Born, Martin Ludovico: Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

Aus dem Institut für Anatomie
der medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae

Vorgelegt der medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität Berlin

Von Martin Ludovico Born

Dekan: Prof. Dr. med. J. Dudenhausen

Gutachter:
Prof. Dr. med. H. Bigalke
PD Dr. med. F. Schmitz
PD Dr. rer. nat. T. Jöns

eingereicht: 04. Januar 2002

Datum der Promotion: 23. September 2002

Abstrakt

Die Deckzellen des Urothels sind die einzigen Zellen, die mit dem Urin über einen längeren Zeitraum in direktem Kontakt stehen. Ihre apikale Plasmamembran weist ein facettiertes Aussehen auf und hat dicht gepackte Uroplakin III Moleküle eingelagert, die durch Ausbildung von hexagonalen Proteinkomplexen entscheidend sind für die hohe chemische Resistenz, gegen die zum Teil zellschädigende Zusammensetztung des Urins. Unterhalb der apikalen Plasmamembran befinden sich zahlreiche diskuide Vesikel. Diese entsprechen in ihrem molekularen Membranaufbau der apikalen Membran und können als präapikale Reservemembran angesehen werden, die bei Bedarf in die apikale Plasmamembran eingebaut werden kann. In der vorliegenden Arbeit ist untersucht worden, in wieweit SNARE-Proteine für die Fusion zwischen den diskuiden Vesikeln und der apikalen Plasmamembran von Bedeutung sind. In Immunoblotanalysen wurde das Vorkommen von Synaptobrevin, Syntaxin, SNAP23, NSF und alpha,beta-SNAP gezeigt und es konnte in Immunopräzipitationen die Ausbildung des SNARE-Haftkomplexes nachgewiesen werden. Immunfluoreszenz Untersuchungen und Immunogoldmarkierungen bestätigten das Vorhandensein von SNARE-Proteinen und wiesen durch das subzelluläre Verteilungsmuster der Proteine auf einen kombinierten homotypischen und heterotypischen Fusionsmechanismus hin. Hinweise auf eine mit der Fusion der Vesikel gleichgeschaltete Endozytose wurden nicht gefunden, das Abknospen von Membranbestandteilen der apikalen Zellmembran konnte jedoch ultrastrukturell gezeigt werden. Ein weiterer Hinweis auf eine möglicherweise kontinuierliche Erneuerung der apikalen Zellmembran der Deckzellen konnte durch den Nachweis von Uroplakin III im Urin von gesunden Probanden gebracht werden. In einem Zentrifugationsexperiment wurde Uroplakin III in Fraktionen von Membranaggregaten sehr unterschiedlicher Größe nachgewiesen, was die ultrastrukturellen Befunde, die das Abknospen sowohl von einzelnen Vesikeln wie auch von größeren Membranbestandteilen zeigten, bestätigt.

Schlagwörter:
Urothel, Uroplakin, SNARE, homotypische Fusion

Abstract

The luminal surface of the bladder epitehlium is continuously exposed to the urine that differs in ionic composition and osmolarlity from blodd. The apical plasma membrane of facet cells, facing the urine, is covered with rigid-looking plaques consisting of hexagonal uroplakin-particles. Together with tight junctions these plaques form a specialized membrane compartment that represents one of the tightest and most impermeable barrier of the body. Plaques also occur in the membrane of cytoplasmic discuid vesicles. Here we show that synaptobrevin, SNAP23, syntaxin, NSF and alpha/beta-SNAP are perfectly colocalized with uroplakin III at the apical plasma membrane and with the membrane of discuid vesicles. This distribution suggest that discuid vesicles of a homotypic and heterotypic fusion events. Furthermore we detected uroplakin III containing membranes of different size in the urine of healthy humans and rats. probably facet cells maintain their permeability barrier by a process of membrane renewal where pieces of the apical membrane are continuously taken off by freshly fused discuid vesicles.

Keywords:
Urothelium, Uroplakin, SNARE, homotypic Fusion


Seiten: [4] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18-20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteIdentifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte
Vorwort
1 Einleitung
1.1Anatomie der Harnblase
1.2Übersicht über das Harnblasenepithel
1.3Prinzipien der Membranfusionen
1.4Die SNARE-Hypothese
2 Fragestellung und Ziel der Arbeit
3 Materialien und Methoden
3.1Chemikalien und Reagenzien
3.2Puffer und Lösungen
3.3Verwendete Antikörper
3.4Verwendete Geräte
3.5Durchführung der Experimente
3.5.1Membranpräparation des Harnblasenepithels
3.5.2Protein-Gelelektrophorese und Westernblot-Analyse
3.5.3Immunopräzipitation
3.5.4Proteinfällung
3.5.5Urinzentrifugation
3.5.6Indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie
3.5.7Elektronenmikroskopie
3.6Statistische Methoden
4 Ergebnisse
4.1Morphologie
4.2Detektion von SNARE-Proteinen im Urothel der Rattenharnblase
4.2.1Immunofluoreszenz
4.2.2Westernblotanalyse
4.2.3Ultrastrukturelle Lokalisation
4.3Ausbildung des SNARE-Haftkomplexes im Urothel der Ratte
4.4Detektion von Uroplakin als Deckzellprotein im Urin
4.4.1Westernblotanalyse
4.4.2Ultrastruktur des Urinsediments
5 Diskussion
5.1Terminologie
5.2SNARE-Proteine im Urothel der Ratte
5.3Modell der homotypischen Fusion in Deckzellen
5.4Uroplakin
6 Zusammenfassung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Harnblase - Übersicht (mod. n. Krstiæ)
Abb. 2: Harnblase - Urothel (mod. n. Krstiæ)
Abb. 3: Semidünnschnitt (1 µm) der Harnblase einer Ratte nach Gefriertrocknung und Einbettung. Toluidinblau gefärbt. Die starke Fältelung der Harnblasenwand lässt auf eine entleerte Harnblase schließen. Die Deckzellen liegen als superfizielle Zelllage den Intermediärzellen an und bilden die luminale Abdichtung des Epithels. Es fällt eine deutliche Anfärbung im Bereich des luminalen Kompartiments (Pfeil) auf. Diese Struktur wurde als „Crusta“ bezeichnet. Nähere Erläuterungen im Text.
Abb. 4+5: Semidünnschnitte (1 µm) der Harnblase der Ratte. Lokalisation von Uroplakin III in Deckzellen des Urothels durch Immunofluoreszenz. Punktlinie in Abb. 5 markiert die basale Zellgrenze. Uroplakin wird vermehrt im apikalen Zellpol exprimiert und dann in die Plasmamembran eingebaut (Abb. 4)
Abb. 6: Lokalisation von Zytokeratin 20 in Deckzellen im Urothel der Ratte. Neben anderen Zytokeratinen (CK 8, 18) wird als wichtiges Protein des Zytoskeletts Zytokeratin 20 nur in den Deckzellen exprimiert und kann als Marker für die enddifferenzierte Deckzelle dienen.
Abb. 7: Immunolokalisation von SNARE-Proteinen im Urothel der Rattenharnblase. Die drei untersuchten SNARE-Proteine Syntaxin (a), Synaptobrevin (b) und SNAP 23 (c) zeigen ein starkes Immunofluoreszenzsignal im apikalen Zellkompartiment. Im Bereich der luminalen Zellmembran (Pfeile) ist das Signal für alle drei untersuchten Proteine am stärksten ausgeprägt. Der teils wolkig-diffuse Hintergrund kann auf artifizielle Stauchung des Schnittes und damit die Umverteilung von tieferliegenden Zellstrukturen, wie Bereiche der Muscularis, zurückgeführt werden.
Abb. 10: Immunoblot einer Membranpräparation von Urothel und Tunica muscularis einer Rattenharnblase. SDS-PAGE 12%. SNAP 23 ist in beiden Präparationen detektiert, da in der motorischen Endplatte neuronale Strukturen vorhanden sind. Als Positivkontrolle für die Urothelpräparation wurde der monoklonale Antikörper gegen Uroplakin III eingesetzt (unten). Der monoklonale Antikörper gegen glattmuskuläres alpha-Aktin wurde als Negativkontrolle eingesetzt (oben).
Nähere Erläuterungen dazu im Text.
Abb. 11: Immunoblot einer Membranpräparation von Urothel und Tunica muscularis einer Rattenharnblase. SDS-PAGE 12%. SNAP 23 ist in beiden Präparationen detektiert, da in der motorischen Endplatte neuronale Strukturen vorhanden sind. Als Positivkontrolle für die Urothelpräparation wurde der monoklonale Antikörper gegen Uroplakin III eingesetzt (unten). Der monoklonale Antikörper gegen glattmuskuläres alpha-Aktin wurde als Negativkontrolle eingesetzt (oben).
Nähere Erläuterungen dazu im Text.
Abb. 12: Detektion von SNARE-Proteinen im Harnblasenepithel zum Vergleich mit dem Epithel im Plexus choroideus in der Ratte. SNAP 25 (25) kann nur im Epithel des Plexus choroideus gezeigt werden. Die SNARE-Proteine Synaptobrevin (Syb), SNAP 23 (23) und Syntaxin werden in beiden Epithelien exprimiert. Detektion mit monoklonalen Antikörpern [außer für SNAP 23]. SDS-PAGE 12%. Visuelle Entwicklung mit Chloronaphtol.
Abb. 13: Ultradünnschnitt (60 nm) des Harnblasenepithels der Ratte. Überblick einer Deckzelle. Zellmembran (*) als Grenzstruktur zu den Intermediärzellen. Deckzellen weisen als Permeabilitätsbarriere gegen den aggressiven Urin starke Zonulae occludentes (Pfeil) zwischen den Zellen auf. Ein parazellulärer Durchtritt von Flüssigkeit wird so verhindert.
Abb. 14: Ultradünnschnitt (60 nm) des Harnblasenepithels der Ratte. Darstellung subzellulärer Strukturen. Die Deckzelle besitzt zum größten Teil apikal liegende fusiforme Vesikel, die mit ihren integralen Plaques die Zelle nach luminal abdichten. Dazu fusionieren die Vesikel mit der Plasmamembran (a) und die Innenseite wird nach luminal geklappt. Fusionieren die Vesikel untereinander, bilden sich Strukturen, die dann als Vesikelschlauch mit der Plasmamembran fusionieren (b). Auch ohne Kontakt zur apikalen Plasmamembran ist eine Fusion der Vesikel untereinander möglich (c).
Abb. 15: Ultrastrukturelle Immunolokalisation von SNAP 23 im Harnblasenepithel der Ratte. Die Immunogoldmarkierung ist membranassoziiert. Sowohl die Membranen der diskoiden und fusiformen Vesikel, als auch die apikale Plasmamembran der Deckzellen sind immunopositiv (Pfeilspitzen).
Abb. 16: Immunogoldmarkierung von Syntaxin im Urothel der Ratte. Zur Detektion wurde ein monoklonaler Antikörper eingesetzt. Die Membranen der Vesikel als auch die luminale Plasmamembran sind immunopositiv für Syntaxin (Pfeilspitzen).
Abb. 17: Immunogoldmarkierung im Ultradünnschnitt (60 nm) des Harnblasenepithels der Ratte. Lokalisation von Synaptobrevin (Pfeilspitzen) durch Detektion mit monoklonalem Antikörper. Markierung im apikalen Kompartiment der Deckzelle sowie auf der Vesikelmembran.
Abb. 18: Ultrastrukturelle Immunolokalisation von Uroplakin III im Harnblasenepithel der Ratte. Lokalisation im luminalen Kompartiment der Deckzelle. Detektion mit monoklonalem Antikörper und 5 nm Goldkolloiden.
Box-Plot I: Darstellung der ausgezählten Goldkolloide von Inkubationen mit monoklonalen Antikörpern gegen Uroplakin III, Synaptobrevin und Syntaxin. Bei allen jeweils gültigen 20 Fällen (ausgezählte Gesamtschnittfläche ca. 400 µm²) zeigen sich keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05). Markierter Ausreißer von 10 gezählten Markierungen bei einer Inkubation gegen Uroplakin III.
Nähere Erläuterung im Text.
Box-Plot II: Darstellung der ausgezählten Inkubationen mit polyklonalem Antiserum gegen SNAP 23 im Vergleich zu Inkubationen mit Nonimmunserum. Von den jeweils gültigen 20 Fällen (ausgezählte Gesamtschnittfläche ca. 400 µm²) zeigt sich ein signifikanter Unterschied (p < 0,05).
Nähere Erläuterung im Text.
Abb. 19: Immunopräzipitation von Syntaxin und Synaptobrevin mit Antiserum gegen SNAP 23. Membranpräparation des Urothels der Ratte. Das SNAP 23-Antiserum präzipitiert einen Proteinkomplex, der Syntaxin, Synaptobrevin und SNAP 23 enthält. SDS-PAGE 12%. Es wurden monoklonale Antikörper eingesetzt [außer für SNAP 23].
Abb. 20: Immunoblot von NSF und there4alpha-SNAP. SDS-PAGE 12%. Membranpräparation des Urothels der Ratte. Zur Kontrolle wurde Hirnhomogenat der Ratte inkubiert (nicht gezeigt). In beiden Präparationen wird NSF (70 kDa) durch das polyklonale Antiserum detektiert. Der monoklonale Antikörper detektiert there4alpha-SNAP in der Membranpräparationen.
Abb. 21: Immunoblot von Uroplakin im Urin nach Proteinfällung. SDS-PAGE 12%. Detektion von Uroplakin III bei 47 kDa. Als Positivkontrolle ist der Immunoblot der Membranpräparation des Urothels der Ratte gezeigt. Zytokeratin (CK 20) ist bei 46 kDa detektiert. Es wurden monoklonale Antikörper eingesetzt.
Abb 22a: Immunoblot von Uroplakin von zentrifugiertem Urin. SDS-PAGE 12%. Es wurde der Urin von weiblichen und männlichen gesunden Personen untersucht. Nähere Erläuterungen im Text.
Abb. 22b: Immunoblot von Uroplakin nach gradueller Zentrifugation von Urin. SDS-PAGE 12%. Spezifische Bande für Uroplakin III bei 47 kDa in allen Zentrifugationsfraktionen. Nähere Erläuterungen im Text.
Abb. 23: Ultrastruktur von Urinsediment. Zentrifugation von physiologischem, unbehandeltem Urin bei 3.000x g. In Abb. a vesikelähnliche Strukturen (*), die keine definierten Membranen aufweisen. Es fanden sich Fragmente (Pfeilspitze in b), die eine membranähnliche Struktur aufwiesen. Zum Vergleich Plasmamembran einer Deckzelle (c).
Nähere Erläuterungen im Text.
Abb. 24: a Deckzelle, schematisch dargestellt
b Fusion fusiformer Vesikel zu einem Vesikelschlauch
c homotypische Fusion der Vesikel mit der apikalen Plasmamembran
Ein Haftkomplex, bestehend aus Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP 23, bildet sich an den Membranen von Vesikel und luminaler Deckzelle aus. Eine Fusion ist so zwischen den Vesikeln (b, c) möglich. Einzelne Vesikel können auch heterotypisch mit der Plasmamembran fusionieren (b, oben). Es kommt zur Ausbildung eines Vesikelschlauches, der dann zum Lumen hin aufklappt.
Abb. 25: Nachweis von Uroplakin III in verschiedenen Urinsedimenten. Im unteren Bildabschnitt sind Deckzellen schematisch dargestellt. Die abgegebene Membran ist im schematischen Bild jeweils rot markiert. Im oberen Abschnitt ist die Ultrastruktur im histologischen Schnittbild (60 nm) dargestellt. Es ist möglich, dass bei Zentrifugationen geringer g-Zahl (A) größere Zellbestandteile oder ganze Zellen abgegeben werden. Der immunologische Nachweis von Zytokeratin als Bestandteil des Zytoskeletts lässt diese Vermutung zu. Auch kleinere Membranteile (Pfeil) können abgegeben werden (B). Nach Ultrazentrifugation konnte Uroplakin III ebenfalls nachgewiesen werden. Es wäre möglich das es zum Abknospen kleinster Membranabschnitte, eventuell auch einzelner Vesikel kommt (Pfeil in C).

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Fri Feb 7 11:50:51 2003