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1  Einleitung

1.1 Epidemiologie des Prostatakarzinoms

Das Prostatakarzinom ist der häufigste maligne Tumor des Mannes. Er ist ein Tumor des "alten Mannes" und wurde von P.Boyle als "epidemic of unknown origin" bezeichnet. Das heisst, dass das PCa eine Erkrankung mit epidemischem Ausmass ist, Ätiologie und Pathogenese aber weitgehend unbekannt sind [1]. Für Deutschland wird die Zahl der am PCa erkrankenden Männer auf 31600 jährlich geschätzt [2]. In den USA werden 230110 Neuerkrankungen und eine Mortalität durch das PCa von 29900 in 2004 erwartet [3]. Die Therapie des PCa richtet sich nach dem Tumorstadium und der individuellen Situation des Patienten. Beim lokalen Prostatakarzinom ohne Metastasen sind die radikale Prostatektomie bzw. die Strahlentherapie die Methoden der Wahl. In fortgeschrittenen Tumorstadien stellt die Testosteronblockade eine etablierte, aber begrenzte Therapie zur Hemmung der Tumorprogression dar. Die Hormontherapie ist eine nichtkurative Behandlung und die Patienten versterben an der fortschreitenden Tumorerkrankung im hormonrefraktären Stadium. Dieser Umstand erklärt das Interesse zur Erforschung neuer und zusätzlicher Therapiemöglichkeiten des fortgeschrittenen PCa. Eine dieser neuen Therapiemöglichkeiten könnte der Einsatz von synthetischen Inhibitoren der Matrixmetalloproteinasen (MMPI) bei Patienten mit fortgeschrittenem PCa sein.

1.2 Prostatakarzinom

1.2.1 Diagnostik des Prostatakarzinoms

Der Verdacht auf das Vorliegen eines PCa kann prinzipiell durch die DRU, durch die Bestimmung des PSA im Serum und durch den TRUS erhoben werden. Bis in die 80er Jahre war die DRU das einzige traditionelle und akzeptierte Verfahren zur Früherkennung des PCa. Die Entdeckung und Einführung des [Seite 2↓]prostataspezifischen Antigen (PSA) im Jahr 1986 hat die Inzidenz, die Stadienentwicklung bei Erstdiagnose und auch die Mortalität nachhaltig verändert. Aufgrund der eingeschränkten Detektionsfähigkeit des TRUS wird die DRU und das PSA als Früherkennungsverfahren ab dem 50. Lebensjahr empfohlen. Bis zu 86% der neu diagnostizierten Fälle werden bereits im lokalen oder regionalen Stadium diagnostiziert. Die PSA-Bestimmung hat an dieser Entwicklung einen großen Anteil [3,4]. Besteht der Verdacht auf ein PCa, wird eine Biopsie durchgeführt. Zum Ausschluss oder Nachweis von Lymphknotenmetastasen wird die offene oder laparoskopische Lymphadenektomie durchgeführt. In der Diagnostik der Knochenmetastasen kommt die 99m Technetium-Diphosphonat-Knochenszintigraphie zum Einsatz [5]. Bei unklaren Ergebnissen der Knochenszintigraphie werden Röntgenzielaufnahmen und CT- bzw. MRT- Aufnahmen ergänzend eingesetzt. Durch die Vorsorgeuntersuchungen kann ein großer Teil der PCa in einem frühen Stadium erkannt und die Patienten einer potentiell kurativen Therapie zugeführt werden. Die Sterblichkeit dieser Tumorentität ist in den USA seit dem Jahr 1994 um 4,0 % gesunken. Gleichzeitig ist die Gesamtmortalität der Männer in den USA seit 1992 um ca. 1,5 % jährlich gesunken. Der Effekt wird dem PSA zugeschrieben [3].

1.2.2 Therapieprinzipien

Die Therapie des PCa wird in erster Linie durch das Tumorstadium bestimmt. Der Ausschluß einer Metastasierung ist Voraussetzung für die lokale, potentiell kurative Therapie. Bei einer allgemeinen Lebenserwartung dieser Patienten von mindestens 10 Jahren und organbegrenztem PCa sowie unter Berücksichtigung der gesamten Komorbidität sind lokale Therapieverfahren indiziert. Hierzu gehören die radikale Prostatektomie und die Strahlentherapie. Patienten mit einem metastasierten PCa bzw. Patienten mit einem systemischen Progreß nach lokaler Therapie werden mit einer antiandrogenen Hormontherapie behandelt. Die kontrasexuelle, antiandrogene Hormontherapie hemmt das Tumorwachstum. Für [Seite 3↓]die Therapie des progredienten Tumors unter antiandrogener Therapie gibt es nur eingeschränkte Therapieoptionen.

1.2.3 Therapie des lokalen Prostatakarzinoms

Durch das PSA ist die Früherkennung des PCa nachhaltig verändert worden. Die Mehrzahl der PCa sind seit der Einführung des PSA bei Erstdiagnose lokal begrenzt [6]. Hieraus resultiert die Möglichkeit einer kurativen Therapie. Dies sind die radikale Prostatektomie bzw. Strahlentherapie [7]. Vor einer operativen bzw. Strahlentherapie erfolgt in den meisten Fällen die pelvine Lymphadenektomie zum Ausschluß von Lymphknotenmetastasen. Die radikale Prostatektomie kann über einen perinealen oder retropubischen bzw. laparoskopischen Zugang erfolgen. Bei gut differenzierten Tumoren mit einer geringen Progressionswahrscheinlichkeit kann die Verlaufsbeobachtung in bestimmten Fällen als Alternative angesehen werden [8]. Für das lokale, organbegrenzte PCa ohne Kapselinfiltration (pT2) liegen die progressionsfreien 10-Jahres-Überlebensraten nach radikaler Prostatektomie zwischen 80 und 90 % [9]. Alternativ und insbesondere bei Vorliegen von Risikofaktoren kommt die konformale Strahlentherapie mit dreidimensionaler Bestrahlungsplanung zum Einsatz. Beim lokal fortgeschrittenen PCa wird sowohl die radikale Prostatektomie als auch die Strahlentherapie eingesetzt [10]. Liegt ein kapselinfiltrierendes Karzinom (pT3) vor, so sinkt die 10-Jahres-Überlebensrate auf 37-56 %. Gleichzeitig zeigen sich 30-50 % der klinisch als lokal begrenzt diagnostizierten Tumore (pT2) nach Begutachtung des Operationspräparates als lokal fortgeschrittene Tumore (pT3) [11]. Die Patienten mit einem Progreß nach radikaler Prostatektomie oder Strahlentherapie werden mit einer Hormontherapie behandelt. Auch hier könnten MMPI in Zukunft von Nutzen sein.


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1.2.4  Therapie des metastasierten Prostatakarzinoms

Grundsätzlich gilt das metastasierte PCa bis heute als nicht heilbar. Die Tumorprogression und vor allem deren Symptome können jedoch für einen längeren Zeitraum durch eine hormonelle Therapie beeinflußt werden. Die Stimulation des Tumorwachstums durch Androgene kann durch eine Androgendeprivation gehemmt werden. Diese Androgendeprivation kann prinzipiell durch Androgenentzug und/oder Androgenblockade erreicht werden. Zum Androgenentzug gehört die chirurgische (bilaterale Orchiektomie) und die medikamentöse Kastration. Die therapeutischen Ergebnisse der chirurgischen und medikamentösen Kastration sind vergleichbar.

Bei der medikamentösen Kastration wird die Androgenblockierung durch steroidale und nichtsteroidale Antiandrogene erreicht. Die Therapie bei androgensensiblem PCa zielt auf die komplette Hemmung der Androgensynthese und Blockade der Androgenwirkung. Die Hemmung der Androgensynthese (Androgenentzug) erfolgt durch LH-RH-Analoga sowie natürliche und synthetische Östrogene (medikamentöse Kastration). Die Ausschaltung der testikulären Androgenproduktion durch die bilaterale subkaspuläre Entfernung der Hoden war die erste Form der Hormontherapie. Aufgrund der nachvollziehbaren Störung der körperlichen Integrität wird die medikamentöse Kastration häufiger vorgezogen. Durch die Gabe von LH-RH-Analoga wird der Testosteronspiegel innerhalb weniger Tage in den Kastrationsbereich gesenkt. Durch den therapiebedingten initialen Testosteronanstiegs, müssen in den ersten Tagen nach Beginn mit LH-RH-Analoga zusätzlich Antiandrogene gegeben werden.

Die Antiandrogene unterdrücken die androgenbedingte Proliferationsstimulation der Prostataepithelzellen und konkurrieren mit Androgenen um die Bindung an die Rezeptoren. Man unterscheidet spezifische und unspezifische Antiandrogene. Sie werden als Monotherapie, aber häufiger in Kombinationstherapien eingesetzt. Von den Patienten mit metastasiertem PCa entwickeln 80% einen [Seite 5↓]androgenunabhängigen und damit therapierefraktären Tumor. Diese Tumoren zeigen nach unterschiedlich langen Zeiträumen dann ein Androgen-unabhängiges Wachstum.

1.2.5 Therapie des hormonrefraktären Prostatakarzinoms

Kommt es trotz einer antiandrogenen Hormonbehandlung zur Progression der Erkrankung, spricht man von einem hormonrefraktären PCa. Bei diesen Patienten findet man innerhalb von 1,5-3 Jahren Knochenmetastasen [12].

Das PCa kann aus hormonabhängigen und hormonunabhängigen Zellklonen bestehen. Unter der Hormontherapie entwickelt sich wahrscheinlich die Fraktion der hormonunabhängigen Zellklone stärker oder es kommt zu einer Mutation und Alteration des Androgenrezeptors an den hormonabhängigen Zellklonen. Hieraus folgen als therapeutische Optionen ein Absetzen der Hormontherapie und Beginn einer sogenannten "second line" Therapie. Als "second line" Therapie werden häufig das Estramustinphosphat und Fosfesterol eingesetzt. Die Wirksamkeit ist bei niedrigen objektiven Ansprechraten relativ gering. Im Vordergrund steht die Erhaltung bzw. Verbesserung der Lebensqualität. Es besteht auch hier kein kurativer Ansatz. Die Chemotherapie hat bis heute aufgrund der geringen Ansprechrate und oft schwierigen Krankheitskonstellation aus Alter, Allgemeinzustand und Tumorbiologie trotz verbesserter perichemotherapeutischer Konzepte zu keiner wesentlichen Verbesserung der Therapie des PCa geführt. Neue Substanzen, z.B. Taxoform werden in klinischen Studien evaluiert. 85-100 % der Patienten, die am PCa sterben, haben Knochenmetastasen [13]. Aus dieser bis heute unbefriedigenden therapeutischen Situation des fortgeschrittenen PCa erklärt sich die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Therapiestrategien.


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1.3  Matrix - Metalloproteinasen (MMP)

1.3.1 Systematik und Funktion

Proteinasen sind seit über hundert Jahren Gegenstand wissenschaftlicher Forschung. Das bekannteste Beispiel hierfür ist das von W. Kühne 1886 entdeckte Trypsin. 1962 publizierten J. Gross et al. ein Experiment, dass heute als Beginn der Metalloproteinasenforschung gilt. Ein frisches Querschnittssegment einer Kaulquappe auf einem Kollagen-Gel löste das Kollagen an dieser Stelle auf (siehe Bild im Anhang). Damit war die Spur zu den Kollagenasen gelegt. Gegenwärtig sind 21 MMP bekannt, sechs davon als membrangebundene Formen (MT-MMP). Die MMP sind als MMP-1 bis MMP-28 numeriert [14,15]. Nach der Nomenklatur der IUBMB sind die MMP unter der Enzymklassifikation (E.C.) Nr. 3.4.24.ff. zusammengefaßt. Nach taxonomischen Gesichtspunkten gehören sie zur Familie M10 A der interstitiellen Kollagenasen (Merops ID:M10.001, Clan MA) [16]. In der Subgruppe der Metalloproteinasen gehören sie zur Superfamilie der Metzincins, deren Konsensussequenz HEXXHXXGXXH (H=Histidine, E=Glutamin, X=beliebige Aminosäure, G=Glycin) ist. Die Verwendung der Begriffe Metalloendopeptidasen, -proteinasen und -proteasen ist weitgehend willkürlich. Gemeint ist mit diesen Begriffen die Fähigkeit, makromolekulare Substanzen zu hydrolysieren. Da diese Begriffe nach A.J. Kenny dasselbe bedeuten, wird im weiteren nur noch von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) gesprochen [17].

Zu den Charakteristika, die allen Karzinomen gemeinsam sind, gehören der veränderte Zellzyklus und die gestörte Interaktion der Zellen mit der Extrazellulären Matrix (EZM). Diese Interaktion wird wesentlich von den MMP beeinflußt. MMP sind für den Auf-, Um- und Abbau der EZM mitverantwortlich. Substrate der Enzyme reichen von fibrillären Kollagenen der Knochen, der Haut und des interstitiellen Bindegewebes, zu den nicht-fibrillären Kollagenen, Laminin und Fibronektin, die Bestandteile von Basalmembranen sind. Zu den Substraten der MMP gehören auch Nicht-Matrixproteine wie Transportproteine und [Seite 7↓]Wachstumsfaktoren. Über die proteolytische Spaltung von Rezeptoren können sie biologische Signalketten beeinflussen. Zum physiologischen Spektrum der biologischen Funktionen gehören parakrine Wirkungen und durch Proteolyse entstehende bioaktive Spaltprodukte, die Vermittlung der Apoptose, Zellproliferation und Angiogenese. Zu den biologischen Funktionen gehört in pathologischer Hinsicht auch die Modulation der Tumorprogression.

Physiologische Beispiele für die MMP-Eigenschaften sind die Einnistung des embryonalen Throphoblasten in das mütterliche Endometrium, die Wundheilung und die funktionelle, bzw. altersbedingte Involution von Organen [18]. An der Einnistung des Trophoblasten ist ein komplexes und redundantes System aus Enzymen beteiligt. Die genetische Defizienz einzelner Enzyme führt daher selten zu einer fehlenden Implantation. Fehlt allerdings die für die Trophoblasteninvasion wichtige Gelatinase B (MMP-9), so kommt es nicht zur Implantation. Vorraussetzungen für die Wundheilung sind die Migrationsfähigkeit der Keratinozyten und die Kontraktion der Wundränder. Die Migration der Keratinozyten ist u.a. von MMP-1 und die Kontraktion der Wundränder von MMP-3 abhängig. Eine genetische Defizienz dieser Gene oder ihre Inhibition führt zu einer verzögerten und gestörten Wundheilung [19,20].

Beispiele für funktionelle Eigenschaften von MMP im Zusammenhang mit pathologischen Veränderungen sind die Metastasierung bzw. Invasivität von Tumoren und entzündliche Erkrankungen, wie Arthritis oder Sepsis. TNF-α bewirkt bei systemischer Freisetzung katastrophale Folgen bei Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis oder septischen Zuständen in Folge bakterieller Infektionen. Mindestens sieben der derzeit bekannten MMP sind in der Lage, das Proenzym des TNF-α in die aktive Form zu überführen. Eine Blockade der MMP mit unspezifischen synthetischen Inhibitoren kann septische Zustände im Tiermodell verhindern [21,22]. MMP werden sowohl von Tumorzellen als auch von Zellen des umgebenden Stroma produziert. So führt die ektope Produktion von MMP-3 zur verstärkten Invasivität von Brustkrebszellen in das umliegende Gewebe und [Seite 8↓]experimentelle Überexpression verschiedener Metalloproteinasen führt zu verstärkter Invasivität und Metastasierung von Tumorzellinien [23-26].

1.3.2 Biochemie, Physiologie und Regulation der MMP

Die MMP sind eine Familie sezernierter und membrangebundener, kalzium- und zinkabhängiger Endoproteinasen, d.h. sie katalysieren nicht Prozesse am N- oder C-terminalen Ende von Proteinen (Exoproteinasen), sondern im helikalen Abschnitt einer Proteinstruktur. Die MMP sind in der in der Lage, die EZM, die u.a. aus Kollagenen, Lamininen, Proteoglycanen und Fibronectin besteht, aufzulösen. Die EZM wird im wesentlichen von Enzymen wie MMP, Plasmin, Thrombin, Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) umgebaut [27]. Jedes Mitglied der MMP-Familie hat spezifische Wirkungen auf bestimmte Komponenten der extrazellulären Matrix. Die MMP–Familie schließt die einzigen bekannten Enzyme ein, die in der Lage sind fibrilläres Kollagen aufzulösen. Die fibrillären Kollagene Typ I, II, III, V und XI konstituieren die Hauptbestandteile der EZM. Zu den Nicht-Matrixsubstraten der MMP gehören Wachstumsfaktoren wie das IGFBP-3, die Proformen des "transforming growth factor-β" (Pro-TGF-β), des Interleukin 1-β (Pro-IL 1-β), des TNF-α (Pro-TNF-α), des Interleukin-2α Rezeptors (Pro-IL-2Rα) und Plasminogen. Grundsätzlich bestehen die MMPs aus:

  1. einem N-terminalen Präpeptid oder Signalsequenz
  2. einem Propeptid
  3. einer katalytischen Domäne mit Konsensussequenz und Zinkmotiv
  4. einer C-terminalen Domäne, die an der Substratidentifizierung beteiligt ist.


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Mehrere strukturelle Eigenschaften unterscheiden die MMP von anderen Metalloproteinasen. Die MMPs enthalten zwei Zinkatome und mehrere Kalziumatome. Eines der Zinkatome und die Kalziumatome sind integrale Bestandteile der Faltblattstruktur der MMP. Das zweite Zinkatom stellt das katalytische Zentrum dar. Ausserdem enthalten alle MMP eine charakteristische „Methionin–Schleife“ und den sog. „Cystein-switch". Die MMP sind wie alle Enzyme in ihrer Funktion abhängig vom pH–Wert in der Reaktionsumgebung. Die pH–Abhängigkeit der MMP–Katalyse wird durch eine breite glockenförmige Kurve von pH 4,5–9,5 beschrieben. Diese pH–Abhängigkeit ist für synthetische Inhibitoren vom Typ der Hydroxamsäureinhibitoren zu beachten [28].

Die Aktivität der MMP ist aufgrund ihres starken proteolytischen Potentials streng reguliert. Außer der Kontrolle der Genexpression und posttranskriptionellen Phase durch Wachstumsfaktoren und Hormone werden die MMP in Form latenter Proenzyme an der Zelloberfläche sezerniert. Die MMP können aber auch intrazellulär aktiviert und dort proteolytisch wirksam werden. Propeptide koordinieren die Zinkatome in der Zymogenform und konservieren die Enzyme so im präaktiven Zustand [29]. Erst nach Modifizierung oder Entfernung der aminoterminalen Domäne (Propeptid) und Dissoziation einer definierten Aminosäure (Cystein 73) vom katalytischen Zinkatom (sog. "Cystein-switch"), entwickeln sie enzymatische Aktivität [30]. Wie bei der Thrombolyse oder im Gerinnungssystem wird auch der Kollagenabbau, bzw. das System der MMP-Aktivierung, kaskadenförmig reguliert. Dies erfolgt unter Einbeziehung von freien und membranständigen Proteasen der gleichen und anderer Enzymfamilien [31,32]. Das Propeptid kann im Experiment durch proteolytische Enzyme, quecksilberhaltige Agentien oder Hitze entfernt werden. Insbesondere im aktivierten Zustand, aber auch bei der Aktivierung selbst, wird die MMP-Aktivierungskaskade von spezifischen (TIMP) und unspezifischen Inhibitoren auf enzymatischem Weg sowie durch Wiederaufnahme in die Zelle kontrolliert (MMP-Clearance).


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1.3.3  Physiologische Inhibitoren der MMP

Zur Inhibitionskaskade der proteolytisch wirkenden MMP gehört ein System spezifischer und unspezifischer physiologischer Inhibitoren. Zu den unspezifischen Inhibitoren der MMP gehören der α1-Proteinase Inhibitor und das
α2–Makroglobulin. Sie machen mehr als 95 % der Antikollagenaseaktivität im Plasma aus [33]. Weitere unspezifische Inhibitoren der MMP sind u.a. Thrombospondin-1 und Thrombospondin-2.

Zu den spezifischen Inhibitoren gehören die "Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases". Die wesentliche physiologische Funktion der TIMP liegt wahrscheinlich in der Limitierung der proteolytischen Wirkung der MMP, wie sie bei der Involution, der embryonalen Implantation und der Wundheilung vorgefunden wird. Diese Fähigkeit ist auch eine der zentralen Eigenschaften der TIMP bei der Tumorinvasion, der Metastasierung und der Angiogenese [34]. Es gilt als gesichert, dass die Veränderung im stöchiometrischen Verhältnis inhibitorischer, antiproteolytischer TIMP und proteolytischer MMP eine entscheidende Rolle für das invasiven Verhalten eines Tumors spielt [35,36,37]. TIMP bilden einen festen, aber reversiblen 1:1-Komplex mit MMP. Bis heute sind sechs Proteine dieser Familie bekannt (TIMP 1-6). Die biologische Rolle der TIMP ist nicht abschließend geklärt und ihre Bezeichnung möglicherweise irreführend. TIMP zeigten in verschiedenen Experimenten neben ihrer antiproteolytischen Wirkung auch proliferationsfördernde und signaltransduzierende Eigenschaften [38]. So wurde TIMP-1 initial als ein Protein gefunden, daß die Erythropoese stimuliert [37,39]. Stimulierende Eigenschaften der TIMP können mit dem Konzept der Enzymhemmung kollidieren. Dies ist von Bedeutung, da die Versuche mit synthetischen Enzyminhibitoren auf dem Konzept der pharmakologischen Enzymhemmung aufbauen. Dieses Konzept stützt sich auf Experimente, die zeigen, dass sowohl Überexpression von TIMP als auch deren pharmakologische Applikation die experimentelle Metastasierung vermindert [40].


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Das einfache Konzept der proteolytisch bedingten Invasivität von Tumorzellen stützte sich Anfang der 90er Jahre auf den vermehrten Nachweis von MMP in humanen Tumoren. Als weitere Bestätigung dieser Vorstellung gilt die verstärkte Invasivität bei experimenteller Überexpression von MMP in Zellinien und das verminderte Tumorwachstum bei "MMP-knockout" Tieren [41]. Auf gleiche Weise konnte man bei "TIMP-knockout" Tieren ein vermehrtes Tumorwachstum, eine stärkere maligne Transformation von Tumoren und eine ausgeprägte Invasivität zeigen. Korrespondierend hierzu zeigten Tiere, in denen TIMP experimentell überexprimiert wurden, ein vermindertes Tumorwachstum, eine geringere maligne Transformation und weniger Invasivität der Tumoren [42,43]. Dabei scheinen TIMP weniger Einfluß auf Metastasierung und Invasivität zu haben, als vielmehr auf das Tumorwachstum [44]. Die beobachtete physiologische, inhibitorische Wirkung der TIMP legte einen therapeutischen Einsatz nahe. Aufgrund ihres hohen Molekulargewichtes von 20-30 KDa und ihrer kurzen biologischen Halbwertszeit eignen sich die physiologischen TIMP nicht für eine pharmakologische Therapie [45].

1.4 Befunde zur veränderten Expression und Aktivität der MMP und deren spezifische Inhibitoren

1.4.1 Zelle

Maligne Zellen können die Basalmembran durchbrechen und sich invasiv in andere Gewebe ausbreiten. Die MMP haben bei der Auflösung der Basalmembran eine entscheidende Bedeutung. Viele Tumorgewebe aus Tiermodellen zeigen sowohl in vitro als auch in vivo eine erhöhte Expression von MMP, die mit dem metastatischen Potential in diesen Modellen korreliert [46-50]. Darüber hinaus beeinflussen die MMP die Zellproliferation, Apoptose und den Abbau der Knochenmatrix [51,52]. Ausserdem haben sie transformierende Eigenschaften bei der Entwicklung von nicht-invasiven zu invasiven Zellformen [24,53]. Bei [Seite 12↓]Untersuchungen an Zellen muß berücksichtigt werden, daß die Aktivität der MMP eine Folge der Wechselwirkungen zwischen Gewebe und Zellen ist [54]. TIMP sind in der Lage, die Auflösung von Zell-Zell-Kontakten durch MMP zu blockieren [24]. Darüberhinaus kontrollieren TIMP die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und verhindern die autokrine Stimulierung der Zellvermehrung durch MMP [55,56].

1.4.2 Gewebeverband

Bei der immunhistologischen und biochemischen Untersuchung von Tumorgeweben konnte ein Zusammenhang zwischen Expression und Aktivität der MMP und der Tumorprogression, dem Malignitätsgrad und dem Krankheitsstadium beim Menschen gezeigt werden [43,57-63]. Artifizielle Versuchsanordnungen demonstrierten Mechanismen der Tumoretablierung und Progression durch MMP. Zu diesen Versuchen zählen die Neovaskularisations- und Invasionsversuche. Durch genetische Überexpression, genetische Ausschaltung ("knock-out") oder gezielte Hemmung von MMP kann die Penetration von Tumorzellen in künstliche Gewebe erreicht oder verhindert werden. Mit derartigen Experimenten demonstrierten z.B. Hiraoka et al. (1998), dass MMP die Neovaskularisation in Geweben steuern können [47,64,65]. Bei der Anwendung unterschiedlicher Nachweistechniken, wie Immunhistochemie und in situ-Hybridisierung kam es jedoch wiederholt zu widersprüchlichen Ergebnissen. Ein Hauptgegenstand der Interpretationen war, dass die MMP nicht von den Tumorepithelien exprimiert würden, sondern von den umgebenden Zellen des Stroma. Die Wechselwirkung zwischen der Expression von MMP durch Stroma- und Epithelzellen wurde insbesondere auch bei Hautwunden untersucht. Die Wundheilung ist bei veränderter MMP und TIMP Expression gestört. In Analogie hierzu gilt für Malignome eine gestörte Interaktion von Stroma- und Tumorzellen durch MMP im Sinne des "Tumors als einer Wunde die nicht heilt" als wahrscheinlich [66]. Weitere Untersuchungen zeigten, daß bei der Auflösung von Geweben zahlreiche Botenstoffe, Enzyme und Mediatoren im Sinne einer [Seite 13↓]"Speicherentleerung" freigesetzt werden. So kommt es bei der Auflösung von Gewebeverbänden, an der die MMP maßgeblich beteiligt sind, zu einer Vielfalt weiterer biochemischer Prozesse. Dies macht die Einschätzung der Abhängigkeit und Funktion der MMP schwierig. In Tumorgewebe sind MMP unterschiedlich überexprimiert. Ausserdem können Tumore der gleichen Entität unterschiedlich aggressiv wachsen. Dies legt nahe, daß jeder Tumor ein eigenes Profil von überexprimierten MMP haben könnte [67].

1.4.3 Tiermodelle

Im Tierversuch wurden die MMP in prinzipiell zwei unterschiedlichen Modellen untersucht. Diese sind die direkten Tumormodelle durch chemische Induktion, Implantation von Tumorgewebe oder Injektion maligner Zellen und die indirekten Tumorinduktionsmodelle durch gezielte genetische Veränderungen der DNA. In beiden Modellformen konnte in unterschiedlichsten etablierten Tumormodellen die Beteiligung der MMP an der Tumorentstehung und Tumorprogression gezeigt werden. Beim PCa wurde dies auch am Dunning-Tumor nachgewiesen [68-71]. In diesem Modell wurde auch der Zusammenhang zwischen MMP und Knochenmetastasierung demonstriert [72]. Tiermodelle mit gezielter Gendefizienz der MMP-Gene zeigen eine geringere Tumorprogression und Metastasierungsrate. Modelle mit zusätzlicher Aktivierung von MMP-Genen zeigen eine verstärkte Invasivität und Tumorausbreitung. An diesen Tiermodellen läßt sich auch die Tumorentstehung untersuchen [24,41,73,74].

Bei einer Variante der indirekten Tumorinduktion werden den Versuchstieren genetisch veränderte Tumorzellen appliziert. Auch in diesen Experimenten konnte eine Korrelation zwischen MMP und Tumorentwicklung gezeigt werden. So führen Tumorzellen nach Induktion einer MMP-2 Überexprimierung zu einem aggressiveren Tumorverhalten bei Implantation in das Tiermodell, als die etablierte Mutterzellinie. Synthetische MMP-Inhibitoren konnten diese [Seite 14↓]Tumorausbreitung reduzieren [75].

1.4.4 Mensch

Im Gewebe von menschlichen Tumoren wurden erhöhte Konzentrationen und Aktivitäten von MMP gefunden. Die Expression der MMP ist in malignen Geweben höher, als bei prämalignen oder benignen Gewebealterationen [76]. Zahlreiche Studien haben eine Korrelation zwischen MMP-Expression und dem Differenzierungsverlust, einem fortgeschrittenen histologischen grading und klinischen staging [77], Tumorgröße und Invasionsgrad, Lymphknoten- und Fernmetastasen gezeigt [60]. Hier ist der Befund von Hashimoto et al. (1998) bei PCa Patienten hervorzuheben, die bereits eine Hormontherapie erhalten hatten. Bei diesen Patienten wurde eine Erhöhung der Konzentration von MMP-7 im Tumorgewebe nachgewiesen [43]. Untersuchungen zur Beziehung zwischen MMP und dem Überleben oder zwischen MMP und der Wahrscheinlichkeit eines Tumorrezidivs zeigen signifikante Zusammenhänge. In manchen Fällen repräsentieren die MMP unabhängige Prognosefaktoren für das erkrankungsfreie Überleben bzw. das Gesamtüberleben [78]. Die nachgewiesene vermehrte Aktivität der MMP in menschlichem Tumorgewebe unterstützt die Entwicklung pharmakologischer Konzepte zu deren Hemmung. Hier stehen die spezifischen synthetischen Proteasehemmer an erster Stelle.


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1.5  Befunde über den Einsatz von synthetischen Inhibitoren der MMP

1.5.1 Synthetische Inhibitoren im Tiermodell

Eine frühe Untersuchung zeigte 1988 die Blockierung der Metastasierung im Tiermodell durch den Kollagenaseinhibitor SC44463 (GD Searle), wie Batimastat vom Typ der Hydroxamsäure-Inhibitoren [79]. Seitdem wurden die hemmenden Eigenschaften verschiedenster MMPI auf die Tumorprogression in zahlreichen Tumormodellen beobachtet. In Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Gabe, Dosis und Art des synthetischen MMPI wurden unterschiedliche Ergebnisse im Tiermodell erzielt. Diese reichen von signifikanter Beeinflussung der Tumorprogression bis zur kompletten Wachstumshemmung des Primärtumors. MMPI verminderten die lokale und regionale Tumorinvasion sowie die Metastasenbildung in spezifischen Tiermodellen. In einer Studie wurde eine komplette Reduktion von malignem Aszites und die Tumorabkapselung beobachtet [80]. In einigen Fällen konnte eine Überlegenheit gegenüber Standardchemotherapeutika oder Potenzierung von deren Wirkung gezeigt werden. MMPI verhinderten das Wiederauftreten des Tumors und verlängerten das Gesamtüberleben der Tiere [68,80-88].

1.5.2 Synthetische MMPI in klinischen Studien

Die ersten klinischen Studien mit MMPI wurden Anfang der 90er Jahre bei Patienten mit malignem Aszites und Pleuraergüssen durchgeführt [89,90]. Seither sind im wesentlichen sieben MMPI von ca. 150 patentierten MMPI in klinischen Studien wiederholt und in verschiedenen Phasen getestet worden. Zu diesen MMPI gehören die synthetischen, peptid-imitierenden Substanzen, wie Batimastat (BB-94) und Marimastat (BB-2516) von British Biotech. Weiterhin die synthetischen "Nicht-Peptid"-MMPI wie Tanomastat (BAY 12-9566) von Bayer, Prinomastat (AG 3340) von Agouron und CGS 270023A von Novartis. Eine dritte pharmakologische Kategorie sind biologische MMPI wie Neovastat (AE941) aus [Seite 16↓]Knorpel von Haien von der Firma Aeterna. Unter den klinisch getesteten MMPI finden sich als vierte Kategorie modifizierte Tetrazykline wie Metastat (COL-3) von CollaGenex. Bisphosphonate, die bereits in der klinischen Anwendung sind, zeigen experimentell eine Hemmung von MMP und können als fünfte Kategorie von MMPI interpretiert werden [91]. Bis heute erhielt keiner dieser synthetischen MMPI eine offizielle Zulassung. Einige Studien mussten aufgrund von muskuloskeletalen Nebenwirkungen abgebrochen werden [92]. Bei Nebenwirkungen und ungenügender Wirksamkeit, scheint auch die Art des synthetischen Inhibitors, die jeweilige Tumorentität und der Zeitpunkt des Einsatzes eine entscheidende Rolle zu spielen. So zeigten sich phototoxische Nebenwirkungen bei MMPI auf Tetrazyklinbasis. In einer Untersuchung mit BAY 12-9566 wurde das Tumorwachstum beim Nichtkleinzelligen Lungekarzinom eher begünstigt [93]. Wichtige Erkenntnisse aus diesen Studien waren, daß nicht alle Ergebnisse aus den Tierversuchen übertragbar sind und die Wirkung der MMPI bei fortgeschrittenen Tumoren und nach multiplen vorhergehenden Therapien eingeschränkt ist. Zudem sind MMPI sehr schnell in die klinische Forschung eingeführt worden [94]. In zukünftigen Studien ist der Einsatz neuer und zunehmend selektiver MMPI sowie deren Kombination mit anderen Medikamenten bei Patienten in früheren Tumorstadien zu erwarten [95,96,97].

1.6 Batimastat

1.6.1 Funktion und Biochemie

Die MMP erkennen eine definierte Schnittstelle an ihren Substraten nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip. Das Batimastat als unspezifischer synthetischer Inhibitor immitiert diese Schnittstelle und führt zu einer reversiblen, kompetitiven Hemmung der MMP. Batimastat ist ein synthetischer Inhibitor vom Typ der Hydroxamsäureinhibitoren, der eine Vielzahl von MMP inhibiert. Die Grundstruktur des Pseudopeptids Batimastat beruht auf der Hydroxamsäure, deren [Seite 17↓]Grundbaustein N-Hydroxyl-Aminosäure ist. Batimastat inhibiert die MMP im nanomolaren Bereich, gleichzeitig hat es eine geringe Wirkung auf verwandte Enzymfamilien, wie der des "angiotensin converting enzymes". Aufgrund der hochkonservierten DNA-Sequenz der Protein-Enzymschnittstelle bei den MMP konnten durch vergleichende Untersuchungen und Röntgenkristallographie die heutigen MMPI auf rationeller Basis synthetisiert werden. Sie wurden nicht nach dem Zufallsprinzip getestet, sondern durch chemische Modulation der bekannten Enzymschnittstelle angepaßt.

1.6.2 Struktur von Batimastat

In der folgenden Abbildung ist die Struktur von Batimastat dargestellt (Molekulargewicht 477 kDa). Der chemische Name ist [4(N-hydroxyamino)-2R-isobutyl-35-(thienyl-thiomethyl)-succinyl]-L-phenylalanine-N-methylamid [94]. In vitro zeigte Batimastat IC50 - Werte (Inhibition von 50 % der Enzymaktivität) von weniger als 10 ng/ml für MMP -1, -2, -3, -7 und -9. Dieses Molekül wird von den MMP als Substrat erkannt. Batimastat simuliert die Proteinstruktur einer der Hauptschnittstellen des Kollagen. Dadurch kann der synthetische MMPI Batimastat reversibel im aktiven Zentrum der Proteinasen binden. Die Hydroxamat Gruppe (-CONHOH) des Batimastat bindet an das Zinkatom im aktiven Zentrum der MMP. Batimastat ist aufgrund seiner schlechten Löslichkeit (6 nMol in Wasser) kaum oral bioverfügbar. Die Lösung erfolgt in Lösungsmitteln mittels Ultraschall und ergibt eine weißliche, kristalline Flüssigkeit. Diese Substanz ist der erste synthetische MMPI, der bei Tumorpatienten im Rahmen kontrollierter Studien erprobt wurde.


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1.6.3 Einsatz von Batimastat in klinischen Studien

Die Vielzahl der von Batimastat inhibierten MMP führte zu der Bezeichnung "Breitspektruminhibitor". Unter einem "Breitspektrum-Inhibitor" der MMP wird auch bei anderen synthetischen MMP-Inhibitoren die Inhibition mehrerer MMP gleichzeitig durch nanomolare Dosen der Proteasenhemmer verstanden. Batimastat gilt als "Goldstandard" in der präklinischen und klinischen Erforschung der Funktion von MMP und der Wirkung von synthetischen MMPI. In einer Auswertung von 15 präklinischen Studien mit unterschiedlichsten Tumormodellen fanden sich bei 10 Arbeitsgruppen in vitro keine wachstumshemmenden oder zytotoxischen Effekte von Batimastat [80,83,86,98-104]. Bei den anderen 5 Studien wurde ein konzentrations- oder zeitabhängiger wachstumshemmender Effekt von Batimastat auf Tumorzellinien und normale Zellen festgestellt [85,104-107]. Diese Hemmung der Zellproliferation wird als reversibel beschrieben. Für Batimastat sind Veränderungen des Zellzyklus, des Zytokinprofils und die Beeinflußung der Sekretion des "angiotensin converting enzymes" beschrieben [105,108].


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In klinischen Studien zeigte Batimastat bei therapierefraktärem malignem Aszites und Pleuraerguß klinische Effekte [89,109]. Unter dem Einsatz von Batimastat waren Aszites und Pleuraergüsse rückläufig, so daß auf häufige Abpunktion verzichtet werden konnte. Aufgrund der geringen Bioverfügbarkeit von Batimastat wurde in weiteren klinischen Studien die Nachfolgesubstanz Marimastat eingesetzt. Marimastat ist im Gegensatz zu Batimastat oral bioverfügbar und hat eine Plasmahalbwertszeit von 8-10 h. In einer Studie bei Patienten mit inoperablem Magenkarzinom wurde eine größere progressionsfreie Überlebenszeit für Marimastat gegenüber Placebo gezeigt [110]. Für Tumormodelle des PCa gibt es bisher zwei präklinische Studien mit Batimastat [68,111]. Klinische Studien in unterschiedlichen Phasen bei PCa sind bisher mit Marimastat /BB-2516), Prinomastat (AG3340), Neovastat (AE941) und Metastat (Col-3) mit insgesamt 182 Patienten unternommen worden [92,112-115]. Die vorliegenden Ergebnisse beim PCa rechtfertigen fortführende Untersuchungen.

1.7 Tumorzellinien und Tumormodell

1.7.1 PCa-Zellinien

In der Literatur zur Erforschung des PCa finden sich zahlreiche aus menschlichen PCa oder deren Metastasen gewonnene Tumorzellinien. Diese werden seit vielen Jahren in internationalen Laboren kultiviert und zu Forschungszwecken weitergegeben. Sie stellen standardisierte Referenzobjekte zur Erforschung des PCa dar. Zu diesen Referenzzellinien gehören u.a. die Zellinien DU 145, LNCaP, PC-3 und MATLyLu.


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DU 145

Die hormonunabhängige Zellinie DU 145 wurde von K.R. Stone 1977 aus einer Gehirnmetastase eines 64 - jährigen PCa – Patienten mit starker Metastasierung isoliert. Die Zellinie war nicht hormonsensitiv und nur schwach positiv für saure Phosphatase. Ultrastrukturelle Untersuchungen der Zellinie und des Tumors zeigten Microvilli, Tonofilamente und Desmosomen, außerdem viele Mitochondrien, gut ausgebildete Golgiapparate und heterogene Lysosomen. Der Ploidiegrad im Karyogramm bewegt sich zwischen Hypoploidie und Tetraploidie [116].

LNCaP

Die hormonabhängige Zellinie LNCaP wurde 1977 von J.S. Horoszewicz aus dem Material einer Nadelbiopsie gewonnen. Die Biopsie wurde aus einem supraklavikulären Lymphknoten eines 50 – jährigen Patienten mit metastasiertem PCa entnommen. Die Zellen produzieren saure Phosphatase, PSA und weisen Androgenrezeptoren auf. Die Zellinie ist hypotetraploid [117].

PC – 3

Die hormonunabhängige Zellinie PC–3 stammt aus einem Prostataadenokarzinom eines 62–jährigen Patienten. Die Zellen sind schwach positiv für saure Phosphatase und Testosteron 5–α–Reduktase Aktivität. Der Ploidiegrad ist hypotriploid, in Q–Band Analysen wurden keine normalen Y–Chromosomen entdeckt [118].


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1.7.2  MATLyLu-Zellinie und Tiermodell

Für meine tierexperimentellen Untersuchungen wurde der Dunning Tumor der Copenhagen Ratte ausgewählt. 1963 berichtete Fr. Dr. W.F. Dunning zum ersten Mal über einen spontanen Tumor der Rattenprostata in der Copenhagen Ratte. Dieser wurde später Dunning Tumor genannt und ist heute als R–3327 System des Rattenprostatakarzinoms in der Literatur bekannt. Der Dunning Tumor gilt als Standardtiermodell für das menschliche PCa. Die Copenhagen Ratte ist eine Inzuchtlinie. Der ursprüngliche Tumor war in einem älteren männlichen Tier der Copenhagen Ratte gefunden worden und füllte dessen ganzes Abdomen aus. Der Tumor wächst in einer kompakten Form und besitzt eine feste Konsistenz.
Dr. Dunning transplantierte diesen Tumor erfolgreich in die Flanke der syngenen Copenhagen Ratte und deren F1-Hybriden (Copenhagen x Fischer). Der Tumor stellte histologisch ein papilläres Adenokarzinom dar. Das drüsenartige Muster des Orginaltumors von R-3327 glich dem histologischen Bild eines gut differenzierten menschlichen PCa. Der R-3327 Tumor wuchs sehr langsam und in weiblichen bzw. kastrierten männlichen Tieren langsamer als in intakten männlichen Tieren. Die Metastasen des Tumors waren vor allem in den drainierenden Lymphknoten und der Lunge, aber auch in der Leber und dem Zwerchfell gefunden worden [119].

Aus dem ursprünglichen Tumor entwickelte sich ein System von Tochterzellinien. Die mit den Tochterzellinien dieses Tumorsystems induzierbaren Tumoren sind vergleichbar mit den Stadien des menschlichen Pca [120]. Bei den Dunning Tumoren gibt es hormonsensitive und hormoninsensitive Tumore. Diese haben ein vergleichbares Ansprechmuster auf Hormon-, Chemo- und Strahlentherapie, wie sie beim menschlichen PCa gefunden werden [121,122,123]. Wie das menschliche PCa reagiert die Mutterzellinie AT-1 auf hormonelle Manipulation. Die folgenden Tochterzellinien, wie MATLyLu, entwickeln hormoninsensitive Tumore [124,125,126]. MATLyLu ist eine hormonunabhängige anaplastische Zellinie des Dunning-Tumor (R–3327–System) [127].


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1974 veröffentlichte Dr. Dunning das System der R-3327 Zellinien als Modell für das menschliche PCa. 1975 wurde nach serieller in vivo Passage des Tumors die schnell wachsende Variante R-3327-H (H für Hopkins) entdeckt und als androgenunabhängiges squamöses Karzinom klassifiziert [119]. Die MATLyLu Zellinie (in Lymphknoten und Lunge metastasierende AT-Zellinie) entwickelte sich aus der nichtmetastasierenden AT-1 (Anaplastic Tumor) Zellinie [128]. MATLyLu ist metabolisch aktiver als andere Zellinien des R–3327 Systems [123]. MATLyLu produziert höhere Mengen an mRNA von VEGF und dessen Rezeptoren und mehr TGF-β1 mRNA als die normalen Zellen der Rattenprostata [129,130]. MATLyLu hat eine sehr hohe Metastasierungsrate. Mehr als 75% der inokulierten Tiere entwickeln neben einem lokalen Tumor auch Fernmetastasen [128]. Die Verdopplungszeit des Tumors in vivo beträgt 1,5 Tage [127]. Aufgrund dieser Eigenschaften und der breiten Verwendung dieser Zellinie in der Forschung bietet MATLyLu gute Vorraussetzungen für die Ziele meiner Arbeit [131].

1.7.3 Der MTT-Test

Zur Untersuchung der Zellinien auf Proliferation und Lebensfähigkeit unter dem Einfluß von Batimastat dient der MTT-Test. Der MTT-Test korreliert mit der Stoffwechselrate (Glykolyserate) und NADH-Produktion [132]. MTT ist die Abkürzung für die chemische Verbindung des Tetrazoliumsalzes
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid-Formazan. Bei diesem Test wird das Tetrazoliumsalz durch mikrosomale Enzyme in Anwesenheit von NAD-H und NADPH zu farbintensiven, dem Kaliumpermanganat ähnlichen, Formazankristallen reduziert. Er ist somit abhängig von der Atmungskette und der metabolischen Aktivität einer Zelle. Der MTT-Test ist bekannt für seine gute Vergleichbarkeit mit anderen Proliferationstests [133]. Bei hohen Zellzahlen in Mikrotiterplattenversuchen kann allerdings nicht von einer linearen Beziehung zwischen Formazanproduktion der Zellen und Zellzahl ausgegangen werden. Daher limitieren hohe Zellzahlen die Dauer einer Versuchsanordnung mit MTT-[Seite 23↓]Bestimmung auf wenige Tage. Die Linearität ist für jede Zellinie individuell zu bestimmen [134]. Der MTT-Test wird in der Literatur für Untersuchungen mit PCa-Zellinien häufig beschrieben [135]. In der Literatur finden sich verschiedene Angaben zur Durchführung des MTT-Tests. Insbesondere kommen unterschiedliche Konzentrationen der Testsubstanz zur Anwendung [136,137,138]. Es ist daher notwendig, für den MTT-Test die Zellzahl und Konzentration der Testlösung für jede Zellinie einzeln einzustellen.


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02.03.2005