2. Material und Methoden

2.1. Grundlagen der Versuchsanordnung

2.1.1. Die Experimente

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Um eine Aussage treffen zu können, ob die bevorzugte Lipoproteinadsorption eine gemeinsame Eigenschaft fibrogener Mineralstäube darstellt, die sie von inerten Mineralstäuben unterscheidet, wurden in vitro Adsorptionsversuche durchgeführt und das Adsorptionsverhalten fibrogener mit dem inerter Mineralstäube verglichen.

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Die Adsorption erfolgte aus einer reinen bovinen Lipoproteinlösung und aus menschlichem Serum. Die Adsorption aus Serum unterscheidet sich von der aus reiner Lipoproteinlösung durch das Auftreten von Konkurrenz, da alle im Serum befindlichen Substanzen als potentielle Adsorbate um die auf dem Mineralstaub zur Verfügung stehende Fläche konkurrieren. Unterschiede im Adsorptionsverhalten, die unter diesen Bedingungen auftreten, kommen der Realität im Körper vermutlich näher als solche, die bei fehlender Konkurrenz beobachtet werden können.

Auch die Fähigkeit des Polymers Polyvinylpyridin-N-oxid (PVPNO), die Oberfläche von Quarz zu maskieren und so seine silikogene Wirkung zu hemmen, wurde genutzt, um zu überprüfen, ob Lipoproteine in der Pathogenese der Silikose eine Rolle spielen könnten. Die Adsorption von Lipoproteinen aus Serum an Quarz wurde in An- und Abwesenheit von PVPNO in der Suspension durchgeführt. Das Polymer wurde dem Serum in einer Konzentration von einem Massenprozent zugesetzt. Dies entspricht in der Größenordnung den PVPNO- Konzentrationen, unter denen die Verminderung pathogener Effekte von Quarz beobachtet werden konnten [29].

Die Bestimmung von Menge und Art der adsorbierten Lipoproteine erfolgte über die Messung der durch den Mineralstaubkontakt verursachten Konzentrationsabnahme von LDL-, HDL-, und Gesamtcholesterol in den untersuchten Lösungen.

2.1.2. Auswahl der Mineralstäube

↓18

Unter den Mineralstäuben gibt es faserförmige (z.B. Asbest) und granuläre (z.B. Quarz). Aufgrund dieses Unterschiedes in der physikalischen Eigenschaft folgt die pathologische Wirkung auf Zellen und Gewebe einem möglicherweise grundlegend anderen Mechanismus. So sollen bei der Entstehung der Asbestose Länge und Durchmesser der Asbestfasern einen Einfluss auf die Ausbildung der Fibrose haben [62,63], ein Mechanismus, der in der Silikoseentstehung keine Rolle spielt.

Die vorliegende Arbeit beschränkt sich auf die Untersuchung granulärer Mineralstäube, um zusätzliche Konfusion durch die Verwendung von Stäuben mit unterschiedlicher physikalischer Struktur zu vermeiden.

Für die Adsorptionsversuche mussten Mineralstäube ausgewählt und nach vorhandenem bzw. fehlendem fibrogenen Potential in zwei Gruppen unterteilt werden. Um eine Aussage über das fibrogene Potential eines Staubes machen zu können, wurden Tierversuchsstudien und epidemiologische Studien über das Auftreten von Staublungenerkrankungen bei exponierten Menschen ausgewertet. Dabei traten Schwierigkeiten auf, die im Folgenden kurz erläutert werden.

↓19

Den verschiedenen Studien liegt kein einheitlicher Versuchsaufbau zugrunde. So wurden die zu untersuchenden Stäube im Tierversuch teils intratracheal appliziert, teils der normalen Atemluft zugesetzt. Andere Autoren injizierten Staub intraperitoneal oder intravenös. Dies erschwerte die Vergleichbarkeit und führte zum Teil zu widersprüchlichen Aussagen in bezug auf die Fibrogenität eines Staubes. Ein weiteres Problem ergab sich daraus, dass in Tierversuchsstudien meist gleiche Massen verschiedener Stäube eingesetzt werden, nicht gleiche Oberflächen. Da nach unserer Vorstellung die Lipoproteinadsorption aus Körperflüssigkeiten an die Oberfläche des Mineralstaubs für dessen Fibrogenität ursächlich sein könnte, stellte sich die Frage, inwieweit Studien aussagekräftig sind, in denen Substanzen zwar anhand gleicher Massen, möglicherweise aber stark voneinander abweichender Oberflächen auf ihr fibrogenes Potential hin verglichen wurden. Weiterhin war es problematisch, Gewebereaktionen verschiedener Versuchstiere miteinander zu vergleichen oder daraus Rückschlüsse auf mögliche Reaktionen beim Menschen zu ziehen, zumal die nach unserer Vorstellung möglicherweise entscheidenden Lipoproteine bei den verschiedenen Tieren in unterschiedlichen Serumkonzentrationen vorliegen und auch eine unterschiedliche Dichte und chemische Zusammensetzung aufweisen können [64,65], was zu veränderten Adsorptionseigenschaften führen könnte. Bei der Auswertung der epidemiologischen Studien über das Auftreten von Pneumokoniosen bei exponierten Menschen entstand das Problem, dass die inhalierten Stäube oft nicht eindeutig charakterisiert sind, da es sich um Staubgemische handelt. In diesen Fällen war es schwer möglich, das fibrogene Potential einem der beteiligten Mineralstäube allein zuzuschreiben. Möglicherweise sind eher die Verunreinigungen ursächlich beteiligt.

Nach Auswertung der vorhandenen Literatur wurden folgende Mineralstäube in die Versuchsreihen aufgenommen. Die Zuteilung zu beiden Gruppen erfolgte anhand der in Klammern angegebenen Literatur.

Mineralstäube mit fibrogenem Potential:

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Inerte Mineralstäube:

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α- Quarz ist der am besten untersuchte Mineralstaub hinsichtlich seiner Wechselwirkung mit dem Organismus. In den verschiedenen Tierversuchsstudien und in vitro Experimenten werden in Europa vorwiegend die Standard- α- Quarze QuarzDQ12 und QuarzF600 verwendet. Es erschien deshalb interessant, auch das Adsorptionsverhalten dieser Quarze vergleichend zu untersuchen. Die Mineralstäube Talk und Kaolin gehören zu den Silikaten und enthalten im Kristallgitter unter anderem auch SiO4- Tetraeder, aus denen auch α- Quarz aufgebaut ist.

2.1.3. Die Oberfläche der Stäube

In der vorliegenden Arbeit wurde quantitativ die Adsorption von Lipoproteinen auf den Oberflächen verschiedener Stäube untersucht. Dafür war es notwendig, jeweils Staubmengen gleicher Oberfläche zu verwenden. Die Kenntnis der spezifischen Oberflächen der Stäube, d.h. der Fläche in Quadratmetern, die ein Gramm des Stoffes besitzt, war deshalb eine Grundvoraussetzung.

Eine verbreitete Methode, die die Bestimmung der spezifischen Oberfläche erlaubt, ist die Brunauer-Emmett-Teller (BET) Gasadsorption [83]. Hier wird gasförmiger Stickstoff auf die Oberfläche von Stäuben aufgebracht und aus der adsorbierten Gasmenge auf die spezifische Oberfläche (ABET)des Staubes rückgeschlossen. Der Platzbedarf eines Stickstoffmoleküls in monomolekularer Schicht auf der Stauboberfläche wird unter definierten Umgebungsbedingungen mit 0,162nm2 angegeben [84]. Die Oberfläche von Mikroporen in der Stauboberfläche, deren Öffnungsfläche größer als der Durchmesser der Gasteilchen ist, geht in die Oberflächenbestimmung ein.

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Der Durchmesser der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Lipoproteine liegt zwischen 5nm und 25nm [43]. Damit steht die Oberfläche der Mikroporen den wesentlich größeren Lipoproteinen nicht als Adsorptionsfläche zur Verfügung. Diese nicht nutzbare Fläche variiert mit der Porosität von Stoff zu Stoff, sodass ein systematischer Fehler resultieren würde. Deshalb wurde für diese Arbeit eine Methode zur Bestimmung der Oberfläche entwickelt, bei der die Mikroporen eines Staubes nicht in die Messung eingehen. Bei der Methodenentwicklung konnte auf nicht veröffentlichte Ideen und Vorversuche von Contag (TFH Berlin) zur Oberflächenbestimmung kanzerogener Stäube zurückgegriffen werden.

Das Prinzip der entwickelten Methode ist die Adsorption von in Lösung befindlichen Nonadecansäuremolekülen an die zu bestimmende Oberfläche. Als Lösungsmittel wurde n-Hexadecan verwendet. Man kann davon ausgehen, dass eine monomolekulare Schicht der langkettigen Fettsäure auf der Stauboberfläche entsteht, da nach Bigelow et al. [85] unverzweigte, langkettige Fettsäuren mit n-Hexadecan als Lösungsmittel auf Glas- und Metalloberflächen in Form einer monomolekularen Schicht abgeschieden werden. Um das Adsorptionsverhalten zu überprüfen, wurde die Adsorptionsisotherme aufgenommen. Der Platzbedarf eines Fettsäuremoleküls in monomolekularer Schicht beträgt ca. 0,2nm2[86-89]. Die Länge der hydrophoben Kohlenstoffkette lässt sich nach Zocher et al. [90] berechnen und beträgt für Nonadecansäure etwa 2,5nm. Da die Fettsäure mit der funktionellen Carboxylgruppe an der Stauboberfläche adsorbiert, steht die Oberfläche von Poren mit einem Durchmesser kleiner als 2,5nm aufgrund der Länge der nach außen stehenden Kette nicht als Adsorptionsfläche zur Verfügung, d.h. diese Mikroporen werden bei der Oberflächenbestimmung nicht erfasst. Poren mit Durchmessern zwischen 2,5nm und 5nm stellen eine Fehlerquelle bei den Lipoproteinadsorptionsversuchen dar, da ihre Fläche zwar in die Oberflächenbestimmung eingeht, nicht aber für die Adsorption von Lipoproteinen zur Verfügung steht.

Die auf der Oberfläche adsorbierte Masse Nonadecansäure (NDS) wurde bestimmt, indem mittels Infrarotspektrometrie die Konzentrationsänderung der Lösung NDS in n-Hexadecan ermittelt wurde. Anhand von Eichsubstanzen, deren spezifische Oberflächen bekannt waren, wurde die Masse NDS ermittelt, die in monomolekularer Schicht pro Quadratmeter Oberfläche binden kann. Als Eichsubstanzen wurden Quarzsände verwendet unter der Annahme, dass Sände eine porenfreie Oberfläche besitzen. Diese Annahme bestätigte sich später durch die ermittelte Packungsdichte der NDS- Moleküle (vergleiche hierzu 3.1 Die Mineralstauboberflächen). Aus der Masse NDS, die in monomolekularer Schicht pro Quadratmeter Oberfläche binden kann, konnte die spezifische Oberfläche der untersuchten Mineralstäube bestimmt werden. Die so ermittelte Oberfläche unterscheidet sich von derjenigen, die mittels BET- Methode ermittelt würde (ABET) um die Fläche der Mikroporen mit Öffnungsdurchmesern <2,5nm und wird im folgenden mit ANDS bezeichnet. Die genaue Beschreibung der Methode findet sich unter 2.2.3 Durchführung.

2.2. Bestimmung der Mineralstauboberflächen

2.2.1. Material

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2.2.2. Geräte

2.2.3. Durchführung

Die Bestimmung der Oberflächen erfolgte bei Raumtemperatur (22 +/- 2°C). Zur Herstellung einer nahezu gesättigten Lösung von Nonadecansäure in n-Hexadecan wurden 150mg Nonadecansäure im Messkolben mit n-Hexadecan auf 100ml aufgefüllt und geschwenkt. Erleichtertes Lösen ließ sich durch Erwärmung im Wasserbad sowie mit Hilfe eines Magnetrührers erreichen. Von dieser Lösung (1,50mg/ml) wurden durch Mischen mit n-Hexadecan Lösungen folgender Konzentrationen hergestellt: 1,25mg/ml, 1,00mg/ml, 0,75mg/ml, 0,50mg/ml und 0,25mg/ml. Sie dienten zur Erstellung der Eichkurve am Infrarotspektrometer. Verwendet wurde eine NaCl- Küvette mit der Schichtdicke 0,1mm. Die Messung erfolgte bei 1714cm-1, was dem Absorptionsmaximum der C=O- Schwingung entspricht. Die Küvette wurde vor jeder Messung mit Petrolether gespült, anschließend mit einer Wasserstrahlpumpe getrocknet und mit der zu messenden Lösung dreimal durchgespült, um den Fehler durch Verunreinigung der Küvette zu minimieren. Die Extinktion wurde mit je zwei Messungen bestimmt. Bei deutlicher Abweichung der beiden Messwerte voneinander wurden noch eine dritte oder vierte Messung angeschlossen. Ursache für Abweichungen waren möglicherweise Verunreinigungen durch Partikel auf der Küvettenaußenseite. Die Werte für die Eichkurve wurden an jedem Messtag bestimmt, um die Vergleichbarkeit der Extinktionswerte an den einzelnen Messtagen zu überprüfen. Aus den erhaltenen Wertepaaren von Nonadecansäurekonzentration und Extinktionswert wurde eine Eichkurve erstellt und deren Steigung als Steigung der Regressionsgeraden durch alle ermittelten Werte mit Gleichung 1 bestimmt.

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Gleichung 1 zur Bestimmung der Steigung der Regressionsgeraden:

mit

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n: Anzahl der Wertepaare (x/y)

x: Konzentration Nonadecansäure in n-Hexadecan [mg/ml]

y: Messwert der Extinktion am Infrarotspektrometer

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b: Steigung der Eichkurve [ml/mg]

Ebenfalls durch Verdünnung mit n-Hexadecan wurden aus der Ausgangslösung (1,50mg/ml) Lösungen der folgenden Konzentrationen hergestellt: 1,20mg/ml, 0,90mg/ml, 0,60mg/ml, 0,30mg/ml. Mit diesen Lösungen wurde eine Adsorptionsisotherme aufgenommen, die den Verlauf der Adsorption von Nonadecansäure aus n-Hexadecan an eine Quarzsandoberfläche bei 22°C in Abhängigkeit von der Nonadecansäurekonzentration zeigt. Dazu wurden jeweils einem Quadratmeter eines Quarzsandes mit bekannter spezifischer Oberfläche (0,406m2/g) 10ml der verschiedenen Lösungen zugesetzt. Die erhaltenen Suspensionen wurden auf einer Schüttelmaschine für eine Stunde waagerecht liegend geschüttelt. Anschließend wurde der Staub 20 Minuten bei 1000g abzentrifugiert. Im Überstand lag nun eine Nonadecansäurekonzentration vor, die aufgrund der stattgefundenen Adsorption um einen bestimmten Wert unter der ursprünglichen Konzentration lag. Die Nonadecansäurekonzentration im Überstand wurde infrarotspektrometrisch bestimmt. Die Messung am Spektrometer erfolgte wie oben beschrieben. Die Differenz aus Ausgangskonzentration und Konzentration im Überstand ergab bei bekanntem verwendeten Volumen (10ml) nach Gleichung 2 die adsorbierte Masse Nonadecansäure pro Quadratmeter. Es wurden jeweils drei Messungen durchgeführt und der Mittelwert gebildet.

Gleichung 2 zur Berechnung der adsorbierten Masse Nonadecansäure pro Quadratmeter Oberfläche:

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mit

MAds: Adsorbierte Masse Nonadecansäure pro Quadratmeter Oberfläche [mg/m²]

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C0: Konzentration der zugegebenen Lösung[mg/ml]

V: zugegebenes Volumen der Lösung [ml]

E: Extinktionswert am Infrarotspektrometer nach Adsorption

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b: Steigung der Eichkurve [ml/mg]

AQ : spezifische Oberfläche Quarzsand [m²/mg]

mQ : Eingewogene Masse Quarzsand [mg]

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Die Masse Nonadecansäure, die aus der nahezu gesättigten Lösung pro Quadratmeter Quarzsandoberfläche adsorbierte, wurde außerdem für den oben verwendeten und einen weiteren Quarzsand mit der bekannten spezifischen Oberfläche von 0,299m2/g mit jeweils sieben Messungen in gleicher Weise bestimmt. Der Mittelwert diente als Referenz für die Bestimmung der spezifischen Oberflächen der einzelnen Mineralstäube.

Zur Bestimmung ihrer spezifischen Oberfläche wurde jeweils die Masse der einzelnen Mineralstäube abgewogen, die in etwa 0,4m2 entsprach. Die ungefähre Masse eines Quadratmeters war im Vorfeld der eigentlichen Messreihen durch Vorversuche mit verschiedenen Einwaagen ermittelt worden. Die Stäube wurden in Zentrifugengläsern mit je 5ml der nahezu gesättigten Lösung (1,50mg/ml) versetzt, verschlossen, kräftig per Hand geschüttelt und anschließend für eine Stunde waagerecht liegend auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Nach 20- minütiger Zentrifugation bei 1000g wurde die Nonadecansäurekonzentration im Überstand wie oben beschrieben mittels Infrarotspektrometrie bestimmt. Für jeden Mineralstaub wurden mindestens drei Messreihen aufgenommen.

Unter der Annahme, dass die Masse Nonadecansäure, die pro Quadratmeter Oberfläche bindet, für alle untersuchten Stäube den glei

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chen Wert hat (vergleiche hierzu 4.1 Methode der Oberflächenbestimmung mittels Nonadecansäureadsorption), konnte mit Gleichung 3 die spezifische Oberfläche aus den ermittelten Extinktionen errechnet werden.

Gleichung 3 zur Berechnung der spezifischen Oberfläche ANDS der verwendeten Mineralstäube:

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mit

ANDS: spezifische Oberfläche [m²/mg]

m: eingewogene Masse des Mineralstaubs [mg]

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C0: Konzentration der zugegebenen Lösung[mg/ml]

V: zugegebenes Volumen der Lösung [ml]

E: Extinktionswert am Infrarotspektrometer nach Adsorption

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b: Steigung der Eichkurve [ml/mg]

MAds: Masse Nonadecansäure, die pro Quadratmeter Oberfläche bindet [mg/m²]

2.3. Lipoproteinadsorption

2.3.1. Material

2.3.2. Geräte

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2.3.3. Durchführung

2.3.3.1. Adsorptionsisothermen mit bovinem Lipoproteinkonzentrat

Zunächst wurden für einen Teil der Mineralstäube die Adsorptionsisothermen bei einer Temperatur von 22°C aufgenommen. Dazu wurde das Lipoproteinkonzentrat mit physiologischer Kochsalzlösung auf Werte von 800mg Cholesterol pro Deziliter, 600mg/dl, 400mg/dl und 200mg/dl verdünnt. Jeweils 3ml der jeweiligen Lösung wurden zu 1m2 Mineralstaub in ein Reagenzglas gegeben und durch kräftiges Schütteln per Hand vermengt. Im Anschluss wurden die Gefäße eine Stunde lang waagerecht liegend auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Der Mineralstaub wurde dann durch 20- minütige Zentrifugation bei 1000g abgetrennt. Pro Mineralstaub und Cholesterolkonzentration wurden drei Messungen durchgeführt. Der klare Überstand wurde abpipettiert und zur Cholesterolbestimmung (siehe 2.3.3.5 Cholesterolbestimmung) bereit gestellt. Eine Differenzierung der Dichteklassen HDL und LDL wurde nicht vorgenommen.

2.3.3.2. Adsorption bei konstanter Konzentration aus bovinem Lipoproteinkonzentrat

Das Lipoproteinkonzentrat wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 200mg Cholesterol pro Deziliter verdünnt. Die Lösung wurde anschließend im Wasserbad auf 37°C erwärmt bzw. in einer weiteren Versuchsreihe bei einer Raumtemperatur von 22°C ohne Erwärmung, wie oben beschrieben (siehe 2.3.3.1 Adsorptionsisothermen mit bovinem Lipoproteinkonzentrat), den Stäuben zugesetzt. Das Verhältnis betrug ebenfalls 3ml Lipoproteinkonzentrat pro Quadratmeter Stauboberfläche. Das anschließende Schütteln erfolgte für die eine Versuchsreihe im 37°C warmen Wasserbad, ansonsten glich das weitere Vorgehen mit Zentrifugation und Cholesterolbestimmung dem oben für die Aufnahme der Isothermen beschriebenen Verfahren. Mit jedem Mineralstaub wurden drei Messungen durchgeführt. Eine Differenzierung der Dichteklassen HDL und LDL wurde nicht vorgenommen.

2.3.3.3. Adsorption bei konstanter Konzentration aus menschlichem Serum

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Alle Versuche wurden mit frisch entnommenem Blut eines 68-jährigen Mannes durchgeführt. Die Blutentnahmen erfolgten jeweils zu Beginn eines Messtages unter gleichbleibenden Bedingungen. Nach der Gewinnung des Serums durch 10- minütige Zentrifugation bei 1000g wurden die Cholesterolkonzentrationen im nativen Serum bestimmt (siehe 2.3.3.5 Cholesterolbestimmung). Das unverdünnte, auf 37°C erwärmte Serum wurde im Verhältnis von 3ml Serum zu 1m2 Mineralstaub den Stäuben zugesetzt. Im Weiteren wurde wie oben beschrieben verfahren (siehe 2.3.3.1 Adsorptionsisothermen mit bovinem Lipoproteinkonzentrat). Der Schüttelvorgang erfolgte im 37°C warmen Wasserbad. Auch die Adsorptionsversuche mit menschlichem Serum wurden für jeden Mineralstaub dreimal durchgeführt. Die HDL- und LDL- Adsorption wurden getrennt ermittelt.

2.3.3.4. Adsorption bei konstanter Konzentration aus menschlichem Serum in Gegenwart von Polyvinylpyridin-N-oxid (PVPNO)

Um die Wirkung des Polymers PVPNO auf das Adsorptionsverhalten von Lipoproteinen auf Quarzoberflächen zu untersuchen, wurde dem unverdünnten, 37°C warmen Serum pulverförmiges PVPNO im Verhältnis von 1g auf 100ml Serum unter ständigem Schwenken zugesetzt. Das Schwenken verhinderte ein Verklumpen des Polymers im Serum. Im Weiteren wurde wie oben verfahren (siehe 2.3.3.1 Adsorptionsisothermen mit bovinem Lipoproteinkonzentrat). In diese Versuchsreihe wurden nur die drei verschiedenen α- Quarze (Sigma, DQ12, F600) einbezogen, da für α- Quarz eine fibrosehemmende Wirkung von PVPNO gezeigt wurde [91]. Die HDL- und LDL- Adsorption wurden getrennt ermittelt.

2.3.3.5. Cholesterolbestimmung

Die Cholesterolbestimmung erfolgte in den durch Zentrifugation erhaltenen klaren Überständen der oben genannten Ansätze. Die Bestimmung erfolgte nach der CHOD-PAP-Methode. Mit Detergentien werden Cholesterol und Cholesterolester bei dieser Methode aus Lipoproteinen freigesetzt. Die Cholesterolester werden durch Cholesterolesterase hydrolysiert und das freie Cholesterol dann durch Cholesteroloxidase enzymatisch oxidiert. Das dabei entstehende H2O2 wird in einer Peroxidase- katalysierten Reaktion zu einem farbigen Chinonimin umgesetzt, dessen Konzentration photometrisch bestimmt werden kann.

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Zur Bestimmung der Gesamtcholesterolkonzentration wurden je 0,01ml Überstand abgenommen und zur Cholesterolbestimmung mit je 1ml Reaktionslösung in 10mm- Einmalküvetten gemischt. Nach zehnminütiger Reaktionszeit folgte die photometrische Messung bei 500nm gegen die reine Reaktionslösung. Als Standard fungierte eine von Merck vorgesehene Kalibratorlösung, mit einem bekannten Cholesterolgehalt von 225mg/dl. Von jeder Probe wurden mindestens zwei Extinktionen bestimmt und diese anschließend gemittelt.

Zur Bestimmung des HDL- Cholesterols wurden vom Überstand je 0,1ml abgenommen und in Eppendorfgefäßen mit je 0,25ml HDL- Fällungsreagenz versetzt. Das Fällungsreagenz fällt Lipoproteine aller Dichteklassen außer HDL. Die Gefäße wurden gut geschüttelt und nach 15 Minuten Fällzeit 20 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Vom klaren Überstand wurden 0,1 ml zur Cholesterolbestimmung mit je 1ml Reaktionslösung gemischt. Die photometrische Messung erfolgte wie oben beschrieben. Die Kalibratorlösung wurde im gleichen Verhältnis wie die zu untersuchenden Proben mit physiologischer NaCl- Lösung verdünnt (0,1ml zu 0,25ml).

Zur Bestimmung der LDL- Cholesterolkonzentration wurden je 0,04ml vom Überstand abgenommen und in Eppendorfgefäßen mit je 0,4ml LDL- Fällungsreagenz versetzt. Es wurde gut geschüttelt und nach 15 Minuten Fällzeit 20 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Vom klaren Überstand wurden 0,1 ml zur Cholesterolbestimmung mit je 1ml Reaktionslösung gemischt. Die photometrische Messung erfolgte wie oben beschrieben. Die Kalibratorlösung wurde im gleichen Verhältnis wie die zu untersuchenden Proben mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt (0,04ml zu 0,4ml). Das LDL- Fällungsreagenz fällt nur LDL. Daraus ergab sich, dass die LDL- Konzentration aus der Differenz der nach der Fällung verbliebenen Cholesterolkonzentration und der Gesamtcholesterolkonzentration errechnet werden musste.

2.4. Statistische Methoden

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Aufgrund der kleinen Fallzahlen und der schiefen Verteilung der Merkmale erfolgte die statistische Auswertung der Versuchsergebnisse mit nichtparametrischen Tests. Demnach kam beim Vergleich unabhängiger Stichproben der Mann- Whitney- U- Test für nichtparametrische, unverbundene Stichproben zur Anwendung, abhängige Stichproben wurden mit dem Wilcoxon- Test für nichtparametrische, verbundene Stichproben überprüft. Verwendet wurde das Software- Programm SPSS.


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20.10.2005