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4  Ergebnisse

4.1 Konzentration, Linearität und Zeitabhängigkeit der MTT Messung

Zur Einstellung des MTT-Test wurden die Tumorzellinien mit MTT-Konzentrationen von 0,2-1,2 mg/ml für 2 h, 4 h oder 6 h inkubiert und die Extinktionswerte nach Auflösung mit DMSO im Fotometer ausgelesen. Je Zellinie und Ansatz erfolgten jeweils sechs Einzelmessungen. In Abbildung 1 sind diese Untersuchungen stellvertretend für die vier Tumorzellinien (DU 145, LNCaP, PC-3 und MATLyLu) anhand von DU 145 dargestellt. Es zeigt sich, daß mit MTT-Konzentrationen zwischen 0,4-0,8 mg/ml und einer Inkubationszeit von 2 bis 6 h im linearen Anstiegsbereich der Fotometerantwort gemessen werden kann. Eine Inkubationszeit von 5000 Zellen/Versuch stellt sich als ausreichend dar.

Abb. 1: DU 145, 5000 Zellen/Versuch. MTT-Konzentration in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (o=6 h, Δ=4 h, ■=2 h). Sechs Einzelversuche je Datenpunkt. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung. Erreichter Farbstoffumsatz der Zellen als Extinktionswerte (OD) dargestellt.


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Für einen Zellkulturversuch über mehrere Tage ist eine lineare Fotometeranwort notwendig. In Abbildung 2 ist die Linearität der Messung bei einer MTT-Konzentration von 0,4 mg/ml und einer Inkubationszeit von 2 h von niedrigen zu hohen Zellzahlen gezeigt. Dies spiegelt die Situation innerhalb der fünftägigen Wachstumsphase der Toxizitätsversuche wider. Damit kann vorausgesetzt werden, daß sich eine Zu- oder Abnahme der Zellproliferation über einen mehrtägigen Versuch sicher bestimmen läßt.

Abb. 2: DU 145, 2000-100000 Zellen. Die MTT-Messung ist auch bei hohen Zellzahlen linear. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils sechs Einzelversuchen pro Datenpunkt. Erreichte Farbstoffumsätze der Zellen sind als Extinktionswerte (OD) dargestellt.


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Das Farbstoffprodukt des MTT-Test wird in der Literatur von einigen Autoren als instabil beschrieben. Aus diesem Grund wurde der Intensitätsverlust der Fotometerantwort nach Auflösen der Farbkristalle über einen Zeitraum von
75 Minuten gemessen. In Abbildung 3 ist die Zeitabhängigkeit der Fotometerantwort dargestellt. Hier zeigte sich, dass der von den Zellen zu Formazankristallen umgesetzte Farbstoff innerhalb von 25 Minuten soweit aufgelöst wird, dass danach nur geringe Extinktionsschwankungen zu erwarten sind. Somit wurde die Fotometerantwort in allen folgenden Versuchen standardisiert 25 Minuten nach Auflösung mit DMSO gemessen.

Abb. 3: DU 145, 30000 Zellen/Versuch. Die Mikrotiterplatte wurde über 75 Minuten auf dem Plattenrüttler langsam bewegt und in Intervallen von 10 Minuten mit dem Fotometer gemessen. Nach 25 Minuten bleibt die Extinktionsmessung linear. Sechs Einzelversuche je Boxplott. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert, sowie 25. und 75. Perzentile. Erreichte Farbstoffumsätze der Zellen sind als Extinktionswerte (OD) dargestellt.


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Die Lebensfähigkeit bzw. metabolische Aktivität der Zellinien wird durch den relativen Unterschied des Farbumsatzes zwischen den Zellinien abgeschätzt. In Abbildung 4 ist diese unterschiedliche metabolische Aktivität der vier PCa-Zellinien dargestellt. Es zeigt sich, daß MATLyLu die signifikant höchste metabolische Aktivität hat. LNCaP hat dagegen die signifikant geringste metabolische Aktivität unter den vier getesteten PCa-Zellinien. Die hormonunabhängigen Tumorzellinien DU 145, PC-3 und MATLyLu zeigen eine höhere metabolische Aktivität als die hormonabhängige PCa-Zellinie LNCaP.

Abb. 4: Metabolische Aktivität der PCa-Zellinien. Farbstoffumsatz von jeweils 10000 Zellen bei einer Konzentration von 4 mg/ml MTT und einer Inkubationszeit von 2 h. Die Zellen wurden vor der Messung 24 h bei 37°C kultiviert. Signifikante Unterschiede sind im Vergleich zu DU 145 mit **p < 0,01 angegeben. Jeweils sechs Einzelversuche pro Zellinie. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert, sowie 25. und 75. Perzentile. Erreichte Farbstoffumsätze der Zellen sind als Extinktionswerte (OD) dargestellt.


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4.2  Wirkung von Batimastat auf Prostatkarzinomzellinien in vitro

Im Vergleich zum Ausgangsbefund ohne Batimastat (Abb. 4) zeigen die Zellinien unter hohen Batimastatkonzentrationen (4000 ng/ml) (Abb. 5) kein verändertes Bild der metabolischen Aktivität untereinander. In Abbildung 4 wurden jeweils 10000 Zellen nach 24 h Anheftungszeit mit MTT 2 h inkubiert. In Abbildung 5 wurden jeweils 1000 Zellen über 4 Tage unter Wachstumsmedium mit 4000 ng/ml Batimastat inkubiert. Es wurde ebenfalls ein MTT-Test mit zweistündiger Inkubationszeit durchgeführt. Die Extinktionswerte sind unter hohen Batimastatkonzentration niedriger. Das Verhältnis in der metabolischen Aktivität ist nicht verändert. Hieraus kann geschlossen werden, dass Batimastat keinen Einfluß auf die metabolische Aktivität hat. Die geringeren Extinktionswerte sind auf niedrigere Zellzahlen zum Zeitpunkt der Messung zurückzuführen. Eine zytotoxische Wirkung läßt sich weitgehend ausschließen.

Abb. 5: Metabolische Aktivität der Zellinien unter 4000 ng/ml Batimastat. Jeweils 1000 Zellen/Versuch (bzw. LNCaP 2000 Zellen/Versuch). MTT Test nach
4 Tagen. Signifikante Unterschiede sind im Vergleich zu DU 145 mit **p < 0.01 angegeben. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert, sowie 25. und 75. Perzentile.


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In Abbildung 6 A + B und Abbildung 7 C + D wird der Effekt von Batimastat auf die Prostatakarzinomzellinien MATLyLu (A), DU 145 (B), PC-3 (C) und LNCaP (D) gezeigt. Die Darstellung in Prozent der Vehikelkontrollen zeigt deutlich, dass Batimastat in hohen Konzentrationen (4000 ng/ml) einen signifikanten hemmenden Effekt auf das Wachstum aller vier Zellinien hat, jedoch in den verwendeten Konzentrationen nicht zytotoxisch wirkt. Je nach Zellinie wird trotz der hohen Batimastatkonzentration von 4000 ng/ml noch eine Proliferation zwischen 35 und 55 % der Vehikelkontrolle erreicht. Auch geringe Konzentrationen (40-400 ng/ml) des synthetischen MMPI Batimastat zeigen einen von der Dosis abhängigen signifikanten proliferationshemmenden Effekt.

Die vier PCa-Zellinien reagieren unterschiedlich auf Batimastat. So kommt es bei MATLyLu (A) ab Tag 4 bei den Konzentrationen 400 und 4000 ng/ml und bei LNCaP (D) ab Tag 3 bei der Konzentration von 400 ng/ml Batimastat zu einer Erholung der Proliferationsfähigkeit. Bei DU 145 und PC-3 (Abb.6 B und 7 C) zeigt sich am Tag 5 für alle Batimastatkonzentrationen eine signifikante (p<0,001) Verminderung der Proliferationsrate. Unter den vier Zellinien wird die Lebensfähigkeit und Proliferationsfähigkeit der Zellinie LNCaP durch Batimastat am geringsten beeinflusst. Diese Zellinie wächst langsamer und ist gleichzeitig metabolisch weniger aktiv als DU 145, PC-3 und MATLyLu (siehe Abb. 4).

Aus diesen Ergebnissen läßt sich eine zytostatische Wirkung von Batimastat bei einer Konzentration von 4000 ng/ml für alle untersuchten PCa-Zellinien belegen. Bei einer Konzentration von 400 ng/ml zeigt Batimastat auch eine signifikante zytostatische Wirkung auf die Zellinien DU 145 (Abb. 6 B) und PC-3 (Abb. 7 C).


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Abb. 6: Effekt von Batimastat auf das Zellwachstum von MATLyLu (A) und DU 145-Zellen (B) in den Konzentrationen: ٭ = 40, Ο = 400, ■ = 4000 ng/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils sechs unabhängigen Einzelmessungen. Der Effekt von Batimastat ist in Abhängigkeit von der Vehikelkontrolle (=100%) gezeigt. Signifkante Unterschiede von der Vehikelkontrolle sind mit *p < 0,05 und **p < 0,001 gekennzeichnet.


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Abb. 7: Effekt von Batimastat auf das Zellwachstum von PC-3 (C) und LNCaP (D) in den Konzentrationen: ٭ = 40, Ο = 400, ■ = 4000 ng/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils sechs unabhängigen Einzelmessungen. Der Effekt von Batimastat ist in Abhängigkeit von der Vehikelkontrolle (=100%) gezeigt. Signifkante Unterschiede von der Vehikelkontrolle sind mit *p < 0,05 und **p < 0,001 gekennzeichnet.


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Die in Abbildung 6 und 7 gezeigten Versuche wurden mehrfach wiederholt. Die Rohdaten aus diesen Versuchsreihen werden nach Umrechnung in Prozent vergleichbar. Auf diese Weise kann eine goße Zahl von Einzelversuchen mit einander verglichen werden. Diese Methode ist zur Abschätzung zuverlässiger Ergebnisse für den MTT-Test in der Literatur von Sieuwerts et al. beschrieben [139]. Die Wirkung von Batimastat wurde bei DU 145 in vier, bei PC-3 in sechs, bei MATLyLu in neun und bei LNCaP in sieben Versuchsreihen getestet (je sechs unabhängige Werte pro Versuchsreihe; Tab.1 und 2).

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass das Wachstum und die metabolische Aktivität der DU 145 Zellen bei einer Batimastatkonzentration von 40 ng/ml in vier Versuchsreihen nie größer war, als das der Vehikelkontrolle. Dies gilt ebenso für PC-3 nach sechs Versuchsreihen. Bei MATLyLu war dagegen nach neun Versuchsreihen, das Wachstum und die metabolische Aktivität der Zellen in zwei Versuchsreihen signifikant größer als das Wachstum der Vehikelkontrolle. Bei LNCaP war dies nach sieben Versuchsreihen einmal ebenfalls in signifikantem Ausmaß zu sehen.

Tab. 1: Übersicht über alle durchgeführten Versuche bei einer Batimastatkonzentration von 40 ng/ml. Angegeben sind die Anzahlen der Versuchsreihen (je Versuch 6 unabhängige Einzelwerte) bei denen unter Batimastat höhere, gleiche oder niedrigere Wachstumsraten im Vergleich zur jeweiligen Vehikelkontrolle gefunden wurden. In Klammern findet sich das Signifikanzniveau aus den einzelnen Versuchsreihen.

Wachstum

DU 145

PC-3

MATLyLu

LNCaP

Batimastatkon.

40 ng/ml

40 ng/ml

40 ng/ml

40 ng/ml

Versuchsreihen insgesamt

4

6

9

7

Höher

0

0

2 (p < 0,01)

1 (p<0,01)

Gleich

1

4

5

6

Niedriger

3 (p<0,05-0,01)

2 (p<0,01)

2 (p < 0,05)

0


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Die Tabelle bestätigt die in Abbildung 6 und 7 gezeigten Ergebnisse für eine Batimastatkonzentration von 40 ng/ml. PCa-Zellinien können unterschiedlich auf niedrige Konzentrationen von Batimastat reagieren. Wachstum und metabolische Aktivität der hormonabhängigen Zellinie LNCaP werden bei niedrigen Konzentrationen von Batimastat im Vergleich zu den hormonunabhängigen PCa Zellinien DU 145 und PC-3 weniger beeinflußt. Dieser Unterschied zeigt sich für die hormonunabhängige Zellinie MATLyLu im Vergleich zu LNCaP nicht.


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Die im Zusammenhang mit Tabelle 1 erläuterte unterschiedliche Reaktion der Zellinien auf niedrige Batimastatkonzentrationen ist graphisch noch einmal in Abbildung 8 gezeigt. Hier wurden alle vorhandenen Werte nach Umrechnung in Prozent zur jeweiligen Vehikelkontrolle (=100 %) dargestellt. Während DU 145 und PC-3 unter bzw. im Bereich der Vehikelkontrolle bleiben, läßt sich ein zytostatischer Einfluß auf das Wachstum von MATLyLu und LNCaP bei einer Konzentration von 40 ng/ml nach einer Versuchsdauer von fünf Tagen ausschließen. Einschränkend auf dieses Ergebnis muß die hohe Standardabweichung bei LNCaP von bis zu 40% gewertet werden.

Abb. 8: Analyse von 4-9 Versuchen pro Zellinie mit n=24-54. Werte von Tag 5 der Zellkultur. Eingesäte Zellzahlen am Tag 0 zwischen 500 und 10000 Zellen je Versuch. Proliferation in Wachstumsmedium und Batimastat (40 ng/ml). Mittelwert der Vehikelkontrolle als 100%. Einzelwerte prozentual zur jeweiligen Vehikelkontrolle. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert sowie 25. und 75. Perzentile. Signifikante Unterschiede sind im Vergleich zu DU 145 mit **p < 0,01 angegeben.


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Die unterschiedliche Reaktion der Zellinien auf die verwendeten Batimastat-Konzentrationen 40, 400 und 4000 ng/ml wird in Tabelle 2 für den 4. und 5. Versuchstag herausgearbeitet. Wie für Tabelle 1 und Abbildung 8 wurden alle Versuchsreihen ausgewertet.

Tab. 2: Proliferationsrate der vier PCa-Zellinien in Prozent gegenüber der jeweiligen Vehikelkontrolle. Mittelwerte der Prozentzahlen aus der Gesamtanalyse von 4-9 Versuchen mit n=24-54. Batimastatkonzentrationen von 40-4000 ng/ml. Werte von Tag 4 und 5 der Versuche.

 

DU - 145

PC - 3

MATLyLu

LNCaP

ng/ml / %

4000

400

40

4000

400

40

4000

400

40

4000

400

40

Tag 4

57,0

76,1

84,1

47,7

82,4

93,2

66,8

98,8

100,7

60,3

76,7

90,8

Tag 5

53,4

74,2

79,4

44,4

79,3

93,5

72,5

98,0

102,9

68,0

91,9

108,0

Nach fünf Tagen Inkubationszeit und hohen Batimastat-Konzentrationen (4000 ng/ml) erreichen DU 145 und PC-3 durchschnittlich 53,4 %, bzw. 44,4 % der metabolischen Aktivität der Vehikelkontrolle, MATLyLu und LNCaP dagegen, 72,5 % bzw. 68,0 % (Tab. 2). Der unterschiedliche Einfluß von hohen Batimastat-Konzentrationen auf die Zellinien wird aus Tabelle 2 ersichtlich. Die Zellinien DU 145 und PC-3 zeigen vom 4. auf den 5. Versuchstag eine konstante Abnahme des Wachstum und der metabolischen Aktivität für 400 und 4000 ng/ml Batimastat. Dies kann als zytostatischer Effekt von Batimastat gewertet werden. Dagegen weisen MATLyLu und LNCaP am letzten Versuchstag eine gegenüber dem Vortag leicht gesteigerte metabolische Aktivität bei einer Konzentration von 4000 ng/ml Batimastat auf. Für LNCaP wurden insgesamt 7 Versuche mit n=42 Einzelversuchen durchgeführt. Tabelle 2 zeigt bei allen Konzentrationen von 40-4000 ng/ml für LNCaP eine Erholung der Proliferationsrate von Tag 4 auf Tag 5. Am Tag 2 und 4 fand generell ein Mediumwechsel statt.


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Zellinien der gleichen Tumorentität zeigen in hohen und niedrigen Konzentrationsbereichen von Batimastat unterschiedliche Wachstumsraten und hierdurch bedingte geringere metabolische Aktivität. Zytostatische Effekte können wie bei LNCaP und MATLyLu innerhalb von 24 h reversibel sein.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die PCa-Zellinien im vorgestellten Versuchsansatz nicht vergleichbar auf Batimastat reagierten. Batimastat wirkt unterschiedlich zytostatisch auf die untersuchten PCa-Zellinien in vitro. Es unterdrückt das Wachstum auch bei hohen Konzentrationen (4000 ng/ml) nicht vollständig. Die hormonabhängige Zellinie LNCaP wird in ihrer Proliferationsfähigkeit und metabolischen Aktivität weniger von Batimastat beeinflußt als die hormonunabhängigen Zellinien DU 145, PC-3. Dagegen läßt sich kein Unterschied hinsichtlich Proliferation und metabolischer Aktivität bei der hormonunabhängigen Zellinie MATLyLu im Vergleich zu den hormonabhängigen LNCaP Zellen erkennen. Batimastat wirkt in den untersuchten Konzentrationen nicht zytotoxisch auf die PCa-Zellinien. Bei hohen Batimastat-Konzentrationen kommt es bei allen PCa-Zellinien zu einer signifikanten Hemmung der Proliferation. Der zytostatische Effekt von hohen Batimastatkonzentrationen kann innerhalb von 24 h reversibel sein.


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4.3  Wirkung von Batimastat im Tiermodell

Nach der Tumorzellinjektion in den ventralen Lappen der Rattenprostata entwickelten alle Tiere einen orthotopen Tumor. Bei keinem der Tiere ergaben sich operative oder postoperative Komplikationen. Die OP-Wunden heilten problemlos. Das mittlere Ausgangsgewicht der Ratten in der Kontrollgruppe war 212,5 g, in der Vehikelgruppe 219,3 g und in der Batimastatgruppe 208,9 g. Die Gewichtsentwicklung der Tiere im Beobachtungszeitraum ist in Abbildung 9 dargestellt. In den unbehandelten Versuchsgruppen verminderte sich das Körpergewicht während des Versuches insgesamt um 8,1% in der Kontrollgruppe und um 11,1% in der Vehikelgruppe sowie in der behandelten Gruppe (Batimastat) um 9,0%. Es gab keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht am Ende des Beobachtungszeitraumes. Daher konnte ein Einfluss von Batimastat auf die Gewichtsentwicklung der Tiere nicht nachgewiesen werden.

Abb. 9: Körpergewichte der behandelten Tiergruppe (Batimastat), Vehikelgruppe und Kontrolgruppe. Das mittlere Ausgangsgewicht der drei Gruppen wurde als 100% definiert. Die Mittelwerte der Tiergewichte sind in Prozent wiedergegeben.


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In der unbehandelten Kontrollgruppe starben drei Tiere zwischen dem 19.-20. Tag. Das Tumorgewicht dieser Tiere war 19,3, 20,4 und 24,9 g. Nach der Tötung aller Tiere am 20. Tag nach Tumorzellinjektion, stellten sich die kleineren Tumoren der behandelten Gruppe makroskopisch als vollständig in Bindegewebe abgekapselt und ohne Infiltration in das umliegende Gewebe dar. Im Gegensatz dazu zeigten die Tumore der Kontroll- und Vehikelgruppe ein größeres Volumen und ein infiltrierendes Wachstum in das Kolon und in die Samenbläschen. In Abbildung 10 ist das Tumorgewicht der unbehandelten und behandelten Tiere am 20. Tag nach Tumorzellinokulation dargestellt. Gezeigt sind die Tumorgewichte der Kontrollgruppe (MW 18,9 ± 5,4 g), der Vehikelgruppe (MW 22,3 ± 4,3 g) und der Batimastatgruppe (MW 11,1 ± 2,6 g) (Abb.10).

Abb. 10: Tumorgewicht 20 Tage nach der Tumorzellinokulation. Dargestellt sind Einzelwerte und der Mittelwerte.

Das Tumorgewicht ist signifikant unterschiedlich zwischen den Gruppen. Zwanzig Tage nach Tumorzellinokulation war das Gewicht der orthotopen Tumore bei den behandelten Tieren signifikant kleiner als bei der Kontrollgruppe oder der [Seite 44↓]Vehikelgruppe (MW 11,1 g vs. 18,9 g vs. 22,3 g; p < 0,001). Zwischen der Kontrollgruppe und der Vehikelgruppe fand sich kein signifikanter Unterschied beim Tumorgewicht (MW 18,9 g vs. 22,3 g; p > 0,05 ). Im Vergleich zu den unbehandelten Gruppen verminderte Batimastat das Tumorwachstum um bis zu 50 %. Das gleiche Ergebnis ergab sich aus der Berechnung der Tumorvolumina, die in Abbildung 11 dargestellt sind. Das Tumorvolumen war in der Batimastat-Gruppe signifikant kleiner als bei Kontroll- und Vehikelgruppe (MW 10,8 ml vs. 20,4 ml vs. 24,2 ml, p < 0,01). Zwischen Kontrollgruppe und Vehikelgruppe fand sich kein signifikanter Unterschied im Tumorvolumen.

Abb. 11: Tumorvolumen in Milliliter (ml) nach 20 Tagen. Dargestellt sind Einzelwerte und Mittelwerte.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß Batimastat das orthotope Tumorwachstum signifikant vermindert hat. Das Vehikel für Batimastat blieb ohne Einfluß auf das Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrollgruppe.


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02.03.2005