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4.  Diskussion

Shigellen sind die Erreger der bakteriellen Ruhr. Dabei ist die Invasion der Shigellen in die Epithelzellen der Darmschleimhaut ein wesentlicher Schritt des Pathomechanismus. Während des Invasionsprozesses kommt es zu Shigellen-induzierten Zytoskelett­veränderungen, die zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur um das Bakterium herum und schließlich zu einer Aufnahme des Bakteriums führen (9). Es wurden nun Untersuchungen zum Rekrutierungsmechanismus und zur funktionellen Rolle von Myr5, einem nicht konventionellen Myosin der Klasse IX, bei der Shigelleninvasion durchgeführt.

4.1. Diskussion der Methoden

4.1.1. Verwendete Zelllinie

Für die Studien wurde Myr5 in HeLa-Zellen, epitheliale Zellen eines Zervixkarzinoms (78), zur Expression gebracht. Im Gegensatz zu den polarisierten Enterozyten des Gastro­intestinaltraktes sind HeLa-Zellen nicht polarisiert. Shigella kann die polarisierten Enterozyten von basolateral, nicht jedoch von apikal infizieren (27). Dies wurde in vitro auch für die polarisierten Caco2-Zellen gezeigt (27, 82, 83). Da mittels Mikroskop die Zellen von “oben“ betrachtet werden, hätten wir bei der Verwendung von polarisierten Zellen für unsere Studien, wie z.B. Caco2-Zellen, die bakteriell induzierten Zytoskelett­veränderungen somit nur seitlich beurteilen können. HeLa-Zellen boten uns aufgrund der Tatsache, dass Shigella die gesamte Oberfläche dieser Zellen zur Invasion nutzen konnte, die Möglichkeit, die morphologischen Zellveränderungen auch horizontal im Querschnitt zu beurteilen.

4.1.2. Transfektionsmethode

Als Transfektionsmethode wurde die Kalziumphosphat-Präzipitation gewählt, da sie u.a. unterschiedliche Expressionsniveaus der Proteine und hohe Transfektionsraten, wie für die quantitativen Invasionsexperimente benötigt, lieferte. Wir zogen die Kalziumphosphat-Präzipitation der Mikroinjektion von DNA vor, da sie weniger zeitaufwendig war.

Die Lipidtransfektion, eine weitere Alternative zur Kalziumphosphat-Präzipitation, hat den Nachteil der Lipideinlagerungen in die Zellmembran. Da die bakterielle Infektion in engem [Seite 52↓]Zusammenhang zur Zellmembran steht und somit die veränderte Membran­zusammensetzung zur Beeinflussung der Shigelleninfektion und dadurch zu verfälschten Ergebnissen führen könnte, entschieden wir uns für die Kalziumphosphat-Präzipitation.

4.1.3. Auswahl der Bakterienstämme

Der Stamm Shigella flexneri SC301 besitzt das Plasmid IL-22, welches aus uropathogenen E.coli isoliert wurde und für die Bildung von afimbriärem Adhäsin kodiert. Dadurch erlangt dieser Stamm Zelladhärenz, wodurch seine Infektionseffizienz deutlich über der des Wildtyps M90T liegt. Um bei den Untersuchungen der Morphologie der bakteriell induzierten Zytoskelettver­änderungen sowie der Rekrutierungsmuster von Myr5, Aktin und Rho möglichst viele Infektionsereignisse beurteilen zu können, verwendeten wir dabei daher den Shigellenstamm SC301 bzw. als Kontrolle den adhärenten, apathogenen Stamm SC300.

Für die Darstellung von Shigella in den zellulären Protrusionen war SC301 jedoch nicht geeignet. Aufgrund der Adhärenz von SC301 waren die Zellen bei einer Infektion mit diesem Stamm “übersät“ von Bakterien, und diese ließen sich auch durch mehrfaches Waschen nicht von den HeLa-Zellen ablösen. Daher war es nahezu unmöglich, den bakteriell induzierten Membranausstülpungen die sie auslösenden Bakterien zuzuordnen. Der Wildtyp M90T und der als Kontrolle eingesetzte apathogene Stamm BS176, die keine Zelladhärenz besitzen und daher zur Erhöhung der Infektionseffizienz auf die Zellen zentrifugiert wurden, ließen sich dagegen durch mehrfaches Waschen problemlos von den Zellen entfernen, so dass nur noch die bereits von den Membranausstülpungen umschlungenen Bakterien an der Zelloberfläche verblieben und somit eine parallele Darstellung des Bakteriums und der zugehörigen Membranveränderung möglich war.

Der IcsA-negative Stamm SC560 fand aufgrund seiner fehlenden intra- und interzellulären Bewegung bei den quantitativen Invasionsexperimenten Verwendung (siehe 4.1.4).

4.1.4.  Quantitative Invasionsexperimente

Mit den quantitativen Invasionsexperimenten wurde der Einfluss von Myr5 bzw. Myr5-250 auf die Effizienz der primären, von extrazellulär erfolgenden HeLa-Zell-Infektion durch Shigella getestet. Dabei wurden infizierte Zellen anhand intrazellulär wachsender Bakterienkolonien identifiziert. Da Shigellen aufgrund der interzellulären Bewegung auch benachbarte Zellen infizieren können, wäre es bei der Verwendung des Wildtyps unmöglich [Seite 53↓]gewesen, primär durch Shigella infizierte Zellen von sekundär durch interzelluläre Ausbreitung infizierten Zellen zu unterscheiden. Aus diesem Grund wurde für die quantitativen Invasionsexperimente der IcsA-negative Stamm Shigella flexneri SC560, der nicht zu intra- und interzellulärer Bewegung fähig ist, verwendet. Die intrazellulären Bakterienkolonien wurden mittels Shigellen-spezifischen Antikörpern markiert und anschließend mit grün-fluoreszierenden Sekundärantikörpern gefärbt. Parallel wurde Myr5 bzw. Myr-250 mit HA-tag-Antikörpern markiert und dann rot-fluoreszierend dargestellt. Beim Auszählen der Zellen zeigte sich, dass die Infektionseffizienz nicht nur von Experiment zu Experiment, sondern auch innerhalb eines Experimentes auf den einzelnen Deckgläschen selbst variierte. Daher wurden die Deckgläschen beim Auszählen der Zellen meanderförmig, vollständig „durchmikroskopiert“, um sowohl die Bereiche mit einer hohen Infektionseffizienz als auch die Bereiche von niederer Infektionseffizienz zu erfassen und somit eine Selektion zugunsten von infizierten Zellen zu vermeiden.

4.1.5. Konstrukt Myr5-VSV-tag

Um Myr5 und Myr5-250 parallel immunfluorezenzmikroskopisch darstellen zu können, war es nötig, das HA-tag von Myr5 durch ein anderes tag zu ersetzen. Der erste Gedanke, um dies zu realisieren, war, das HA-tag aus „unserem Standard-Myr5 im Vektor pUHD“ herauszu­schneiden und anschließend ein neues tag einzuklonieren. Das war nicht möglich, da bei der Herstellung des Konstruktes Myr5-HA-tag im Vektor pUHD die Schnittstelle zwischen Myr5 und dem tag verloren ging und somit das HA-tag nicht isoliert werden konnte. Daher bezogen wir von Prof. Martin Bähler das Konstrukt Myr5-Flag-tag im Vektor pUHD. Dieses Konstrukt konnten wir für die parallele Darstellung jedoch nicht nutzen, da der Primärantikörper gegen das Flag-tag mit einem uns unbekannten Protein, das ebenfalls in die Invasionszone rekrutiert wird, kreuzreagierte. Jedoch gab uns dieses Konstrukt aufgrund der Tatsache, dass es zwischen Myr5 und dem Flag-tag eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym besaß, die Möglichkeit, das Flag-tag auszuschneiden und anschließend über die gleichen Schnittstellen ein für ein VSV-tag kodierendes, hybridisiertes Oligonukleotid wieder in den Vektor einzuklonieren. Das Ergebnis war das Konstrukt Myr5 mit einem C-terminalem VSV-tag im Vektor pUHD.


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4.2.  Untersuchungen zum Rekrutierungsmechanismus von Myr5 während der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri

Zunächst interessierte die Frage, auf welche Art und Weise Myr5 in die bakterielle Invasionszone rekrutiert wird.

Für eukaryote Zellen sind verschiedene intrazelluläre Transportmechanismen beschrieben. Einige davon beruhen auf der Interaktion zwischen Aktin und verschiedenen nicht konventionellen Myosinen. Es wurde gezeigt, dass das 95F Myosin, ein nicht konventionelles Myosin der Klasse VI, ein Transportprotein für Zytoplasmapartikel in Drosophila ist. Dabei bewegt sich das 95F Myosin ATP-abhängig entlang von filamentärem Aktin (84). Für nicht konventionelle Myosine der Klasse V, wie z.B. Myo2-66, sind ebenfalls Transportfunktionen für sekretorische Vesikel und Vesikel des endoplasmatischen Retikulums entlang von Aktinfilamenten beschrieben (85, 86, 87). Auch Myosin-IXb (M9b), ein humanes Myosin der Klasse IX, das eine hohe Homologie zu Myr5 aufweist und wie dieses eine GAP-Aktivität besitzt (70, 71), kann sich entlang von Aktinfilamenten bewegen (71). Diese Beobachtungen und die Tatsache, dass Myr5 und Aktin in der bakteriellen Invasionszone kolokalisieren (siehe 3.2.), führten zu der Hypothese, dass auch die Rekrutierung von Myr5 Aktin-abhängig sein könnte. Diese Hypothese wurde getestet, indem HeLa-Zellen mit Myr5-Mutanten, Myr5-225 und Myr5-248, transfiziert wurden, deren ATPase-Funktion bzw. ATP-Bindungsstelle und damit die Fähigkeit, mit Aktin zu interagieren, durch Punktmutationen inhibiert waren. Bei der anschließenden Infektion mit Shigella flexneri zeigten diese Mutanten das gleiche Rekrutierungsmuster wie Myr5. Eine mögliche Erklärung dieser Ergebnisse ist die Tatsache, dass es sich bei den verwendeten Myr5-Konstrukten um putative Mutanten handelt. Putativ heißt, dass der Verlust der ATP-Bindungsfähigkeit bzw. der ATPase-Funktion durch die jeweiligen Punktmutationen zwar für das konventionelle Myosin jedoch nicht für diese Mutanten experimentell belegt ist. So könnte es sein, dass die Punktmutation im Kopfbereich dieser Mutanten nicht zu einer Inhibition der Myosin-Funktion führt. Dagegen sprechen jedoch kürzlich in der AG Adam gewonnene Daten (noch unveröffentlicht), die für Myr5 und diese Mutanten eine unterschiedliche Rekrutierung bei der intra- und interzellulären Bewegung beschreiben. Zur IcsA-abhängigen, intra- und interzellulären Bewegung induziert Shigella eine polarisierte Aktinpolymerisation, die zur Ausbildung eines Aktinschweifes führt (32, 33). Für Myr5 konnte eine Rekrutierung in diese Schweifstruktur beobachtet werden, wohingegen Myr5-225 und Myr5-248 nicht in den Aktinschweifen akkumulierten. Dies [Seite 55↓]spricht dafür, dass die Myr5-Rekrutierung in die Aktinschweife in Abhängigkeit von der Myosin-Funktion erfolgt.

Im Gegensatz dazu ist die Hypothese der Aktin-abhängigen Rekrutierung von Myr5 in die bakterielle Invasionszone aufgrund unserer Ergebnisse eher unwahrscheinlich. Eine mögliche Erklärung dieses Ergebnisses ist die Tatsache, dass Myr5 nicht in der Lage ist, coiled-coil-Formationen in der Schwanz-Region zu bilden (63). Diese coiled-coil-Formation ist eine Zusammenlagerung von zwei oder mehr Myosin-Proteinen im Bereich der Schwanz-Region, so dass die zugehörigen Myosin-Kopf-Regionen als “Einheit“ mit Aktin interagieren. Die coiled-coil-Formation, wie sie für das Muskelmyosin der Klasse II und die o.a. “Transport-Myosine“ der Klassen V und VI sowie für Myr7, einem weiteren Myosin der Klasse IX, das im Gehirn der Ratte identifiziert werden konnte, beschrieben wurden (72, 88, 89, 90, 91), verbindet somit die an Aktin gebundenen Myosin-Kopf-Regionen in der Schwanz-Region untereinander und hat dadurch eine entscheidende Bedeutung für die gerichtete Bewegung von Myosin entlang von Aktin. Denn wahrscheinlich wird durch die gleichzeitige Aktinbindung von in der Schwanz-Region untereinander verbundenen Myosinen während des Querbrückenzyklusses ein Abdiffundieren der einzelnen Myosin-Kopf-Region von Aktin verhindert.

Ein weiterer Mechanismus, der für die intrazelluläre Rekrutierung von Myr5 in Frage kommt, ist der Transport entlang von Mikrotubuli, wie er für die Proteine Kinesin und Dynein beschrieben wurde. Diese sind in der Lage, sich ATP-abhängig entlang von Mikrotubuli fortzubewegen (92). Ein Beispiel für diesen Mechanismus ist der gerichtete Transport von Golgi-Vesikeln in polarisierten Epithelzellen. Dabei werden die Vesikel an Dynein gebunden und entlang von Mikrotubuli zum apikalen Pol der Epithelzelle transportiert (93). Es ist vorstellbar, dass Myr5 über einen solchen Mechanismus, z.B. an Dynein oder Kinesin gebunden, zur bakteriellen Eintrittsstelle transportiert wird. Diese Hypothese könnte in weiteren Studien getestet werden, indem man die Bildung von Mikrotubuli mit Nocodazol inhibiert (94) und anschließend die Rekrutierung von Myr5 während der Epithelzellinvasion durch Shigella überprüft.

Auch Diffusion kommt für die Akkumulation von Myr5 in der Invasionszone in Frage. Es wäre möglich, dass Myr5 in der Invasionszone an das filamentäre Aktin bindet und so innerhalb der Zelle ein Konzentrationsgradient für “freies“ Myr5 entsteht. Durch Brown-Molekularbewegung würde dann mehr und mehr Myr5 zur Eintrittsstelle diffundieren und an Aktin binden und somit dort akkumulieren. Ob die langsam erfolgende Diffusion, die ein Mechanismus von geringer Kinetik ist, für die Myr5-Akkumulation verantwortlich ist, bleibt [Seite 56↓]insbesondere aufgrund der Tatsache, dass die Myr5-Akkumulation schnell erfolgt und somit ein Prozess hoher Kinetik ist, aber fraglich.

Myr5 unterscheidet sich von den anderen nicht konventionellen Myosinen unter anderem dadurch, dass es in der Schwanz-Region eine GAP-Domäne besitzt und somit ein GTPase-activating protein (GAP-Protein) ist (63). Über diese GAP-Domäne kann Myr5 mit den GTPasen der Rho-Gruppe, Rho, Rac und CDC42 interagieren (63). Diese GTPasen der Rho-Gruppe sind für die Regulation des Zytoskelettes, insbesondere für die intrazelluläre Aktinorganisation, von großer Bedeutung (95, 96). Während Rac die Bildung von blattähnlichen Membranfalten, den sogenannten Lamellipodien, reguliert (55, 97), ist CDC42 u.a. für die Bildung von kleinen Mikrospikes, den Filopodien, verantwortlich (55, 98). Rho seinerseits reguliert die Bildung von Stressfasern und fokalen Adhäsionsplaques (55, 56). Dabei induzieren Rac und CDC42 direkt die Aktinpolymerisation, wohingegen Rho filamentäres Aktin bündelt und stabilisiert (61, 99). Myr5 interagiert mit diesen Proteinen, indem es mit seiner GAP-Domäne an diese bindet und sie in einen GDP-gebundenen Zustand überführt und dadurch inaktiviert. Dies wurde für die Ras-verwandten GTPasen der Rho-Gruppe, RhoA, RhoB, RhoC, CDC42 und Rac, gezeigt (63, 100).

Da sowohl Myr5 als auch Rho in der bakteriellen Invasionszone akkumulieren und beide Proteine in einem funktionellen Zusammenhang stehen, wurde nun untersucht, inwiefern sich die Rekrutierungsmuster dieser Proteine während der Shigelleninvasion ähneln. Interessanterweise folgte Myr5 dem Rekrutierungsmuster von RhoB und RhoC und kolokalisierte mit diesen in den Spitzen der Protrusionen der blütenartigen Membranstruktur. Eine Kolokalisation mit RhoA konnte hingegen nicht beobachtet werden, da RhoA um die Bakterien herum akkumulierte (siehe 3.4.). Diese Beobachtungen festigen zum einen die Annahme, dass Myr5 auch mit RhoB und RhoC interagiert, und zum anderen die Hypothese, dass den Rho-Isoformen während der Epithelzellin­vasion durch Shigella verschiedene Funktionen zukommen (37). Da RhoA bereits frühzeitig an der bakteriellen Kontaktstelle akkumuliert (AG Adam, unveröffentlichte Daten), wird vermutet, dass RhoA eher in der frühen initialen Phase der Aktinpolymerisation, direkt an der Kontaktstelle zwischen Zellwand und Bakterium, von Bedeutung ist, während RhoB und RhoC die Stabilisierung der Aktinfilamente bis in die Spitzen der blütenartigen Membranstruktur fortsetzten (37).

Aufgrund der Tatsachen, dass Myr5 mittels seiner GAP-Domäne an Rho binden kann (63) und Myr5 mit RhoB und RhoC am Invasionsort kolokalisiert, wurde nun geprüft, ob Myr5 und Rho gemeinsam rekrutiert werden. Dazu wurden Untersuchungen mit einer Myr5-[Seite 57↓]Mutante durchgeführt, deren GAP-Domäne durch eine Punktmutation variiert wurde. Für diese Mutante wurde gezeigt, dass sie keine GAP-Aktivität mehr besitzt (73). Bei den Untersuchungen wurde auch für die Myr5-Mutante mit inhibierter GAP-Aktivität ein Rekrutierungsmuster beobachtet, das dem von Myr5 ähnelte. Die anschließend durchgeführte Doppeltransfektion mit Myr5 und dieser Mutante zeigte, dass die Rekrutierung dieser beiden Proteine einheitlich ist. Somit ist klar, dass die Rekrutierung von Myr5 unabhängig von der GAP-Aktivität erfolgt. Eine gemeinsame Rekrutierung von Myr5 und Rho und umgekehrt kann aber nicht sicher ausgeschlossen werden, weil die für die Untersuchungen verwendete Myr5-Mutante eventuell trotz inhibierter GAP-Aktivität noch an Rho binden konnte. Gegen eine gemeinsame Rekrutierung von Myr5 und Rho spricht jedoch die Beobachtung, dass Myr5 zwar mit RhoB und RhoC kolokalisiert, nicht jedoch mit RhoA. Da Myr5 über seine GAP-Domäne höchstwahrscheinlich sowohl RhoA als auch RhoB und RhoC binden kann, wäre bei einer gemeinsamen Rekrutierung der Rho-Isoformen und Myr5 über diese Bindung auch eine Kolokalisation von Myr5 und RhoA zu erwarten gewesen. Um eine gemeinsame Rekrutierung von Myr5 und Rho sicher auszuschließen, müssten Untersuchungen mit einer Myr5-Mutante, die nicht mehr an Rho binden kann, durchgeführt werden.

Zusammenfassend scheint es sicher zu sein, dass die Myr5-Rekrutierung in die bakterielle Invasionszone unabhängig von der Myosin-Funktion erfolgt. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Rekrutierung von Myr5 auch unabhängig von der GAP-Aktivität erfolgt, wobei ein gemeinsamer Transport von Myr5 und Rho nicht sicher ausgeschlossen werden konnte. Der genaue Rekrutierungs­mechanismus konnte nicht aufgedeckt werden und bleibt somit unklar.

4.3. Untersuchungen zur funktionellen Rolle von Myr5 während der Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri

Die Myosine werden zurzeit in 18 Klassen eingeteilt. Das Myosin des Muskels wird als konventionelles Myosin bezeichnet und gehört der Myosinklasse II an. Die Myosine der anderen Klassen werden als nicht konventionelle Myosine bezeichnet. Für die nicht konventionellen Myosine wurden in den letzten Jahren eine Vielzahl verschiedener Funktionen beschrieben, so z.B. eine Beteiligung bei der Zellbewegung, bei der Endo- und Exozytose, bei der Phagozytose, beim Intrazellulärtransport und bei der Signaltransduktion (65, 66, 67, 68).


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Charakteristisch für die Myosine der Klasse IX ist die GAP-Domäne in der Schwanz-Region des Proteins. Es wurde gezeigt, dass Myr5 und das humane Myosin-IXb aus der Myosinklasse IX mittels dieser GAP-Domäne in vitro spezifisch GTPasen der Rho-Gruppe, die eine große Bedeutung bei der Regulation des Zytoskelettes besitzen (95, 99, 101), von einem GTP-gebundenen, aktiven Zustand in einen GDP-gebundenen, inaktiven Zustand überführen (63, 71). Dabei stellte sich heraus, dass Myr5 in vitro Rho zu 95%, CDC42 zu 90% und Rac zu 70% inaktivieren kann (63, 100). Dass Myr5 Rho auch in vivo inaktivieren kann, zeigten die Untersuchungen, bei denen HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert wurden. Dabei wurde beobachtet, dass Myr5 bei einer Überexpression die Bildung von Stressfasern inhibierte. Da Stressfasern u.a. die Integrität der Zelle gewährleisten, führte die verminderte Bildung der Stressfasern zu abnormen Veränderungen der Zellmorphologie, so dass die HeLa-Zellen ein Neuron-ähnliches Aussehen zeigten (siehe 3.1.). Da die Bildung von Stressfasern Rho-abhängig ist (54), scheint es sehr wahrscheinlich, dass Myr5 diese verminderte Bildung der Stressfasern über eine Inaktivierung von Rho bewirkte. Diese Annahme wird auch dadurch gestützt, dass bei Zellen, die mit dem Rho-spezifischen Inhibitor Clostridium botulinum Exoenzym C3 behandelt wurden, die gleichen Effekte wie bei der Überexpression von Myr5 beobachtet wurden (60). Der Tatsache, dass Myr5 somit Rho auch in vivo inaktivieren kann, liegt die Vermutung nahe, dass Myr5 bei der Signaltransduktion als physiologischer Regulator für GTPasen der Rho-Gruppe von Bedeutung ist.

Rho ist essentiell für die Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri (37). Dies zeigte sich dadurch, dass bei HeLa-Zellen, die mit dem Rho-spezifischen Inhibitor Clostridium botulinum Exoenzym C3 behandelt wurden (60), eine 87%ige Inhibition der Shigelleninvasion nachgewiesen wurde (37). Während der Invasion stabilisiert und bündelt Rho Shigellen-induziert filamentäres Aktin, das an der bakteriellen Eintrittsstelle aus monomerem Aktin (G-Aktin) polymerisiert. Dies wiederum führt zur Bildung von Membranaus­stülpungen um das Bakterium herum und schließlich zur Aufnahme des Bakteriums (9). Nach der Bakterienaufnahme depolymerisiert das filamentäre Aktin wieder zu monomerem Aktin (40). Es ist vorstellbar, dass Shigella auch die Aktindepolymerisation induziert, damit genügend monomeres Aktin für die IcsA-abhängige, intra- und interzelluläre Bewegung von Shigella, die essentiell für die Pathogenität ist (35, 38), zur Verfügung steht.

So liegt die Vermutung nahe, dass es einen Mechanismus gibt, über den Rho nach der Bakterienaufnahme inaktiviert und dadurch eine überschüssige Aktinreorganisation verhindert wird. Da Myr5 während der Shigelleninvasion mit RhoB und RhoC kolokalisiert [Seite 59↓]und die Tatsache, dass Myr5 Rho in vivo inaktivieren kann, führten zu der Hypothese, dass Myr5 nach der Bakterienaufnahme, eventuell Shigellen-induziert, Rho inaktiviert, dadurch die Shigellen-induzierte Aktinreorganisation inhibiert und somit die anschließende Aktin­depolymerisation initiiert.

Um diese Hypothese zu prüfen, wurden HeLa-Zellen mit Myr5 transfiziert und anschließend Invasionsexperimente mit Shigella flexneri durchgeführt, bei denen die Infektionseffizienz abhängig vom Expressionsniveau von Myr5 bestimmt wurde. Dabei konnte festgestellt werden, dass Myr5 die Infektion durch Shigella abhängig vom Expressionsniveau inhibierte. Je stärker die Expression von Myr5 war, desto höher war die Inhibition der Infektion (siehe 3.7.). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass Myr5 über eine Inaktivierung von Rho dessen Aktin-stabilisierende Wirkung und dadurch die Shigelleninvasion inhibierte. Dieses Ergebnis liefert zum einen weiteren Beleg dafür, dass Myr5 Rho auch in vivo inaktivieren kann und stützt zum anderen die Vermutung, dass Myr5 nach der Shigelleninvasion als Inaktivator von Rho fungieren könnte.

Es ist interessant, dass Myr5 Rho in vitro nur zu ca. 95% inaktiviert (63), die Shigelleninfektion bei starker Expression aber vollständig inhibiert. Die einfachste Erklärung dieses Phänomens ist die Annahme, dass Rho durch Myr5 zwar nicht 100%ig inaktiviert wird, der verbleibende, aktive Anteil an Rho aber nicht mehr für eine Invasion von Shigella flexneri ausreicht. Doch Myr5 besitzt in vitro auch eine inaktivierende Wirkung auf die GTPasen CDC42 und Rac (63), die ebenfalls an der Organisation des Zytoskelettes beteiligt sind (95, 99, 101) und für die kürzlich eine Beteiligung bei der Epithelzellinvasion durch Salmonella typhimurium gezeigt werden konnte (3). Daher muss auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass diese vollständige Inhibition der Infektion durch Myr5 nicht auf eine alleinige Inaktivierung von Rho zurückzuführen ist, sondern möglicherweise erst durch eine gemeinsame Inaktivierung von Rho, CDC42 und Rac erreicht wird. Diese Vermutung liegt insbesondere nahe, da kürzlich gewonnene Daten zeigen, dass auch CDC42 und Rac während der Shigelleninfektion in der Invasionszone mit F-Aktin kolokalisieren und für die Invasion von Shigella funktionell von Bedeutung sind (53, 102).

Gestützt wird diese Spekulation des Weiteren dadurch, dass bei HeLa-Zellen die mit dem Clostridium botulinum Exoenzym C3 bzw. dem Clostridium difficile toxin B behandelt wurden, eine unterschiedlich starke Inhibition der Shigelleninvasion beobachtet werden konnte. Das Clostridium botulinum Exoenzym C3 ist eine Glukosyltransferase und hemmt spezifisch Rho und besitzt keine Wirkung auf CDC42 und Rac (60). Es bewirkt eine ADP-[Seite 60↓]Ribosylierung von allen Rho-Isoformen (60). Dabei wird weder die GTPase-Aktivität von Rho noch die Bindung von GAP-Proteinen und Rho-GDI, einem Protein, das der Aktivierung von Rho entgegenwirkt (62), behindert. Vielmehr hemmt das Exoenzym C3 die Interaktion zwischen Rho und seinen Reaktionspartnern in der Form, dass ADP-ribosyliertes, inaktives Rho kompetitiv als Antagonist zu aktivem, GTP-gebundenem Rho wirkt (60). Das Clostridium difficile toxin B ist ebenfalls eine Glukosyltransferase (103). Es besitzt im Gegensatz zum Clostridium botulinum Exoenzym C3, das spezifisch Rho inhibiert (60), eine hemmende Wirkung sowohl auf Rho als auch auf CDC42 und Rac (103, 104). Bei einer alleinigen Inaktivierung von Rho durch das Clostridium botulinum Exoenzym C3 zeigte sich eine Inhibition der Bakterieninvasion von 87%. Bei einer gemeinsamen Inaktivierung von Rho, CDC42 und Rac durch das Clostridium difficile toxin B konnte hingegen eine 99,99%ige Invasionsinhibition beobachtet werden (37). Da bei einer zusätzlichen Inaktivierung von CDC42 und Rac eine höhere Invasionsinhibition als bei einer alleinigen Inaktivierung von Rho erreicht wurde, stützen diese Ergebnisse die gezeigte Involvierung von CDC42 und Rac während des Invasionsprozesses von Shigella. Gegen die Spekulation, dass Myr5 durch eine gemeinsame Inaktivierung von Rho, CDC42 und Rac die 100%ige Invasionsinhibition bewirkt, sprechen allerdings unlängst publizierte Ergebnisse, die verdeutlichen, dass Myr5 in vitro zwar alle drei Proteine inhibiert, in vivo jedoch nur einen starken Effekt auf Rho besitzt und nur sehr geringe Wirkung auf CDC42 und Rac zeigt (73). Des Weiteren unterscheiden sich die Rekrutierungsmuster von Myr5 und Rac, und auch CDC42 wird nur in geringem Maße in die zellulären Protrusionen rekrutiert (100), so daß auch aufgrund der unterschiedlichen Lokalisation der Proteine während des Invasionsprozesses eine Inaktivierung von CDC42 und Rac durch Myr5 unwahrscheinlich ist.

Die quantitativen Invasionsexperimente mit Myr5 zeigten, dass Myr5 expressionsabhängig die Shigelleninvasion in HeLa-Zellen inhibiert. Die wahrscheinlichste Erklärung dieses Ergebnisses ist die Hypothese, dass Myr5 über eine Inaktivierung von Rho dessen Aktin-stabilisierende Wirkung und dadurch die Shigelleninvasion inhibiert. Nun wurden quantitative Invasionsexperimente mit einer GAP-negativen Myr5-Mutante, deren Rekrutierungsmuster dem von Myr5 entsprach (siehe 3.6.), durchgeführt. Diese Kontrolluntersuchung hatte zwei wesentliche Gründe. Zum einen wurde mit diesen Experimenten untersucht, ob die beobachtete Invasionsinhibition durch Myr5 die Folge einer durch die Aufnahme fremder DNA bedingten gestörten Stoffwechsellage der Zellen war. Zum anderen lieferten diese quantitativen Invasionsexperimente mit der GAP-negativen Mutante eine Kontrolle dafür, ob [Seite 61↓]die Invasionsinhibition durch Myr5 tatsächlich auf dessen GAP-Aktivität zurückzuführen ist.

Das Ergebnis war sehr interessant. So bewirkte Myr5-GAP im Gegensatz zu Myr5 keine Inhibition der Shigelleninvasion. Das Gegenteil war der Fall. Myr5-GAP förderte die Invasion von Shigella in HeLa-Zellen (siehe 3.8.). Dabei machte es den Eindruck, als ob die Invasionseffizienz der Shigellen umso größer wurde, desto stärker die Expression von Myr5-GAP war (siehe Abb. 20). Diese Daten lassen zwei wesentliche Aussagen zu.

1. Die Inhibition der Shigelleninvasion durch Myr5 war kein Nebeneffekt der Transfektion. Da eine Transfektion eine starke Belastung für die Zelle darstellt, musste die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass die bei den mit Myr5 transfizierten Zellen beobachtete Invasionsinhibition allein durch die Aufnahme von freier DNA und den damit verbundenen Störungen des Zellstoffwechsels bedingt wurde. Da bei einer Transfektion mit Myr5-GAP, was für die Zellen eine identische Belastung wie die Transfektion mit Myr5 darstellte, keine Invasionsinhibition festgestellt wurde, kann die Invasionsinhibition durch Myr5 somit nicht als Artefakt des Transfektionser­eignisses selbst gedeutet werden.

2. Die Inhibition der Shigelleninvasion durch Myr5 ist auf die GAP-Aktivität von Myr5 zurückzuführen. Die GAP-negative Mutante unterscheidet sich von Myr5 lediglich durch den Austausch einer Aminosäure und dem damit verbundenen Verlust der GAP-Aktivität. Eine Überexpression der GAP-inaktiven Mutante führte im Gegensatz zur Überexpression von GAP-aktivem Myr5 nicht zu einer Invasionsinhibition. Das beweist, dass die GAP-Aktivität von Myr5 für die Inhibition der Shigelleninvasion verantwortlich ist.

Diese Erkenntnisse sind ein klarer Beleg dafür, dass Myr5 bei Überexpression mittels seiner GAP-Aktivität eine Inaktivierung von Rho und dadurch eine Inhibition der Shigelleninvasion bewirkt. Dies wiederum erhärtet die Annahme, dass Myr5 nach der Bakterien­aufnahme als Inaktivator von Rho fungieren könnte.

Die Ergebnisse der quantitativen Invasionsexperimente mit der GAP-negativen Mutante warfen auch die Frage auf, warum Myr5-GAP die Invasion von Shigella förderte. In diesem Zusammenhang kam der Gedanke auf, dass die Myosin-Funktion von Myr5 ebenfalls von Bedeutung sein könnte und Myr5 somit vielleicht zwei verschiedene, antagonistische Funktionen während der Shigelleninvasion besitzt. So kann spekuliert werden, dass Myr5 in einer frühen Phase der Invasion mittels der Myosin-Funktion möglicherweise ebenfalls Aktin-[Seite 62↓]stabilisierend wirkt und/oder die Aktinfilamente der Protrusionen in der Zellmembran “verankert“ und dadurch die Invasion fördert. Nach der Bakterienaufnahme könnte dann ein zweites bakterielles Signal zur Aktivierung der GAP-Funktion von Myr5 führen und dadurch eine Rho-Inaktivierung induzieren. Da bei der GAP-negativen Myr5-Mutante lediglich die Myosin-Funktion aktiv ist, könnte diese Hypothese somit die beobachtete Invasionssteigerung durch die Überexpression von Myr5-GAP erklären.

Weitere Überlegungen, die Förderung der Invasion durch Myr5-GAP zu deuten, zielen darauf, die Invasionssteigerung durch eine verminderte Rho-Inaktivierung und eine damit verbundene, effektivere Aktinstabilisierung und -bündelung zu erklären. So ist es vorstellbar, dass Myr5-GAP die Bindung eines humanen, aktiven Klasse-IX-Myosins, z.B. des Myosin-IXb, das kürzlich in HeLa-Zellen nachgewiesen werden konnte (AG Bähler, unveröffentlichte Daten), an Rho kompetitiv inhibiert. Da GAP-negatives Myr5 nicht in der Lage ist, Rho zu inaktivieren, stünde somit effektiv mehr GTP-gebundenes, aktives Rho zur Verfügung. Dadurch könnte eine effektivere, Rho-getriggerte Aktinreorganisation eventuell diese erhöhte Invasivität der Shigellen erklären. Diese Überlegungen setzen allerdings die Annahme voraus, dass die GAP-negative Mutante trotz inhibierter GAP-Aktivität noch an Rho binden konnte. Auf dieser Annahme beruht auch ein weiteres Modell, das die Förderung der Shigelleninvasion durch Myr5-GAP erklären könnte. Diesem Modell liegt die Vermutung zu Grunde, dass Rho möglicherweise über die Bindung an Myr5 im Bereich der GAP-Domäne gemeinsam mit diesem in die bakterielle Invasionszone rekrutiert wird. Bei den mit der GAP-negativen Mutante transfizierten Zellen würde somit nicht nur vermehrt das GAP-negative Myr5, sondern auch das daran gebundene Rho vermehrt in der Invasionszone akkumulieren. Die daraus resultierende erhöhte Konzentration von Rho an der bakteriellen Eintrittsstelle könnte somit die gesteigerte Invasion der Shigellen erklären.

Weiterhin ist denkbar, dass es für Myr5 einen spezifischen Rekrutierungsmechanismus gibt. Ein spezifischer Mechanismus konnte zwar nicht aufgedeckt werden (siehe 4.2.), aber es ist nicht ausgeschlossen, dass das humane Myosin-IXb und die GAP-negative Mutante um einen solchen möglichen Rekrutie­rungs­mechanismus konkurrieren. Die Überexpression der GAP-negativen Mutante in den transfizierten Zellen könnte somit einen verminderten Transport des physiologischen, aktiven Klasse-IX-Myosins in die Invasionszone zur Folge haben. Dies wiederum würde eine verminderte Inaktivierung von Rho und dadurch eine verstärkte Aktinstabilisierung nach sich ziehen, was die erhöhte Invasivität der Shigellen verständlich machen würde.


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Zusammenfassend lassen sich unsere Ergebnisse wie folgt interpretieren. Eine Überexpression von Myr5 führt zu einer Verminderung der Infektionseffizienz. Dabei inaktiviert Myr5 mittels seiner GAP-Funktion vermehrt Rho und inhibiert dadurch dessen für die Shigelleninvasion essentielle, Aktin-stabilisierende Wirkung. Im Gegensatz dazu führt eine Überexpression von Myr5-GAPzu einer Erhöhung der Infektionseffizienz, was darauf hindeutet, dass neben der GAP-Funktion auch die Myosin-Funktion von Myr5 funktionell von Bedeutung ist. Möglicherweise besitzt Myr5 somit während der Epithelzellinvasion von Shigella flexneri zweizeitig verschiedene, antagonistische Funktionen. Im Modell zur Shigelleninvasion könnte Myr5 zunächst mittels seiner Myosin-Funktion Aktin-stabilisierend und somit invasionsfördernd wirken. Zu einem späteren Zeitpunkt inaktiviert Myr5 mittels der GAP-Funktion die GTPase Rho und inhibiert dadurch dessen Aktin-stabilisierende Wirkung. Somit würde Myr5 in diesem Modell dann antagonistisch zur Shigellen-induzierten Aktin­reorganisation wirken und könnte damit die Rückbildung der zur Invasion nötigen Zytoskelett­veränderungen initiieren.

Da durch die Unterbindung einer überschüssigen Aktin­polymerisation auch der intrazelluläre Pool an G-Aktin erhöht und somit gesichert wird, dass den Shigellen genügend monomeres Aktin für die IcsA-abhängige, intra- und interzelluläre Bewegung, die für die Pathogenität von Shigella essentiell ist (34, 35, 38), zur Verfügung steht, könnte die Aktivierung der GAP-Funktion von Myr5 ebenfalls Shigellen-induziert sein.

Weiterhin zeigten unsere Untersuchungen, dass Myr5 nur mit den Rho-Isoformen RhoB und RhoC in den Spitzen der zellulären Protrusionen kolokalisiert und daher sehr wahrscheinlich, nur diese Rho-Isoformen nach der Invasion von Shigella inaktiviert. Da Myr5 in vitro jedoch auf alle 3 Rho-Isoformen eine inaktivierende Wirkung besitzt, scheinen somit im Modell zur Epithelzellinvasion von Shigella RhoB und RhoC allein durch ihr Rekrutierungsverhalten, Isoformen-spezifisch von Myr5 inaktiviert zu werden. Somit zeigen unsere Kolokali­sationsexperimente im Gegensatz zu biochemischen in vitro Untersuchungen, die eine Interaktion zwischen Myr5 und RhoA zeigten, dass eine tatsächliche in vivo Interaktion voraussetzt, dass sich die Interaktionspartner zu einem gegebenen Zeitpunkt am gleichen Ort befinden müssen (Kolokalisation).

Die unterschiedlichen Rekrutierungsmuster von Myr5 und RhoA führen zu der Annahme, dass es für RhoA, das vermehrt in den zellnäheren Abschnitten der Membranstruktur um das Bakterium herum akkumuliert, einen anderen, Myr5-unabhängigen Mechanismus zur Inaktivierung geben könnte.

Naheliegend ist die Vermutung, dass RhoA durch ein anderes GAP-Protein inaktiviert wird. [Seite 64↓]So besitzen u.a. die Proteine p190, Bcr und p122 eine GAP-Aktivität für RhoA (105, 106). Des Weiteren gibt es experimentelle Daten, die darauf hindeuten, dass insbesondere das GAP-Protein p190 als Inaktivator von RhoA in Frage kommt. So kann p190 zum einen RhoA inaktivieren, zum anderen wird die Aktivität von p190 durch die Tyrosinkinase pp60c-src reguliert (107, 108). Nun ist es höchst interessant, dass diese Tyrosinkinase in die bakterielle Invasionszone rekrutiert wird und dabei das Rekrutierungsmuster von pp60c-src dem von RhoA ähnelt (109). Diese Beobachtungen lassen die Aufstellung eines hypothetischen Modells zu, bei dem eine Signalkaskade die RhoA-Inaktivierung steuert. So könnte pp60c-src Shigellen-induziert das GAP-Protein p190 aktivieren und dadurch zur Inaktivierung von RhoA führen.

In diesem Zusammenhang muß auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, daß RhoA nicht spezifisch inaktiviert wird, sondern dessen Wirkung durch einen anderen Mechanismus antagonisiert wird. So wurde von Bourdet-Sicard et al. gezeigt, daß IpaA an Vinculin, ein Aktin-bindendes Protein (110, 111), dem u.a. Bedeutung bei der Verankerung von F-Aktin an der Zellmembran zugeschrieben wird (112), binden kann und dadurch eine vermehrte Bindung von Vinculin an F-Aktin bewirkt. Dies wiederum führt zu einer vermehrten Depolarisation von F-Aktin (50). Diese Kausalkette ist insbesondere von Bedeutung, wenn man die Tatsache hinzuzieht, daß IpaA-negative Shigellenmutanten ungeordnet wirkende, zelluläre Membranausstülpungen initiieren, die offenbar eine Hemmung der Aktin­polimerisation im Bereich der bakteriozellulären Kontaktzone und dadurch die Bildung der typischen, blütenartigen Membranstruktur um die Bakterien herum vermissen lassen (45). Somit kann die Hypothese aufgestellt werden, daß IpaA insbesondere unterhalb der bakteriozellulären Kontaktzone, in der auch RhoA akkumuliert und F-Aktin bündelt und stabilisiert, zu einer Vinculinakti­vierung und damit vermehrten Aktindepolimerisation führt, so daß es keiner spezifischen RhoA-Inaktivierung bedarf.

Im Zuge dieser Spekulationen zum Inaktivierungsmechanismus von Rho muss auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass die Rho-Aktivität während der Invasion von Shigella nicht über GAP-Proteine, wie z.B. Myr5, reguliert wird, sondern über eine Aktivierung bzw. Inaktivierung von GEF-Proteinen (GDP/GTP exchange factor). GEF-Proteine überführen Rho von einem GDP-gebundenen, inaktiven Zustand in einen GTP-gebundenen, aktiven Zustand und wirken somit antagonistisch zu GAP-Proteinen (113, 114). Es ist vorstellbar, dass ein Shigellen-induziertes Signal zur Aktivierung der GEF-Proteine führt und dadurch die Rho-getriggerte Aktinreorganisation initiiert. Nach der [Seite 65↓]Bakterienaufnahme könnte ein zweites bakteriell-induziertes Signal eine Inaktivierung der GEF-Proteine bewirken und dadurch Rho inhibieren.

Fest steht, dass die Aktin-stabilisierende Wirkung von Rho essentiell für die Epithel­zellinvasion von Shigella flexneri ist. Dabei kommt der Regulation der Rho-Aktivität durch das Bakterium eine zentrale Rolle zu. Diese Regulation der Rho-Aktivität während der Epithelzellinvasion ist ein hochspezifischer Prozess, der durch Shigella gesteuert wird und höchstwahrscheinlich auf einer gezielten Induktion von Rho-Aktivatoren und Rho-Inaktivatoren basiert. Wie dabei Shigellen-induziert die Rho-Aktivierung erfolgt, ist bisher ungeklärt. Ein Modell zum Mechanismus der Rho-Inaktivierung konnte im Rahmen dieser Arbeit entwickelt werden. Dabei fungiert ein GAP-Protein der Myosinklasse IX, das in den Epithelzellen des humanen Gastrointestinaltraktes das Myosin-IXb sein könnte, als Inaktivator der Rho-Isoformen RhoB und RhoC. Außerdem schlägt dieses Modell das GAP-Protein p190 als Inaktivator von RhoA vor. Myr5 interagiert während der Shigelleninvasion nicht mit RhoA. Da Myr5 in vitro mit allen 3 Rho-Isoformen interagiert, bei unseren in vivo Experimenten jedoch nur mit RhoB und RhoC, scheint die tatsächliche in vivo Interaktion über das unterschiedliche Rekrutierungsverhalten gesteuert zu werden.

Während der Epithelzellinvasion greift Shigella in physiologische Prozesse der Wirtszelle ein und macht sich diese zunutze. Die hier beschriebene mögliche Inaktivierung von Rho durch Myr5 mag dafür ein Beispiel sein. Wie Shigella dabei gezielt zelluläre Moleküle aktiviert bzw. inaktiviert und dadurch physiologische Reaktionskaskaden induziert, ist bisher nur teilweise verstanden. Die Aufklärung dieser Mechanismen wird ein weiterer wesentlicher Schritt sein, um die Pathogenitätsmechanismen virulenter Bakterien zu verstehen.


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06.01.2005