abgetötet, während bereits eingedrungene Bakterien zu intrazellulären Mikrokolonien heranwuchsen. [Seite 46↓]Um eine interzelluläre Ausbreitung der Bakterien zu verhindern, wurde der invasive Stamm SC560benutzt. Dieser ist IcsA-negativ und dadurch weder zu intrazellulärer noch zu interzellulärer Bewegung fähig (38, 33). Zur Darstellung wurden die Bakterien mit dem Primärantikörper anti-LPS-Shigella flexneri-Kaninchen markiert und mit einem Fluoreszein-gekoppelten Sekundärantikörper gefärbt. Myr5 wurde mit dem Primärantikörper anti-HA-tag-Maus markiert und mit einem Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper gefärbt.

Zur Beantwortung der Frage, ob Myr5 Einfluss auf die Infektionseffizienz von Shigella flexneri hat, wurden die Zellen nun auf die Eigenschaften Transfektionseffizienz von Myr5 (Kalziumphosphat-Präzipitation lieferte unterschiedliche Transfektionseffizienzen, nicht transfiziert, schwach transfiziert, mittelstark transfiziert, stark transfiziert = morphologische Veränderungen) und Infektion (infiziert, nicht infiziert) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Myr5 die bakterielle Invasion in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz inhibiert. Bei schwach transfizierten Zellen konnte eine Invasionsinhibition von etwa 30%, bei mittelstark transfizierten Zellen von etwa 60% sowie bei stark transfizierten Zellen von 100% nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind graphisch in Tab. 8 und Abb. 19 dargestellt.

Tab. 8: Dargestellt sind die Ergebnisse aus 3 quantitativen Invasionsexperimenten (8A-8C). Dabei wurden HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert, anschließend mit dem Shigellenstamm SC560 (siehe 4.1.4) infiziert und auf die Eigenschaften Transfektionseffizienz von Myr5 (nicht transfiziert, schwach transfiziert, mittelstark transfiziert, stark transfiziert) und Infektion (infiziert, nicht infiziert) untersucht. Die Anzahl der infizierten Zellen in Prozent wurde auf 100 % normalisiert. Aus diesen Werten wurden für die unterschiedlichen Transfektionseffizienzen der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet (8D, s entspricht der Standardabweichung).

8A

Transfektionseffizienz

Gesamtzellzahl

Infizierte Zellen

Infizierte Zellen in %

Normalisierung

nicht transfiziert

43569

293

0,67

100 %

schwach transfiziert

2231

7

0,31

46,27 %

mittelstark transfiziert

819

2

0,24

35,82 %

stark transfiziert

360

0

0

0 %


[Seite 47↓]

8B

Transfektionseffizienz

Gesamtzellzahl

Infizierte Zellen

Infizierte Zellen in %

Normalisierung

nicht transfiziert

68857

638

0,93

100 %

schwach transfiziert

2436

23

0,94

101,08 %

mittelstark transfiziert

1012

4

0,4

43,01 %

stark transfiziert

419

0

0

0 %

8C

Transfektionseffizienz

Gesamtzellzahl

Infizierte Zellen

Infizierte Zellen in %

Normalisierung

nicht transfiziert

92016

812

0,88

100 %

schwach transfiziert

2388

15

0,63

71,59 %

mittelstark transfiziert

637

2

0,31

35,23 %

stark transfiziert

109

0

0

0 %

8D

Transfektionseffizienz

8A

8B

8C

Mittelwert

s

nicht transfiziert

100 %

100 %

100 %

100 %

0

schwach transfiziert

46,27 %

101,08 %

71,59 %

72,98 %

22,40

mittelstark transfiziert

35,82 %

43,01 %

35,23 %

38,02 %

3,54

stark transfiziert

0 %

0 %

0 %

0 %

0


[Seite 48↓]

Abb. 19: Dargestellt ist die Effizienz der Infektion von HeLa-Zellen durch Shigella flexneri in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz von Myr5. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte, die aus 3 voneinander unabhängigen Experimenten gewonnen wurden (siehe Tab. 8; s entspricht der Standardabweichung).

3.8.  Steigerung der Infektionseffizienz durch Myr5-GAP

Werden HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert und anschließend mit Shigellen infiziert, so zeigt sich eine von der Expressionseffizienz von Myr5 abhängige Infektionsinhibition (siehe 3.7.). Dieses Ergebnis ist höchstwahrscheinlich auf eine durch die GAP-Funktion von Myr5 bedingte Inhibition von Rho und damit verbundene verminderte Stabilisierung und Bündelung von filamentärem Aktin in den zellulären Protrusionen zurückzuführen.

Um diese Vermutung zu prüfen, wurden nun quantitative Invasionsexperimente durchgeführt, bei denen die HeLa-Zellen vor der Infektion mit Shigella flexneri SC560 mit der GAP-negativen Mutante Myr5-250 transfiziert wurden. Nach der Infektion wurden extrazelluläre Bakterien mit Gentamicin abgetötet. Zur Darstellung wurden die Bakterien mit dem Primärantikörper anti-LPS-Shigella flexneri-Kaninchen markiert und mit einem Fluoreszein-gekoppelten Sekundär­antikörper gefärbt. Myr5-250 wurde mit dem Primärantikörper anti-HA-tag-Maus markiert und mit einem Texas-Red-gekoppelten Sekundärantikörper gefärbt.


[Seite 49↓]

Wie bei den quantitativen Invasionsexperimenten mit Myr5 wurden die HeLa-Zellen nun auf die Eigenschaften Transfektionseffizienz und Infektion untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die GAP-negative Mutante die Shigelleninvasion in HeLa-Zellen fördert. Dabei scheint die Erhöhung der Infektionseffizienz von der Transfektionseffizienz abzuhängen, da die Infektionseffizienzsteigerung bei den schwächer transfizierten Zellen etwa 60% betrug und bei den stark transfizierten Zellen bei über 100% lag. Diese Resultate sind in Tab. und Abb. 20 zusammengefasst.

Tab. 9: Dargestellt sind die Ergebnisse aus 3 quantitativen Invasionsexperimenten (9A-9C). Dabei wurden HeLa-Zellen mit GAP-negativem Myr5-250 transfiziert, anschließend mit dem Shigellenstamm SC560 (siehe 4.1.4) infiziert und auf die Eigenschaften Transfektionseffizienz von Myr5-250 (nicht transfiziert, schwach transfiziert, mittelstark transfiziert, stark transfiziert) und Infektion (infiziert, nicht infiziert) untersucht. Die Anzahl der infizierten Zellen in Prozent wurde auf 100% normalisiert. Aus diesen Werten wurden für die unterschiedlichen Transfek­tions­effizienzen der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet (9D; s ent­spricht der Standardabweichung).

9A

Transfektionseffizienz

Gesamtzellzahl

Infizierte Zellen

Infizierte Zellen in %

Normalisierung

nicht transfiziert

131039

924

0,71

100 %

schwach transfiziert

1579

21

1,33

187,32 %

mittelstark transfiziert

654

11

1,68

236,62 %

stark transfiziert

128

2

1,56

219,72 %

9B

Transfektionseffizienz

Gesamtzellzahl

Infizierte Zellen

Infizierte Zellen in %

Normalisierung

nicht transfiziert

132095

1795

1,36

100 %

schwach transfiziert

909

20

2,2

161,76 %

mittelstark transfiziert

435

9

2,07

152,21 %

stark transfiziert

143

4

2,8

205,88 %


[Seite 50↓]

9C

Transfektionseffizienz

Gesamtzellzahl

Infizierte Zellen

Infizierte Zellen in %

Normalisierung

nicht transfiziert

119455

801

0,67

100 %

schwach transfiziert

983

9

0,92

137,93 %

mittelstark transfiziert

405

4

0,99

147,76 %

stark transfiziert

110

2

1,82

271,64 %

9D

Transfektionseffizienz

9A

9B

9C

Mittelwert

s

nicht transfiziert

100 %

100 %

100 %

100 %

0

schwach transfiziert

187,32 %

161,76 %

137,93 %

162,34 %

20,17

mittelstark transfiziert

236,62 %

152,21 %

147,76 %

178,86 %

40,88

stark transfiziert

219,72 %

205,88 %

271,64 %

232,41 %

28,31

Abb. 20: Dargestellt ist die Effizienz der Infektion von HeLa-Zellen durch Shigella flexneri in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz von GAP-negativem Myr5-250. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte, die aus 3 voneinander unabhängigen Experimenten gewonnen wurden (siehe Tab.; s entspricht der Standardab­weichung).


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der Humboldt-Universität zu Berlin
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06.01.2005