Born, Martin Ludovico: Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Morphologie

Durch die Einbettungsmethode nach Gefriertrocknung mit Epon konnte eine gute Gewebeerhaltung erreicht werden. Der mittels Toluidinblau gefärbte Semidünnschnitt (Abb. 3) erlaubt eine sehr gute Beschreibung der lichtmikroskopischen Strukturen des Urothels. Die Tunica mucosa ist als deutliche Struktur erhalten. Die dem Lumen zugewandten Deckzellen sind angefärbt und lassen eine Zuordnung von Zellgrenzen und Zellkern zu. Die verstärkte apikale Anfärbung der Deckzellen wurde historisch als „Crusta“ bezeichnet. Sie ist auf ein dichtes Netz von Intermediär- und Aktinfilamenten zurückzuführen.
Ein Kontakt der Deckzellen mit der Basalmembran konnte in der hier vorliegenden Histologie in keinem Schnitt beobachtet werden. Da die Schnitte sehr dünn sind und so eine kontinuierliche Membranverbindung von luminal bis in die basalen Ausziehungen nicht verfolgt werden konnte, lässt sich eine eindeutige Zuordnung zu den mehrschichtigen Epithelien nicht beweisen. Daher kann die angloamerikanische Bezeichnung „umbrella cells“, die aufgrund des basalen Kontaktes der Deckzelle mit der Lamina propria entstanden ist, ebenfalls nicht gezeigt werden. Die Bezeichnung „Deckzelle“ scheint die idealste Bezeichnung der luminalen Zellen des Urothels zu sein.
In der Immunofluoreszenz mit einem Antikörper gegen Uroplakin III konnten Deckzellen spezifisch markiert werden (Abb. 4 und 5). Das apikale Membrankompartiment, bestehend aus der apikalen Plasmamembran und den diskoiden und fusiformen Vesikeln, wird durch die Verstärkung des Fluoreszenzsignals am apikalen Zellpol gezeigt. Dieses Fluoreszenzsignal bleibt auf die luminale Zellreihe beschränkt und kann als Kontrollmarkierung der Deckzellen eingesetzt werden.
Da Uroplakin III fast auschließlich in enddifferenzierten Deckzellen lokalisiert ist (Sun und Wu, 1993), wurde Uroplakin III in den gezeigten Bildern als spezifischer Marker für die Enddifferenzierung der Zellen eingesetzt.
Als weiteres Markerprotein der enddifferenzierten Deckzelle kann Zytokeratin 20 gezeigt werden (Romih et al., 1998). Basal- oder Intermediärzellen sind dagegen


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Zytokeratin 20-negativ. Zytokeratin 20 wird sowohl in gesunden, als auch in karzinomatös entarteten Deckzellen exprimiert und zeigt ein deutliches subzelluläres Verteilungsmuster (Abb. 6). In der Immunofluoreszenzmikroskopie zeigt sich ein starkes apikales Signal, welches bis basolateral reicht. Aufgrund dieser Verteilung stellt Zytokeratin 20 ein wichtiges Strukturelement im Aufbau des Zytoskeletts dieser Zellen dar.


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Abb. 3: Semidünnschnitt (1 µm) der Harnblase einer Ratte nach Gefriertrocknung und Einbettung. Toluidinblau gefärbt. Die starke Fältelung der Harnblasenwand lässt auf eine entleerte Harnblase schließen. Die Deckzellen liegen als superfizielle Zelllage den Intermediärzellen an und bilden die luminale Abdichtung des Epithels. Es fällt eine deutliche Anfärbung im Bereich des luminalen Kompartiments (Pfeil) auf. Diese Struktur wurde als „Crusta“ bezeichnet. Nähere Erläuterungen im Text.

DZ Deckzelle
Tm Tunica muscularis
IZ Intermediärzelle
K Kapillare
BZ Basalzelle
L Lumen der Harnblase
Tsm Tunica submucosa
Bar 10 µm


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Abb. 4+5: Semidünnschnitte (1 µm) der Harnblase der Ratte. Lokalisation von Uroplakin III in Deckzellen des Urothels durch Immunofluoreszenz. Punktlinie in Abb. 5 markiert die basale Zellgrenze. Uroplakin wird vermehrt im apikalen Zellpol exprimiert und dann in die Plasmamembran eingebaut (Abb. 4)

L = Lumen; Bar 10 µm

Abb. 6: Lokalisation von Zytokeratin 20 in Deckzellen im Urothel der Ratte. Neben anderen Zytokeratinen (CK 8, 18) wird als wichtiges Protein des Zytoskeletts Zytokeratin 20 nur in den Deckzellen exprimiert und kann als Marker für die enddifferenzierte Deckzelle dienen.

L = Lumen; Bar 10 µm


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4.2 Detektion von SNARE-Proteinen im Urothel der Rattenharnblase

4.2.1 Immunofluoreszenz

Durch Inkubation von Semidünnschnitten mit Antiseren gegen SNAP 23, Synaptobrevin und Syntaxin konnte das Vorkommen und die Lokalisation dieser SNARE-Proteine im Urothel der Ratte gezeigt werden (Abb. 7a-c). Die enddifferenzierten Deckzellen wiesen in der Immunofluoreszenz ein ähnliches Signalmuster auf, wie es durch die Inkubationen mit den Uroplakinantikörpern gezeigt werden konnte. Im apikalen Kompartiment der Deckzelle zeigte sich auch hier ein starkes Fluoreszenzsignal. Die untersuchten SNARE-Proteine kommen nach diesen immunologischen Untersuchungen ausschließlich in den enddifferenzierten Deckzellen des Urothels vor und sind hier im Bereich des apikalen Membrankompartiments stark angereichert. Im Zytosol fallen freie, nicht markierte Bereiche auf.
Da eine Inkubation dieser Schnitte mit Antiserum gegen SNAP 25 zu keinem spezifischem Signal führte, kann davon ausgegangen werden, dass SNAP 23, als Analogon von neuronalem SNAP 25, hier eine Rolle als Q-SNARE spielt. Das Verteilungsmuster von Synaptobrevin, SNAP 23 und Syntaxin in den Deckzellen gleicht dem von Uroplakin III (Abb. 3 und 4) und scheint auf den Bereich der diskoiden und fusiformen Vesikel im apikalen Membrankompartiment sowie der apikalen Plasmamembran beschränkt zu sein.


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Abb. 7: Immunolokalisation von SNARE-Proteinen im Urothel der Rattenharnblase. Die drei untersuchten SNARE-Proteine Syntaxin (a), Synaptobrevin (b) und SNAP 23 (c) zeigen ein starkes Immunofluoreszenzsignal im apikalen Zellkompartiment. Im Bereich der luminalen Zellmembran (Pfeile) ist das Signal für alle drei untersuchten Proteine am stärksten ausgeprägt. Der teils wolkig-diffuse Hintergrund kann auf artifizielle Stauchung des Schnittes und damit die Umverteilung von tieferliegenden Zellstrukturen, wie Bereiche der Muscularis, zurückgeführt werden.

(L = Lumen, N = Zellkern;Markierter Bereich = DeckzellePfeile = apikale Plasmamenbran Bar 10 µm)


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Durch die Immunofluoreszenzuntersuchungen werden die Daten der Westernblot-Analyse unterstützt und es kann davon ausgegangen werden, dass SNAP 23 die relevante Komponente ist, die zusammen mit Synaptobrevin und Syntaxin den SNARE-Haftkomplex im Harnblasenepithel ausbildet. Eine parallel durchgeführte Inkubation mit Antiserum gegen SNAP 25 führte zu keinem spezifischen Signal.
Die scheinbare Gleichverteilung aller drei SNARE-Proteine innerhalb der Zelle lässt eine zielgerichtete Fusion nach einem Mechanismus, wie er in Neuronen beschrieben wird, als eher unwahrscheinlich erscheinen. Auf Grund der Gleichverteilung (siehe auch siehe ) der SNARE-Proteine ist eine Unterteilung in die Ziel- oder die Vesikelmembran nicht möglich, vielmehr können die Vesikel untereinander aber auch mit der apikalen Plasmamembran fusionieren. Die immunohistologischen Daten deuten somit auf einen homotypischen Fusionsmechanismus hin, wie er für die Fusion der Hefevakuolen bekannt ist (Ungerman et al., 1998b).

4.2.2 Westernblotanalyse

Zur Kontrolle der Reinheit der hier verwendeten Epithelpräparation wurde eine separate Präparation der Muskelschicht der Harnblase durchgeführt.
Durch Inkubation der gelelektrophoretisch aufgetrennten und elektroeluierten Membransuspensionen mit urothel- beziehungsweise muskelspezifischen Antikörpern gegen Uroplakin III und alpha-Aktin konnte eindeutig gezeigt werden, dass eine Kontamination von SNARE-Proteinen aus der motorischen Endplatte durch die hier gewählte Präparationsmethode ausgeschlossen werden konnte (Abb. 10). Der Nachweis von Uroplakin III in der Epithelpräparation wurde als Positivkontrolle für das Epithel verwendet. Aktin konnte nur in der Präparation der Tunica muscularis nachgewiesen werden, während Uroplakin III nur in der Urothel- und nicht in der Muskelpräparation vorhanden war.


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Abb. 10: Immunoblot einer Membranpräparation von Urothel und Tunica muscularis einer Rattenharnblase. SDS-PAGE 12%. SNAP 23 ist in beiden Präparationen detektiert, da in der motorischen Endplatte neuronale Strukturen vorhanden sind. Als Positivkontrolle für die Urothelpräparation wurde der monoklonale Antikörper gegen Uroplakin III eingesetzt (unten). Der monoklonale Antikörper gegen glattmuskuläres alpha-Aktin wurde als Negativkontrolle eingesetzt (oben).
Nähere Erläuterungen dazu im Text.


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Im Immunoblot der Membransuspension des Rattenurothels konnte die Detektion von Syntaxin, Synaptobrevin und SNAP 23 gezeigt werden (Abb. 11). Diesen Untersuchungen zu folge ist SNAP 25 offenbar nicht im Harnblasenepithel vorhanden. Wie auch für andere Epithelien gezeigt wurde, scheint auch in diesem Epithel SNAP 25 durch SNAP 23 ersetzt zu werden.
In einer vergleichenden Westernblotanalyse zwischen einer Präparation des Plexus choroideus und des Harnblasenepithels konnte dieser Befund bestätigt werden (Abb.12). Im Plexus choroideus ist sowohl SNAP 23 wie auch SNAP 25 vorhanden, im Harnblasenepithel nur die nicht neuronale SNAP 23 Isoform. SNAP 23 weist ein apparentes Molekulargewicht von 29 kDa auf, was eine Bestätigung verschiedener anderer Untersuchungen im Epithel des Pankreas oder der Mastzellen darstellt (Zhenheng et al., 1998). In anderen Epithelien ist SNAP 23 ebenfalls mit dem Molekulargewicht von 29 kDa vorhanden (Ravichandran et al., 1996).

Abb. 11: Immunoblot einer Membranpräparation von Urothel und Tunica muscularis einer Rattenharnblase. SDS-PAGE 12%. SNAP 23 ist in beiden Präparationen detektiert, da in der motorischen Endplatte neuronale Strukturen vorhanden sind. Als Positivkontrolle für die Urothelpräparation wurde der monoklonale Antikörper gegen Uroplakin III eingesetzt (unten). Der monoklonale Antikörper gegen glattmuskuläres alpha-Aktin wurde als Negativkontrolle eingesetzt (oben).
Nähere Erläuterungen dazu im Text.


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Abb. 12: Detektion von SNARE-Proteinen im Harnblasenepithel zum Vergleich mit dem Epithel im Plexus choroideus in der Ratte. SNAP 25 (25) kann nur im Epithel des Plexus choroideus gezeigt werden. Die SNARE-Proteine Synaptobrevin (Syb), SNAP 23 (23) und Syntaxin werden in beiden Epithelien exprimiert. Detektion mit monoklonalen Antikörpern [außer für SNAP 23]. SDS-PAGE 12%. Visuelle Entwicklung mit Chloronaphtol.

4.2.3 Ultrastrukturelle Lokalisation

Durch das Einbettungsverfahren nach Meyer et al. (1991) wurde eine sehr gute Gewebeerhaltung erreicht. Diese erlaubte es, anhand morphologischer Charakteristika wie der typischen vesikulären Strukturen im apikalen Kompartiment der Zellen, die Deckzellen des Urothels eindeutig zu bestimmen und von den tiefer liegenden Intermediärzellen zu unterscheiden (Abb. 13).


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Abb. 13: Ultradünnschnitt (60 nm) des Harnblasenepithels der Ratte. Überblick einer Deckzelle. Zellmembran (*) als Grenzstruktur zu den Intermediärzellen. Deckzellen weisen als Permeabilitätsbarriere gegen den aggressiven Urin starke Zonulae occludentes (Pfeil) zwischen den Zellen auf. Ein parazellulärer Durchtritt von Flüssigkeit wird so verhindert.

DZ Deckzelle
N Nucleus
L Lumen
Bar 2,5 µm (a); 0,4 µm (b)

Die facettierte Gestalt der apikalen Plasmamembran und die direkt darunter liegenden vesikulären Strukturen geben ein sehr deutliches Bild der hier permanent ablaufenden Fusionsereignisse. An verschiedenen Abschnitten der apikalen Plasmamembran sind schlauch- oder beutelartige Membransysteme zu erkennen, die offensichtlich durch untereinander fusionierte diskoide Vesikel entstanden sind. Diese Membransysteme öffnen sich dann anscheinend durch ein weiteres Fusionsereignis mit der apikalen Membran zum Harnblasenlumen (Abb. 14).


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Abb. 14: Ultradünnschnitt (60 nm) des Harnblasenepithels der Ratte. Darstellung subzellulärer Strukturen. Die Deckzelle besitzt zum größten Teil apikal liegende fusiforme Vesikel, die mit ihren integralen Plaques die Zelle nach luminal abdichten. Dazu fusionieren die Vesikel mit der Plasmamembran (a) und die Innenseite wird nach luminal geklappt. Fusionieren die Vesikel untereinander, bilden sich Strukturen, die dann als Vesikelschlauch mit der Plasmamembran fusionieren (b). Auch ohne Kontakt zur apikalen Plasmamembran ist eine Fusion der Vesikel untereinander möglich (c).

Inkubationen mit Antikörpern gegen die SNARE-Proteine Synaptobrevin, SNAP 23 und Syntaxin führten zu spezifischen Immunogoldmarkierungen im apikalen Membrankompartiment der Deckzellen. Sowohl die apikale Plasmamembran wie auch die vesikulären Strukturen im apikalen Kompartiment der Zellen wurden durch die Antikörper markiert. Es zeigte sich kein Unterschied im subzellulären Verteilungsmuster zwischen den untersuchten SNARE-Proteinen (Abb. 15 - 17). Die Immunolokalisation der Proteine entsprach in gleicher Weise, wie die lichtmikroskopische Immunofluoreszenz zeigt (siehe Abb. 4 und 5), der subzellulären Verteilung von Uroplakin III (Abb. 18).


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Abb. 15: Ultrastrukturelle Immunolokalisation von SNAP 23 im Harnblasenepithel der Ratte. Die Immunogoldmarkierung ist membranassoziiert. Sowohl die Membranen der diskoiden und fusiformen Vesikel, als auch die apikale Plasmamembran der Deckzellen sind immunopositiv (Pfeilspitzen).

Bar 0,15µm


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Abb. 16: Immunogoldmarkierung von Syntaxin im Urothel der Ratte. Zur Detektion wurde ein monoklonaler Antikörper eingesetzt. Die Membranen der Vesikel als auch die luminale Plasmamembran sind immunopositiv für Syntaxin (Pfeilspitzen).

L = Lumen
V = Vesikel
Bar 0,1 µm

Abb. 17: Immunogoldmarkierung im Ultradünnschnitt (60 nm) des Harnblasenepithels der Ratte. Lokalisation von Synaptobrevin (Pfeilspitzen) durch Detektion mit monoklonalem Antikörper. Markierung im apikalen Kompartiment der Deckzelle sowie auf der Vesikelmembran.

L = Lumen
V = Vesikel
Bar 0,1 µm


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Abb. 18: Ultrastrukturelle Immunolokalisation von Uroplakin III im Harnblasenepithel der Ratte. Lokalisation im luminalen Kompartiment der Deckzelle. Detektion mit monoklonalem Antikörper und 5 nm Goldkolloiden.

L = Lumen
V = Vesikel
Bar 0,1 µm

Der explorativen Datenanalyse wurde eine Normalverteilung zu Grunde gelegt und die mittleren 50 % der Datensätze sind zum Vergleich herangezogen worden. Die Immunogoldmarkierungen der untersuchten Proteine wurden ausgezählt und jeweils für monoklonale Antikörper und polyklonale Seren im Box-Plot (Auftragung der Interquartilsabstände zu den absolut ausgezählten Goldmarkierungen für die jeweiligen Inkubationen) gegenübergestellt.
Die Mediane (markierte Linie in den Boxen) der Inkubationen mit den monoklonalen Antikörpern befinden sich jeweils in den Interquartilsbereichen der verglichenen Inkubationen (die Boxen bezeichnen die 25 % der kleinsten Werte - unteres Quartil und 25 % der größten Werte - oberes Quartil). Die Frage nach der gleichen Verteilung der SNARE-Proteine Synaptobrevin und Syntaxin im Vergleich zu Uroplakin U III kann daher beantwortet werden. Durch den Einsatz monoklonaler Antikörper gegen Synaptobrevin, Syntaxin und Uroplakin konnte anhand der statistischen Betrachtung eine Gleichverteilung im luminalen Kompartiment angenommen werden.


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Box-Plot I: Darstellung der ausgezählten Goldkolloide von Inkubationen mit monoklonalen Antikörpern gegen Uroplakin III, Synaptobrevin und Syntaxin. Bei allen jeweils gültigen 20 Fällen (ausgezählte Gesamtschnittfläche ca. 400 µm²) zeigen sich keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05). Markierter Ausreißer von 10 gezählten Markierungen bei einer Inkubation gegen Uroplakin III.
Nähere Erläuterung im Text.

Analog zur Auswertung der Inkubationen mit den monoklonalen Antikörpern wurde die Datenanalyse für das polyklonale Serum gegen SNAP 23 durchgeführt. Als Referenz erfolgte die parallele Inkubation mit einem Nonimmunserum. Wie im Box-Plot II dargestellt, zeigt die Markierung von SNAP 23 ein eindeutiges Signal. Der Median der Inkubation mit Nonimmunserum liegt deutlich außerhalb der mittleren 50% der Markierungen von Inkubationen gegen SNAP 23. Der Einsatz von polyklonalem Antiserum zum Nachweis von SNAP 23 im luminalen Kompartiment der Deckzelle ist daher geeignet. Die höhere Anzahl und größere Streuung der ausgezählten Goldkolloide bei dieser Inkubation lässt sich auf unspezifische Bindungen polyklonaler Antiseren zurückführen.


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Box-Plot II: Darstellung der ausgezählten Inkubationen mit polyklonalem Antiserum gegen SNAP 23 im Vergleich zu Inkubationen mit Nonimmunserum. Von den jeweils gültigen 20 Fällen (ausgezählte Gesamtschnittfläche ca. 400 µm²) zeigt sich ein signifikanter Unterschied (p < 0,05).
Nähere Erläuterung im Text.

Die statistische Auswertung der Antikörpermarkierungen zeigte eine gleiche Verteilung der drei untersuchten SNARE-Proteine entlang der apikalen Plasmamembran der Deckzellen und der Membran der diskoiden und fusiformen Vesikel. Eine Unterteilung in Vesikel- oder Zielmembran-SNARE-Proteine war somit nicht möglich.

4.3 Ausbildung des SNARE-Haftkomplexes im Urothel der Ratte

Für die Fusion von Membranen oder Membranbestandteilen ist ein SNARE-Haftkomplex erforderlich, der die fusionierenden Membranen ausrichtet und die konformationellen Zwänge der Lipidmembranen überwindet, damit der Fusionsprozess realisiert werden kann. Diese Konformationsänderungen führen letztlich zur ausreichenden Annäherung der Lipidmembranen.
In einer Immunopräzipitation mit einem gegen SNAP 23 gerichteten Antiserum konnte die Ausbildung eines SNARE-Komplexes im Urothel der Rattenharnblase gezeigt werden (Abb. 19). Die Immunopräzipitation führte zur Kopräzipitation von Syntaxin und Synaptobrevin.
Eine parallel durchgeführte Präzipitation mit SNAP 25 (der neuronalen Isoform von


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SNAP 23) führte nicht zur Präzipitation der genannten SNARE-Proteine. Im Gegensatz zu der Ausbildung des Haftkomplexes in Neuronen scheint SNAP 23 die Rolle von SNAP 25 im Urothel zu übernehmen.

Abb. 19: Immunopräzipitation von Syntaxin und Synaptobrevin mit Antiserum gegen SNAP 23. Membranpräparation des Urothels der Ratte. Das SNAP 23-Antiserum präzipitiert einen Proteinkomplex, der Syntaxin, Synaptobrevin und SNAP 23 enthält. SDS-PAGE 12%. Es wurden monoklonale Antikörper eingesetzt [außer für SNAP 23].

Als Regulatorproteine von Fusionsproteinen konnten NSF und alpha-SNAP nachgewiesen werden. Eine Protein-Bande bei 70 kDa wurde in der Westernblotanalyse gezeigt (Abb. 20). Als Kontrolle diente eine Membranpräparation aus dem Hirnhomogenat einer adulten Ratte. Für eine Bindung von NSF an diesen Haftkomplex ist eine vorausgegangene Bindung von Adaptorproteinen erforderlich. Wie für die Parietalzellen des Magens gezeigt wurde, spielen diese Regulatorproteine für den homotypischen Fusionsprozess der tubulären Vesikel untereinander und der canaliculären Membran in diesen Zellen eine Rolle (Lehnardt et al., 2000). Das Vorhandensein von NSF und alpha-SNAP spricht für einen ähnlichen Fusionsprozess.


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Abb. 20: Immunoblot von NSF und there4alpha-SNAP. SDS-PAGE 12%. Membranpräparation des Urothels der Ratte. Zur Kontrolle wurde Hirnhomogenat der Ratte inkubiert (nicht gezeigt). In beiden Präparationen wird NSF (70 kDa) durch das polyklonale Antiserum detektiert. Der monoklonale Antikörper detektiert there4alpha-SNAP in der Membranpräparationen.


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4.4 Detektion von Uroplakin als Deckzellprotein im Urin

4.4.1 Westernblotanalyse

Um zu untersuchen, ob unter physiologischen Bedingungen apikale Teile der Plasmamembran von Deckzellen abgegeben und mit dem Urin ausgespült werden, sollte Uroplakin III im Urin von gesunden Probanden beider Geschlechter detektiert werden.
Nach Ausfällung des Gesamteiweißes aus menschlichem Urin konnte Uroplakin im Immunoblot nachgewiesen werden. Des Weiteren war der Nachweis von Zytokeratin 20, einem Bestandteil des luminalen Kompartiments des Zytoskeletts der Deckzellen (Moll et al., 1990) möglich (Abb. 21).
Selbst im nicht angereicherten physiologischen Urin konnte Uroplakin nachgewiesen werden. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung von 20 µl Urin, was einer Gesamtproteinmenge von 1 - 3 µg entspricht, konnte Uroplakin III nach Antikörperinkubation als typische Doppelbande identifiziert werden (Abb. 22a). Das Erscheinen einer Doppelbande im Immunoblot ist auf die hier durchgeführte Behandlung mit beta-Mercaptoethanol zurückzuführen (Wu, X. R. und T. T. Sun, 1993).
Eine parallel durchgeführte Westernblotanalyse von Urin aus der Rattenharnblase war ebenfalls für Uroplakin III positiv. Es stellte sich die Frage, ob es sich bei den vorliegenden Befunden um den Abgang ganzer Zellen, größerer Zellbruchstücke oder kleiner Membranbestandteile handelt. Zur Klärung dieser Frage wurden mit Hilfe eines graduiertem Zentrifugationsexperiments die Urinsedimente von 3?000 g, 5?000 g, 10?000 g, 200?000 g und 540?000 g im Immunoblot analysiert. Es konnte so gezeigt werden, dass im ausgeschiedenen Urin sowohl Zelltrümmer, Membranbstandteile und auch vesikuläre Strukturen sehr unterschiedlicher Größe bzw. Dichte vorhanden sind. Sowohl in Sedimenten von Zentrifugationen mittlerer g-Zahl, als auch in der Ultrazentrifugation konnte Uroplakin III nachgewiesen werden (Abb. 22b). Nach niedertourigen Zentrifugationen bei 800 g wurde kein Immunsignal für Uroplakin erhalten, was vermuten lässt, dass physiologisch keine ganzen Zellen des Urothels abschilfern und mit dem Urin abgegeben werden.


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Abb. 21: Immunoblot von Uroplakin im Urin nach Proteinfällung. SDS-PAGE 12%. Detektion von Uroplakin III bei 47 kDa. Als Positivkontrolle ist der Immunoblot der Membranpräparation des Urothels der Ratte gezeigt. Zytokeratin (CK 20) ist bei 46 kDa detektiert. Es wurden monoklonale Antikörper eingesetzt.

Abb 22a: Immunoblot von Uroplakin von zentrifugiertem Urin. SDS-PAGE 12%. Es wurde der Urin von weiblichen und männlichen gesunden Personen untersucht. Nähere Erläuterungen im Text.

Abb. 22b: Immunoblot von Uroplakin nach gradueller Zentrifugation von Urin. SDS-PAGE 12%. Spezifische Bande für Uroplakin III bei 47 kDa in allen Zentrifugationsfraktionen. Nähere Erläuterungen im Text.

A 3.000x g BR> B 5.000x g
C 10.000x g
D 200.000x g
E 540.000x g


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4.4.2 Ultrastruktur des Urinsediments

Dem Nachweis von Uroplakin in der Westernblotanalyse folgte die elektronenmikroskopische Untersuchung des Urinsediments nach einer Zentrifugation von 3?000 g. Es sollte untersucht werden, welche Uroplakin assoziierten Strukturen im Urinsediment vorkommen. Lassen sich Membranabschnitte oder vesikuläre Strukturen im Urinsediment darstellen?
Der Nachweis von Membranbruchstücken und vesikulären Strukturen subzellulären Ursprungs kann nicht optimal bewertet werden, weil eine optimale Gewebeerhaltung nach der Urinzentrifugation nicht zu erwarten ist.
Die eingangs gestellte Frage konnte somit nicht eindeutig beantwortet werden, da es sich bei den vorliegenden Ultradünnschnitten (60 nm) auch um Artefakte handeln könnte, die auf angewandte Untersuchungsmethoden zurückzuführen sind.

Abb. 23: Ultrastruktur von Urinsediment. Zentrifugation von physiologischem, unbehandeltem Urin bei 3.000x g. In Abb. a vesikelähnliche Strukturen (*), die keine definierten Membranen aufweisen. Es fanden sich Fragmente (Pfeilspitze in b), die eine membranähnliche Struktur aufwiesen. Zum Vergleich Plasmamembran einer Deckzelle (c).
Nähere Erläuterungen im Text.

Bar 0,15 µm (a); 0,04 µm (b,c)


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