Born, Martin Ludovico: Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

18-20

Kapitel 3. Materialien und Methoden

3.1 Chemikalien und Reagenzien

Reagenz

Hersteller

Aceton

Herbeta (Berlin)

Acrylamid Stammlösung (30%)

Roth (Karlsruhe)

Äther zur Narkose

Roth (Karlsruhe)

Agarose

Merck (Darmstadt)

Albumin Rinderserum (BSA)

Roth (Karlsruhe)

Alkohol (unvergällt)

Merck (Darmstadt)

Ammoniumpersulfat

Sigma (München)

Ammoniumsulfat

Roth (Karlsuhe)

Araldit

Serva (Heidelberg)

Bisacrylamid Stammlösung (30%)

Roth (Karlsruhe)

Bleinitrat

Merck (Darmstadt)

Bromphenolblau

Sigma (München)

Chloronaphtol

Bio - Rad (Hercules, CA, USA)

Diaminobenzidin (DAB)

Sigma (München)

Dimethyl-Sulfoxid (DMSO)

Roth (Karlsuhe)

Dithioeritherol (DTE)

Roth (Karlsruhe)

DNAse I aus Rinderpankreas

Roche (Mannheim)

Dodecylbernsteinsäureanhydrid

Fluka (Neu - Ulm)

ECL™ (Enhanced Chemiluminescence)

Amersham (Buckinghamshire, GB)

Epon

Fluka (Neu - Ulm)

Ethanol

Merck (Darmstadt)

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)

Roth (Karlsruhe)

Ethylenglykol, bis(2-aminoethyl)tetraacetsäure (EGTA)

Roth (Karlsruhe)

Formvar (0,3 % in 1,2-Dichlorethan)

Serva (Heidelberg)

Glutaraldehyd

Fluka (Neu - Ulm)

Glycerin

Merck (Darmstadt)

Glycin

Merck (Darmstadt)

Hybond C (Nitrozellulose)

Amersham (Buckinghamshire, GB)

Imidazol

Sigma (München)

Low Molecular Weight Marker (LMW)

Pharmacia Biotech (Uppsala, S)

Magermilchpulver

Glücksklee (München)

Metaperjodat

Merck (Darmstadt)

Methanol

Merck (Darmstadt)

2-Methylbutan

Roth (Karlsruhe)

Mowiol

Hoechst (Frankfurt a. M.)

Natriumchlorid (NaCl)

Merck (Darmstadt)

Natriumcitrat

Merck (Darmstadt)

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Boehringer Mannheim

Natrium-Methylat

Fluka (Neu - Ulm)

Natriumtetraborat

Merck (Darmstadt)

Nitrozellulose

Schleicher & Schuell (Kassel)

Nonidet® 40

Fluka (Neu - Ulm)

Osmiumtetroxid

Merck (Darmstadt)

Paraformaldehyd (PFA)

Merck (Darmstadt)

Perjodsäure

Merck (Darmstadt)

Pikrinsäure

Odczyniki Chemczne (Gliwice, P)

Polyethylenglykol 20.000

Roth (Karlsruhe)

Ponceau S

Sigma (St. Louis, USA)

Propylenoxid

Serva (Heidelberg)

 

Proteinase Inhibitoren:

Aprotinin

Boehringer Mannheim

Leupeptin

Boehringer Mannheim

Pepstatin

Boehringer Mannheim

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)

Roth (Karlsruhe)

 

Protein A [aus Staph. aureus] Sepharose

Pharmacia Biotech (Uppsala, S)

Sucrose

Merck (Darmstadt)

Tetramethylethyldiamin (TEMED)

Sigma (München)

Toluidin Blau

Merck (Darmstadt)

Toluol

Merck (Darmstadt)

Trisdimethylaminomethylphenol

Fluka (Neu - Ulm)

Triton X-100

Roth (Karlsruhe)

Tween 20

Merck (Darmstadt)

Wasserstoffperoxid (H2O2)

Merck (Darmstadt)

Ziegenserum (NGS)

Pan-Systems (Aidenbach)

 


21

3.2 Puffer und Lösungen

Antikörper-Lösung für Immunofluoreszenzmikroskopie

1,5 %

Rinderserum Albumin in PBS

Antikörper- / Block-Lösung für Immunogoldmarkierung

140 mM

NaCl

 

5

MM

Tris

pH 7,6 (HCl)

1

L

Aqua dest.

 

1

%

NGS

 

1

%

BSA

 

0,1

%

Triton X-100

 

Antikörper-Lösung für Immunogoldmarkierung

140 mM

NaCl

 

5 mM

Tris

pH 8,2 (HCl)

1 l

Aqua dest.

 

0,1 %

Triton X-100

 

Antikörper- / Block-Lösung für Westernblot-Analysen

10 %

Magermilchpuffer in PBS

Block-Lösung für Immunofluoreszenz

2 %

BSA in PBS

Fixationspuffer für Elektronenmikroskopie

4 %

PFA

pH 7,4 mit Phosphat abgepuffert

0,2 %

Pikrinsäure

 

0,05 %

Glutaraldehyd

 

Immunopräzipitationspuffer

150 mM

NaCl

 

10 mM

Tris

pH 7,4

1 mM

EDTA

 


22

1 mM

EGTA

 

0,2 mM

Na - Vanadat

 

0,2 mM

PMSF

 

1 %

Triton X 100

 

0,5 %

Nonidet® P40

 

Kontrastierungslösung nach Reynolds®

120 mM

Natriumcitrat

 

80 mM

Bleinitrat

 

8 ml

1N Natronlauge

pH 12.0

auf 50 ml

Aqua dest

 

Phosphatpuffer (PBS)

140 mM

NaCl

10 mM

Na2HPO4

2,7 mM

KCl

1,8 mM

KH2PO4


Ponceau-S Lösung

0,5 %

Ponceau S

3 %

Trichloressigsäure

Präparationspuffer für Membranpräparation

250 mM

Sucrose

ph 7,3

10 mM

DTE

 

5 mM

Imidazol

 

5 mM

EDTA

 

1 µg/ml

Aprotinin

 

1 µg/ml

Pepstatin

 

1 µg/ml

Leupeptin

 

1 µmol/ml

PMSF

 

1 Spsp

DNAse

 


23

Probenpuffer (3x)

4 M

Glycerin

 

200 mM

SDS in Aqua dest.

 

180 mM

Tris

pH 6,9 (HCl)

12 M

DTE

 

800 µl

Bromphenolblau (6 M)

 

 

 

ad 40 ml Aqua dest.

Sammelgel-Puffer (4x)

500 M

Tris

pH 6,8

15 mM

SDS

 

 

ad 1 Liter Aqua dest.

 

Spüllösung für Westernblot-Analysen

0,1 %

Tween 20 in PBS

Transblotpuffer (Semi Dry)

192 mM

Glycin

 

25 mM

Tris

pH 8,3

20 %

Methanol

 

Tris I

500 mM

Tris

pH 6,8 (HCl)

0,4 %

SDS

 

Tris II

1,5 M

Tris

pH 8,8 (HCl)

0,4 %

SDS

 

Toluidinfärbelösung

1,2 M

Sucrose

 

100 ml

Aqua dest.

pH 9,3

25 mM

di-Natriumtetraborat

 


24

15 mM

Toluidinblau

 

Trenngel-Puffer (4x)

1 M

Glycin

 

120 mM

Tris

pH 8,8

20 mM

SDS

 

 

auf 1 Liter Aqua dest.

 

3.3 Verwendete Antikörper

Primäre Antikörper

Antikörper

Bezugsquelle und Referenz

alpha - Actin (Klon 1A4)
monoklonal, Maus

Sigma, St. Louis, USA
Skalli et al. (1986)

Zytokeratin 17 (Klon E3)
monoklonal, Maus

Dako, Glostrup, Dänemark
Moll et al. (1982)

Zytokeratin 20 (Klon Ks 20.8)
monoklonal, Maus

Dako, Glostrup, Dänemark
Moll et al. (1990)

SNAP 25 (Klon SMI 81)
monoklonal, Maus

Sternberger Monoclonals, Baltimore, USA
Mehta et al. (1996)

SNAP 23
polyklonal, Kaninchenserum

Synaptic Systems, Göttingen
Südhof et al. (1995)

alpha - SNAP
monoklonal, Maus

Synaptic Systems, Göttingen
Rothman, J. E. (1994)

Synaptobrevin II
polyklonal, Kaninchen

R. Jahn, Göttingen
Edelmann et al. (1995)

Synaptobrevin II (Klon 69.1)
monoklonal, Maus

Synaptic Systems, Göttingen
Edelmann et al. (1995)

Syntaxin (Klon HPC-1)
monoklonal, Maus

Sigma, St. Louis, USA
Barnstable et al. (1985)

NSF
polyklonal, Kaninchen

Synaptic Systems, Göttingen
Südhof, T. C. (1995)

Uroplakin (Klon AU1)
monoklonal, Maus

ProGen, Heidelberg
Wu et al. (1993)

Die gegen die verschiedenen Zytokeratine eingesetzten Antikörper sind nach Moll et al. (1982) klassifiziert. Die Zytokeratine 17 und 20 haben beide eine Größe von 46 kDa und sind in verschiedenen Epithelzellen beschrieben worden (Moll et al.,


25

1982 und 1990).
Actin ist ein ubiquitäres Protein, welches in fast allen Zellen exprimiert wird. Verschiedene Actinisoformen sind beschrieben worden. Der hier eingesetzte Antikörper ist gegen alpha-Actin, die Isoform der glatten Muskulatur, gerichtet (Skalli et al., 1986).
Gegen SNAP 25 wurde ein monoklonaler Antikörper gegen den C-Terminus des Peptids eingesetzt. Dieser Antikörper ist in synapsenreichen Gebieten des Gehirns und der Retina spezifiziert (Mehta et al., 1996).
Die Detektion des R-SNARE-Proteins Synaptobrevin war durch das polyklonale Antiserum möglich. Für die ultrastrukturellen Untersuchungen wurde ein monoklonaler Antikörper eingesetzt. Es handelt sich hierbei um ein spezifisches Antiserum gegen das Synaptobrevin II. Das Molekulargewicht liegt für Synaptobrevin II bei 18 kDa (Edelmann et al., 1995).
Für Syntaxin, als Q-SNARE-Protein, wurde der Antikörperklon HPC-1, gerichtet gegen die extrazelluläre Domäne des Proteins, eingesetzt. Syntaxin hat ein Molekulargewicht von 35 kDa und wurde überwiegend in neuronalen Geweben spezifiziert (Barnstable et al., 1988).
Der Klon AU1 ist gegen Uroplakin III gerichtet. Uroplakin ist ein urothelspezifisches Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 47 kDa im Urothel. Nach Deglykosilierung wird in der Westernblotanalyse eine zusätzliche Proteinbande von 30 kDa gefunden (Wu und Sun, 1993). Die Hybridkultur wird als immunhistologischer Marker, zur Differenzierung verschiedener Karzinome, in der Pathologie eingesetzt (Kaufmann et al. 2000).

Sekundäre Antikörper

Antikörper

Bezugsquelle

Pferd anti - Maus IgG
Peroxidase gekoppelt

Vector Laboratories, Burlingham, USA

Ziege anti - Kaninchen IgG
Peroxidase gekoppelt

Vector Laboratories, Burlingham, USA

Esel anti - Maus IgG
Texas Red™ gekoppelt

Jackson Laboratories, West Grove, USA

Ziege anti - Kaninchen IgG
Texas Red™ gekoppelt

Jackson Laboratories, West Grove, USA


26

Ziege anti - Kaninchen IgG
Oregon Green™ gekoppelt

Molecular Probes, Eugene, USA

Ziege anti - Kaninchen IgG
5 nm Gold gekoppelt

Amersham, Uppsala, Schweden

Ziege anti - Maus IgG
10 nm Gold gekoppelt

Aurion, AA Wageningen, Niederlande

3.4 Verwendete Geräte

Zentrifugen

Beckmann Optima™ TL Ultrazentrifuge

Rotor: TLA 100.4 (Palo Alto, USA)

Beckmann J2 - HS

Rotor: JA 14, JA 20 (Palo Alto, USA)

Eppendorf Zentrifuge 5402

(Hamburg)

Elektrophorese

Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)
Power Pac 200 Netzgerät (Bio-Rad)
Mini-Protean® II Elektrophorese-Kammer (Bio-Rad)

Mikroskopie

Gefriertrockner Edwards (Crawley, UK)
Ultramikrotom Leica (Bensheim)
Epifluoreszenz-Mikroskop mit Durchlichteinrichtung Leica DMLB (Wetzlar)
Digitalkamera SPOT INTAS (Göttingen)
Transmissionselektronenmikroskop Zeiss EM 900 (Oberkochen)


27

3.5 Durchführung der Experimente

3.5.1 Membranpräparation des Harnblasenepithels

Zur Herstellung der Membransuspension für die Westernblotanalyse wurden Harnblasen adulter Ratten verwendet. Es wurden ausschließlich adulte Wistar-Ratten beider Geschlechter verwendet. Die Tiere wurden nach tiefer Äthernarkose dekapitiert. Nach Freipräparieren der Harnblase wurde das Gewebe schnell extrahiert und anschließend mit 4°C-kaltem Präparationspuffer gespült. Zur Epithelgewinnung wurde die luminale Harnblasenwand mit Präparationspuffer mit enthaltenen Proteaseinhibitoren beträufelt und mit einem Skalpell vorsichtig abgeschabt. Die Zellsuspension wurde mit dem Präparationspuffer auf 3 ml aufgefüllt und mit dem Glas-Teflon-Homogenisator homogenisiert.
Zur Weiterverarbeitung wurde das Homogenat 10 min mit 1_200 g in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Das so erhaltene Sediment enthält Zellkerne und nichtlysierte Zellen sowie größere Zelltrümmer. Der Überstand wurde bei 150_000 g in der Ultrazentrifuge von Beckmann 30 min zentrifugiert. Danach konnte der Überstand dekantiert und die sedimentierten Membranen in Probenpuffer für die Elektrophorese aufgenommen werden. Alle Schritte erfolgten bei 4 °C.

3.5.2 Protein-Gelelektrophorese und Westernblot-Analyse

Die Proteinsuspensionen wurden in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt (mod. n. Laemmli). Die in Probenpuffer aufgenommenen Proteinsuspensionen wurden vor dem Auftragen für 10 min, bei 95 °C erhitzt. Die Auftrennung erfolgte, wenn nicht anders aufgeführt, mit 12 % Gelen. Als Marker diente ein kommerzieller Standard (LMW) mit Proteinbanden von 14.4 kDa bis 94 kDa. Das Gel war wie folgt zusammengesetzt:

 

Trenngel 12%

Sammelgel 3%

 

Tris II

2000 µl

Tris I

500 µl

Acrylamid Stock 30%

3200 µl

200 µl

Bisacrylamid Stock 30%

1280 µl

80 µl

H2O

1520 µl

1220 µl

Temed

10 µl

2,6 µl


28

10% APS

80 µl

20 µl

Die Proteine wurden nach der Auftrennung im SDS-Gel bei 0,3 A / Gel 20 min auf Hybond C Nitrozellulosemembran im Sandwichverfahren elektrotransferiert. Dazu wurde das Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell System (Bio-Rad) benutzt. Zur Optimierung des Proteintransfers wurde die Nitrozellulosemembran und das Filterpapier in Transblotpuffer 20 min inkubiert.
Zur reversiblen Visualisierung der aufgetrennten Proteine wurde die Nitrozellulosemembran in Panceau-S Lösung 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit Aqua dest. gespült. Danach konnte die Nitrozellulose entsprechend der Marker beschriftet und geschnitten werden. Zur Suppression unspezifischer Proteinbindungsstellen (Johnson et al.,1984) wurden die Nitrocellulosestreifen 1 h in Blocklösung inkubiert.
Die Inkubation mit den Primärantikörpern erfolgte über Nacht bei 4 °C. Der entsprechende sekundäre Antikörper wurde 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach jeder Inkubation wurden die Nitrozellulosestreifen 3 x 15 min in Spüllösung gewaschen. Alle Inkubationen und Waschschritte erfolgten auf einem Schüttler bei 150 rpm.
Die Visualisierung der antikörpermarkierten Proteinbanden erfolgte über Lumineszenz. Dazu wurde das ECL™-Westernblot Analysesystem von Amersham benutzt.

3.5.3 Immunopräzipitation

Zur Analyse der verschiedenen Protein-Proteininteraktionen wurden Immunopräzipitationen durchgeführt. Zu einem ml Membransuspension [beschrieben unter 3.5.1 ] mit ca. 200 µg Protein in 100 µl Präzipitationspuffer wurden 3 µl eines polyklonalen SNAP 23 Antiserums gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurde 30 µl Protein A-Sepharose (50%) zur Lösung gegeben und für weitere 4 h auf dem Rotationsschüttler inkubiert. Nach dreimaliger Waschzentrifugation mit Immunopräzipitationspuffer wurde die Protein A-Sepharose in Probenpuffer resuspendiert und für 10 min aufgekocht (Anderson et al.,1981). Danach erfolgte die elektrophoretische Auftrennung und der Elek


29

trotransfer auf Nitrozellulose. Die Detektion der im Komplex gebundenen Proteine erfolgte durch Antikörperinkubation und ECL™-Visualisierung.
Parallel dazu wurde eine Immunopräzipitation mit SNAP 25 Antiserum durchgeführt.

3.5.4 Proteinfällung

Zur Gewinnung von Protein aus humanem physiologischen Urin wurden 800 ml Urin in Dialysierschläuche Visking 20/32 (Roth, Karlsruhe) über Nacht gegen Aqua dest. dialysiert. Anschließend wurde das Dialysat unter Polyethylglykol auf ca. 30 ml eingeengt. Es erfolgte die Zugabe von gekühlter gesättigter Ammoniumsulfatlösung unter Rotation auf dem Magnetrührer mit Inkubation über Nacht. Es erfolgte eine Zentrifugation von 40_000 g über 60 min. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet in Probenpuffer resuspendiert. Es wurde eine elektrophoretische Auftrennung mit anschließender Westernblotanalyse [beschrieben unter 3.5.2 ] durchgeführt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei 4 °C.

3.5.5 Urinzentrifugation

Für die Zentrifugation von physiologischem Urin wurden 2 l Urin eines gesunden Probanden über 12 h gesammelt. Die Zentrifugation von 8 x 250 ml Urin erfolgte bei 3_000 g über jeweils 30 min. Der Urinüberstand wurde dekantiert und für die weiteren Zentrifugationsschritte kühl gelagert. Die Sedimentpellets wurden mit Urin resuspendiert, in einem Gefäß gesammelt und erneut bei 3_000 g zentrifugiert. Nach Beendigung dieser Zentrifugation wurden die Pellets in Probenpuffer überführt und resuspendiert. Der dekantierte Urinüberstand wurde anschließend bei 5_000 g, 10_000 g, 200_000 g und 540_000 g zentrifugiert und die Pellets in Probenpuffer resuspendiert.
Die elektrophoretische Auftrennung und der Elektrotransfer erfolgte wie unter 3.5.2 beschrieben.
Zur elektronenmikroskopischen Betrachtung wurde 1,5 l humaner Urin verwendet. Die Zentrifugation erfolgte bei 30_000 g. Das Pellet wurde in Präparationspuffer aufgenommen und für die Elektronenmikroskopie aufbereitet [siehe 3.5.7 ]. Alle


30

Zentrifugationschritte erfolgten bei 4 °C.

3.5.6 Indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie

Nach Entnahme der Harnblase [beschrieben unter 3.5.1 ] wurden Gewebeblöckchen von 1 - 2 mm³ in schmelzendem Methylbutan unter N2-Kühlung schnell eingefroren. Nach Gefriertrocknung über 48 h wurden die Gewebeproben unter Vakuum in Epon eingebettet (Drenckhahn et al., 1984). Von dem eingebetteten Gewebe wurden 1 µm Semidünnschnitte angefertigt. Für die Antikörperinkubation wurden die Schnitte in Na-Methanolat 6 min, in 1:1 Methanol-Toluol Gemisch 5 min, in Aceton 2 x 5 min, in Aqua dest. 5 min und in PBS 5 min inkubiert und aus dem Epon herausgelöst. So wurde die Zugänglichkeit der Antikörper zu den Epitopen der Proteine ermöglicht. Anschließend wurden die Schnitte in Blocklösung zur Suppression unspezifischer Bindungsstellen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation des Primärantikörpers erfolgte über Nacht bei 4 °C. Danach wurde 3 x 5 min mit PBS gespült. Es folgte die Inkubation des jeweiligen mit Fluorochromen markierten Sekundärantikörpers und eine abschließende Spülung 3 x 5 min mit PBS. Alle Inkubationen und Waschschritte erfolgten in einem dunklen, feuchten Inkubator. Die Schnitte wurden anschließend mit Mowiol und Deckgläschen abgeschlossen.Die Methode der indirekten Immunofluoreszenz ermöglicht eine Signalverstärkung durch die mehrfache Bindung der sekundären, fluoreszenzmarkierten Antikörper an den Primärantikörper.
Die eingesetzten sekundären Antikörper emittieren bei einer Erregerstrahlung von 596 nm Licht roter Wellenlänge [Texas Red™] bzw. bei einer Bestrahlung von 488 nm grünes Licht [Oregon Green™].

3.5.7 Elektronenmikroskopie

Es wurden, wie unter 3.5.6 beschrieben, kleine Gewebeblöckchen von ca. 2 mm³ aus der Rattenharnblase gewonnen und in Fixationspuffer über 2 h auf Eis schüttelnd fixiert. Die fixierten Gewebestückchen wurden dann 4 x mit PBS jeweils 15 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler gespült. Anschließend erfolgte die


31

Kontrastierung mit Osmiumtetroxid 30 min. Durch Inkubation mit 4% Osmiumtetroxid werden Doppelbindungen oxidiert. Das entstehende reduzierte Osmiumdioxid ist wasserunlöslich und fällt kontrastgebend aus.
Danach wurde mit PBS 2 x 30 min gespült. Die Gewebestückchen wurden über Nacht in 70 % Alkohol bei 4 °C aufbewahrt. Da das Hochvakuum des Elektronenmikroskops ein absolut wasserfreies Präparat erfordert, erfolgte eine alkoholische Entwässerungsreihe (90 %, 96 %, 100 % jeweils 2 x 30 min). Zusätzlich wurde das Gewebe 2 x 10 min in 100 % Propylenoxid inkubiert. Zur Einbettung in Araldite wurden die Gewebeblöckchen in einem Araldite / DDSA / Propylenoxid-Gemisch und Beschleuniger (DMP-30) (mod. n. Meyer at al., 1991) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Durch eine vertikale Rotation bei ca. 60 Upm wurde eine homogene Durchmischung der Gewebeblöckchen erreicht. Am nächsten Tag wurden die Gewebestückchen im 1:1-Gemisch Araldite / DDSA mit Beschleuniger (mod. n. Meyer et al., 1991) 1 h bei 60 upm vertikal rotiert und anschließend bei Raumtemperatur in Gelatinekapseln überführt. Zur Entlüftung wurden die Kapseln für 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Polymerisation erfolgte bei 65 °C.
Von dem eingebetteten Gewebe wurden Ultradünnschnitte von 60 nm Dicke gefertigt. Zur besseren Haftung der Schnitte wurden die Präparatehalter mit einem Formvarfilm beschichtet, was zu einer planen Unterlage für die Schnitte führt. Die Ultradünnschnitte können durch diese Beschichtung nicht durch das Gitter der Nickelpräparatehalter (Roth, Karlsruhe) gelangen, sondern liegen dem Film dicht auf. Nach Befeuchtung mit Aqua dest. wurden die Schnitte jeweils für 7 min in 1 % Perjodat und 1 % Natriummetaperjodat angeätzt und mit der “post-embedding-Methode“ nach Wenzel et al. (1997) weiterbehandelt. Verwendet wurden die Antikörper gegen Uroplakin III, Synaptobrevin, Syntaxin, SNAP 23. Als sekundäre Antikörper wurden 5 nm goldgekoppelte Antikörper anti-Kaninchen IgG und 10 nm Gold gekoppelte Antikörper anti-Maus IgG eingesetzt. Für Kontrollinkubationen wurde ein Präimmunserum verwendet.
Zur Positivkontrastierung, bei der durch spezifische Anlagerung von Schwermetallsalzen an Proteinen oder Nukleinsäuren biologische Strukturen dunkel erscheinen, wurden die Präparate jeweils 10 min mit Uranylacetat und Bleinitrat (Reynolds®) behandelt und abschließend mit Aqua dest. gespült.

32

Sämtliche Lösungen wurden, um eine Verschmutzung der Präparate zu verhindern, durch einen 30 µm Filter gefiltert. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei Raumtemperatur.
Die Betrachtung der Präparate wurden am Elektronenmikroskop EM 900 (Zeiss) bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV durchgeführt.Die belichteten Filme wurden vom institutseigenen Fotolabor entwickelt.

3.6 Statistische Methoden

Die goldmarkierten Ultradünnschnitte wurden fotografiert und die Au-Signale standardisiert ausgezählt. Zur Auszählung wurden für jedes immunologisch detektierte Protein 20 Fotografien (25 x 32 cm) des Gewebeschnittes herangezogen. Die untersuchte Fläche betrug somit ca. 400 µm² Zellfläche für jedes untersuchte Protein.
Zur Kontrolle wurden Inkubationen mit Nonimmunserum durchgeführt und in gleicher Weise statistisch ausgewertet und den zu untersuchenden Auszählungen gegenübergestellt.
Die statistischen Berechnungen der vorliegenden Daten wurde durch das Computerprogramm Statistik Programm System SPSS® (V 10.0) im biomedizinischen Institut der Charitè unterstützt und in Box-Plots dargestellt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Feb 7 11:50:51 2003