Aus der Klinik für Urologie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

"Der Einfluß von Batimastat auf Prostatakarzinom Zellinien und den Dunning Tumor der Ratte"

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

von
Herrn Dietmar Borchert


aus Freiburg im Breisgau

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. PD Dr. med. M. Lein
2. Prof. Dr. med. D. Fahlenkamp
3. PD Dr. med. A. Semjonow

Datum der Promotion: 10.12.2004

Teile dieser Dissertationsschrift wurden in folgenden Arbeiten publiziert:

Lein M, Jung K, Le DK, Hasan T, Ortel B, Borchert D, Winkelmann B, Schnorr D and Loening SA. Synthetic Inhibitor of Matrix Metalloproteinases ( Batimastat ) Reduces Prostate Cancer Growth in an Orthotopic Rat Model. Prostate 2000; 43: 77 - 82

Borchert D, Lein M, Jung K, Schnorr D, Loening SA. Effect of inhibitors of matrix metalloproteinases on prostate carcinoma cell lines and Dunning tumor in rats. European Students Conference 1999, Abstract U 03.

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Epidemiologie des Prostatakarzinoms
  • 1.2 Prostatakarzinom
    • 1.2.1 Diagnostik des Prostatakarzinoms
    • 1.2.2 Therapieprinzipien
    • 1.2.3 Therapie des lokalen Prostatakarzinoms
    • 1.2.4  Therapie des metastasierten Prostatakarzinoms
    • 1.2.5 Therapie des hormonrefraktären Prostatakarzinoms
  • 1.3  Matrix - Metalloproteinasen (MMP)
    • 1.3.1 Systematik und Funktion
    • 1.3.2 Biochemie, Physiologie und Regulation der MMP
    • 1.3.3  Physiologische Inhibitoren der MMP
  • 1.4 Befunde zur veränderten Expression und Aktivität der MMP und deren spezifische Inhibitoren
    • 1.4.1 Zelle
    • 1.4.2 Gewebeverband
    • 1.4.3 Tiermodelle
    • 1.4.4 Mensch
  • 1.5  Befunde über den Einsatz von synthetischen Inhibitoren der MMP
    • 1.5.1 Synthetische Inhibitoren im Tiermodell
    • 1.5.2 Synthetische MMPI in klinischen Studien
  • 1.6 Batimastat
    • 1.6.1 Funktion und Biochemie
    • 1.6.2 Struktur von Batimastat
    • 1.6.3 Einsatz von Batimastat in klinischen Studien
  • 1.7 Tumorzellinien und Tumormodell
    • 1.7.1 PCa-Zellinien
    • 1.7.2  MATLyLu-Zellinie und Tiermodell
    • 1.7.3 Der MTT-Test
• 2  Zielstellung der Arbeit
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Konzeption der Untersuchungen
  • 3.2 Verwendete Tumorzellinien
  • 3.3 Zellkultur
  • 3.4  In vitro Versuch
  • 3.5 MTT Test
  • 3.6 Tiermodell
  • 3.7  Statistische Analyse
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Konzentration, Linearität und Zeitabhängigkeit der MTT Messung
  • 4.2  Wirkung von Batimastat auf Prostatkarzinomzellinien in vitro
  • 4.3  Wirkung von Batimastat im Tiermodell
• 5  Diskussion
  • 5.1 Bewertung des MTT - Test
  • 5.2 Batimastat unter in vitro Bedingungen
  • 5.3 Reduktion des Tumorwachstum im Tiermodell
    • 5.3.1  Tierexperimentelle und klinische Ergebnisse im Vergleich
  • 5.4 MMP und TIMP bei Malignomen
    • 5.4.1 Korrelation von MMP und TIMP bei Malignomen
    • 5.4.2 Maligne Transformation durch MMP und TIMP
    • 5.4.3 Einfluß auf die Tumorinvasion durch MMP und TIMP
    • 5.4.4 Gefäßneubildung durch MMP und TIMP
    • 5.4.5 Wirkung von MMP und TIMP auf die Tumorprogression
    • 5.4.6 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidestattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Übersicht über alle durchgeführten Versuche bei einer Batimastatkonzentration von 40 ng/ml. Angegeben sind die Anzahlen der Versuchsreihen (je Versuch 6 unabhängige Einzelwerte) bei denen unter Batimastat höhere, gleiche oder niedrigere Wachstumsraten im Vergleich zur jeweiligen Vehikelkontrolle gefunden wurden. In Klammern findet sich das Signifikanzniveau aus den einzelnen Versuchsreihen.
• Tab. 2: Proliferationsrate der vier PCa-Zellinien in Prozent gegenüber der jeweiligen Vehikelkontrolle. Mittelwerte der Prozentzahlen aus der Gesamtanalyse von 4-9 Versuchen mit n=24-54. Batimastatkonzentrationen von 40-4000 ng/ml. Werte von Tag 4 und 5 der Versuche.

Bilder

• Abb. 1: DU 145, 5000 Zellen/Versuch. MTT-Konzentration in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (o=6 h, Δ=4 h, ■=2 h). Sechs Einzelversuche je Datenpunkt. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung. Erreichter Farbstoffumsatz der Zellen als Extinktionswerte (OD) dargestellt.
• Abb. 2: DU 145, 2000-100000 Zellen. Die MTT-Messung ist auch bei hohen Zellzahlen linear. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils sechs Einzelversuchen pro Datenpunkt. Erreichte Farbstoffumsätze der Zellen sind als Extinktionswerte (OD) dargestellt.
• Abb. 3: DU 145, 30000 Zellen/Versuch. Die Mikrotiterplatte wurde über 75 Minuten auf dem Plattenrüttler langsam bewegt und in Intervallen von 10 Minuten mit dem Fotometer gemessen. Nach 25 Minuten bleibt die Extinktionsmessung linear. Sechs Einzelversuche je Boxplott. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert, sowie 25. und 75. Perzentile. Erreichte Farbstoffumsätze der Zellen sind als Extinktionswerte (OD) dargestellt.
• Abb. 4: Metabolische Aktivität der PCa-Zellinien. Farbstoffumsatz von jeweils 10000 Zellen bei einer Konzentration von 4 mg/ml MTT und einer Inkubationszeit von 2 h. Die Zellen wurden vor der Messung 24 h bei 37°C kultiviert. Signifikante Unterschiede sind im Vergleich zu DU 145 mit **p < 0,01 angegeben. Jeweils sechs Einzelversuche pro Zellinie. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert, sowie 25. und 75. Perzentile. Erreichte Farbstoffumsätze der Zellen sind als Extinktionswerte (OD) dargestellt.
• Abb. 5: Metabolische Aktivität der Zellinien unter 4000 ng/ml Batimastat. Jeweils 1000 Zellen/Versuch (bzw. LNCaP 2000 Zellen/Versuch). MTT Test nach  4 Tagen. Signifikante Unterschiede sind im Vergleich zu DU 145 mit **p < 0.01 angegeben. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert, sowie 25. und 75. Perzentile.
• Abb. 6: Effekt von Batimastat auf das Zellwachstum von MATLyLu (A) und DU 145-Zellen (B) in den Konzentrationen: ٭ = 40, Ο = 400, ■ = 4000 ng/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils sechs unabhängigen Einzelmessungen. Der Effekt von Batimastat ist in Abhängigkeit von der Vehikelkontrolle (=100%) gezeigt. Signifkante Unterschiede von der Vehikelkontrolle sind mit *p < 0,05 und **p < 0,001 gekennzeichnet.
• Abb. 7: Effekt von Batimastat auf das Zellwachstum von PC-3 (C) und LNCaP (D) in den Konzentrationen: ٭ = 40, Ο = 400, ■ = 4000 ng/ml. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils sechs unabhängigen Einzelmessungen. Der Effekt von Batimastat ist in Abhängigkeit von der Vehikelkontrolle (=100%) gezeigt. Signifkante Unterschiede von der Vehikelkontrolle sind mit *p < 0,05 und **p < 0,001 gekennzeichnet.
• Abb. 8: Analyse von 4-9 Versuchen pro Zellinie mit n=24-54. Werte von Tag 5 der Zellkultur. Eingesäte Zellzahlen am Tag 0 zwischen 500 und 10000 Zellen je Versuch. Proliferation in Wachstumsmedium und Batimastat (40 ng/ml). Mittelwert der Vehikelkontrolle als 100%. Einzelwerte prozentual zur jeweiligen Vehikelkontrolle. Dargestellt sind Maximal-, Median- und Minimalwert sowie 25. und 75. Perzentile. Signifikante Unterschiede sind im Vergleich zu DU 145 mit **p < 0,01 angegeben.
• Abb. 9: Körpergewichte der behandelten Tiergruppe (Batimastat), Vehikelgruppe und Kontrolgruppe. Das mittlere Ausgangsgewicht der drei Gruppen wurde als 100% definiert. Die Mittelwerte der Tiergewichte sind in Prozent wiedergegeben.
• Abb. 10: Tumorgewicht 20 Tage nach der Tumorzellinokulation. Dargestellt sind Einzelwerte und der Mittelwerte.
• Abb. 11: Tumorvolumen in Milliliter (ml) nach 20 Tagen. Dargestellt sind Einzelwerte und Mittelwerte.