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3  Material und Methoden

3.1 Konzeption der Untersuchungen

Zur Beantwortung der in der Zielstellung dargelegten Fragen führte ich eine Zellkulturuntersuchung (Toxizitätsversuch) und einen Tierversuch durch. Im Zellkulturversuch wurden vier PCa-Zellinien unter der Einwirkung von Batimastat untersucht. Die Messung der in vitro Effekte erfolgte durch den MTT-Test. Im Tierversuch wurde der Einfluß von Batimastat auf den Dunning-Tumor der Ratte untersucht. Die Einschätzung des Effektes von Batimastat erfolgte durch Messung von Tumorgewicht und Tumorvolumen.

3.2 Verwendete Tumorzellinien

In der vorliegenden Untersuchung wurden drei hormonunabhängige PCa-Zellinien (DU 145, PC-3 und MATLyLu) und eine hormonabhängige PCa-Zellinie (LNCaP) für die Zellkulturversuche verwendet. MATLyLu diente darüberhinaus zur Etablierung des Dunning-Tumors der Ratte.

3.3 Zellkultur

Die verschiedenen Tumorzellen wurden in Wachstumsmedium bei 37°C in 5% CO2 kultiviert. Das Medium enthielt Phenolrot, L-Gluthamin, 10% fetales Kälberserum und 1% Penizillin/Streptomyzin. Untersuchung auf Mykoplasmen erfolgte regelmäßig mittels eines immunologischen Testsystems. Das Wachstumsmedium wurde alle vier Tage erneuert und die Zellen nach der
30.– 40. Passage in der Logphase bei einer 60-70 % Konfluenz für die Versuche verwendet. Die Zellen wurden alle 8-10 Tage durch Trypsinisierung passiert.


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3.4  In vitro Versuch

Nach Bestimmung des Anteils der lebenden Zellen durch Trypanblau und Zählung mit einem Hämozytometer, wurden die Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten pipetiert und die Adhäsion über 24 Stunden ermöglicht. Im Anschluß an die Adhäsionszeit enthielt das neue Medium jeweils 40, 400 und 4000 ng/ml Batimastat (entsprechend 0,0837 µM, 0,837 µM und 8,37 µM). Die Zellen wurden in diesem Medium über fünf Tage kultiviert. Die Erneuerung des Batimastat-Medium fand im 48-h-Zyklus statt. Batimastat wurde nach entsprechenden Herstellerangaben mit einer Ultraschallsonde in Suspension in PBS/Tween (0,01%) gebracht.

3.5 MTT Test

MTT wird in einer Pufferlösung (PBS) gelöst und steril filtriert. Zur Messung fügt man dem Wachstumsmedium die MTT-Lösung hinzu. Das alte Medium wird aus den Mikrotiterplatten abgesaugt und die Zellen vorsichtig mit Pufferlösung gewaschen. Anschließend werden die Zellen mit frischem Wachstumsmedium und MTT bei 37°C bis zu 2 h inkubiert. Nach Entfernung des MTT-Mediums wird 100µl DMSO hinzugegeben und die Formazankristalle über 20 Minuten durch Bewegung gelöst. Unter dem Spektrometer erfolgt die Ausmessung des Absorptionsgrades der umgesetzten Farbe in den Mikrotiterplatten mit dem 540 und 620 nm Filter. Ein durchschnittlicher Leerwert (Medium + MTT) von < 20 kann bei Extinktionswerten bis maximal 3500 in der statistischen Auswertung vernachläßigt werden.

3.6 Tiermodell

In der vorliegenden Untersuchung wurden 30 männliche Copenhagen Ratten im Alter von 3 Monaten mit einem Gewicht zwischen 180 und 220 g verwendet. Die Haltung richtete sich nach den institutionellen Richtlinien. Die Gewöhnungszeit an [Seite 27↓]Umgebung und Situation betrug 7 Tage. Wasser und Nahrung wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Induktion des Tumors erfolgte durch sterile Inokulation von 100000 MATLyLu Zellen in den ventralen Lappen der Rattenprostata über eine suprapubischen Querschnitt des unteren Abdomens. Um eine mögliche Aussaat von Tumorzellen in den Peritonealraum oder den Wundbereich zu verhindern, wird die Inokulationsnadel durch einen mit Kochsalzlösung getränkten Baumwolltupfer in die Rattenprostata eingeführt. Nach Zurückziehen der Nadel wird der Baumwolltupfer noch eine Minute auf die Inokulationsstelle gedrückt. Die Narkose wurde in Pentobarbitalanästhesie durchgeführt. Die verwendeten Tumorzellen wurden entsprechend den in vitro Versuchen kultiviert. Um eine Aussage statistisch zu sichern, sind mindestens 10 Tiere pro Behandlungsgruppe notwendig. Diese Zahl ergibt sich aus den Streuungen der Kontrollwerte und der Anforderungen an die Schärfe der Statistik des Untersuchungsergebnisses. Es erfolgte randomisiert folgende Gruppeneinteilung:

  1. Gruppe: keine Behandlung
  2. Gruppe: Vehikel (PBS/Tween-80 0,01%)
  3. Gruppe: mit Batimastat behandelt (30 mg/kg KG).

Die Auflösung von Batimastat in PBS/Tween (0,01%) erfolgte mit Hilfe von Ultraschall. Die tägliche intraperitoneale Gabe von Batimastat begann am Tag der Tumorinduktion. Eine Kontrolle von Gewicht und Zustand der Tiere erfolgte täglich. Die Tiere wurden am 20. Tag nach Inokulation der Tumorzellen durch Injektion von Tötungsmittel K 61 mit 1 mg/kg i.v. getötet, die Tumore exzidiert und auf Größe und Gewicht untersucht. Der Tumor kann aufgrund einer Pseudokapselbildung gut vom umgebenden Gewebe getrennt werden. Die Bestimmung des Tumorvolumen erfolgte unter der Annahme, dass die Tumore Hemiellipsoide sind (V = Länge x Breite x Höhe x 0,5236).


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3.7  Statistische Analyse

Die deskriptive statistische Auswertung und die Signifikanzberechnung wurde mit dem Statistikprogramm "GraphPad Prism", Version 3.00, GraphPad Software,
San Diego, USA, durchgeführt. Als Teste für die in vivo Versuche diente die Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey´s Multivergleichstest. Für die Auswertung der in vitro Versuche wurde die ANOVA-Analyse kombiniert mit Dunnett´s Multivergleichstest für wiederholte Messungen verwendet. Das Niveau p<0,05 wird als statistisch signifikant angenommen.


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02.03.2005