Die Immunfluoreszenzfärbung wurde für Zytoskelettdarstellungen und die quantitativen Invasionsexperimente eingesetzt.

∙ Verwendete Primärantikörper und Verdünnungen in PBS, (Hersteller):

• anti-HA-tag-Kaninchen (polyklonaler Antikörper), 1: 100, (HISS, Freiburg)

• anti-HA-tag-Maus (monoklonaler Antikörper), 1: 500, (HISS, Freiburg)

• anti-LPS-Shigella flexneri-Kaninchen (polyklonaler Antikörper), 1: 250,
  (freundlicherweise überlassen von Philippe Sansonetti, Institut Pasteur, Paris)

• anti-VSV-tag-Maus = P₅D₄ (monoklonaler Antikörper), 1: 200, (Überstand von
  Hybridom-Kultur, die von Thomas Kreis, Heidelberg, zur Verfügung gestellt wurde (74))

∙ Verwendete Sekundärantikörper und Fluoreszenzfarbstoffe: siehe Tab. 2

Phalla­cidin wurde erst luftgetrocknet und anschließend in 1x PBS oder im Sekundäranti­körperansatz verdünnt.

Anregung

Emission

Verdünnung in 1xPBS

Hersteller

anti-Maus-Fluoreszein (FITC)

492 nm

520 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Maus-Texas Red (TR)

596 nm

623 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Maus-Cy 3

553 nm

575 nm

1: 200

DIANOVA

anti-Kaninchen-Fluoreszein

492 nm

520 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Kaninchen-Texas Red

596 nm

623 nm

1: 100

DIANOVA

anti-Kaninchen-Cy 3

553 nm

575 nm

1: 200

DIANOVA

BODIPY FL Phallacidin

505 nm

512 nm

1: 10

MOLECULAR PROBES

Tab. 2: Übersicht der verwendeten Sekundärantikörper und Fluoreszenzfarbstoffe.

Die auf Deckgläschen gewachsenen Zellen wurden 20 Minuten mit 3,7% Paraformaldehyd bei RT fixiert und anschließend zur Neutralisation der Aldehydgruppen mindestens 5 Minuten in 0,1 M Glyzin bei RT inkubiert. Daraufhin folgte die 5 minütige Permeabilisierung mit 0,1% Triton-X-100 in PBS. Zwischen den einzelnen Schritten wurden die Zellen jeweils 3x mit PBS gewaschen. Nach Zugabe der Primärantikörper gegen das HA- bzw. VSV-tag (40µl/Deckgläschen) erfolgte die 20-minütige Inkubation in einer feuchten Kammer bei RT. Zur Darstellung von Shigellen, z.B. für die quantitativen Invasionsexperimente, wurde der anti-LPS-Shigella flexneri-Kaninchen Antikörper verwendet. Die Zellen wurden dann erneut 3x mit PBS gewaschen. Für die indirekte Immunfluoreszenz wurden nun die Zellen mit den Sekundärantikörpern (40µl/Deckgläschen) wiederum in einer feuchten Kammer für mindestens 20 Minuten bei RT inkubiert. Nach dem zweiten Färbeschritt wurden die Deckgläschen 3x mit PBS gewaschen und möglichst blasenfrei auf einem Objektträger in Mowiol () eingebettet. Nach 10- minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Präparate bei 4°C aufbewahrt.

Mowiol: 2,4 g Mowiol 4-88 (HOECHST) wurden mit 6 g Glyzerol und 6 ml H₂O gemischt und für mindestens 2 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden 12 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 8,5, zugegeben und die Lösung erst 10 Minuten auf 50°C erwärmt, dann 15 Minuten bei 5000xg zentrifugiert und schließlich aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bei –20°C.

Wir führten im Vorfeld der quantitativen Invasionsassays Experimente zur Optimierung der Infektionseffizienz mit dem Stamm SC560 durch. Dabei verwendeten wir zur Darstellung von intrazellulären Shigellen die weniger zeitaufwendige GIEMSA-Färbung.

Die auf Deckgläschen gewachsenen Zellen wurden dabei 1 Minute mit 100% Ethanol fixiert. Nach Absaugen des Ethanols wurden die Zellen getrocknet, 2x mit PBS gewaschen und 20 Minuten lang mit GIEMSA-Lösung gefärbt.

Um E.coli-Zellen kompetent, das heißt sie aufnahmebereit für freie DNA zu machen, wurde das nachfolgend beschriebene Verfahren verwendet.

E.coli-DH_{5 α}-Zellen wurden in Luria Bertani broth (LB; FLUKA) inokuliert und für 16-20 Stunden im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Dann wurde eine 1/100 Verdünnung hergestellt und diese weitere 3 Stunden im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Nun wurden die Bakterien 10 Minuten bei 2600xg und 4°C abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 5 ml 100 mM CaCl₂ aufgenommen. Nach einer Inkubation von 20 Minuten auf Eis wurde der Ansatz 10 Minuten bei 2600xg und 4°C

zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde nun in 2 ml 125 mM CaCl₂ suspendiert. Dazu wurden dann 500 µl Glyzerol gegeben und die Bakterien anschließend bei –80°C gelagert.

Die Transformanden wurden über eine Plasmid-kodierte Ampicillin-Resistenz selektiert. Dazu wurden die bei –80°C gelagerten, kompetenten E.coli-Zellen (siehe 2.9.1) auf Eis aufgetaut. Dann wurde zu 100 µl Bakterienlösung ca. 2 µg DNA zugegeben und für mindestens 20 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend kam der Ansatz für exakt 2 Minuten in ein 42°C warmes Wasserbad. Nun wurden 900 µl LB zugegeben. Nach einer Stunde bei 37°C im Wärmeblock wurde der Ansatz 2 Minuten bei 15800xg und RT zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl LB aufgenommen, die Bakteriensuspension auf eine LB-Ampicillin-Platte () ausgespatelt und für 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 0,9% CO₂ inkubiert. Da sich auf dem Plasmid, das die DNA enthielt, z.B. das Gen für Myr5, auch eine Sequenz befand, die für eine Ampicillin-Resistenz kodierte, selektierte die LB-Ampicillin-Platte zugunsten derjenigen Bakterien, die dieses Plasmid und somit die DNA aufgenommen hatten. Von der Platte wurden dann Einzelkolonien abgenommen und jeweils in 10 ml LB mit 100 µg/ml Ampicillin überimpft. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm wurden zu 900 µl dieser Bakteriensuspension 300 µl Glyzerol gegeben und die Bakterien bei –80°C gelagert.

LB-Ampicillin-Platte: Einem Liter H₂O wurden 20 g LB und 13 g Agar zugegeben und anschließend autoklaviert. War der Ansatz auf ca. 50°C abgekühlt, wurden ihm 2 ml Ampicillin (50 mg/ml; SIGMA) zugesetzt und schließlich die Platten gegossen.

Zur DNA-Gewinnung wurden die Bakterien in ca. 400 ml LB inokuliert und ca. 20 Stunden im Schüttelinkubator bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Nach Abzentrifugation der Bakterien bei 3200xg wurde die DNA unter Verwendung eines kommerziellen Plasmid-Präparationssystems (QIAGEN - maxi bzw. midi prep) aus den Bakterien gewonnen. Dabei wurde nach der Lyse der Bakterien die Plasmid-DNA mittels Salzfällung von der chromosomalen DNA getrennt. Die Reinigung der Plasmid-DNA erfolgte durch eine Anionenaustauschchromatographie. Dabei wurde im ersten Schritt bei geringer Salzkonzentration die Plasmid-DNA an die Säule gebunden, während Proteine und Bakterienreste die Säule passierten. Nach zwei Waschschritten wurde dann die Plasmid-DNA bei hoher Salzkonzentration eluiert. Nach der Präzipitation der DNA mit Isopropanol und Entsalzung mit 70% Ethanol wurde die DNA in Aqua bidest. aufgenommen. Anschließend wurde die DNA-Konzentration am Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.

Dieses Verfahren dient zur Trennung von Proteinen und DNA und beruht auf den unterschiedlichen hydrophilen bzw. hydrophoben Eigenschaften von Proteinen und DNA.

Die in Wasser gelöste DNA wurde, um Verluste beim Pipettieren von sehr kleinen Volumina zu vermeiden, mit 1x TE () auf 300 µl aufgefüllt. Diesem Ansatz wurden 300 µl Phenol (4°C) zugegeben und dann 2 Minuten gemixt. Dabei lösten sich die Proteine in der hydrophoben Phase des Phenols. Die DNA hingegen verblieb in der hydrophilen Phase. Zur Trennung der beiden Phasen erfolgte eine Zentrifugation von 15 Minuten bei 15800xg und 4°C. Die obere, klare, wässrige Phase, in der die DNA gelöst war, wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert. Zum abgenommenen Überstand wurde im Verhältnis 1: 1 ein Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25: 24: 1; 4°C, FLUKA) gegeben und dann wieder 2 Minuten gemixt. Dabei lösten sich noch vorhandene Proteine und das Phenol aus dem ersten Schritt in der hydrophoben Phase, wohingegen die DNA wiederum in der wässrigen Phase verblieb. Daraufhin wurde wieder 15 Minuten bei 15800xg und 4°C zentrifugiert und der hydrophile Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert. Dazu wurde dann Chloroform, RT, im Verhältnis 1: 1 gegeben und erneut 2 Minuten gemixt. Da sich das in der hydrophilen Phase verbliebene Phenol im hydrophoben Chloroform löste, diente dieser Schritt auch der Reinigung der hydrophilen Phase vom Phenol. Nach 5 minütiger Zentrifugation bei 15800xg und RT konnte der Überstand, mit der darin gelösten DNA, in ein neues Eppendorf-Gefäß pipettiert werden. Anschließend folgte meist eine Ethanolpräzipitation (siehe 2.9.5).

TE-Puffer (pH 8,0):

100 mM

10 mM

Tris-HCl

EDTA

Folgende Überlegungen und Berechnungen gingen dem Restriktionsansatz voraus:

1. 1 Einheit (unit) einer Restriktionsendonuklease schneidet 1 µg einer 3,5 kb langen DNA in einer Stunde zu 99%. Dies entspricht einer 1-fachen Restriktion. Geschnitten wurden 20 µg einer 9,2 kb langen DNA (Myr5-Flag in pUHD 310/311) in 2 Stunden mit einer 12-fachen Restriktion. Somit wurden 60 Einheiten beider Enzyme benötigt.

2. Die Restriktionsenzyme wurden mindestens 1/20 verdünnt, da sich bei Glycerol­konzentration von > 5% die Aktivität der Enzyme erfahrungsgemäß verringert.

3. Buffer R (MBI/FERMENTAS), den beide Enzyme zum Schneiden benötigten, musste im Ansatz 1-fach vorliegen.

4. BSA (bovines serum albumin; MBI/FERMENTAS), das die Effizienz der Enzyme steigerte, musste im Ansatz eine Konzentration von 0,1 mg/ml aufweisen.

5. Als Kontrolle wurden je 2 µg der DNA nur mit NdeI bzw. Eco32I geschnitten. Anhand der Kontrollen konnte bei der sich anschließenden Elektrophorese beurteilt werden, ob beide Enzyme das Plasmid geschnitten hatten.

Somit ergab sich folgender Ansatz: siehe Tab. 3

Gesamtvolumen

DNA
1,27 µg/µl

Buffer R
10-fach

BSA
2 mg/ml

NdeI
10 unit/µl

Eco32I
10 unit/µl

Aqua

300 µl

15,8 µl

30 µl

15 µl

6 µl

6 µl

227,2 µl

30 µl

1,6 µl

3 µl

1,5 µl

0,6 µl

/

23,3 µl

30 µl

1,6 µl

3 µl

1,5 µl

/

0,6 µl

23,3 µl

Tab. 3: Pipettierschema des 1. Restriktionsansatzes.

Zum Schneiden wurden die Proben 2 Stunden lang im Wärmeblock bei 37°C inkubiert und anschließend die Enzyme durch 20 Minuten im Wärmeblock bei 65°C inaktiviert.

Das ausgeschnittene Fragment (Flag-tag) wurde nun mittels Gelelektrophorese vom Plasmid (pUHD+Myr5) getrennt. Das Verfahren beruht auf den unterschiedlichen Wanderungsge-schwindigkeiten von verschieden großen DNA-Fragmenten im elektrischen Gleichspannungs-feld. Dazu wurde ein 1x TAE (), 1% Agarosegel benutzt. Vor dem Auftragen wurde den Proben TAE, Endkonzentration 1x, und Loading-Buffer (), in Probe 1: 6 verdünnt, zugesetzt (siehe Tab. 4).

Probe

Gesamtvolumen

Restrik.-ansatz

1 kb Leiter

50x TAE

Loading-B.

Aqua

NdeI, Eco32I

400 µl

300 µl

/

8 µl

65 µl

27 µl

NdeI

50 µl

30 µl

/

1 µl

8 µl

11 µl

Eco32I

50 µl

30 µl

/

1 µl

8 µl

11 µl

1 kb Leiter

50 µl

/

1,5 µl

1 µl

8 µl

39,5 µl

Tab. 4: Ansätze für die Gelelektrophorese.

Die Proben wurden, nach einer Inkubation von 5 Minuten / 70°C, bei 50 Volt ca. 90 Minuten im Gel laufen gelassen und die interessierende Bande unter einer UV-Lampe ausgeschnitten.

50x TAE:

242 g

Tris

57,1 ml

100% CH₃COOH

100 ml

0,5 M EDTA

ad 1000 ml

H₂O

Loading-Buffer:

0,25%

Xylin-Cyanol

0,25%

Bromphenolblau

30%

Glyzerol

Die Gelextraktion erfolgte nach dem Protokoll “QIAquick Gel Extraction Kit“ von QIAGEN. Nachdem das Gel aufgelöst worden war, wurde bei diesem Verfahren die DNA mit Hilfe einer Silica-Membran vom Gel getrennt. Dabei wurde die DNA im ersten Schritt bei einer hohen Salzkonzentration und bei einem geringen pH-Wert (Zugabe von Natriumazetat) an die Membran gebunden, das Gel jedoch nicht. Nun wurde die DNA gewaschen und anschließend bei geringer Salzkonzentration und einem höheren pH-Wert mit 265 µl Aqua bidest. eluiert. Dann erfolgte am Spektralphotometer bei 260 nm die Konzentrationsbestimmung der DNA. Diese ergab eine Konzentration von 0,026 µg/µl. Bei einem Volumen von 265 µl waren dies also 6,89 µg DNA.

Dem schloss sich eine Phenol-Chloroform-Extraktion sowie eine Ethanolpräzipitation (siehe 2.9.4 bzw. 2.9.5) an, wobei die ca. 4 µg DNA in 20 µl Aqua bidest. aufgenommen wurden. Hiernach wurde die DNA nochmals mit NdeI und Eco32I geschnitten. Dies hatte den Sinn, die Anzahl ungeschnittener sowie nur einfach geschnittener Plasmide möglichst gering werden zu lassen. Zum Schneiden wurden von den 20 µl DNA 11 µl (ca. 2,2 µg) eingesetzt und 2 Stunden mit 14-facher Restriktion geschnitten (siehe Tab. 5).

Gesamtvolumen

DNA
0,2 µg/µl

Buffer R
10-fach

BSA
2 mg/ml

NdeI
10 unit/µl

Eco32I
10 unit/µl

Aqua

100 µl

11 µl

10 µl

5 µl

0,8 µl

0,8 µl

72,4 µl

Tab. 5: Pipettierschema des 2. Restriktionsansatzes.

Nach der Enzyminaktivierung folgte eine Dephosphorylierung der DNA mit alkalischer Phosphatase. Dabei wurde nach dem “Protocol for DNA dephophorylation using calf intestine alkaline phosphatase (CIAP)“ (MBI/FERMENTAS) vorgegangen. Hierbei wurden mittels einer Phosphomonoesterase von den DNA-Enden freie Phosphate abgespalten. Da eine Ligation von Doppelstrang-DNA nur möglich ist, wenn mindestens einer der zu ligierenden Stränge ein Phosphat besitzt, konnte anschließend nur eine Ligation zwischen den hybridisierten Oligonukleotiden (siehe Abb. 17), die an ihrem 5`-Ende jeweils phophoryliert waren, und der DNA erfolgen. Eine Religation von nur einfach geschnittenen Plasmiden wurde dadurch ausgeschlossen. Der Dephosphorylierung folgte eine Phenol-Chloroform-Extraktion.

Eine Ligation zwischen den hybridisierten Oligonukleotiden und den beim 2. Schneiden ausgeschnittenen Flag-tag-Fragmenten wurde verhindert, indem diese kleinen Fragmente nach dem Protokoll des DS^TM Primer Remover® (MOBITEC) aus dem Ansatz entfernt wurden. Das Verfahren beruht auf der unterschiedlichen Präzipitation kleiner (bis ca. 100 bp) und großer DNA-Fragmente. Die verbliebene DNA wurde in 12 µl Aqua bidest. aufgenommen (Konzentration: 0,125 µg/µl). Eine genaue Konzentrations­bestimmung der DNA wurde aufgrund der geringen DNA-Menge nun nicht mehr durchgeführt.

Die Ligation erfolgte nach dem Protokoll “Ligation with T4 DNA ligase (with PEG) / 1. DNA insert ligation into plasmid vektor“ (MBI/FERMENTAS).

Pro Ligation wurden 2 µl DNA eingesetzt. Dies entsprach etwa 40 fmol DNA. Da diese DNA-Menge nur eine Schätzung war, wurden verschiedene Verhältnisse zwischen DNA (Vektor) und Oligohybrid gewählt, nämlich 1: 20, 1: 5, 1: 1, 2: 1 und 8: 1. Somit waren die in Tab. 6 dargestellten Ansätze nötig:

Ansatz 1

Ansatz 2

Ansatz 3

Ansatz 4

Ansatz 5

Ansatz 6

Ansatz 7

Ansatz 8

Verhältnis V/O

1 : 20

1 : 5

1 : 1

2 : 1

1 : 8

/

/

/

Vektor

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
41,6 fmol

/

/

Oligohybrid

2 µl
832 fmol

2 µl
208 fmol

2 µl
41,6 fmol

2 µl
20,8 fmol

2 µl
5,23 fmol

/

2 µl
41,6 fmol

/

Stammlösung

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

16 µl

Aqua

/

/

/

/

/

2 µl

2 µl

4 µl

Tab. 6: Pipettierschema der Ligationsansätze.

Die Ansätze 6, 7 und 8 dienten als Negativkontrollen, wobei Ansatz 6 ein Maß für die Anzahl an ungeschnittenen Plasmiden lieferte.

Da das Gesamtvolumen pro Ligationsansatz laut Protokoll 20 µl betragen sollte, blieb abzüglich der 2 µl Vektor und 2 µl Oligohybrid pro Ligationsansatz ein Volumen von 16 µl für die übrigen Zusätze. Da diese für jeden Ansatz identisch waren, wurden sie zu einer “Stammlösung“ zusammenpipettiert. Diese wurde nach Protokoll hergestellt, wobei 4 Einheiten T4 DNA Ligase pro Ligation verwendet wurden, weil die Eco32I-Schnittstelle “blunt end“ ligiert werden musste.

Die benötigten Verdünnungen des Oligohybrides (10 µM) in Aqua bidest lauteten wie folgt: siehe: Tab. 7:

für Ansatz 1

für Ansatz 2

für Ansatz 3+7

für Ansatz 4

für Ansatz 5

Verdünnung

1 : 24

1 : 96

1 : 480

1 : 960

1 : 3840

Tab. 7: Verwendete Oligohybridverdünnungen für die Ligationsansätze.

Die Proben wurden nun 1 Stunde bei 22°C inkubiert. Dann erfolgte die Transformation. Die dazu benutzten E.coli-DH_{5 α}-Zellen wurde anschließend auf LB-Ampicillin-Platten ausgestrichen und für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Vom Ligationsansatz 2 (V/O=1: 5), bei welchem die meisten Kolonien gewachsen waren, wurden 4 Kolonien abgenommen, auf LB-Ampicillin-Platten fraktioniert ausgestrichen und für 20-24 Stunden bei 37°C inkubiert. Von jeder der 4 Platten wurde dann eine Einzelkolonie in LB inokuliert und tags darauf eine DNA-Präparation (midi prep; QIAGEN) durchgeführt. Mit den gewonnenen DNA`s wurden anschließend HeLa-Zellen transfiziert und mittels einer Immunfluoreszenzfärbung (Primärantikörper: anti-VSV-tag-Maus, Sekundärantikörper: anti-Maus-TR) die Expression des neuen Konstruktes geprüft.