Born, Martin Ludovico: Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

Kapitel 1. Einleitung

Die Erforschung molekularer Strukturen ist seit Jahrzehnten eine Aufgabe der modernen Anatomie und Zellbiologie. Die Analysen und Entdeckungen bilden die morphologischen Grundlagen, um fachübergreifende Zusammenhänge subzellulärer Strukturen zu verstehen. So wurde ein enormer Wissenszuwachs auf dem Gebiet verschiedener zellbiologischer Funktionen erreicht. Einen wichtigen Fundus stellt dabei die Grundlagenforschung dar, die für klinische Anwendungen und breite medizinische Neuerungen Nutzen bringt. Durch die immer detaillierteren Erkenntnisse wurde die Blickrichtung der molekularen Zellbiologie beeinflusst.
Die Beschreibung der Mechanismen der exozytotischen Transmitterfreisetzung in Neuronen stand bisher im Interesse der neuroanatomischen Forschung. Das besondere Interesse galt der dabei erforderlichen Membranverschmelzung, die eine Transmitterfreisetzung erst ermöglicht. Es konnten Modelle entwickelt werden, welche einen Einblick in die Prinzipien der Verschmelzung von Membranen erlauben. Neuerdings werden diese Modelle modifiziert auch bei nicht-neuronalen Zellen diskutiert. So wurden Hepatozyten (Fujita et al., 1998), Sammelrohrzellen der Niere (Jo et al., 1995) oder Parietalzellen des Magens (Jöns et al., 1999; Peng et al., 1997) hinsichtlich dieser Aspekte betrachtet. Vor diesem Hintergrund werden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen in Epithelzellen des Urothels der Ratte untersucht.

1.1 Anatomie der Harnblase

Beim Menschen befindet sich die Harnblase zum Teil extraperitoneal im kleinen Becken, zum Teil subperitoneal bzw. präperitoneal hinter der Symphyse. Ventral gelangen die dem Levatorschenkel anliegenden Ligamenta pubovesicalia zum Blasenhals, dorsal ist die Harnblase über das Ligamentum rectovesicale verbunden. Beim Mann ist die Harnblase fest mit der Prostata verwachsen. Bei der Frau ist die Harnblase an der Vorderwand der Vagina und der Cervix uteri gelegen, wobei eine weit weniger starke Fixierung der Harnblase ausgebildet ist. Über die Ligg. vesicosacralia ist die Harnblase zusätzlich an der Vorderfläche des

Kreuzbeines fixiert.
Als glattmuskuläres Hohlorgan sammelt sie den Urin aus den Nieren. Der Urin erreicht die Harnblase über die beiden Ureteren, die Harnleiter. Die physiologisch gefüllte Harnblase fasst durchschnittlich 350 ml. Die Form der Harnblase wechselt stark mit dem Füllungszustand und gewinnt so auch Einfluss auf die Lage der benachbarten Organe, wie den anliegenden Organabschnitten von Ileum oder Rectum.
Die Muskelschicht wird in drei Hauptlagen unterteilt: Eine innere und eine äußere jeweils längs verlaufende sowie eine mittlere mehr ringförmig verlaufende Schicht, die alle durch zum Teil abbiegende Verlaufsrichtungen miteinander in Verbindung stehen (Abb. 1) . Das Peritoneum überzieht den dorsalen Bereich und schlägt dann auf das Rectum über.
Die Miktion wird durch die Erschlaffung der Muskeln im Bereich der Harnröhrenöffnung eingeleitet. Infolge von Kontraktionen der Ringfasern nimmt bei der Blasenentleerung der horizontale Durchmesser ab und der vertikale Durchmesser zu. Der Druck der von oben lastenden Bauchorgane gegen die vertikale Achse führt zu einer Abknickung der Harnblase gegen die Harnröhre. Dadurch werden die Mm. pubovesicales gespannt und die Öffnung des Ostium urethrae internum nach vorn erweitert. Durch die Reduzierung des horizontalen Blasendurchmessers verringert sich der venöse Gefäßtonus infolge der Muskelspannung, so dass die venösen Geflechte des Uvulapolsters entleert werden. Längsfasern der Tunica muscularis, die in die Uvula ausstrahlen, werden durch die seitliche Ausdehnung gespannt und ziehen somit die Uvula zusätzlich aus dem Ostium urethrae int. der Harnblase. Die mechanische Abflussbehinderung des Urins durch die Uvula ist dadurch aufgehoben.
Die Versorgung der Harnblase mit Sauerstoff, Wärme und Nährstoffen erfolgt über die Aa. vesicales superiores, Äste aus der A. umbilicalis und aus der A. vesicalis inferior, einem Ast aus dem parietalen Abschnitt der A. iliaca interna. Das Blut des submukösen, intramuskulären und superfiziellen Venenplexus wird beim Mann über den Plexus venosus vesicoprostaticus abgeleitet und mündet in die Vv. iliacae internae. Bei der Frau erfolgt der venöse Abfluss auch über ein ausgeprägtes Venengeflecht, das Corpus spongiosum urethrae.
Die nervale Versorgung der Harnblase erfolgt über sympathische Fasern aus dem

lumbalen Lendenmark und parasympathische Fasern aus dem Sakralmark. Der Blasenwand liegt ein vegetativer Plexus an; die Reflexzentren für die Füllung und Entleerung der Harnblase liegen im Lumbal- bzw. Sakralmark. Die übergeordneten Zentren befinden sich im Hirnstamm. Der sympathische Teil regelt durch ein Nachlassen der Wandspannung die Füllung, der parasympathische Teil, aufgrund der Kontraktion des M. detrusor vesicae, die Entleerung.
Mit dem Urin werden Stoffwechselendprodukte ausgeschieden. Dazu gehören als Hauptbestandteile zum einen Harnstoff aus dem Stickstoffwechsel und zum anderen Kreatinin, dass sich durch Zyklisierung aus Kreatin spontan bildet und das Endprodukt des Muskelstoffwechsels ist. Urochrome, die beim Hämoglobinabbau entstanden, färben den Urin gelblich. Als Stellglied im Flüssigkeitshaushalt reguliert die Niere das Flüssigkeitsvolumen des Körpers und kann somit auf die Druckregulierung des Herzkreislaufsystems einwirken. Über die Ausscheidung bzw. Rückresorption von Ionen stellt die Niere einen wichtigen Regulationsmechanismus des Blut-pH-Wertes dar. Das Säure-Basen-Verhältnis des Körpers kann so über die Urinausscheidung reguliert werden. Physiologischerweise entstehen 0,5 bis 2 l Urin pro Tag. Der pH-Wert des Urins kann eine große Schwankungsbreite von etwa 4,5 bis über 8,3 aufweisen.
Mit dem Urin werden verschiedene Ionen ausgeschieden und es befinden sich auch unter physiologischen Bedingungen Proteine im Urin. Die Proteinausscheidung kann bis zu 200 mg pro Tag betragen. Modifizierte Aminosäuren-Derivate, wie Hydroxyprolin aus dem Kollagenstoffwechsel, werden als diagnostische Marker genutzt. Des Weiteren werden Metabolite verschiedener Hormone oder Hormone selbst über den Urin ausgeschieden, die ebenfalls als Marker klinisch von Bedeutung sind. So wird z.B. der Nachweis von Choriongonadotropin im Urin als immunologischer Schwangerschaftsnachweis benutzt.

1.2 Übersicht über das Harnblasenepithel

Nach innen ist die Tunica muscularis durch eine lockere Tela submucosa mit der Schleimhaut, der Tunica mucosa, verbunden (Abb. 1). Im Bereich des

Blasengrundes, dem Trigonum vesicae, kommt keine Submukosa vor. Die harnleitenden Organe sind von einem hochdifferenzierten Epithelgewebe, dem Übergangsepithel, ausgekleidet. Hierbei handelt es sich um ein mehrreihiges bis mehrschichtiges Epithel (Drenckhahn, 1994). Verschiedene Autoren rechnen das Harnblasenepithel zur Gruppe der mehrreihigen Epithelien (Leonhardt, 1986). Eine allgemeingültige Klassifizierung ist bisher noch nicht erfolgt. Das Übergangsepithel besteht aus Basalzellen, Intermediärzellen und Deckzellen. Die zum Harnblasenlumen weisenden Deckzellen sind die größten Zellen dieses Epithels und besitzen stielförmige basale Ausziehungen, die bis zur Basallamina herunterreichen können. Diese Eigenschaft wird als partielle Mehrreihigeit beschrieben. Aufgrund der großen Füllungsunterschiede der Harnblase werden die Deckzellen temporär stark gedehnt und dabei abgeflacht. Die Deckzellen entwickeln sich aus den Basalzellen. Durch Teilung dieser oder Verschmelzung von zwei Zellen bilden sich über Intermediärzellen letztendlich die ausdifferenzierten Deckzellen. Diese Entwicklung ist in etwa elf Wochen abgeschlossen. Die Deckzelle kann sich im gedehnten Zustand über einer Fläche bis zu ca. 7500 µm² ausbreiten und hat dann einen Durchmesser von ca. 100 µm. Aus autoradiographischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Deckzellen eine durchschnittliche Lebensspanne von etwa 200 Tagen haben (Leonhardt, H., 1990).
Die apikale Zellmembran der Deckzellen ist potenziell aggressiven, zellschädigenden Substanzen aus dem Urin ausgesetzt. Der Schutz tieferliegender Zell- und Gewebsschichten wird durch die zwischen den Deckzellen sehr gut ausgebildeten Zonulae occludentes gewährleistet. Eine parazelluläre Passage von Urin wird so verhindert. Die apikale Plasmamembran dieser Zellen weist darüber hinaus eine auffällige Modifikation auf, welche elektronenmikroskopisch als asymmetrische Plasmamembran imponiert. Die stärkere äußere Lamelle (8 nm statt normal 4 nm) ist die prominenteste Struktur in der Lipiddoppelschicht (Hicks, 1965 und Koss, 1969). Ein dichtes Netz von Intermediärfilamenten und Aktinfilamenten unterhalb der apikalen Membran ist für eine verstärkte Anfärbbarkeit des apikalen Zytoplasmasaums der Deckzellen verantwortlich. Dieser Bereich wurde früher als „Crusta“ bezeichnet und wird heute nicht mehr verwendet.

Abb. 1: Harnblase - Übersicht (mod. n. Krstiæ)

E
Lp
Tsm
Sli
Sc
Sle
Tss
Tse
Ta

Epithel (gefaltet)
Lamina propria
Tela submucosa
Stratum longitudinale internum
Stratum circulare
Stratum longitudinale externum
Tela subserosa
Tunica serosa
Tunica adventitia (nur in retroperitonealen Organabschnitten)

Abb. 2: Harnblase - Urothel (mod. n. Krstiæ)

Die apikale Plasmamembran wird durch zahlreiche dichtgepackte Urothel-Plaques gebildet (Abb. 2). Diese enthalten in einer sehr hohen Konzentration Uroplakin als integrales Membranprotein. Bisher wurden drei Subtypen isoliert. Die Uroplakinmoleküle bilden hexagonale Strukturen aus, die anscheinend durch ihre symmetrische, fast parakristalline Anordnung den Plaques und damit auch der apikalen Membran der Deckzellen ihre Rigidität und hohe chemische Resistenz verleihen. Das asymmetrische Bild der Plasmamembran lässt sich der unterschiedlichen Verteilung des Uroplakins in der Membran zuschreiben, da die extrazelluläre Domäne des Uroplakins wesentlich größer ist als die intrazelluläre (Liang et al., 2001). Von den bisher bekannten Subtypen haben nur die Uroplakinsubtypen I und III zytoplasmatische Domänen (Wu und Sun, 1993). Neben dieser einzigartigen Modifikation der apikalen Plasmamembran weisen Deckzellen eine weitere Besonderheit auf. Intrazellulär befinden sich zahlreiche vesikuläre Strukturen mit einem teils fusiformen, teils diskoiden Aussehen. Diese können als eine Art apikale Reservemembran angesehen werden, da auch diese Vesikel den asymmetrischen Membranaufbau zeigen und aus Urothel-Plaques bestehen. Durch einen, in seinem Mechanismus noch nicht verstandenen Fusionsvorgang verschmelzen diese Vesikel mit der apikalen Membran und erlauben so möglicherweise eine schnelle Anpassung an eine vermehrte Blasenfüllung. Eventuell verlangt aber auch die Zusammensetzung des Urins mit einem sauren oder basischen pH-Wert eine beschleunigte Erneuerung von angegriffenen Membranabschnitten.Die asymmetrische Membran bildet somit

zusammen mit den Zonulae occludentes die effektive Blut-Urin-Schranke (Jezernik et al., 1993; Chang et al., 1994). Da es sich bei den Uroplakinen, insbesondere Uroplakin III, um spezifische, nur in Deckzellen des Urothels vorkommende Membranglykoproteine handelt, wird Uroplakin als morphologischer Tumormarker für metastasierende Urothelzellkarzinome eingesetzt (Moll et al., 1993). Die Identifizierung der Uroplakine findet darüber hinaus auch in der immunohistochemischen Differentialdiagnostik bei urothelialen Karzinomen Anwendung (Kaufmann et al., 2000).
Als weitere Besonderheit konnten spezifische Urothelzytokeratine identifiziert werden. Die für einschichtige Epithelien obligaten Zytokeratine 8 und 18 werden durch das Zytokeratin 20 (CK 20) ergänzt. Dieses charakterisiert die enddifferenzierten Deckzellen, während die Basal- und Intermediärzellen kein Zytokeratin 20 synthetisieren. Während der Differenzierung der Urothelzellen kommt es zu einem Wechsel der Synthese von CK 17 zu CK 20. Die enddifferenzierte Deckzelle enthält kein Zytokeratin 17 (CK 17) mehr.
Wie fast alle eukaryontischen Zellen besitzen die Deckzellen auch Aktinfilamente. Diesen kommt nach Untersuchungen von Romih et al. (1999) eine wichtige Funktion bei der Regeneration der Zellen zu. Nach Schäden der apikalen Membran konnte eine Ausrichtung von Aktinfilamenten längs zur luminalen Plasmamembran beobachtet werden. Dies führt zu einer Verstärkung der apikalen Membran. Diese zellspezifischen Beobachtungen führen zu einem einheitlichen Muster bei der Differenzierung dieser Zellen. Deshalb kann die subzelluläre Verteilung von Aktinfilamenten auch als Marker der urothelialen Differenzierung herangezogen werden (Romih et al., 1999).

1.3 Prinzipien der Membranfusionen

In Epithelzellen stehen zwei Möglichkeiten einer polaren Verteilung der Membranproteine zur Verfügung (Caplan 1997). Ein vektorieller Transport, bei dem Membranproteine in trans-Golgi Netzwerke sortiert werden, um dann in Transportvesikeln zielgerichtet zur apikalen oder basolateralen Plasmamembran transportiert zu werden (Simons et al., 1990; Drubin et al., 1996). Die zweite Möglichkeit wird durch die transzytotische Steuerung beschrieben. Bei diesem

Transport werden Membranproteine nach dem Zufallsprinzip in die basolaterale oder apikale Plasmamembran eingebaut. „Falsch eingebaute“ Proteine werden als solche erkannt und durch den Prozess der Transzytose zur korrekten Membrandomäne oder zum lysosomalen Kompartiment transportiert (Drubin et al., 1996; Weimbs et al., 1997). Dabei ist es von Bedeutung, dass bei der Fusion von Vesikeln die Lumenseite der Vesikelmembran zur Außenseite der Plasmamembran wird. Dadurch befinden sich transmembranale Glykoproteine mit ihren Kohlenhydratgruppen auf der extrazellulären Seite der Membran.
In den Deckzellen des Urothels kommt es zum exozytotischen Vesikeltransport. Die in Kap. 1.2 beschriebenen diskoiden Vesikel verschmelzen dabei mit der luminalen Plasmamembran, um so verbrauchte Membranbestandteile zu erneuern. Dazu werden Vesikelmembranen in die Plasmamembran eingebaut. Es handelt sich also um eine Fusion von Membranen. Fusionen zwischen Membranbestandteilen sind innerhalb von Zellen häufig zu beobachten. Es können entweder Membranen von unterschiedlichen Kompartimenten oder von nur einem Kompartiment beteiligt sein. Die Endozytose sowie die Exozytose sind durch die Verschmelzung von zwei Membranen gekennzeichnet. Die Membranfusionen können somit in beide Richtungen ablaufen. Die Internalisierung von Membranabschnitten wird als Vesikulation bezeichnet. Der entscheidende Punkt bei einer Fusion ist, die räumliche Annäherung getrennter Membranen. Bei dieser Annäherung müssen mechanische Zwänge durch die entgegenwirkenden Membranen überwunden werden. Hierbei wird, durch Konformationsänderungen der an diesem Prozess beteiligten Proteine, Energie verbraucht. Diese Energie muss zur Einleitung der eigentlichen Fusion durch energietragende Moleküle, zum Beispiel ATP, bereitgestellt werden.

1.4 Die SNARE-Hypothese

Die molekularen Mechanismen, die den Fusionsvorgängen zugrunde liegen, sind insbesondere an Hefezellen und Neuronen untersucht worden. In der von Rothman aufgestellten SNARE-Hypothese (Rothman, 1994) werden SNAP-Rezeptor-Proteine angenommen, die für die Membranfusionen erforderlich sind. Diese SNARE-Hypothese erlaubt es eine bestimmte Art von Fusionsvorgängen

zu beschreiben wie sie z.B. bei der exozytotischen Freisetzung von Neurotransmittern durch Fusion der synaptischen Vesikel mit der präsynaptischen Membran vorkommt. Sie stellt mit der Assoziation verschiedener Membranproteine, sowie zytosolischer Proteine untereinander, als einleitender und wichtiger Schritt der nachfolgenden Membranfusion eine gute Modellvorstellung dar. Nach dieser Hypothese werden Proteinrezeptorpaare der Vesikel (v-SNARE-Proteine) und der Ziel-(target)membran (t-SNARE-Proteine) unterschieden. Die v-SNAREs umfassen die Familie der Synaptobrevine; sie werden auch als vesikel-assoziierte Membranproteine (VAMPs) bezeichnet. Die Familie der Syntaxine und SNAP 25 gehören zu den t-SNARE- Proteinen. Diese SNAP-Rezeptor-Proteine bilden miteinander einen initialen Haftkomplex aus. Dieser Komplex bildet sich nicht nur in vivo, sondern auch spontan in vitro und ist gegen starkes Erhitzen und SDS-Behandlung resistent (Söllner et al., 1993; Calakos et al., 1994). Neben den SNARE-Proteinen spielen nach dem Modell der SNARE-Hypothese auch die zytosolischen Proteine NSF (N-ethylamid-sensitive factor), eine ATPase, und die alpha

-SNAPs eine wichtige Rolle (Wilson et al., 1989). In vivo löst NSF als Chaperonemolekül den SNARE-Komplex. NSF selbst wird durch SNAP (soluble NSF attachment protein) an die Vesikelmembran gebunden. Mit der ATP-Hydrolyse durch NSF wird der SNARE-Komplex dissoziiert und damit die eigentliche Fusion der Lipidmembranen eingeleitet.In neueren kristallographischen Untersuchungen wurde bei den Syntaxinen die Aminosäure Glutamin (Q) und bei den Synaptobrevinen ein Argenin (R) an zentraler, funktionell bedeutender, Position lokalisiert (Jahn und Südhoff, 1999). Diese Beobachtung führte zu einer neuen Terminologie für die SNARE-Proteine. Danach werden die SNARE-Proteine, deren Mitglieder im Verteilungsmuster nicht streng nach Vesikel- und Zielmembran getrennt werden können (Jahn et al., 1999), nach ihren molekularen Eigenschaften bezeichnet. Es werden Q-SNAREs und R-SNAREs unterschieden.
Neben den eigentlichen SNARE-Proteinen sind zahlreiche regulatorische Proteine beschrieben worden, die für die Fusionsvorgänge von Bedeutung sind. Kleine GTP bindende Proteine der Rab-Familie, die bei Säugern etwa 40 Formen umfasst, stellen eine Gruppe von Faktoren für den Fusionsprozess. Für die synaptische Vesikelfusion spielt Rab3A eine Rolle. Möglicherweise wirken Rab-

Proteine auch bei der Membranerkennung und der initialen Anheftung mit (Cao et al., 1998, Ungermann et al., 1998a). Eine abschließende Bedeutung der Rab-Proteine für den Fusionsprozess konnte bisher noch nicht gefunden werden (Chavrier et al., 1990; Rothman et al., 1997). Für weitere Proteine, wie den Munc 18-Isoformen, wurden ebenfalls regulatorische Funktionen beschrieben. Munc 18 bindet an Syntaxin. Dadurch wird die Komplexbildung mit SNAP 25 oder Synaptobrevin verhindert (Hata et al., 1993). In Neuronen begünstigt ein weiteres Regulatorprotein als Kalziumsensor den Übergang in den vollfusionierten Zustand der Membranen.
In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass nicht nur in Neuronen und in Hefe, sondern auch in anderen Zellen Fusionsvorgänge nach einem vergleichbaren Muster ablaufen können.
In verschiedenen Epithelzellen konnten bereits Isoformen bestimmter SNARE-Proteine identifiziert werden. Beispiele hierfür sind die Hepatozyten der Leber (Fujita et al., 1998), die Parietalzellen des Magens (Jöns et al. 1999; Peng et al., 1997) oder die Sammelrohrzellen der Niere (Jo et al., 1995). SNAP 23, eine Isoform von SNAP 25, wurde in den Zellen von verschiedenen Geweben beschrieben (Ravichandran et al., 1996). Die eindeutige Zuordnung von SNAP 23 zu bestimmten Membrankompartimenten war bisher jedoch nicht möglich. In den Azinuszellen des Pankreas kommt SNAP 23 basolateral vor, in MDCK-Zellen hauptsächlich apikal (Low et al., 1998).

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