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Kapitel 3. Materialien und Methoden

3.1 Chemikalien und Reagenzien

Reagenz Hersteller Aceton Herbeta (Berlin) Acrylamid Stammlösung (30%) Roth (Karlsruhe) Äther zur Narkose Roth (Karlsruhe) Agarose Merck (Darmstadt) Albumin Rinderserum (BSA) Roth (Karlsruhe) Alkohol (unvergällt) Merck (Darmstadt) Ammoniumpersulfat Sigma (München) Ammoniumsulfat Roth (Karlsuhe) Araldit Serva (Heidelberg) Bisacrylamid Stammlösung (30%) Roth (Karlsruhe) Bleinitrat Merck (Darmstadt) Bromphenolblau Sigma (München) Chloronaphtol Bio - Rad (Hercules, CA, USA) Diaminobenzidin (DAB) Sigma (München) Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) Roth (Karlsuhe) Dithioeritherol (DTE) Roth (Karlsruhe) DNAse I aus Rinderpankreas Roche (Mannheim) Dodecylbernsteinsäureanhydrid Fluka (Neu - Ulm) ECL™ (Enhanced Chemiluminescence) Amersham (Buckinghamshire, GB) Epon Fluka (Neu - Ulm) Ethanol Merck (Darmstadt) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Roth (Karlsruhe) Ethylenglykol, bis(2-aminoethyl)tetraacetsäure (EGTA) Roth (Karlsruhe) Formvar (0,3 % in 1,2-Dichlorethan) Serva (Heidelberg) Glutaraldehyd Fluka (Neu - Ulm) Glycerin Merck (Darmstadt) Glycin Merck (Darmstadt) Hybond C (Nitrozellulose) Amersham (Buckinghamshire, GB) Imidazol Sigma (München) Low Molecular Weight Marker (LMW) Pharmacia Biotech (Uppsala, S) Magermilchpulver Glücksklee (München) Metaperjodat Merck (Darmstadt) Methanol Merck (Darmstadt) 2-Methylbutan Roth (Karlsruhe) Mowiol Hoechst (Frankfurt a. M.) Natriumchlorid (NaCl) Merck (Darmstadt) Natriumcitrat Merck (Darmstadt) Natriumdodecylsulfat (SDS) Boehringer Mannheim Natrium-Methylat Fluka (Neu - Ulm) Natriumtetraborat Merck (Darmstadt) Nitrozellulose Schleicher & Schuell (Kassel) Nonidet® 40 Fluka (Neu - Ulm) Osmiumtetroxid Merck (Darmstadt) Paraformaldehyd (PFA) Merck (Darmstadt) Perjodsäure Merck (Darmstadt) Pikrinsäure Odczyniki Chemczne (Gliwice, P) Polyethylenglykol 20.000 Roth (Karlsruhe) Ponceau S Sigma (St. Louis, USA) Propylenoxid Serva (Heidelberg)

Proteinase Inhibitoren: Aprotinin Boehringer Mannheim Leupeptin Boehringer Mannheim Pepstatin Boehringer Mannheim Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roth (Karlsruhe)

Protein A [aus Staph. aureus] Sepharose Pharmacia Biotech (Uppsala, S) Sucrose Merck (Darmstadt) Tetramethylethyldiamin (TEMED) Sigma (München) Toluidin Blau Merck (Darmstadt) Toluol Merck (Darmstadt) Trisdimethylaminomethylphenol Fluka (Neu - Ulm) Triton X-100 Roth (Karlsruhe) Tween 20 Merck (Darmstadt) Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck (Darmstadt) Ziegenserum (NGS) Pan-Systems (Aidenbach)

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3.2 Puffer und Lösungen

Antikörper-Lösung für Immunofluoreszenzmikroskopie

1,5 %

Rinderserum Albumin in PBS

Antikörper- / Block-Lösung für Immunogoldmarkierung

140 mM		NaCl
5	MM	Tris	pH 7,6 (HCl)
1	L	Aqua dest.
1	%	NGS
1	%	BSA
0,1	%	Triton X-100

Antikörper-Lösung für Immunogoldmarkierung

140 mM	NaCl
5 mM	Tris	pH 8,2 (HCl)
1 l	Aqua dest.
0,1 %	Triton X-100

Antikörper- / Block-Lösung für Westernblot-Analysen

10 %	Magermilchpuffer in PBS

Block-Lösung für Immunofluoreszenz

2 %	BSA in PBS

Fixationspuffer für Elektronenmikroskopie

4 %	PFA	pH 7,4 mit Phosphat abgepuffert
0,2 %	Pikrinsäure
0,05 %	Glutaraldehyd

Immunopräzipitationspuffer

150 mM	NaCl
10 mM	Tris	pH 7,4
1 mM	EDTA

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1 mM	EGTA
0,2 mM	Na - Vanadat
0,2 mM	PMSF
1 %	Triton X 100
0,5 %	Nonidet® P40

Kontrastierungslösung nach Reynolds®

120 mM	Natriumcitrat
80 mM	Bleinitrat
8 ml	1N Natronlauge	pH 12.0
auf 50 ml	Aqua dest

Phosphatpuffer (PBS)

140 mM	NaCl
10 mM	Na2HPO4
2,7 mM	KCl
1,8 mM	KH2PO4

Ponceau-S Lösung

0,5 %	Ponceau S
3 %	Trichloressigsäure

Präparationspuffer für Membranpräparation

250 mM	Sucrose	ph 7,3
10 mM	DTE
5 mM	Imidazol
5 mM	EDTA
1 µg/ml	Aprotinin
1 µg/ml	Pepstatin
1 µg/ml	Leupeptin
1 µmol/ml	PMSF
1 Spsp	DNAse

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4 M	Glycerin
200 mM	SDS in Aqua dest.
180 mM	Tris	pH 6,9 (HCl)
12 M	DTE
800 µl	Bromphenolblau (6 M)
		ad 40 ml Aqua dest.

Sammelgel-Puffer (4x)

500 M	Tris	pH 6,8
15 mM	SDS
	ad 1 Liter Aqua dest.

Spüllösung für Westernblot-Analysen

0,1 %

Tween 20 in PBS

Transblotpuffer (Semi Dry)

192 mM	Glycin
25 mM	Tris	pH 8,3
20 %	Methanol

Tris I

500 mM	Tris	pH 6,8 (HCl)
0,4 %	SDS

Tris II

1,5 M	Tris	pH 8,8 (HCl)
0,4 %	SDS

Toluidinfärbelösung

1,2 M	Sucrose
100 ml	Aqua dest.	pH 9,3
25 mM	di-Natriumtetraborat

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15 mM

Toluidinblau

Trenngel-Puffer (4x)

1 M	Glycin
120 mM	Tris	pH 8,8
20 mM	SDS
	auf 1 Liter Aqua dest.

3.3 Verwendete Antikörper

Primäre Antikörper

Antikörper	Bezugsquelle und Referenz
- Actin (Klon 1A4) monoklonal, Maus	Sigma, St. Louis, USA Skalli et al. (1986)
Zytokeratin 17 (Klon E3) monoklonal, Maus	Dako, Glostrup, Dänemark Moll et al. (1982)
Zytokeratin 20 (Klon Ks 20.8) monoklonal, Maus	Dako, Glostrup, Dänemark Moll et al. (1990)
SNAP 25 (Klon SMI 81) monoklonal, Maus	Sternberger Monoclonals, Baltimore, USA Mehta et al. (1996)
SNAP 23 polyklonal, Kaninchenserum	Synaptic Systems, Göttingen Südhof et al. (1995)
alpha - SNAP monoklonal, Maus	Synaptic Systems, Göttingen Rothman, J. E. (1994)
Synaptobrevin II polyklonal, Kaninchen	R. Jahn, Göttingen Edelmann et al. (1995)
Synaptobrevin II (Klon 69.1) monoklonal, Maus	Synaptic Systems, Göttingen Edelmann et al. (1995)
Syntaxin (Klon HPC-1) monoklonal, Maus	Sigma, St. Louis, USA Barnstable et al. (1985)
NSF polyklonal, Kaninchen	Synaptic Systems, Göttingen Südhof, T. C. (1995)
Uroplakin (Klon AU1) monoklonal, Maus	ProGen, Heidelberg Wu et al. (1993)

Die gegen die verschiedenen Zytokeratine eingesetzten Antikörper sind nach Moll et al. (1982) klassifiziert. Die Zytokeratine 17 und 20 haben beide eine Größe von 46 kDa und sind in verschiedenen Epithelzellen beschrieben worden (Moll et al.,

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Sekundäre Antikörper

Antikörper	Bezugsquelle
Pferd anti - Maus IgG Peroxidase gekoppelt	Vector Laboratories, Burlingham, USA
Ziege anti - Kaninchen IgG Peroxidase gekoppelt	Vector Laboratories, Burlingham, USA
Esel anti - Maus IgG Texas Red™ gekoppelt	Jackson Laboratories, West Grove, USA
Ziege anti - Kaninchen IgG Texas Red™ gekoppelt	Jackson Laboratories, West Grove, USA

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Ziege anti - Kaninchen IgG Oregon Green™ gekoppelt	Molecular Probes, Eugene, USA
Ziege anti - Kaninchen IgG 5 nm Gold gekoppelt	Amersham, Uppsala, Schweden
Ziege anti - Maus IgG 10 nm Gold gekoppelt	Aurion, AA Wageningen, Niederlande

3.4 Verwendete Geräte

Zentrifugen

Beckmann Optima™ TL Ultrazentrifuge	Rotor: TLA 100.4 (Palo Alto, USA)
Beckmann J2 - HS	Rotor: JA 14, JA 20 (Palo Alto, USA)
Eppendorf Zentrifuge 5402	(Hamburg)

Elektrophorese

Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) Power Pac 200 Netzgerät (Bio-Rad) Mini-Protean® II Elektrophorese-Kammer (Bio-Rad)

Mikroskopie

Gefriertrockner Edwards (Crawley, UK) Ultramikrotom Leica (Bensheim) Epifluoreszenz-Mikroskop mit Durchlichteinrichtung Leica DMLB (Wetzlar) Digitalkamera SPOT INTAS (Göttingen) Transmissionselektronenmikroskop Zeiss EM 900 (Oberkochen)

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3.5 Durchführung der Experimente

3.5.1 Membranpräparation des Harnblasenepithels

Zur Herstellung der Membransuspension für die Westernblotanalyse wurden Harnblasen adulter Ratten verwendet. Es wurden ausschließlich adulte Wistar-Ratten beider Geschlechter verwendet. Die Tiere wurden nach tiefer Äthernarkose dekapitiert. Nach Freipräparieren der Harnblase wurde das Gewebe schnell extrahiert und anschließend mit 4°C-kaltem Präparationspuffer gespült. Zur Epithelgewinnung wurde die luminale Harnblasenwand mit Präparationspuffer mit enthaltenen Proteaseinhibitoren beträufelt und mit einem Skalpell vorsichtig abgeschabt. Die Zellsuspension wurde mit dem Präparationspuffer auf 3 ml aufgefüllt und mit dem Glas-Teflon-Homogenisator homogenisiert.
Zur Weiterverarbeitung wurde das Homogenat 10 min mit 1_200 g in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Das so erhaltene Sediment enthält Zellkerne und nichtlysierte Zellen sowie größere Zelltrümmer. Der Überstand wurde bei 150_000 g in der Ultrazentrifuge von Beckmann 30 min zentrifugiert. Danach konnte der Überstand dekantiert und die sedimentierten Membranen in Probenpuffer für die Elektrophorese aufgenommen werden. Alle Schritte erfolgten bei 4 °C.

3.5.2 Protein-Gelelektrophorese und Westernblot-Analyse

Die Proteinsuspensionen wurden in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt (mod. n. Laemmli). Die in Probenpuffer aufgenommenen Proteinsuspensionen wurden vor dem Auftragen für 10 min, bei 95 °C erhitzt. Die Auftrennung erfolgte, wenn nicht anders aufgeführt, mit 12 % Gelen. Als Marker diente ein kommerzieller Standard (LMW) mit Proteinbanden von 14.4 kDa bis 94 kDa. Das Gel war wie folgt zusammengesetzt:

	Trenngel 12%		Sammelgel 3%
	Tris II	2000 µl	Tris I	500 µl
Acrylamid Stock 30%	3200 µl		200 µl
Bisacrylamid Stock 30%	1280 µl		80 µl
H2O	1520 µl		1220 µl
Temed	10 µl		2,6 µl

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10% APS

80 µl

20 µl

Die Proteine wurden nach der Auftrennung im SDS-Gel bei 0,3 A / Gel 20 min auf Hybond C Nitrozellulosemembran im Sandwichverfahren elektrotransferiert. Dazu wurde das Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell System (Bio-Rad) benutzt. Zur Optimierung des Proteintransfers wurde die Nitrozellulosemembran und das Filterpapier in Transblotpuffer 20 min inkubiert.
Zur reversiblen Visualisierung der aufgetrennten Proteine wurde die Nitrozellulosemembran in Panceau-S Lösung 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit Aqua dest. gespült. Danach konnte die Nitrozellulose entsprechend der Marker beschriftet und geschnitten werden. Zur Suppression unspezifischer Proteinbindungsstellen (Johnson et al.,1984) wurden die Nitrocellulosestreifen 1 h in Blocklösung inkubiert.
Die Inkubation mit den Primärantikörpern erfolgte über Nacht bei 4 °C. Der entsprechende sekundäre Antikörper wurde 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach jeder Inkubation wurden die Nitrozellulosestreifen 3 x 15 min in Spüllösung gewaschen. Alle Inkubationen und Waschschritte erfolgten auf einem Schüttler bei 150 rpm.
Die Visualisierung der antikörpermarkierten Proteinbanden erfolgte über Lumineszenz. Dazu wurde das ECL™-Westernblot Analysesystem von Amersham benutzt.

3.5.3 Immunopräzipitation

Zur Analyse der verschiedenen Protein-Proteininteraktionen wurden Immunopräzipitationen durchgeführt. Zu einem ml Membransuspension [beschrieben unter 3.5.1 ] mit ca. 200 µg Protein in 100 µl Präzipitationspuffer wurden 3 µl eines polyklonalen SNAP 23 Antiserums gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurde 30 µl Protein A-Sepharose (50%) zur Lösung gegeben und für weitere 4 h auf dem Rotationsschüttler inkubiert. Nach dreimaliger Waschzentrifugation mit Immunopräzipitationspuffer wurde die Protein A-Sepharose in Probenpuffer resuspendiert und für 10 min aufgekocht (Anderson et al.,1981). Danach erfolgte die elektrophoretische Auftrennung und der Elek

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3.5.4 Proteinfällung

Zur Gewinnung von Protein aus humanem physiologischen Urin wurden 800 ml Urin in Dialysierschläuche Visking 20/32 (Roth, Karlsruhe) über Nacht gegen Aqua dest. dialysiert. Anschließend wurde das Dialysat unter Polyethylglykol auf ca. 30 ml eingeengt. Es erfolgte die Zugabe von gekühlter gesättigter Ammoniumsulfatlösung unter Rotation auf dem Magnetrührer mit Inkubation über Nacht. Es erfolgte eine Zentrifugation von 40_000 g über 60 min. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet in Probenpuffer resuspendiert. Es wurde eine elektrophoretische Auftrennung mit anschließender Westernblotanalyse [beschrieben unter 3.5.2 ] durchgeführt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei 4 °C.

3.5.5 Urinzentrifugation

Für die Zentrifugation von physiologischem Urin wurden 2 l Urin eines gesunden Probanden über 12 h gesammelt. Die Zentrifugation von 8 x 250 ml Urin erfolgte bei 3_000 g über jeweils 30 min. Der Urinüberstand wurde dekantiert und für die weiteren Zentrifugationsschritte kühl gelagert. Die Sedimentpellets wurden mit Urin resuspendiert, in einem Gefäß gesammelt und erneut bei 3_000 g zentrifugiert. Nach Beendigung dieser Zentrifugation wurden die Pellets in Probenpuffer überführt und resuspendiert. Der dekantierte Urinüberstand wurde anschließend bei 5_000 g, 10_000 g, 200_000 g und 540_000 g zentrifugiert und die Pellets in Probenpuffer resuspendiert.
Die elektrophoretische Auftrennung und der Elektrotransfer erfolgte wie unter 3.5.2 beschrieben.
Zur elektronenmikroskopischen Betrachtung wurde 1,5 l humaner Urin verwendet. Die Zentrifugation erfolgte bei 30_000 g. Das Pellet wurde in Präparationspuffer aufgenommen und für die Elektronenmikroskopie aufbereitet [siehe 3.5.7 ]. Alle

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3.5.6 Indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie

Nach Entnahme der Harnblase [beschrieben unter 3.5.1 ] wurden Gewebeblöckchen von 1 - 2 mm³ in schmelzendem Methylbutan unter N2-Kühlung schnell eingefroren. Nach Gefriertrocknung über 48 h wurden die Gewebeproben unter Vakuum in Epon eingebettet (Drenckhahn et al., 1984). Von dem eingebetteten Gewebe wurden 1 µm Semidünnschnitte angefertigt. Für die Antikörperinkubation wurden die Schnitte in Na-Methanolat 6 min, in 1:1 Methanol-Toluol Gemisch 5 min, in Aceton 2 x 5 min, in Aqua dest. 5 min und in PBS 5 min inkubiert und aus dem Epon herausgelöst. So wurde die Zugänglichkeit der Antikörper zu den Epitopen der Proteine ermöglicht. Anschließend wurden die Schnitte in Blocklösung zur Suppression unspezifischer Bindungsstellen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation des Primärantikörpers erfolgte über Nacht bei 4 °C. Danach wurde 3 x 5 min mit PBS gespült. Es folgte die Inkubation des jeweiligen mit Fluorochromen markierten Sekundärantikörpers und eine abschließende Spülung 3 x 5 min mit PBS. Alle Inkubationen und Waschschritte erfolgten in einem dunklen, feuchten Inkubator. Die Schnitte wurden anschließend mit Mowiol und Deckgläschen abgeschlossen.Die Methode der indirekten Immunofluoreszenz ermöglicht eine Signalverstärkung durch die mehrfache Bindung der sekundären, fluoreszenzmarkierten Antikörper an den Primärantikörper.
Die eingesetzten sekundären Antikörper emittieren bei einer Erregerstrahlung von 596 nm Licht roter Wellenlänge [Texas Red™] bzw. bei einer Bestrahlung von 488 nm grünes Licht [Oregon Green™].

3.5.7 Elektronenmikroskopie

Es wurden, wie unter 3.5.6 beschrieben, kleine Gewebeblöckchen von ca. 2 mm³ aus der Rattenharnblase gewonnen und in Fixationspuffer über 2 h auf Eis schüttelnd fixiert. Die fixierten Gewebestückchen wurden dann 4 x mit PBS jeweils 15 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler gespült. Anschließend erfolgte die

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3.6 Statistische Methoden

Die goldmarkierten Ultradünnschnitte wurden fotografiert und die Au-Signale standardisiert ausgezählt. Zur Auszählung wurden für jedes immunologisch detektierte Protein 20 Fotografien (25 x 32 cm) des Gewebeschnittes herangezogen. Die untersuchte Fläche betrug somit ca. 400 µm² Zellfläche für jedes untersuchte Protein.
Zur Kontrolle wurden Inkubationen mit Nonimmunserum durchgeführt und in gleicher Weise statistisch ausgewertet und den zu untersuchenden Auszählungen gegenübergestellt.
Die statistischen Berechnungen der vorliegenden Daten wurde durch das Computerprogramm Statistik Programm System SPSS® (V 10.0) im biomedizinischen Institut der Charitè unterstützt und in Box-Plots dargestellt.

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