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5  Diskussion

5.1 Bewertung des MTT - Test

In meiner Untersuchung wurde der MTT-Test zur Messung der enzymatischen Aktivität und der Proliferation von PCa-Zellinien in vitro eingesetzt. Der MTT-Test basiert auf einem Tetrazoliumfarbstoff. Die Tetrazoliumsalze werden außer in zytologischen Versuchen auch bei enzymatischen Untersuchungen, histochemischen Methoden und in der bakteriologischen Diagnostik verwendet. Die zelluläre Reduktion des Tetrazoliumsalzes korreliert mit der Glykolyserate und der NADH-Produktion und weniger mit der mitochondrialen Zellatmung wie bei Einführung des MTT-Testes ursprünglich angenommen. Eine Beeinflussung des Farbstoffumsatzes über die Behinderung der NADH-Produktion durch Batimastat ist nicht bekannt und könnte im hier gewählten Ansatz nicht von zytostatischen Effekten differenziert werden.

Der in meiner Arbeit verwendete Versuchsansatz wurde gegenüber Standardprotokollen modifiziert [140,141]. So wurde die Azidifizierung des zu Formazankristallen durch die Zellen umgesetzten MTT, wie von Plumb et al. beschrieben, nicht durchgeführt. Der Grund hierfür war die im Ansatz primär niedrigeren Zellzahlen im Vergleich zu Plumb et al. [134]. Der umgesetzte und aufgelöste Farbstoff wird in einigen Studien als instabil beschrieben. Deswegen gilt die unmittelbare photometrische Messung nach Auflösung des Farbstoffes als Standard. Im vorliegenden Versuchsansatz wurde die Messung mit dem Photometer 20-30 Minuten zeitverzögert durchgeführt, da sich der Abfall der Farbintensität nach dieser Zeit als vernachläßigbar zeigte (Abb.4). Sieuwerts et al. beschrieben Unterschiede zwischen Zellmorphologie, metabolischer Aktivität und dem erreichten Farbstoffumsatz [139].

In der vorliegenden Untersuchung scheinen schnell wachsende Zellinien wie MATLyLu mehr Farbstoff umzusetzen als die anderen PCa Zellinien. MATLyLu wächst in vitro aber auch in "Häufchen" und formt sehr schnell sog. "domes". [Seite 46↓]Diese "Türmchen"-Formation erschwert die Abschätzung der Zellmasse. Das Ergebnis der vorliegenen Arbeit wird hierdurch jedoch nicht beeinflußt, da MATLyLu, trotz Häufchenbildung, absolut gesehen die Zellinie mit dem stärksten Farbstoffumsatz ist. Der Vergleich der Zellinien untereinander durch prozentuale Auswertung gegenüber der jeweiligen Vehikelkontrolle erfolgte nach dem Protokoll von Sieuwerts et al. [139]. Unter diesen Bedingungen zeigte sich der MTT-Test als zuverlässiger Test zur Messung der metabolischen Aktivität und Proliferation von PCa Zellinien in vitro. Daher konnte ich den MTT-Test in meiner Untersuchung als Methode zur Messung von Lebensfähigkeit und Proliferation der PCa-Zellen einsetzen.

5.2 Batimastat unter in vitro Bedingungen

Durch die schlechte Löslichkeit und die Ausfällung von kristallinen Aggregaten von Batimastat kann es zu vermindertem Ansprechen der Zellinien auf die Substanz kommen. Aus diesem Grund wurde das Batimastat-Medium im 48-h-Zyklus erneuert. Unter in vitro Bedingungen zeigt Batimastat in der vorliegenden Untersuchung in hohen Konzentrationen proliferationshemmende Effekte. Diese sind bei MATLyLu und LNCaP innerhalb der Versuchsdauer reversibel. In den in vitro Versuchen konnte dargestellt werden, daß Batimastat in hohen Konzentrationen (4000 ng/ml) sowohl homonabhängige (LNCaP) als auch hormonunabhängige (DU 145, PC-3 und MATLyLu) Zellinien im Wachstum und der metabolischen Aktivität inhibiert. Es zeigt sich eine dosisabhängige Reduktion dieses Effektes. Ein zytotoxischer Effekt läßt sich bei Konzentrationen bis 4000 ng/ml Batimastat nicht nachweisen. Dieses Ergebnis ist vereinbar mit Untersuchungen von Batimastat an Zellinien anderer Tumorentitäten. In diesen Studien wurde die Proliferation von Zellinien unter Batimastat mit validierten Verfahren wie MTT-Test, Trypanblau-Test, 3H-Thymidin-Inkorporation und Gesamteiweißbestimmung gemessen [83,100,101,105,106]. Diese Studien zeigen an unterschiedlichen Tumorzellinien zytostatische, jedoch keine zytotoxischen [Seite 47↓]Eigenschaften von Batimastat. Damit läßt sich Batimastat gegen andere zytotoxische synthetische Inhibitoren der MMP wie Col-3, ein Tetrazyklinderivat, abgrenzen [111].

Nemeth et al. berichten, keine dosisabhängige Hemmung der Proliferationsrate von PC-3 Zellen bei Batimastatkonzentrationen von 0,1 bis 20 µM (10000 ng/ml) festgestellt zu haben [72]. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigen, dass bei einer Konzentration von 8 µM (4000 ng/ml) das Wachstum von PC-3 Zellen vermindert wird (Abb. 6C). Beim in vitro Versuch von Nemeth et al. wurde die gleiche MTT-Technik angewandt.

Die in meiner Arbeit verwendeten PCa-Zellinien wurden zum ersten Mal bezüglich der Wirkung eines synthetischen MMPI miteinander verglichen. Dabei wurde DU 145 aufgrund der stabilen Eigenschaften als Referenzzellinie eingesetzt. Es zeigt sich, dass die Zellinie LNCaP in absoluten Werten eine geringere Proliferation und metabolisch schwächere Aktivität als die anderen Zellinien hat (Abb. 4, 7 u. 8). Dies ist in Übereinstimmung mit den bekannten Eigenschaften von LNCaP, wie der langen Verdopplungsrate von 72 Stunden, den geringen adhärenten Eigenschaften und der Entwicklung von Subklonen [117,142]. Die geringen adhärenten Eigenschaften von LNCaP erklären auch die größere Standardabweichung (Abb. 8). Wird LNCaP prozentual gegenüber den anderen Zellinien und zur jeweiligen Vehikelkontrolle verglichen, so zeigt sich jedoch ein anderes Bild. LNCaP ist verglichen mit DU 145 und PC-3 weniger empfindlich gegenüber den zytostatischen Eigenschaften von Batimastat bei höheren Konzentrationen (Tab.1 und 2).

Während DU 145 und PC-3 eine kontinuierliche Abnahme der Proliferationsrate unter 4000 ng/ml Batimastat zeigen, steigt die Proliferationsrate unter dieser zytotstatischen Batimastatkonzentration bei LNCaP und MATLyLu in der Gesamtanalyse (Tab. 2) an. So nimmt das Wachstum von LNCaP vom 4. auf den 5. Versuchstag durchschnittlich von 60,3 % auf 68,0 % und bei MATLyLu von [Seite 48↓]66,8 % auf 72,5 % bei 4000 ng/ml im Vergleich zur jeweiligen Vehikelkontrolle zu. Dies zeigt die potentiell unterschiedliche zytostatische Wirkung von Batimastat in hohen Konzentrationen, die unterschiedliche Empfindlichkeit von PCa-Zellinien auf pharmakologische Beeinflussung und die Reversibilität der zytostatischen Eigenschaften von Batimastat. Ein Signifikanzniveau läßt sich für diese Interpretation nicht angeben, da die Signifikanzniveaus nur für die Einzelversuche gültig sind (Abb. 6 und 7). Für die tierexperimentellen Versuche hat diese Beobachtung eingeschränkte Übertragbarkeit, da bei den in vivo Experimenten Konzentrationen unterhalb von 40 ng/ml verwendet wurden.

Als Ergebnis der in vitro Untersuchungen ist hiermit gezeigt, daß Batimastat in hohen Konzentrationen auf hormonabhängige und homonunabhängige PCa-Zellinien zytostatisch wirkt. Ebenso läßt sich mit der vorliegenden Untersuchung nachweisen, daß Batimastat in Abhängigkeit von der Konzentration unterschiedliche zytostatische Wirkung auf PCa-Zellinien hat. Schließlich deutet die vergleichende Gesamtanalyse daraufhin, daß die Wirkung von Batimastat nicht von der Hormonempfindlichkeit der PCa-Zellinien abhängt.

5.3 Reduktion des Tumorwachstum im Tiermodell

In der vorliegenden Untersuchung konnte nach Inokkulation von 100000 MATLyLu Zellen ein orthotopes Tumorwachstum in allen Tieren nachgewiesen werden. Am Ende des Untersuchungszeitraumes war kein signifikanter Gewichtsunterschied bei den behandelten und unbehandelten Gruppen zu beobachten. In der vorliegenden Studie wurde eine Dosierung von 30 mg Batimastat pro kg Körpergewicht bei täglicher intraperitonealer Applikation verwendet. Bei dieser Dosierung wurde in "Nacktmäusen" Serumkonzentrationen von 12-30 ng/ml über 24 Stunden erreicht [87].


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Es ist davon auszugehen, dass diese Konzentrationen trotz der geringen Löslichkeit von Batimastat und der Bildung von kleinen kristallinen Aggregaten an den Injektionsstellen auch in dieser Studie erreicht wurden. Eine ausreichende intraperitoneale Resorption von Batimastat kann vorausgesetzt werden.

Ein orthotopes Tumorgewicht von über 20 g schien der limitierende Faktor in diesem Tumormodell zu sein, da drei Tiere mit diesem Tumorgewicht starben. Die während des Versuches verstorbenen Tiere waren aus der Kontrollgruppe. Es starb keines der Tiere aus der mit Batimastat behandelten Versuchsgruppe und der Vehikelgruppe. Die Tumoren in der behandelten Gruppe waren signifikant kleiner als die Tumoren in der Kontroll- und Vehikelgruppe. Batimastat reduzierte das Tumorwachstum um bis zu 50 %. In Tiermodellen mit Leber- und Kolontumoren wurden vergleichbare Raten in der Tumorreduktion zwischen 30 - 50 % gesehen [83,87].

In vitro hat Batimastat in den Konzentrationen von 40-400 ng/ml nur einen geringen Effekt auf die Proliferation von MATLyLu-Zellen. Es kann davon ausgegangen werden, dass diese Konzentrationen gleich bzw. bis zu 10 mal höher als die in vivo ereichten Konzentrationen sind. Dennoch bewirkt eine relativ geringe Batimastatkonzentration von < 40 ng/ml im Serum einen signifikanten reduktiven Effekt auf das Tumorwachstum (Abb. 10, p < 0,001). Mit dem signifikant geringeren Tumorgewicht in der behandelten Tiergruppe korreliert das ebenfalls signifikant verminderte Tumorvolumen (Abb. 11, p < 0,01). Der Tumor stellte sich in der behandelten Tiergruppe makroskopisch als solider, bindegewebig abgekapselter Tumor ohne Infiltration in die Umgebung dar. Dies legt die Effektivität des Konzeptes der MMP-Inhibition nahe und unterstützt die bereits in anderen Tierversuchen gemachten Erfahrungen mit Batimastat [70]. Aus der vorliegenden Untersuchung kann geschlossen werden, dass das Dunning R-3327 Adenokarzinom der Copenhagen Ratte ein zuverlässiges Modell für die Evaluierung von synthetischen Inhibitoren der MMP beim PCa ist.


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5.3.1  Tierexperimentelle und klinische Ergebnisse im Vergleich

Die Ergebnisse meiner Arbeit sind in Übereinstimmung mit Untersuchungen an anderen Tumormodellen. Diese zeigen ebenfalls eine Reduktion des lokalen Tumorwachstums unter Behandlung mit synthetischen MMPI. So untersuchten Watson et al. den Effekt von Batimastat in einem Tiermodell für kolorektale Tumoren. Hierbei wurden C170HM2 Zellen (Kolonkarzinom-Zelllen) in die Peritonealhöhle von immundefizienten Mäusen (SCID-Mäuse) injiziert. Die SCID-Mäuse entwickeln darunter solide Tumormanifestationen und Aszites. Batimastat verhinderte die Aszitesentwicklung in 47 % der Tiere und reduzierte das Wachstum von peritonealen Tumoren [143].

In einer ähnlichen Studie von Davies et al. wurden Ovarialkarzinomzellen in die Peritonealhöhle von "Nacktmäusen" implantiert. Die Behandlung mit Batimastat führte zu einem signifikant längeren Überleben der Tiere [80]. In einem Mensch-Tier Brustkrebsmodell wurden menschliche Tumorzellen in das Fettgewebe der Brustdrüsen von "Nacktmäusen" implantiert. Nach Anwachsen wurde der Tumor exstirpiert. Unter Therapie mit Batimastat zeigte sich eine signifikante Reduktion des lokalen Wiederauftretens des Tumors und der Enstehung von Lungenmetastasen [86].

Klinisch ist bisher noch wenig über die Rolle der MMP beim PCa bekannt [59,60,144,145]. Baker et al. bestimmten die Konzentrationen von MMP-1, MMP-3, TIMP-1 und TIMP-2 im Blut von PCa-Patienten. Dabei wurden erhöhte TIMP-1 und MMP-1, unveränderte MMP-3 und erniedrigte TIMP-2 Konzentrationen gefunden [146]. Dagegen fanden Jung et al. erhöhte MMP-3 und TIMP-1 Konzentrationen bei PCa-Patienten mit Metastasen im Vergleich zu Kontrollpersonen und Patienten ohne Metastasen [145]. Auch in Gewebeproben von PCa wurden Veränderungen im Verhältnis von MMP und TIMP gefunden. Diese Ergebnisse unterstützen den in der vorliegenden Arbeit gemachten Ansatz zur experimentellen Untersuchung von synthetischen Inhibitoren der MMP in einem Tiermodell des PCa.


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Bei Patienten mit hormonrefraktärem PCa erreichte der synthetische MMPI Marimastat eine PSA-Reduktion in 6 von 11 Patienten [147]. Das hormonrefraktäre PCa kann mit konventionellen Strategien bis heute nur unzureichend therapiert werden. Das PCa ist eine Tumorentität mit dynamischen Eigenschaften. Dies wird an der sich verändernden Resistenz von Tumorzellen gegenüber der hormonellen Therapie deutlich [148]. Gegen diese dynamischen Veränderungen der Tumorzellen gibt es nur unspezifische zytostatische oder zytotoxische Therapieansätze. Deshalb ist gegenüber den bisherigen Therapien der Einsatz spezifischer Methoden wünschenswert, die unabhängig von der Tumordynamik sind. Die synthetischen MMPI bieten den Ansatz einer neuen und spezifischen therapeutischen Strategie.

Den hier zitierten sowie selbst durchgeführten Versuchen mit synthetischen Inhibitoren der MMP ist gemeinsam, daß der Tumor im Modell unter kontrollierten Bedingungen entsteht und nach Initalisierung therapiert wird. Dies gilt auch für MMP-Knockout und Überexpressions-Modelle, bei denen die genetische Konstellation vor Initialisierung des Tumors gegeben ist. Diese Bedingungen erschweren die Interpretation hinsichtlich des menschlichen PCa. Das ursprüngliche Konzept bei dem ein Ungleichgewicht im Verhältnis der MMP zu deren physiologischen Inhibitoren durch synthetische Inhibitoren ausgeglichen werden kann, läßt sich anhand der vorliegenden Versuche nicht bewerten. Auch die Vorstellung der Auflösung der EZM durch tumorinduzierte MMP und deren Verhinderung durch synthetische Inhibitoren wurde in meinen Experimenten nicht untersucht.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch, daß im verwendeten Tiermodell, dem Dunning Tumor der Copenhagen Ratte, die Wirkung synthetischer Inhibitoren auf das PCa gut untersucht werden kann. Bei fehlender Zytotoxizität und geringer bis fehlender Proliferationshemmung bei niedrigen Batimastat-Konzentrationen
(< 40 ng/ml), liegt ein bisher gegenüber dem konventionellen chemotherapeutisch-zytotoxischen Strategien neuer Therapiemodus vor. Eine Bewahrung der Integrität [Seite 52↓]der Basalmembranen und der EZM durch die Inhibierung tumorinduzierter MMP, nach dem ursprünglichen MMP-TIMP-Konzept, läßt sich durch die vorliegende Untersuchung insofern bestätigen, als die Tiere der mit Batimastat behandelten Gruppe eine abgekapselte, kleinere Tumorformation nach Beendigung des Versuches zeigten. Im Gegensatz dazu weisen die unbehandelten Tiere eine Tumorausbreitung und -invasion auf. Die Annahme eines einfachen Wirkungsmechanismus ist aufgrund der in der Einleitung geschilderten vielfältigen Wirkung von MMP eher abzulehnen. Durch die peritoneale Applikation von Batimastat können sowohl lokale als auch über die serosale Resorption systemische Effekte die Tumorprogression in der behandelten Tiergruppe beeinflußt haben.

5.4 MMP und TIMP bei Malignomen

Die biologische Bedeutung der MMP liegt im Umbau von Gewebeverbänden. Dies erklärt auch die zunehmende Erforschung der MMP im Bereich der reproduktiven Medizin. Die MMP finden sich unter normalen physiologischen Bedingungen nur in niedriger Konzentration und geringer Aktivität in Blut und Urin. Bei physiologischem Gewebeumbau z.B. während des Menstruationszyklus, bei der Involution von Organen, wie dem Uterus nach Schwangerschaft oder der Involution der Brust sind MMP vermehrt nachweisbar. Dies triftt auch für pathologische Zustände wie infektiöse Prozesse oder das Tumorwachstum zu [149,150].

Der Zusammenhang zwischen MMP und der Entstehung und Progression von Tumoren wird durch eine breite Forschung belegt. Die Beteiligung von MMP an der Entstehung und Entwicklung von Malignomen läßt sich sowohl experimentell in Tierversuchen als auch korrelativ in klinisch-pathologischen Untersuchungen zeigen. Trotz der umfangreichen und überzeugenden Ergebnisse über den Zusammenhang zwischen MMP und Malignomen sind die zugrundliegenden Mechanismen der Wirkung von MMP bis heute nicht ausreichend geklärt.


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Die selektive Hemmung der MMP als therapeutisches Ziel bei der Tumortherapie gilt jedoch als unumstritten. Eine andere Situation zeigt sich dagegen für die spezifischen physiologischen Inhibitoren der MMP. Für TIMP liegen experimentelle und histopathologische Untersuchungen vor, die dem therapeutischen Konzept der Enzymhemmung möglicherweise widersprechen. TIMP weisen außer der Enzym-Inhibitor-Interaktion eine Vielfalt weiterer Eigenschaften auf. Diese TIMP-Eigenschaften umfassen neben dem Einfluß auf die MMP-Aktivität auch die Stimulation von malignen Prozessen [151]. Eines der bisher wichtigsten Ergebnisse der MMP-Forschung, das Ungleichgewicht zwischen MMP und TIMP in Prozessen der malignen Transformation, ist jedoch experimentell und klinisch vielfach bestätigt worden.

5.4.1 Korrelation von MMP und TIMP bei Malignomen

Die Konzentration von aktiven und latenten Formen der MMP in Tumorgewebe von Mensch und Tier ist tendenziell höher, als die des jeweiligen gesunden oder prämalignen Gewebes [67,152]. Es kann eine Korrelation von hohen MMP-Konzentrationen im Tumorgewebe mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium nachgewiesen werden [153]. Die Expression der MMP zeigt ihr größtes Ausmaß an der Tumorfront, dem Ort zwischen Tumor und Bindegewebe mit aktiver Tumorinvasion [154]. In verschiedensten Tumorentitäten zeigte sich eine signifikante positive Korrelation zwischen der Expression der MMP und klinisch-pathologischen Indikatoren. Die Expression der MMP korreliert mit der zunehmenden Entdifferenzierung und dem histologischen Grading von Tumoren, einem fortgeschrittenen Tumorstadium, zunehmender Tumorgröße sowie Beteiligung lymphatischer und vaskulärer Strukturen. Ebenso läßt sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen Lymphknotenmetastasen, Fern-metastasen, erneutem und therapierefraktärem Tumorwachstum und anderen Parametern, wie einem niedrigen Hormonrezeptorstatus, nachweisen [155-160].


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Einige Studien fanden einen signifikanten Beziehung zwischen der Expression spezifischer MMP und dem Wiederauftreten bzw. dem Überleben der Patienten. Beim Mammakarzinom repräsentiert die MMP-11 Expression einen unabhängigen prognostischen Parameter für das tumorfreie Überleben [161,162]. Diese hinsichtlich der Korrelation zwischen MMP und Malignomen überzeugend scheinende Datenlage existiert für TIMP bis heute nicht.

Eine vermehrte Expression von TIMP zeigt sich u.a. bei Brustkrebs, kolorektalen Karzinomen, PCa, Magenkarzinomen und Lungentumoren [145,163-166]. Dies weist zunächst darauf hin, daß eine vermehrte Expression von TIMP bei Malignomen auftritt. Wenn eine vermehrte Expression von physiologischen Inhibitoren vorhanden ist, sollte eine vermehrte Hemmung von MMP, eine geringere Invasion und Metastasierung und damit eine geringere Progression resultieren. Tatsächlich zeigt sich statt dessen häufig eine negative Prognose bei TIMP-überexrpimierenden Malignomen. So ist TIMP-1 mit einer schlechten Prognose bei kolorektalen Karzinomen, Brustkrebs, Magenkarzinom, Lymphomen, Lungentumoren, und PCa assoziiert [62,165,167-169].

Hohe präoperative Plasmakonzentrationen von TIMP-1 bei kolorektalen Karzinomen, Lungentumoren und Magenkarzinomen sind mit einem niedrigen Patientenüberleben korreliert [170,171]. Die Plasmakonzentrationen von TIMP-1 sind bei Patienten mit metastasiertem PCa signifikant höher als bei gesunden Personen. Bei Zervixkarzinomen und Brusttumoren korreliert eine schlechte Prognose mit höheren Expressionsraten für TIMP-2 [172]. Diese nachweislich vermehrte und in positiver Korrelation zu Malignomen stehende TIMP-Expression kann auf unterschiedliche Weise interpretiert werden. Einerseits stellt diese Überexpression unter Umständen eine Reaktion des Tumors bzw. des umliegenden Gewebes auf die Tumorentstehung dar. Andererseits kann die Überexpression von TIMP einer MMP-unabhängigen Stimulation unterliegen, die ihrerseits das Tumorwachstum beeinflußt.


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Der prognostische Wert von MMP und TIMP unterliegt methodischen und tumorspezifischen Bedingungen. So können MMP, TIMP als auch deren Verhältnis (MMP zu TIMP) prognostische Bedeutung besitzen. Die Expressionsmuster der einzelnen Proteinasen und ihrer Inhibitoren sind von Faktoren wie dem Tumorstadium, der Tumorentität und der Tumorlokalisation abhängig.

Das in experimentellen und histopathologischen Untersuchungen festgestellte Ungleichgewicht im MMP-TIMP-Verhältnis wird zunehmend durch klinische Studien bestätigt. So wurde ein verändertes Verhältnis von MMP zu TIMP bei colorektalen Karzinomen, bei Lungentumoren und beim Prostatakarzinom gefunden [145,171,173,174]. Dieses Ungleichgewicht hat Bezug zur Prognose der Erkrankung. Darüberhinaus normalisieren sich die Enzymwerte im Serum bei Patienten nach radikaler Tumoroperation [175].

5.4.2 Maligne Transformation durch MMP und TIMP

Die u.a. von Liotta et al. 1980 publizierte Auffassung, daß Tumoren die Basalmembran mit Hilfe proteolytischer Enzyme durchbrechen, führte auf dem Gebiet der MMP in den 90iger Jahren zu vielfachen Studien mit genetisch veränderten Zellinien und Mäusen. In diesen wurden proteolytische oder inhibitorische Enzyme überexprimiert, um den so verstärkten Effekt besser sichtbar bzw. unterscheidbar zu machen. Dabei ließ sich feststellen, daß MMP-überexprimierende Tiere eine vermehrte spontane Malignombildung aufwiesen. Ausserdem reagierten diese Mausmodelle auch schneller mit einer Tumorentstehung unter dem Einfluß von Karzinogenen. So konnte bei MMP-3 und MMP-7 transfizierten Mäusen ein verstärktes spontanes Wachstum von Mammakarzinomen herbeigeführt werden [176,177]. MMP-1 überexprimierende Mäuse zeigten unter Stimulation mit Karzinogenen eine höhere Rate an Hauttumoren [53,73]. Korrespondierend hierzu ließ sich durch eine [Seite 56↓]Überexpression von TIMP oder MMP-defiziente Tiermodelle sowie durch Einsatz synthetischer MMPI eine Verminderung der spontanen Tumorentstehung zeigen [66,178,179,180]. Allerdings demonstrieren neuere Tierexperimente, daß das Tumorwachstum durch die systemische Gabe oder die Überexpression von TIMP in Tumormodellen des Mammakarzinoms, bei Modellen intestinaler Tumore und bei tierexperimentellen Lymphomen auch verstärkt werden kann [38,151,181,182]. TIMP haben außer der Inhibition von MMP weitere komplexe Eigenschaften. So können die antiapoptotischen und parakrinen Wirkungen der TIMP die maligne Transformation veränderter Zellen begüntigen.

5.4.3 Einfluß auf die Tumorinvasion durch MMP und TIMP

Maligne Tumore werden von prämalignen oder benignen Tumoren dadurch unterschieden, daß sie die Gewebegrenzen, die Basalmembran, durchbrechen und in andere Organe einwachsen oder in entfernte Körperregionen metastasieren. Ausgehend von der initialen Entdeckung, daß ein Kaulquappenscheibchen Kollagen auflösen kann, wurden in fast allen menschlichen Tumoren die proteolytische Aktivität der MMP entdeckt [183]. Die Tumorinvasion verläuft in mehreren Schritten, in denen Zellmotilität und Proteolyse unter Einwirkung des umgebenden Stroma eng miteinander verbunden sind. MMP sind die einzigen Enzyme, die in der Lage sind die Hauptstrukturelemente der EZM, wie die fibrillären Kollagene, aufzulösen. Der Einfluß von MMP und TIMP auf die Tumorinvasion wurde durch Invasionsversuche mit der sogenannten Boyden-Kammer, in Hühnerembryos unter Benutzung der chorioallantoiden Membran, in der kornealen Tasche, in Mausmodellen und durch Einsatz synthetischer MMPI untersucht. Auch hier läßt sich wie bei Versuchen zur malignen Transformation zeigen, daß MMP das invasive Verhalten bestimmen, während TIMP und synthetische MMPI die Invasion verhindern können [23,101,106,184,185].


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Ein Standard für Invasionsversuche, stellt die intravenöse Applikation von Tumorzellen dar, die die Lunge besiedeln [186]. Nach einiger Zeit wird die Lunge entnommen und die Tumorbildung im Organ evaluiert. Durch eine zusätzliche Untersuchung, der intravitaIen Videomikroskopie, läßt sich die Extravasation von Tumorzellen sichtbar machen. Mit dieser Methode konnten Koop et al. 1994 zeigen, daß auch TIMP-überexprimierende Tumorzellen effektiv die Blutbahn verließen [44]. Die TIMP-Überexpression konnte in diesem Versuch die Extravasation entgegen der Erwartung nicht verhindern. Die TIMP-überexprimierenden Tumorzellen bildeten aber signifikant kleinere Metastasen als die genetisch nicht veränderte Mutterzellinie. Den Zusammenhang zwischen Tumorinvasion und MMP beim PCa demonstrierten Knox et al. in einem in vitro Invasionsversuch. Dieser Versuch bestätigte die Fähigkeit von Batimastat, die lokale Invasion von Tumorzellen zu verhindern. Knox et al. transfizierten DU-145 Zellen mit MMP-7 (Matrilysin), um so die Aggressivität der Invasion durch Überexpression von MMP-7 zu steigern. Die MMP-7 überexprimierenden Zellen erreichten einen stärkeren Invasionsgrad im Vergleich zu den nicht-transfizierten Zellen. Batimastat schränkte die Invasivität beider Zellinien ein [68].

Die Deletion einer einzelnen MMP oder TIMP aus dem Genom führt im Tierversuch nicht notwendigerweise zu einer veränderten Invasivität von Tumoren. Dies ist bei einer Enzymfamilie von mehr als 20 Enzymen, die am ständigen Ab-, Um- und Neubau der EZM beteiligt sind plausibel. Durch redundante und pleiotrope Eigenschaften von Enzymen kann die Funktion fehlender Enzyme aufgefangen werden. Der Verlust einzelner Enzym-kodierender Abschnitte im Genom führt auch beim Menschen nicht unbedingt zu pathologischen Veränderungen.

Beeindruckende Beweise für die Beteiligung der MMP an der Tumorinvasion lieferten Nabeshima et al. Ausgehend von der Entdeckung der perizellulären fibrinolytischen Aktivität der zellmembranständigen Membran-Typ-MMP (MT-MMP) [31,65], konnte diese Arbeitsgruppe den Beweis führen, daß MMP an der Tumorzellinvasion beteiligt sind und dieser Prozess durch den synthetischen MMPI Batimastat gehemmt werden kann. Nabeshima et al. beschrieben die [Seite 58↓]Tumorzellbewegung in Einzelzellbewegungen (single cell locomotion) und Zellkohortenbewegungen (cohort migration) unter dem Einfluß zellmembranständiger MT-MMP und sezernierter MMP. In den Untersuchungen zur Funktion der MMP bei der Zellbewegung ließ sich auch eine dichotome Eigenschaft der MMP zeigen. Außer den bekannten Eigenschaften der MMP wie Ab-, Um- und Aufbau der EZM ließ sich eine "Pfadfinder"-Funktion nachweisen, die den Weg eines Tumorzellverbandes im Gewebe steuert. Diese "Pfadfinder"-Funktion der MMP läßt sich nicht nur bei Tumorzellen, sondern auch bei der physiologischen Migration von Zellen des Alveolar- und Bronchialsystems nachweisen [187,188,189].

5.4.4 Gefäßneubildung durch MMP und TIMP

Die Tumorentwicklung ist ein komplexer Prozess, der eine Reihe koordinierter Abläufe einschließt. Zu diesen gehört die Enstehung einer tumoreigenen Gefäßversorgung. Frühe Ereignisse in der Tumorprogression sind die zunehmende Proliferation, die verminderte Fähigkeit zur Differenzierung und die Modulation der Immunabwehr. Diese Veränderungen resultieren in der Bildung eines hyperplastischen Gewebes. Ab einer kritischen Größe dieses Areals kann sich der Tumor ohne Gefäßversorgung nicht mehr ausbreiten. Für die Gefäßversorgung müssen endotheliale Zellen in das Tumorgebiet durch die Basalmembran einsprossen. In dieser Situation könnte sich die proteolytisch-antiproteolytische Balance letztlich zugunsten einer Situation mit zunehmener enzymatischer Aktivität verändern [190].

MMP und andere Proteasen bauen die Basalmembran und die umliegenden Gefäßstrukturen ab. Hiraoka et al. prägten hierzu den Begriff der "Invasions-kompetenten Zelle" [65]. Diese Zellen ermöglichen unter Umständen die Migration von Endothelzellen in das hyperplastische Gewebe durch Stimulierung der Gewebeauflösung und Produktion von Signalmolekülen. MMP könnten diese Entwicklung fördern, indem sie Wachstumsfaktoren aus der kompakten EZM oder [Seite 59↓]von Zelloberflächen freisetzen [191]. Bergers et al. zeigten wie MMP-9 in Pankreasinselzelltumoren die Bildung von Gefäßen durch Freisetzung von VEGF bewirken [192].

Der Effekt von MMP auf die Gefäßneubildung konnte indirekt auch durch eine Hemmung mit synthetischen MMPI demonstriert werden. Taraboletti et al. erzielten mit dem Einsatz von Batimastat eine signifikante Verminderung bei der Bildung von Hämangiomen im Tierversuch [102].

Dennoch ist die Situation auch hinsichtlich der Neubildung von Gefäßen durch Malignome im Zusammenhang mit MMP und TIMP nicht eindeutig. So bewirken MMP-2, -7, -9 und -12 die Konversion von Plasminogen in Angiostatin. Andere MMP generieren Endostatin. Angiostatin und Endostatin sind potente Inhibitoren der Gefäßneubildung [193]. Eine Blockierung dieser MMP durch synthetische MMPI würde das Ziel der pharmakologischen Hemmung damit möglicherweise ungünstig beeinflußen. Für die bis heute bekannten TIMP ist gezeigt, daß sie auf verschieden Arten die Gefäßneubildung vermindern. TIMP können die pro-angiogenetischen Eigenschaften der MMP, die Proliferation und die Motilität von Endothelzellen hemmen [193-196]. Zumindest für TIMP-1 ist auch ein gegenteiliger Effekt bekannt. TIMP-1 fördert die Expression von VEGF im Mammakarzinom und die Gefäßneubildung in der Retina[197,198]. Der Nettoeffekt von MMP und TIMP auf die Gefäßneubildung bei Malignomen ist schwierig einzuschätzen. Hier bedarf es weiterer experimenteller und klinischer Forschung.

5.4.5 Wirkung von MMP und TIMP auf die Tumorprogression

Die Untersuchung von MMP und TIMP in tierexperimentellen und klinischen Studien dient vielfach der Korrelation dieser Enzyme mit der Tumorprogression. Zahlreiche Untersuchungen beschreiben prägnant die Bedeutung der MMP und TIMP bei der Progression von Tumoren. So läßt sich z.B. für MMP-7 in der bisherigen Forschung eine Sequenz angefangen vom MMP-7 defizienten [Seite 60↓]Mausmodell für benigne intestinale Tumoren [41], über die Beteiligung von MMP-7 bei Colitis ulcerosa-assoziierten Tumoren [199], bis zur histopathologischen Korrelation mit schlechter Prognose bei kolorektalen Kazinomen nachweisen [200]. Besonders eindrücklich wurde der Einfluß von MMP auf die Tumorprogression mehrfach durch Demonstration der MMP-Expression bei kolorektalen Karzinomen mit eindeutiger und signifikanter Abhängigkeit von den Dukes Stadien gezeigt [201,202]. Ähnliche Ergebnisse gibt es auch für die Beteiligung der MMP an der Tumorprogression bei Zervixkarzinomen. Dieser Tumor läßt sich klinisch und histopathologisch sehr gut in den unterschiedlichen Stadien darstellen. Die Forschung zum Zervixkarzinom zeigt die Beteiligung von MMP in frühen Stadien [160,203], die immunmodulierende Wirkung der MMP [204] und schließlich eine erhöhte Expression und Aktivierung der MMP bei fortgeschrittenen Tumorstadien und Metastasen [205]. Auch bei anderen Tumorentitäten wie dem PCa und Lungentumoren lassen sich stadienabhängige Veränderungen der MMP nachweisen.

Die Datenlage zu den TIMP kann hinsichtlich der Untersuchung der Tumorprogression als weniger ausführlich bezeichnet werden. Ähnlich sequentielle Darstellungen wie zum kolorektalen Karzinom oder Zervixkarzinom lassen sich für TIMP aus der internationalen Literatur nicht belegen. Einzelne Versuche weisen daraufhin, daß TIMP auch bei der Tumorprogression ungünstige Effekte haben können. So begünstigen TIMP die Enstehung intestinaler Adenome, während dies durch Batimastat im gleichen Tiermodell vermindert wird [38]. Insgesamt wenig ist bisher auch über die zeitliche und lokale Verteilung von MMP und TIMP bei der Progression von Malignomen bekannt. Guedez et al. zeigten im Tierversuch einen biphasischen Effekt von TIMP auf das Wachstum von Lymphomen. Nach initialer Tumorstimulation bewirkte TIMP-1 in späteren Tumorstadien eine Hemmung der Lymphome im Tierversuch [181].


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Im Gegensatz zum aktuellen Wissenstand zur Wirkung der TIMP auf die Tumorprogression, sind die Ergebnisse zur Wirkung der synthetischen MMPI aus Tierversuchen besser abschätzbar. In vielen Untersuchungen mit unterschiedlichsten Tumoren und Versuchsanordnungen konnte die Hemmung der Tumorprogression durch synthetische MMPI belegt werden. Wie schwierig dagegen die Übertragung der im Tierversuch gewonnen Informationen sind, illustriert das beim Menschen gefundene "vanishing bone syndromes" in Saudi-Arabischen Familien. Die Betroffenen weisen einen Defekt des MMP-2 Gens auf [206]. Die klinisch-pathologischen Aspekte dieser Erkrankung, wie Wachstumsretardierung und Verlust von Knochensubstanz, sind mit denen von Membran-Typ-1-MMP defizienten Mäusen vergleichbar. MMP-2 defiziente Mäuse zeigen dagegen kaum eine Wachstumsretardierung oder Verlust der Knochensubstanz. Die Diskrepanz zwischen den bisher bekannten biologischen Effekten von MMP und TIMP und dem erfolgreichen Einsatz der synthetischen MMPI macht eine weitere Erforschung dieses Gebietes bis zum klinischen Einsatz notwendig.


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5.4.6 Zusammenfassung

Verschiedenste Proteaseinhibitoren sind bei mikrobiellen und viralen Infektionen, rheumatologischen und pulmonalen Erkrankungen im klinischen Einsatz. Der Einsatz von synthetischen MMPI bei Tumorerkrankungen ist bisher wenig erforscht. Ein Ungleichgewicht im Verhältnis von MMP und deren physiologischen Inhibitoren begünstigt die Tumorprogression. Die Hemmung der MMP durch synthetische MMPI wird als neue therapeutische Strategie zur Verminderung der Tumorprogression angesehen. In der Erforschung befinden sich spezifische und unspezifische synthetische MMPI. Batimastat ist ein unspezifischer Inhibitor zahlreicher MMP. In meiner Arbeit wurde der Einfluß von Batimastat auf Prostatakarzinom Zellinien in vitro und im Tiermodell untersucht. Für den Zellkulturversuch wurden die PCa Zellinien DU 145, PC-3, LNCaP und MATLyLu verwendet. Nach einer Adhäsionszeit von 24 h inkubierten die Zellinien über einen Zeitraum von fünf Tagen mit Batimastatkonzentrationen von 40, 400 und
4000 ng/ml. Das Batimastat-Medium wurde im 48-h-Zyklus erneuert. In vitro zeigt Batimastat zytostatische, aber keine zytotoxischen Effekte. Die zytostatische Wirkung wurde insbesondere bei hohen Batimastatkonzentrationen von 400 und 4000 ng/ml nachgewiesen. Die Wirkung von Batimastat ist konzentrationsabhängig. Verschiedene Tumorzellen der gleichen Tumorentität können unterschiedlich auf Batimastat reagieren. Wachstum und metabolische Aktivität von hormonabhängigen und hormonunabhängigen Tumorzellinien des PCa sind unter dem Einfluß von Batimastat nicht gleich. Eine eindeutige Abhängigkeit vom Hormonstatus der Zellinien ließ sich jedoch nicht nachweisen. Zytostatische Effekt von Batimastat können innerhalb von 24 h reversibel sein.

Zur Untersuchung von Batimastat im Tiermodell wurde der Dunning Tumor der Copenhagen Ratte verwendet. Die Induktion des Tumors erfolgte durch Inokulation von 100000 MATLyLu Zellen in die ventrale Rattenprostata. Es wurden drei Tiergruppen zu je 10 Tieren untersucht. Die Tiergruppen unterteilten sich in [Seite 63↓]eine unbehandelte Kontrollgruppe, eine mit Vehikel und eine mit Batimastat behandelte Gruppe. In letzterer erfolgte ab dem Tag der Tumorinduktion eine tägliche intraperitoneale Gabe von 30 mg/kg KG Batimastat über 20 Tage. Während des Beobachtungszeitraumes wurden die Tiere täglich gewogen. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied in der Gewichtsentwicklung bei den drei Versuchsgruppen. Nach Tötung der Tiere wurden Tumorgewicht und Tumorvolumen bestimmt. Drei Tiere der Kontrollgruppe starben vor Versuchsende. Die Tumore der mit Batimastat behandelten Tiergruppe waren klein und abgekapselt. Die Tumore der unbehandelten Kontrollgruppe und der Vehikelgruppe waren signifikant größer und zeigten ein infiltrierendes Wachstum in das Kolon und in die Samenbläschen. Tumorgewicht und Tumorvolumen von Kontroll- und Vehikelgruppe waren nicht signifikant unterschiedlich. Dagegen waren Tumorgewicht und Tumorvolumen der mit Batimastat behandelten Tiergruppe signifikant kleiner im Vergleich zu den beiden anderen Tiergruppen. Batimastat verminderte das Tumorwachstum um bis zu 50 % im Vergleich zur Vehikel- und Kontrollgruppe (MW 11,1 g vs. 18,9 g vs. 22,3 g; p < 0,001). Aus diesen Ergebnissen kann ein deutlicher inhibitorischer Effekt des unspezifischen MMPI Batimastat auf das PCa-Wachstum beim Dunning Tumor der Copenhagen Ratte abgeleitet werden.

Im Zellkulturversuch zeigt Batimastat keine zytotoxischen Eigenschaften. Niedrige Konzentrationen von Batimastat (40 ng/ml) haben keine zytostatischen Effekte auf MATLyLu in vitro. Die Batimastatkonzentrationen im Serum sind bei einer intraperitonealen Gabe von 30 mg/kg KG geringer als die in vitro verwendeten Konzentrationen von Batimastat. Daher können zytostatische Eigenschaften von Batimastat die Tumorreduktion im untersuchten Tiermodell nicht bewirkt haben. Die Verminderung des Tumorwachstums kann auf die Hemmung der vom Tumor freigesetzten MMP zurückgeführt werden. Der Dunning Tumor der Copenhagen Ratte kann aus diesem Grund als zuverlässiges Modell zur Untersuchung von synthetischen MMPI angesehen werden.


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Der Gewebeumbau unter physiologischen sowie pathologischen Bedingungen erfolgt unter Zusammenwirkung vieler Enzyme. Deshalb kann eine Hemmung mehrerer MMP durch unspezifische MMPI sinnvoll erscheinen. Einzelne MMP werden in unterschiedlichen Tumorentitäten verstärkt nachgewiesen. Dies macht ein tumorspezifisches Proteasenprofil wahrscheinlich. Der verstärkte Nachweis einzelner MMP, macht den Einsatz spezifischer MMP plausibel.

MMP-2 und MMP-9 werden vermehrt mit der Progression des PCa beim Menschen in Zusammenhang gebracht [207,208]. Die spezifischen MMP des Dunning Tumors sind nicht bekannt. Allerdings zeigt eine neuere Arbeit erhöhte Plasmaspiegel von MMP-9 beim Dunning Tumor der Copenhagen Ratte [209]. Das veränderte Verhältnis von MMP und ihren physiologischen Inhibitoren ist das Ziel neuer Strategien in der Tumortherapie. Die Eignung der pharmakologischen Hemmung der MMP als neuer Therapieansatz wird durch die vorliegende Untersuchung ebenso wie durch Untersuchungen an Tiermodellen anderer Tumorentitäten bestätigt.

Auf der Ebene von in vitro-Untersuchungen und Tierexperimenten muß der Effekt von MMPI mit unspezifischen und spezifischen Inhibitoren weiter untersucht werden, um lokale als auch systemische Wirkungen abgrenzen zu können. Die Untersuchung mit spezifischen und unspezifischen MMPI ist weiterhin notwendig, um den Nettoeffekt im speziellen Tumormodell bessere beurteilen zu können. Die bisherigen klinischen Versuche wurden mit unspezifischen MMPI durchgeführt. Deshalb sollte in weiteren Studien die Wirkung von MMPI nach Bestimmung des tumorspezifischen Proteasenprofils in Zukunft mit spezifischen MMPI erfolgen.


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02.03.2005