Born, Martin Ludovico: Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

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Kapitel 5. Diskussion

5.1 Terminologie

Nahezu die gesamte luminale Oberfläche der harnableitenden Organe ist mit einem hochspezialisierten Epithel, dem Urothel, ausgekleidet. Diese Epithelauskleidung ist so beschaffen, dass sie dem Urin dauerhaft widerstehen kann und auf diese Weise ein unkontrolliertes Eindringen von Urin mit einem teilweise aggressiven Milieu in die angrenzenden Gewebebereiche verhindert. Für diese Schutzfunktion sind weitestgehend die enddifferenzierten Deckzellen verantwortlich, denn nur die Deckzellen stehen in direktem Kontakt mit dem Urin und sind untereinander durch sehr gut ausgebildete Zonulae occludentes verbunden. Eine parazelluläre Diffusion von Urinbestandteilen ist somit nicht möglich. Die Deckzellen weisen eine ungewöhnliche Morphologie auf und stehen möglicher Weise über lange zytoplasmatische Ausziehungen mit der Basalmembran im Kontakt. Sie können im Verbund mit den Intermediär- und den Basalzellen des Urothels die Volumenschwankungen, wie sie insbesondere in der Harnblase vorkommen, durch ein beträchtliches Dehnungsvermögen ausgleichen. In dieser Untersuchung war kein Hinweis auf einen direkten Kontakt von Deckzellen mit der Basalmembran zu beobachten, was möglicherweise aber auf die sehr dünnen Schnitte, die in dieser Studie verwendet wurden, zurückzuführen ist. Schlanke Zellausläufer konnten so eventuell nicht mit der verwendeten Schnittebene erfasst werden.

5.2 SNARE-Proteine im Urothel der Ratte

Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung des apikalen Membrankompartiments der Deckzellen. Dieses lässt sich in die luminale Plasmamembran der Zelle und den apikalen vesikulären Strukturen unterteilen. Die Plasmamembran erhält durch Einlagerung von zahlreichen Urothelplaques ein facettenartiges Aussehen, was auch zu der Bezeichnung „facet cells“ geführt hat.


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Außerdem kommen innerhalb der Zellen diskoide und fusiforme Vesikel vor, die hauptsächlich im apikalen Zellpol angereichert sind und als apikale Reservemembranen angesehen werden können. Sowohl in der Membran der Vesikel wie auch in der Zellmembran ist Uroplakin III, als dominierendes Membranprotein vorhanden. Dieses bildet, wie in der Einleitung genauer beschrieben, hexagonale Strukturen aus, die der Membran ihre hohe Widerstandsfähigkeit gegen das aggressive Milieu des Urins vermitteln.
Die Vesikel finden Kontakt zur apikalen Plasmamembran und scheinen in einem kontinuierlichen Prozess mit dieser zu verschmelzen. Der Mechanismus, der dieser Verschmelzung zu Grunde liegt, war bisher nicht bekannt. Von verschiedenen anderen Epithelzellen wie z. B. aus den Sammelrohrzellen in den Nieren (Jo et al., 1995) oder den Parietalzellen des Magens (Jöns et al., 1999) war bekannt, dass auch in diesen Zellen vesikuläre Membranen mit der apikalen Plasmamembran der Zellen fusionieren und so die Membranoberfläche vergrößern. Die integralen Membranproteine der Vesikelmembran können so in die Zellmembran integriert werden, was zum Beispiel in den Parietalzellen des Magens zu einer Steigerung der HCl-Sekretion führt (Jöns et al., 1999).
Für diese Fusionsvorgänge werden Mechanismen diskutiert, die Ähnlichkeiten mit der Fusion von synaptischen Vesikeln an der präsynaptischen Membran aufweisen. Für den Vorgang der neuronalen Fusion wurde die SNARE-Hypothese aufgestellt (Jahn und Südhof, 1994). Diese Hypothese postuliert als einen initialen ersten Schritt, vor der eigentlichen Fusion, die Ausbildung eines Haftkomplexes zwischen den SNARE-Proteinen Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP 25. Diese SNARE-Proteine wurden mittlerweile auch in verschiedenen Epithelzellen, wie in den oben aufgeführten gefunden und spielen hier wahrscheinlich auch eine wichtige Rolle bei Membranfusionen in diesen Zellen.
Wir konnten in Westernblot-Analysen zeigen, dass auch im Epithel der Harnblase der Ratte SNARE-Proteine vorkommen. Neben Synaptobrevin und Syntaxin konnte SNAP 23, eine epitheliale Isoform von neuronalem SNAP 25 (Ravichandran et al., 1996), nachgewiesen werden. Immunopräzipitationen mit SNAP 23 Antikörpern zeigten, dass auch im Urothel ein Komplex zwischen den identifizierten Proteinen ausgebildet wird. Die SNAP 23 Antikörper kopräzipitierten sowohl Synaptobrevin als auch Syntaxin. Obwohl durch Kontrollinkubationen mit

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Antikörpern gegen Uroplakin und ?-Aktin die Spezifität der Harnblasenepithelpräparation nachgewiesen werden konnte, war es anhand der Westernblot-Analysen nicht möglich, die identifizierten SNARE-Proteine nur den Deckzellen zuzuordnen. Zur Beurteilung der zellulären und subzellulären Lokalisation wurden deshalb Inkubationen von Semidünnschnitten des Harnblasenepithels der Harnblase angefertigt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Synaptobrevin, wie auch Syntaxin und SNAP 23 im Deckzellepithel vorhanden sind. Die Antikörpermarkierung befand sich überwiegend an der apikalen Plasmamembran und auch an den Membranen der intrazellulären Vesikel im apikalen Zellpol. Diese Antikörpermarkierung entsprach somit der von Uroplakin III, welches in Kontrollschnitten zur Anwendung kam. Für alle drei SNARE-Proteine konnte ebenfalls eine ultrastrukturelle Lokalisation gezeigt werden. Hier wurde bestätigt, dass die Antikörpermarkierung tatsächlich ausschließlich an der apikalen Zellmembranen sowie an der vesikulären Membran der Deckzellen vorhanden ist. Eine überraschende Beobachtung war, dass alle drei SNARE-Proteine in einem identischen subzellulären Verteilungsmuster gefunden wurden und es nicht, wie es für die heterotypische Fusion der synaptischen Vesikel an der Synapse beschrieben ist, zu einer unterschiedlichen Verteilung von Vesikel- und Ziel-SNARE-Proteinen kommt.
Wir fanden im Harnblasenepithel alle drei SNARE-Proteine auf der Membran der diskoiden Vesikel als auch auf der apikalen Zellmembran, so dass uns ein klassischer heterotypischer Fusionsmechanismus sehr unwahrscheinlich erscheint. Die Vermutung liegt nahe, dass es sich bei den Membranfusionen des apikalen Membrankompartiments der Deckzellen um eine Kombination von homotypischen Fusionen und heterotypischen Fusionen handeln muß.


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5.3 Modell der homotypischen Fusion in Deckzellen

Homotypische Membranfusionen sind erstmals bei der Fusion von Vakuolen der Hefe beschrieben worden. Auf den Membranen dieser Vakuolen sind alle drei SNARE-Proteine vorhanden, so kann jede Vakuole sowohl als Ziel- und auch als Vesikelmembran dienen. Damit können so homotypische Verschmelzungen stattfinden (Wilson et al., 1989; Ungerman et al., 1998b).
Für die Fusionsvorgänge im apikalen Membrankompartiment der Deckzellen wurde folgende Modellvorstellung entwickelt (Abb. 24). Mehrere diskoide oder fusiforme Vesikel verschmelzen miteinander und finden dann durch vereinzelte heterotypische Fusionen mit apikalen Plasmamembranabschnitten Zugang zum Lumen der Harnblase. Es entsteht ein Vesikelschlauch, der über die Länge der fusionierten Vesikel reicht. Nach den ultrastrukturellen Befunden finden zusätzlich auch normale heterotypische Fusionsvorgäne von einzelnen Vesikeln mit der apikalen Membran statt.


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Abb. 24: a Deckzelle, schematisch dargestellt
b Fusion fusiformer Vesikel zu einem Vesikelschlauch
c homotypische Fusion der Vesikel mit der apikalen Plasmamembran
Ein Haftkomplex, bestehend aus Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP 23, bildet sich an den Membranen von Vesikel und luminaler Deckzelle aus. Eine Fusion ist so zwischen den Vesikeln (b, c) möglich. Einzelne Vesikel können auch heterotypisch mit der Plasmamembran fusionieren (b, oben). Es kommt zur Ausbildung eines Vesikelschlauches, der dann zum Lumen hin aufklappt.

Außer den eigentlichen SNARE-Proteinen konnten wir mit alpha, beta-SNAP und NSF zwei weitere Proteine im Urothel nachweisen, die für die Membranfusion von entscheidener Bedeutung sind. Die Funktion, die diese Proteine in den Deckzellen haben könnten, ist bisher noch rein spekulativ. Es wäre aber denkbar, das alpha, beta-SNAP und NSF für das Lösen der lateralen SNARE-Komplexe verantwortlich sind. Diese bilden sich spontan auf Membranen aus, die alle drei SNARE-Proteine enthalten. Vor der Ausbildung des eigentlichen Haftkomplexes zwischen den fusionierenden Membranen müssen diese gelöst werden. Eine derartige Funktion von alpha, beta-SNAP und NSF wird für die Fusion von


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Vakuolen in der Hefe sowie für die Fusion der tubulären Vesikel in den Parietalzellen des Magens diskutiert (Lehnardt et al., 2000).
Ob es sich bei den beschriebenen Fusionsvorgängen um einen kontinuierlichen Prozess handelt oder ob es einen physiologischen Stimulus gibt, der die Fusionsvorgänge aktiviert oder beschleunigt, kann noch nicht beantwortet werden. Vorstellbar wäre, dass über einen Dehnungsreiz, wie er durch eine vermehrte Füllung der Harnblase ausgelöst wird, eine gesteigerte Fusionstätigkeit angeregt wird. Eine weitere Möglichkeit wäre auch, dass Mikrotraumen oder eine Alterung der apikalen Oberfläche registriert werden und es dann infolge der Fusion intrazellulärer Vesikel mit der apikalen Plasmamembran und einer synchronisierten Endozytose oder durch ein Abknospen des gealterten oder verletzten Membranabschnitts zu einem Membranaustausch kommt. Auf diese Weise könnte die Integrität der Membran erhalten bleiben. Die Notwendigkeit für eine wiederholte Erneuerung der apikalen Plasmamembran ergibt sich auch aus der ungewöhnlich langen Lebensspanne, die die enddifferenzierten Deckzellen aufweisen. Im Vergleich zu anderen Epithelzellen wie den Darmepithelzellen, die nach 1,5 bis 4,5 Tagen absterben und ins Darmlumen abgegeben werden, haben die Deckzellen des Urothels eine durchschnittliche Lebenserwartung von 200 Tagen. In unseren lichtmikroskopischen und ultrastrukturellen Untersuchungen konnten wir keinen Hinweis auf eine durch Endozytose bedingte Wiederaufnahme von Bereichen der apikalen Plasmamembran beobachten. Auch Inkubationen mit Antikörpern gegen Clathrin brachten keine Hinweise, die auf eine clathrinvermittelte Endozytose schließen ließen. Bei einer Endozytose käme es mit der Vesikulation von luminalen Membranabschnitten aus der Plasmamebran zu einer Aufnahme des Ausscheidungsprodukts Urin in die Zelle, welches sich für den Zellstoffwechsel mit Sicherheit als schädlich herausstellen würde. Hingegen konnten in den ultrastrukturellen Untersuchungen zahlreiche Membranabschnitte identifiziert werden, die das Bild von abknospenden Membranen zeigten.

5.4 Uroplakin

Um die mit dem Urin ausgeschiedenen Membranen nachweisen zu können, wurde in einer Westernblotanalyse nach dem Hauptmembranprotein Uroplakin III


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gesucht. Zu unserer Überraschung konnte Uroplakin III nicht nur im Präzipitat nach Fällung einer größeren Menge Urin nachgewiesen werden, sondern wurde auch nach Auftragung von nur 20 µl Normalurin, welches in etwa 1 - 3 µg Gesamtprotein entspricht, deutlich positiv markiert. Um einen Hinweis darauf zu bekommen, ob immer Membranvesikel einer definierten Größe von den Deckzellen abgegeben werden oder ob unterschiedliche Vesikelgrößen vorkommen oder evt. sogar ganze Zellen mit dem Urin abgegeben werden, haben wir eine Zentrifugationsanalyse durchgeführt und die so gewonnenen Sedimente wiederum im Westernblot getestet. Wir fanden keinen eindeutigen Hinweis auf ein Vorkommen von ganzen Zellen oder von größeren Zelltrümmern. Allerdings konnten wir kleinere Membranbestandteile sehr unterschiedlicher Größe und Dichte im Urin identifizieren. Einander nachfolgende Zentrifugationen mit 3_000 g bis 540_000 g erbrachten jeweils einen positiven Nachweis von Uroplakin III im Sediment. Dieses Ergebnis findet seine Bestätigung in den ultrastrukturellen Darstellungen, hier konnten ebenfalls sehr kleine abknospende Vesikel als auch größere zusammenhängende Membranabschnitte gezeigt werden. Der positive Befund der Westernblotanalyse mit Antikörpern gegen Zytokeratin 20 im ausgefällten Urinsediment konnte eine Abgabe von größeren Zellbestandteilen oder ganzen Zellen zeigen (Abb. 25).

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Abb. 25: Nachweis von Uroplakin III in verschiedenen Urinsedimenten. Im unteren Bildabschnitt sind Deckzellen schematisch dargestellt. Die abgegebene Membran ist im schematischen Bild jeweils rot markiert. Im oberen Abschnitt ist die Ultrastruktur im histologischen Schnittbild (60 nm) dargestellt. Es ist möglich, dass bei Zentrifugationen geringer g-Zahl (A) größere Zellbestandteile oder ganze Zellen abgegeben werden. Der immunologische Nachweis von Zytokeratin als Bestandteil des Zytoskeletts lässt diese Vermutung zu. Auch kleinere Membranteile (Pfeil) können abgegeben werden (B). Nach Ultrazentrifugation konnte Uroplakin III ebenfalls nachgewiesen werden. Es wäre möglich das es zum Abknospen kleinster Membranabschnitte, eventuell auch einzelner Vesikel kommt (Pfeil in C).

(Bar 2,5 µm[A], 1µm[B], 0,4 µm[C]).


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Die Ausscheidung von Uroplakin im Urin lässt die Annahme zu, dass Uroplakin als Markerprotein für pathologische Veränderungen im Urothel geeignet ist. Blasenkarzinome stellen ca. 3 % aller malignen Erkrankungen. Bei den Harnblasentumoren handelt es sich fast ausschließlich um Urothelzellkarzinome (Freudenberg, 1989). In der Differenzierung dieser Tumoren, wie z. B. Brennertumoren, die den Urothelzellkarzinomen zugeordnet werden, konnte Uroplakin III spezifisch detektiert werden. In anderen Tumoren, z. B. im Mammakarzinom, wird Uroplakin nicht exprimiert (Kaufmann et al., 2000). Aufgrund unserer Ergebnisse könnte Uroplakin als histologischer Marker für metastatische Urothelzellkarzinome eingesetzt werden. Eine maligne Transformation ist mit einer Expression spezifischer Differenzierungsleistung vereinbar (Moll et al., 1993). Da die meisten Urothelzellkarzinome dem ableitenden Harnsystem zugänglich sind, wäre eine Frühdiagnostik im Urin denkbar. Eine quantitative Zunahme von Uroplakin im Urin bei Karzinomwachstum ist wahrscheinlich, da es sich um einen turn over von differenzierten Deckzellen handelt.
Bisher wird untersucht, ob nukleäre Matrixproteine als Screeningtest auf Urothelzellkarzinome eingesetzt werden können. Tumore, welche durch die konventionelle Zytologie nicht erfasst und diagnostiziert werden, können in einem frühen Stadium durch die Detektion von nukleärem Matrixprotein (NMP 22) entdeckt werden (Akaza and Miyanaga, 1997). Dieser Einsatz setzt eine Mikrohämaturie vorraus und ist durch eine vermehrte Freisetzung von NMP bei entzündlichen Veränderungen der Harnblase stark eingeschränkt.
Eine tumorspezifische Veränderung der Uroplakinkonzentration im Urin von Patienten könnte Hinweise auf die pathologische Genese intraurethraler Prozesse geben.


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