Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek
The phylogenetic relationships of the higher arthropod taxa are still of special interest. Especially the interrelationships of the different Crustacea taxa have long been debated. The focus of this investigation is to make a contribution to the phylogenies of two Crustacea taxa using molecular markers: The Phyllopoda which belong together with the Anostraca to the branchiopods, and of the Astacoidea, one of the two higher crayfish taxa (Astacida).
The following molecular markers were used: 1) Phyllopoda: the 3rd domain of the mitochondrial encoded 12S rRNA taking into account informations of the secondary structure, the nuclear encoded proteingene EF-1 alpha and the positions of introns found in the coding region of EF-1 alpha. 2) Astacoidea: the 3rd domain of the 12S rRNA and the mitochondrial encoded proteingene cox1. The choice of the mentioned markers in combination with different computercladistical methods allowed to give a satisfying, and in the case of the Astacoidea a more surprising answer to most addressed phylogenetic questions. The gained hypotheses are then discussed in detail in the light of morphological features and hypotheses.
Innerhalb der Arthropodensystematik sind die phylogenetischen Beziehungen der höheren Crustaceataxa seit langem von besonderen Interesse. Ziel dieser Arbeit ist die Rekonstruktion der phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse mit Hilfe molekularer Datensätze für die Phyllopoda, die zusammen mit den Anostraca die Branchiopoda bilden und der Astacoidea (Astacida), einer Teilgruppe der Flusskrebse.
Folgende molekulare Marker kamen zum Einsatz: 1) Für die Phyllopoda: Die 3. Domäne der mitochondrial codierten 12S rRNA, unter Berücksichtigung von Sekundärtrukturinformationen, das nukleare Gen EF-1 alpha und die Positionen von Introns im Gen EF-1 alpha. 2) Für die Astacoidea: Die 3. Domäne der 12S rRNA und das mitochondrial codierte Gen cox1. Durch die Wahl der molekularen Marker, die mit unterschiedlichen computerkladistischen Methoden ausgewertet wurden, konnten für die meisten Fragen eine eindeutige und im Fall der Astacoidea überraschende phylogenetische Aussage getroffen werden. Die gewonnenen Hypothesen werden ausführlich im Licht morphologischer Hypothesen diskutiert.
To make progress in understanding all this, we probably need to begin with simplified (oversimplified?) models and ignore the critics’ tirade that the real world is more complex. The real world is always more complex, which has the advantage that we shan’t run out of work.
John Ball (1984)
Seit Charles Darwin ist es ein Traum eines jeden Evolutionsbiologen, die Entstehungsgeschichte aller lebenden Organismen zu rekonstruieren und das Ergebnis in Form eines Stammbaumes Haeckel (1866) auszudrücken. Ein Ansatzpunkt zur Verwirklichung dieses Traums ist das Studium des fossilen Berichtes, um eine möglichst lückenlose Genealogie der Organismen mit allen phänotypischen Übergangsformen rekonstruieren zu können. Dies gelingt für Teilbereiche des Baums, so genügend fossilisierbare Strukturen vorhanden waren (wie beispielsweise bei Cormophyten, Vertebraten, Foraminiferen oder Cephalopoden), in durchaus vielversprechender Weise, versagt jedoch zwangsläufig bei Gruppen mit kaum oder nicht fossilisierbarer Morphologie. Da dies bei der Mehrzahl der Großtaxa der Fall ist, wurde schon frühzeitig auf vergleichende Methoden an rezenten Organismen zurückgegriffen. Insbesondere morphologische Methoden haben wesentlich zur Klärung einiger Teilfragen des ``tree of life´´ beigetragen. Die Veränderungen morphologischer Merkmalskomplexe sind jedoch derartig komplex, dass es bis zum heutigen Tag nicht gelingt, ein im Detail klares Bild der Beziehungen der Organismen zueinander zu zeichnen. Viele Fragen der Beziehungen der Großtaxa zueinander sind nach wie vor offen und bedürfen der Bearbeitung mit innovativen Methoden.
Eine solche Vorgehensweise schlugen Zuckerkandl und Pauling Zuckerkandl undPauling (1965) vor, indem sie molekulare DNA- Sequenzen als Merkmale zur Klärung phylogenetischer Fragestellungen empfahlen. Die Erfindungen der enzymatischen DNA Sequenzierung durch Strangabbruch Sanger et al. (1977) und der PCR Mullis et al. (1986) liefern dazu die methodischen Werkzeuge, mit deren Hilfe es seitdem möglich wurde, eine Vielzahl von „DNA Phylogenien“ zu erstellen und in die allgemeine Diskussion einzubringen.
Die vergleichende Analyse von DNA Sequenzen hat einige Vorteile gegenüber der vergleichenden Morphologie. Die elementarste Gemeinsamkeit aller rezenten Organismen ist wohl unbestritten ihre Nutzung der DNA als Erbinformationsträger über alle Generationen hinweg. Weiterhin unbestritten ist, trotz der Beobachtung geringfügiger, seltener Abweichungen, die Universalität des genetischen Codes. Die monophyletische Entstehung der Erbinformationsweitergabe kann deshalb nicht mehr ernsthaft diskutiert werden. Für die phylogenetische Forschung ergibt sich daher die prinzipielle Möglichkeit, DNA-Sequenzen aller rezenten Organismen zu homologisieren und somit einen schier unerschöpflichen Pool an Merkmalen zu gewinnen. Dies setzt voraus, dass geeignete, problemlos homologisierbare (vergleichbare) Sequenzen gewählt werden, die eine gewisse Variabilität aufweisen (abhängig von dem zu untersuchenden taxonomischen Level). Diese Variabilität ist das Ergebnis von Mutationen der DNA, die einem mehr oder weniger gleichmäßigen Muster folgen. So ist es möglich, Evolutionsmodelle zu formulieren, die eingesetzt werden können, um auch entfernte Verwandtschaftsbeziehungen zu erforschen.
Aus genannten Gründen wird daher von der Molekularsystematik i.a. die Aufklärung vieler bislang fraglicher Beziehungen innerhalb des ``tree of life´´ erwartet. Daraus sollte ein besseres Verständnis der zu beobachtenden phänotypischen Komplexität und deren Bewertung ermöglicht werden.
Die von Willi Hennig Hennig (1966) begründete Methode des „Cladismus“ gilt als methodische Basis der phylogenetischen Systematik. Ziel der phylogenetischen Systematik ist es, einen natürlichen Stammbaum zu rekonstruieren. Wir sind nicht Zeugen eines seit Hunderten von Millionen Jahren andauernden Prozesses. Jede Bemühung einer Rekonstruktion von Verwandtschaftsverhältnissen hat daher hypothetischen Charakter und muss der Falsifikation offen gegenüberstehen.
Durch die von W. Hennig eingeführten neuen Begriffe, wie Synapomorphie und Synplesiomorphie, gelang es der phylogenetischen Forschung, qualitativ zwischen Merkmalen und der Evolution derselben zu unterscheiden: Hierbei werden zunächst ursprüngliche (plesiomorphe) Merkmale von abgeleiteten (apomorphen) Merkmalen unterschieden. Taxa, die gegenüber ihren putativen Außengruppen abgeleitete Merkmalszustände teilen (Synapomorphien), werden zu monophyletischen Gruppen zusammengefasst, d.h. die Mitglieder dieser Gruppe stammen von einer nur ihnen gemeinsamen Stammart ab.
Aufgabe der phylogenetischen Forschung ist es nun, durch den Vergleich homologisierbarer Merkmale Abstammungsgemeinschaften (Monophyla) zu entdecken oder aber vermeintliche Monophyla als para- oder polyphyletisch zu entlarven. Die erste Quelle zur Rekonstruktion der Abstammungsgeschichte bieten paläontologische Funde, die, vorausgesetzt die geologische Datierung stimmt, einen chronologischen und typologischen Rahmen vorgeben. Verbunden mit Vergleichen homologer morphologischer Merkmale rezenter Arten versucht die phylogenetische Forschung Ähnlichkeitsreihen abzuleiten, die Hinweise auf die tatsächliche Entwicklungschronologie geben.
Die qualitative Unterscheidung eines Merkmals bezüglich seines plesiomorphen oder apomorphen Ursprungs geschieht hierbei über die Festlegung der Leserichtung , ist allerdings in der Praxis häufig nicht einfach, da sich viele Merkmale konvergent entwickelt haben. Mehrfach parallel evolvierte Merkmale können zu falsch interpretierten Verwandtschaftsverhältnissen führen. Ein zweites Problem ergibt sich aus der Tatsache, dass sich der Forschung nur ein höchst unvollständiges Bild der Evolution zeigt: Fossilfunde bieten nur schlaglichtartig Einblick in die längst ausgestorbene Organismenwelt. Die Systematik rezenter Organismen muß Evolutionsszenarien hypothetisieren, die Millionen von Jahren andauerten, um Schwestergruppenverhältnisse zu erklären. Dies stellt die Wissenschaft vor ein Dilemma. Prinzipiell kann man mit etwas Phantasie fast immer eine mögliche Folge von evolutiven Veränderungen eines beobachteten Merkmals von der putativen Stammart bis zum rezenten Organismus beschreiben. Doch gäbe es hier viele verschiedene Wege für verschiedene Hypothesen. Um der Gefahr eines solchen phantastischen Chaos zu entgehen, beruft sich die empirisch arbeitende phylogenetische Forschung traditionell auf das Ockham'sche Prinzip (Parsimonie) - das Prinzip der größtmöglich anzunehmenden Sparsamkeit: Es ist der Stammbaum anzunehmen, der die geringste Schrittanzahl benötigt, um beobachtete Veränderungen zu erklären. Mit anderen Worten, die Anzahl der ad hoc Hypothesen bezüglich einer Merkmalsverteilung zwischen verschiedenen Taxa muß minimiert werden Rieppel (1999). Diese Vorgehensweise setzt natürlich die
Auch die phylogenetische Analyse molekularer Datensätze lässt sich methodisch in das Ockham’schen Prinzips (Parsimonie) einbetten, d.h. es ist der Stammbaum anzunehmen, der die wenigsten Substitutionen benötigt, um einen Datensatz zu erklären. Neben der Parsimonie Methode zur Berechnung diskreter Datensätze Camin undSokal (1965) kommen in zunehmendem Maß auch statistische Algorithmen zum Einsatz. Verfahren, wie Maximum Likelihood Felsenstein (1981) oder auch Distanzmethoden, wie Neighbor joining Saitou undNei (1987),Studier undKeppler (1988), beruhen jeweils auf einem a priori anzunehmenden Evolutionsmodell. Die Modelle leiten sich aus zahlreichen, in den unterschiedlichsten Datensätzen beobachteten, Substitutionsereignissen von Nukleotiden oder Aminosäuren ab. Zur Berechnung der Datensätze werden zahlreiche Computerprogramme angeboten, in denen die o.g. Methoden und Modelle implementiert sind.
Parsimonie Analysen, die im Gegensatz zu beispielsweise Maximum Likelihood Analysen vorgeben, modellunabhängig zu arbeiten, entsprechen im wesentlichen der Tradition des vom Wissenschaftsphilosophen Karl Popper Popper (1963) begründeten Falsifikationismus und damit den Forderungen, die Anzahl der ad hoc Hypothesen zu minimieren, die nötig sind, um eine neue Theorie aufzustellen. Aus der Tradition der phylogenetischen Systematik heraus und damit verbunden dem Versuch, „...die vergleichende Biologie in die Tradition des Falsifikationismus einzubetten...“ Rieppel (1999), wird die Anwendung von Parsimonie Verfahren gegenüber der Anwendung statistischer Verfahren kontrovers diskutiert De Queiroz undPoe (2003),Kluge (2001).
Der phylogenetisch arbeitende Molekularbiologe sieht sich nun mit der Tatsache konfrontiert, dass es die unterschiedlichsten Qualitäten von Mutationen in der DNA geben kann (z.B. synonyme, nicht-synonyme Mutationen, Rückmutationen, sich gegenseitig kompensierende Mutationen, Covarianzen). Mutationen auf Nukleotidebene treten bei jeder Zellteilung auf. Im Fall von Punktmutationen können, abgesehen von Insertions- bzw. Deletionsereignissen, nur vier Merkmalszustände erreicht werden. Das heißt, bei jeder Replikationsrunde könnte ein anderer Merkmalszustand realisiert werden. Es gibt daher keinen vernünftigen Grund anzunehmen, dass die DNA auf dem kürzesten, für uns logischen Weg, evolviert ist. Daraus ergibt sich ferner, dass es aufgrund des nahezu neutralen Selektionsdruckes auf ein Nukleotid (im Vergleich zu beispielsweise einer komplexen morphologischen Struktur) kaum möglich ist, objektiv zwischen Konvergenzen, Apomorphien oder Plesiomorphien zu unterscheiden. Sogenannte Likelihoodisten empfehlen daher, DNA-Evolution als stochastischen Prozess zu begreifen. Das Wissen über qualitativ unterschiedliche Mutationsereignisse (z.B. Transition : Transversion) macht es möglich, Modelle über DNA-Evolutionen zu erstellen und a priori in die statistische Analyse mit einfließen zu lassen, ein Vorgehen, das im Sinne des Musterkladismus nicht zulässig ist. Dennoch führen die Berechnungen mit Parsimonie- und anderen, modellabhängigen Verfahren häufig zu kongruenten Ergebnissen, was die Diskussion über die verschiedenen Verfahren teilweise sehr theoretisch erscheinen lässt Goldman (1990),Sidall undKluge (1997).
Die Güte der phylogenetischen Informationen, die sich aus einem Sequenzvergleich ergeben, hängt maßgeblich von der Auswahl der molekularen Marker ab. Ein „universell“ anwendbares Gen sollte dabei prinzipiell die folgenden Anforderungen erfüllen Woese (1987):
Das gewählte Gen muß in allen zu betrachtenden Organismen vorhanden sein und die Homologisierbarkeit gesichert.
Die Änderungen an Sequenzpositionen sollten zufällig sein.
Die Sequenzlänge sollte ausreichend sein, um genügend Information zu erhalten.
Bis heute wurden einige wenige Gene bzw. Genabschnitte auf ihre Anwendbarkeit für unterschiedliche systematische Fragestellungen verwendet und getestet. Hier kommt den ribosomalen Genen, insbesondere der nuklearen 18S rRNA, eine besondere Bedeutung zu. Die einfache Amplifizierbarkeit mit allseits bekannten universell einsetzbaren Primern führte in den letzten Jahren zu einer wahren „18S-Datenflut“ in den Genbanken. Obwohl die Probleme hinsichtlich des Auflösungsvermögens der 18S rRNA hinreichend publiziert sind Wägele et al. (1999), führt die große Anzahl an 18S rRNA Daten seitdem zu immer neuen Stammbaumrekonstruktionen verschiedenster
Weitere, für die Bearbeitung phylogenetischer Fragestellungen bekannte Gene sind u.a. die Gene des mitochondrialen Genoms Curole undKocher (1999) und die nuklearen Gene EF-1α Moreira et al. (1999),Roger et al. (1999), EF-2 Rivera undLake (1992) oder auch ein kleiner Abschnitt des Gens für die RNA Polymerase II Shultz undRegier (2000).
Die DNA-Sequenzdatenerhebung ermöglicht nicht nur den phylogenetischen Vergleich von Nukleotiden oder Aminosäuren, sondern kann auch in der Auswertung makromolekularer Strukturen Einblick in verwandtschaftliche Beziehungen gewähren. Hier wären zum einen Elemente der Sekundärstruktur von ribosomalen RNAs zu nennen und zum anderen die Positionen von Introns in proteincodierenden Genen. Die Identifizierung prosthetischer Positionen in Proteinen und damit die Möglichkeit der Modellierung von Proteinsekundärstrukturen bis Quartärstrukturen, wie dies das große Arbeitsfeld der ``Proteomics´´ darstellt, werden sicherlich in Zukunft auch dem phylogenetisch interessierten Wissenschaftler zahlreiche Betätigungsfelder bieten.
Generelle Eigenschaften des mitochondrialen Genoms, wie i.a. maternale Vererbung, hohe Kopienzahl pro Zelle und „single copy genes“ Hoeh et al. (1996), machen dieses Molekül sehr attraktiv für das Studium der Phylogenie verschiedener Eukaryontentaxa Graf undSparks (2000). Insbesondere Sequenzvergleiche der 12S und 16S rDNA wurden in den letzten Jahren zur Aufklärung verschiedener taxonomischer Ebenen verwendet Ballard et al. (1992),Richter et al. (2001), aber bezüglich ihrer Auflösungskraft bei älteren Splits auch kritisch hinterfragt Gray et al. (1999).
Die heute im allgemeinen akzeptierte Erklärung für die Entstehung von Mitochondrien (und auch Chloroplasten) ist die Endosymbiontentheorie. Diese geht von einer endosymbiontischen Aufnahme eubakterieller, aerober Vorläufer durch einen Urkaryonten aus, mit anschließender Koexistenz vor ca. 1,5 Milliarden Jahren Gray (1989). Sequenzvergleiche des „mitochondrienartigsten“ bekannten eubakteriellen Genoms (Rickettsia prowazekii, einem α-Proteobakterium, Andersson et al. (1998)) und dem „bakterienartigsten“ bekannten mitochondrialen Genom (des Protozoen Reclinomonas americana mit 97 Genen, Lang et al. (1997)) machen deutlich, dass alle rezenten mitochondrialen Genome ihren Ursprung in einem einzigen sogenannten protomitochondrialen Genom haben müssen Gray et al. (1999).
Im Laufe der Evolution wurden aus den endosymbiontisch lebenden Bakterien, durch einen regen Gentransfer in das Kerngenom, semiautonome Organellen (Mitochondrien) unter nukleärer Kontrolle Nugent undPalmer (1991). In molekularer Hinsicht bietet der Sequenzvergleich der mitochondrialen
Das mitochondriale Genom der meisten Metazoa liegt in einem zirkulären Plasmid von etwa 16-20 kb Länge vor und kodiert i.d.R. nur noch durchschnittlich für 13 Proteine der Atmungskette (Untereinheiten 1-6 und 4L des NADH Dehydrogenase Komplexes, eine UE des Cytochrom b-c1 Komplexes, UE 1-3 des Cytochrom c Oxidase Komplexes, sowie zwei UE des ATP Synthase Komplexes), zwei ribosomale RNAs (12S und 16S rRNA) und 22 tRNAs (je eine tRNA für 18 Aminosäuren und je zwei tRNAs für die Aminosäuren Serin und Leucin). Mit dieser genetischen Ausstattung sind allerdings nur ca. 20% der in den Mitochondrien benötigten Genprodukte abgedeckt. Ca. 80% der Proteine sind kerncodiert und werden aus dem Cytoplasma in die Organellen importiert. Die Organisation des Chondrioms innerhalb der Metazoa ist sehr kompakt, kann allerdings in der Anordnung speziell seiner Gene für verschiedene tRNAs stark variieren. Die Untersuchung der Rekombination der tRNAs findet eine breite Anwendung für phylogenetische Fragestellung, insbesondere zur Klärung der Stellung verschiedener Taxa innerhalb der Arthropoda Boore et al. (1995),Hwang et al. (2001),Kurabayashi undUeshima (2000). Die meisten untersuchten Vertreter der Metazoa weisen keine Introns in den mitochondrialen Genomen auf (Ausnahme: Metridium senile mit zwei ORFs in den Genen cox1 und ND5).
Ribosomale RNAs bilden nach der Transkription durch Basenpaarung eine Sekundär- bzw. Tertiärstrukturen aus. In dieser Form sind die Moleküle im Ribosom aktiv und mit Hilfe zahlreicher ribosomaler Proteine wesentlich an der Translation beteiligt. Die Sekundärstruktur besteht aus Helices, auch ``stems´´ genannt (basenpaarende Doppelstrangbereiche) und nicht basenpaarende Bereiche, den sogenannten ``loops´´. Auf diese Weise entsteht aus einer rRNA oder auch tRNA ein komplexes zweidimensionales Makromolekül. Verschiedene ``stems´´ und auch ``loops´´ können ebenfalls miteinander agieren und so in räumliche Nähe zueinander kommen, was dann im weiteren die dreidimensionale Struktur des Moleküls bedingt. Um die Sekundär- wie auch Tertiärstrukturen verschiedener prokaryontischer tRNA als auch rRNA Moleküle zu analysieren, wurden verschiedene Methoden wie z.B. Röntgenstrahl-Kristallographie Kim (1979) angewendet, was allerdings für die sehr langen rRNAs methodische Schwierigkeiten bereitet. Die meisten Sekundärstrukturen wurden durch das Auffinden positioneller Covarianzen im vergleichenden Ansatz postuliert und konnten in experimentellen Studien bestätigt werden Gutell et al. (1992),Gutell et al. (1994). Daher spielt insbesondere im Fall der sehr langen ribosomalen RNAs die vergleichende Sequenzanalyse zur Aufklärung von Sekundärstrukturen eine entscheidende Rolle Gutell et al. (1985),Woese et al. (1980),Zwieb et al. (1981).
Somit spielt die Determinierung der Sekundärstruktur von rRNA Sequenzen in einer phylogenetischen Analyse eine entscheidende Rolle. Mit zunehmender Sequenzvariabilität ribosomaler RNAs innerhalb eines Taxons wird es schwieriger, mittels mathematischer Kriterien ein verlässliches Alignment zu rekonstruieren. Über die Identifizierung von Helices und ``loops´´ anhand einer Modellstruktur wird heute im allgemeinen ein Alignment derartig visuell korrigiert, dass ``stem´´-Bereiche primär homologisiert werden können Hickson et al. (1996),Titus undFrost (1996). Auf diese Weise gehen Informationen der Sekundärstruktur in die phylogenetische Computeranalyse mit ein. Uneinigkeit herrscht jedoch über das alignen von ``loop´´-Sequenzen, die eine hohe Variabiliät aufweisen können und sich somit wiederum sensitiv gegenüber verschiedenen ``gap´´-Gewichtungen verhalten Dixon undHillis (1993),Wheeler undHoneycutt (1988). Daher wird häufig die Eliminierung dieser Bereiche empfohlen, was allerdings andererseits zu einem erheblichen Verlust an Informationen führt.
Viele eukaryontische, im Nucleus lokalisierte Gene sind von nicht-codierenden, intervenierenden Sequenzen durchbrochen (Exon-Intron-Struktur). Die Expression dieser Gene erfordert die Entfernung der Introns bei der Reifung der mRNA-Moleküle im Nucleus, bevor sie in das Cytoplasma transportiert und dort translatiert werden. Das ``splicing´´ der Introns erfolgt bei kerncodierten Genen gewöhnlich durch ein sogenanntes Spliceosom, ein RNA-Protein-Komplex bestehend aus snRNPs (``snurps´´) und assoziierten Proteinfaktoren.
Mit der Entdeckung der Introns in eukaryontischen Genen Ende der siebziger Jahre des 20. Jahrhundert stellte sich gleichzeitig die Frage nach Funktion, Ursprung und Evolution derselben.
Dies führte zu zwei gegensätzlichen Postulaten: Die ``intron early´´ Hypothese, die davon ausgeht, dass bereits der Vorläuferorganismus der Prokaryonten Introns besaß Doolittle (1978),Gilbert (1978) und die ``intron late´´ Hypothese, die eine nachträgliche Insertion der Introns in das eukaryontische Genom postuliert Cavalier-Smith (1978),Cavalier-Smith (1985).
Noch bis vor ca. 20 Jahren war allgemein akzeptiert, dass ausschließlich Eukaryontengene von Introns unterbrochen werden. Dies wurde auch nicht durch die ``exon shuffling´´ Theorie Gilbert (1978),Gilbert (1987)
Einen neuen Denkansatz brachte Mitte der achtziger Jahre des letzten Jahrunderts die erstmalige Entdeckung intervenierender Sequenzen in tRNA Genen einiger Archaebakterien, die zu einer neuen Klasse von Introns (Gruppe I Introns) gehören Daniels et al. (1985) und bald darauf auch in Bakteriophagen und in tRNA Genen von Cyanobakterien und Proteobakterien gefunden wurden Belford et al. (1995). In den beiden letztgenannten Organismengruppen gelangte wenig später auch eine Klasse von Introns der Gruppe II zur Entdeckung Ferat et al. (1994),Ferat undMichel (1993). Introns der Gruppe I und II sind autokatalytische Introns, d.h. es wird keine aufwendige spliceosomale Maschinerie zur Excision benötigt. Anstatt einer Bestätigung der ``exon shuffling´´ Theorie bewirkte die Feststellung, dass Introns in allen Organismenreichen vorkommen, eine Stärkung der ``intron late´´ Hypothese. Diese erklärt die Introns als Abkömmlinge ehemaliger mobiler genetischer Elemente, die in ursprünglich kontinuierlich organisierte Gene insertierten. Durch die Entdeckung der selbstspleißenden Introns in Proteobakterien und Cyanobakterien, d.h. den Prokaryontengruppen, aus denen vermutlich die Organellen via Endosymbiose hervorgingen, gewann die ``intron late´´ Hypothese an Argumenten Cavalier-Smith (1991),Roger undDoolittle (1993). Demzufolge liegt der Ursprung der Introns in den Eubakterien. Durch die Etablierung der Endosymbiose gelangten Gruppe I und Gruppe II Introns in die eukaryontische Zelle und von dort aus via massivem Gentransfer im Laufe der Evolution in den Nucleus. Während die Gruppe I Introns im Nucleus persistierten, vermuten Anhänger der ``intron late´´ Hypothese weiterhin, dass ehemalige Gruppe II Introns in die ausschließlich in Eukaryonten zu findenden, spliceosomalen Introns evolvierten Logsdon et al. (1998). Für diese These sprechen einige strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten zueinander Michel undFerat (1995),Strukla undPadgett (2002).
Die heute weitestgehend akzeptierte Theorie, dass spliceosomale Introns auschließlich in Eukaryonten zu finden sind und ihren ancestralen Vorläufer in prokaryontischen Gruppe II Introns haben, ermöglicht es in zunehmenden Maß eine detaillierte Aussage bezüglich der Evolution von Introns zu machen. Obwohl die Debatte der ``intron early´´ versus ``intron late´´ Hypothesen nicht an Aktualität verloren hat, mehren sich doch die Evidenzen für eine weitgehend rezente, autonome Ausbreitung und auch Verluste spleiceosomaler Introns innerhalb der Eukaryonten DeSouza et al. (1998),Stoltzfus et al. (1997). Die Betrachtung der phylogenetischen Verteilung von Intronpositionen, d.h. von Gewinn und Verlust innerhalb der Eukaryonten Logsdon Jr. (1998) und auch die vergleichende Analyse mit den inzwischen zahlreich sequenzierten bakteriellen Genomen und deren Introns auf der Basis der rekombinanten Molekularbiologie Lynch undRichardson (2002) werden hier in Zukunft einen entscheidenden Beitrag liefern können.
Der Intronverlust kann wie folgt erklärt werden:
Die reverse Transkription einer bereits prozessierten mRNA und folgende Rekombination via Genkonversion in das Genom Palmer undLogsdon (1991) führt zu einer intronlosen Kopie. Die reverse Transkription wird hierbei den sogenannten Retrotransposons ``long interspersed nuclear elements´´ (LINEs) zugeschrieben, die häufig in Eukaryontengenomen zu finden sind Kidwell undLisch (2001),Weiner (2002).
Die einfache genomische Deletion eines Introns kann ebenfalls zu einem spontanen Verlust führen. Hierbei kann es unter Umständen durch Ungenauigkeit bei der Deletion zu einer Addition oder Deletion mehrerer Codons im Wirtsgen kommen Llopart et al. (2002).
Die Mechanismen des Introngewinns:
Über den Vorgang der Retrotransposition kann es zur Insertion von Introns kommen Bonen undVogel (2001),Sharp (1985). Dieser Vorgang setzt voraus, dass Komponenten des Spliceosoms transient am zuvor exicierten Intron verbleiben, dieser Lariat-Spliceosom-Komplex an einer unbesetzten ``protosplice-site´´ einer nicht homologen prä-mRNA bindet und als reverse Reaktion die Insertion eines Introns katalysiert. Wenn diese modifizierte prä-mRNA vor ihrer Prozessierung revers transkribiert wird, kann dieses Produkt mit der homologen DNA rekombinieren, was wiederum zur Etablierung eines neuen Introns auf genomischer Ebene führt.
Wenngleich dieses Szenarium zunächst recht aufwendig und unwahrscheinlich klingt, so gibt es doch einige Hinweise für diese Annahme:
Die snRNPs U2, U5 und U6 bleiben nach dem Spleißvorgang noch einige Zeit mit dem Lariat verbunden Burge et al. (1999).
Die Halbwertzeiten der Lariate erscheinen lang genug (~10 bis 30 min.) für eine Retrotransposition und reverse Transkription Clement et al. (2001).
Krebse bilden eines der artenreichsten und darüber hinaus eines der diversesten Taxa innerhalb der Arthropoda. Sie sind primär aquatisch, haben aber auch teilweise das Land erobert (z.B. einige Teiltaxa der Brachyura, der Isopoda und der Amphipoda). Die Crustacea umfassen die rezenten Teiltaxa der Remipedia, Cephalocarida, Maxillopoda (incl. Ostracoda), Branchiopoda und Malacostraca.
Seit der Intensivierung molekularer Studien zur Arthropodensystematik wird einerseits die traditionelle Annahme einer Monophylie der Crustacea und andererseits ihre Schwestergruppenbeziehung zu den
Anhand ausgewählter Genbereiche und weiterer genetischer Marker (Intronpositionen und ribosomale Sekundärstrukturen) sollen die phylogenetischen Beziehungen innerhalb zweier sehr unterschiedlicher Teiltaxa der Crustacea erarbeitet werden. Dabei steht neben der systematischen Bewertung der Taxa die kritische Bewertung der gewählten Marker für unterschiedliche taxonomische Ebenen im Vordergrund. Die beiden Taxa umfassen einmal die Branchiopoda (Blattfußkrebse), die eine sehr hohe Diversität aufweisen und stammesgeschichtlich vermutlich sehr alt sind (Oberes Kambrium) und andererseits die Astacoidea, ein Teiltaxon der Astacida (Malacostraca), die vermutlich erst im Jura evolvierten. (Für eine genauere Beschreibung der beiden Taxa siehe Kapitel 2.2.9)
Für die Branchiopoda kommen folgende Genbereiche zum Einsatz:
Das mitochondrial codierte Gen für die kleine ribosomale Untereinheit (12S rDNA).
Das im Kern lokalisierte Gen EF-1α.
Aus den generierten Sequenzen ergeben sich weitere genetische Marker, die einer phylogenetischen Bewertung unterzogen werden.
Informationen der Sekundärstruktur der dritten Domäne der 12S rRNA implementiert in einem alternativen Alignment.
Für die Astacoidea werden folgende Genbereiche phylogenetisch analysiert.
Das Gen für die 12S rRNA (dritte Domäne).
Das ebenfalls mitochondrial codierte Proteingen cox1.
Alle generierten Datensätze (Ausnahme: Intronpositionen) werden computercladistisch mit Parsimonie- und Maximum Likelihood Verfahren berechnet und die Ergebnisse mit einigen bestehenden morphologischen, molekularen und im Fall der Astacoidea zoogeographischen Hypothesen verglichen.
In der vorliegenden Arbeit werden im wesentlichen Geräte genutzt, die zur Standardausstattung eines molekularbiologischen Labors gehören, wie z.B. diverse Kleingeräte (Tischzentrifuge, Heizblöcke, Agarose Gelelektrophoresekammern, etc.) und zur Durchführung von PCR-Reaktionen und Cyclesequenzierungen Thermocycler der Hersteller Perkin Elmer bzw. MJ Research. Darüber hinaus kommt der Gradientencycler der Firma Eppendorf zur Optimierung von Annealingtemperaturen universeller Primer für einige Arten zur Anwendung. Die Sequenz Gelelektrophorese wird auf ALF Sequenzern für Fluoreszein Sequenzierungen und ALF Express Sequenzern für Cy5 -Sequenzierungen (beide Pharmacia) durchgeführt.
Für die Auswertung der Sequenzdaten und die phylogenetische Analyse der erhobenen Sequenzen wird ein zur Verfügung stehender Personal Computer (Pentium IV, 2,4 GHz Prozessor, 256 MB RAM Arbeitsspeicher) genutzt.
Die Auswertung der Sequenzläufe wird mit der Software ALFwin Vers. 2.00 (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt. Sequenz Assemblies und Analyse der ``reading frames´´ erfolgt mit dem Software Paket SequencherTM Vers. 4.0 (Gene Codes Corporation).
Alignments und phylogenetische Analysen der Sequenzdaten werden mit den Programmpaketen Clustal X Thompson et al. (1997) (``multiple´´ Alignmentprogramm) und POY Gladstein undWheeler (1996-2000) (Alignment + Topologie).
Für die Parsimonie Analysen werden die Programme POY Gladstein undWheeler (1996-2000), NONA, PHAST Goloboff (1993-2000), Winclada, Vers. 0.9.9 als Shellsoftware Nixon (1999-2000) und PAUP Vers. 4.0 (Beta) (Sinauer Associates) genutzt.
Maximum Likelihood Analysen werden ausschließlich mit dem Programm TREE-PUZZLE Vers. 5.0 Schmidt et al. (1999-2000),Schmidt et al. (2002),Strimmer undvon Haeseler (1996) durchgeführt. Consensus Dendrogramme für ML Berechnungen werden mit dem Programm Phylip Vers. 3.5c Felsenstein (1986-1995) erzeugt (siehe auch Kapitel 2.2.7.3). Für die ``likelihood mapping´´ Analysen und das Kishino-Hasegawa-Testverfahren Kishino undHasegawa (1989) wird ebenfalls das Programm TREE-PUZZLE benutzt.
PCR -Reaktionen werden mit der Taq-Polymerase GenThermTM (5u/µl), dem dazugehörigen 10x Puffer (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCL (pH 8,8 bei 25°C), 0,1% Tween 20), MgCl2 (Stammlösung 50 mM) und Desoxyribonukleotiden (100 mM Stammlösung) der Firma GeneCraft durchgeführt.
Zur Evaluierung der PCR Produkte auf dem Agarosegel werden 5µl des Längenstandards ``1 kb Ladder´´ (1µg/µl) von Boehringer Mannheim eingesetzt. Zur Aufreinigung von PCR Reaktionen werden Ultrazentrifugationsröhrchen Microcon 30 bzw. 50 der Firma Amicon verwendet.
Elutionen von PCR Fragmenten aus Agarosegelen erfolgen mit dem PCR Purification Kit der Firma Machery und Nagel nach Herstellerangaben.
Als weitere Kits zur DNA Sequenzierung und Klonierung kommen zum Einsatz: Original TA Cloning Kit (Invitrogen), Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia) und T7-Sequencing-Kit (Amersham-Pharmacia). Plasmid DNA wurde mit mittels eines Mini Plasmid Kits (Machery und Nagel) präpariert. Klonierungen und Sequenzreaktionen erfolgen nach Herstellerangaben. Alle eingesetzten Primer werden von der Firma TibMolBiol (Berlin) synthetisiert. Der Lieferumfang beträgt 1 OD260 eines lyophilisierten Pellets und wird vor Gebrauch mit ddH2O auf eine Lösung von 10 pmol/µl (PCR Primer) bzw. 2 pmol/µl (Sequenzierprimer) eingestellt.
Standardpuffer und Lösungen: 0,5 M EDTA (pH 8); 8 M LiCL; 5 M NaCL; 1 M Tris-HCL (pH 8,2 bei 25°C); 70% EtOH (unvergällt); 100% EtOH; 100% Isopropanol; Chloroform/Isoamylalkohol (24:1); TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM EDTA, pH 8,0).
DNA Präparation, Lysepuffer: 4% CTAB Lysepuffer (4 g Cetyltrimethylammoniumbromid; 1,4 M NaCL; 20 mM EDTA; 100 mM Tris-HCL, pH 8,2) + 100 mM b- Mercaptoethanol.
Elektrophoresepuffer Stammlösung: 10 x TBE Puffer (90 mM Tris base; 90 mM Borsäure; 20 mM EDTA).
6% iges Sequenzgel (60 ml): 13,5 ml einer 30% Polyacrylamid Gelmatrix (19:1 Acrylamid / Bisacrylamid); 6 M Urea, 3,6 ml 10xTBE Puffer (Endkonz. 0,6x). ca. 30 µl Repal Silane (20 ml 100% EtOH, 75 µl 100% Repal Silane, 5 ml 10% Essigsäure) zur Stabilisierung der Sequenzgeltaschen
``Loading solution´´ für die Sequenzgelelektrophorese: 95% Formamid (deionisiert in Amberlite IRN-150L); 500 mM EDTA (pH 8); 60 mg Dextran Blue.
``Loading solution´´ für Agarosegelelektrophorese: 0,25% Bromphenolblau; 40% (w/v) Sucrose (in H2O).
Anfärben der DNA in Agarosegelen: Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (Stammlösung 100 mg/ml H2O) in einer Endkonzentration von 0,5 µg/ml.
Medien zur Anzucht von Bacterien: LB (Luria–Bertani) Flüssigmedium (1l). 10 g NaCl, 10g Bacto-Trypton, 5 g Hefeextrakt, 30% (v/v) Glycerin und zusätzlich 15 g Agar für LB Festmedium. Zur Selektion rekombinanter Bakterien wurde Ampicillin, IPTG und X-Gal, wie in Kapitel: 2.2.6 beschrieben, auf die Festmedien aufgetragen.
Sämtliche Arten werden in 100% EtOH bei 4°C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt. Aufgrund der geringen Größe einiger Spezies der Branchiopoda werden zumeist komplette Tiere verarbeitet. Von den bearbeiteten Astacida stand jeweils ein Pereiod zur Verfügung, von welchem zur DNA Präparation das Muskelgewebe ausgelöst und homogenisiert wird. In den Tabelle 1 und werden alle in dieser Arbeit sequenzierten Arten aufgelistet. Sofern Referenzdaten aus der Genbank (
In Tabelle 3 sind alle in dieser Arbeit verwendeten Primer aufgelistet. (A) enthält die Sequenzen der PCR-Primer für die Branchiopoda (12S und EF-1α) und für die Astacida (12S und cox1) und die für die PCR eingesetzten Annealingtemperaturen. Zur Ansequenzierung der PCR-Produkte vom 5’ und 3’ Ende her sind die Sequenzen der Standard-Sequenzierprimer (5’- Label Fluoreszein) vermerkt. (B) enthält alle für die komplette Sequenzierung des EF-1α Gens eingesetzten internen ``walking´´-Primer.
Alle hier im Text aufgeführten Standardmethoden, wie Chloroformextraktionen, Alkoholfällungen und Agarosegelelektrophorese und die Präparation kompetenter Bakterienzellen (sofern erforderlich) werden nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt.
Die zur Datenerhebung durchgeführten Methoden umfassen die Gesamtnukleinsäurenpräparation, die anschließende PCR Amplifikation des gewünschten Genabschnittes mit universellen Primern und die Direktsequenzierung der PCR Produkte. In Ausnahmefällen, z.B. wenn das PCR Produkt zu schwach ist, um direkt sequenziert zu werden, werden diese Produkte kloniert. Im Regelfall wurden 10 positive Klone gescreent und auf die Richtigkeit ihrer Inserts mittels Sequenzierung überprüft.
Von ca. 1-20 Individuen (Branchiopoda) und ca. 10-20 mg Muskelgewebe der Astacida werden Nukleinsäureextraktionen mit dem 4%- igen Lysepuffer CTAB (s. Kap. 2.1.4) in abgewandelter Form nach der Methode von Doyle & Doyle Doyle undDoyle (1990) angefertigt. Die Homogenisation findet direkt in 500 µl Lysepuffer + 100 mM b- Mercaptoethanol in Gegenwart einiger Körnchen Seesand statt. Durch die Zugabe von Seesand wird die Menge der extrahierten Nukleinsäuren enorm erhöht, da das Gewebe der zum Teil sehr kleinen Tiere besser aufgeschlossen werden konnte. Besonders in Fällen, wo nur ein bis zwei sehr kleine Individuen zur Verfügung standen, ermöglicht erst die Zugabe von Seesand eine Extraktion in ausreichender Menge. Das Homogenisat wird nach einer Inkubationszeit von ca. 30 min bei 65°C mit einem Volumen Chloroform versetzt und ca. 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Anschließend werden die Nukleinsäuren mit 0,8 Volumen Isopropanol aus dem Überstand gefällt. Die Nukleinsäure-Pellets werden je nach ihrer Größe in 5 - 30 µl TE Puffer aufgenommen und bei –20°C gelagert. Menge und Qualität von je 1 µl der Präparationen wurde auf einem 1%- igen Agarosegel abgeschätzt. In einigen Fällen, in denen die DNA Präparationen einer folgenden enzymatischen Reaktion nicht zugängig waren, wird mit 8 M LiCL (2 h bei 65°C) erneut präzipitiert.
Der Einsatz von universell anwendbaren PCR Primern ermöglicht es, mit nur einem Primerpaar einen definierten Genbereich unterschiedlicher Spezies zu amplifizieren.
Die zur Anwendung kommenden PCR Primer (Tabelle 3) werden an ihrem 5’-Ende artifiziell verlängert, sofern die PCR Produkte direkt in der Cyclesequenzierung eingesetzt werden können. Als zusätzliche Sequenzen werden die ``primingsites´´ von Standardprimern gewählt: Die Primer, die zur Amplifikation der Branchiopoda des 12S und EF-1a Gens genutzt werden, werden mit den Sequenzen für die Standardprimer M13 universe und M13 reverse verlängert. Die Primer zur Amplifikation der Gene 12S und cox1 der Astacoidea werden mit den ``primingsites´´ für T7term und T7prom verlängert. Die Methode der künstlichen Verlängerung der PCR Primer Cho et al. (1995) ermöglicht die routinemäßige Cyclesequenzierung unterschiedlicher Templates bei einer gegebenen Temperatur mit den angegebenen Standardprimern. In den Fällen, in denen das PCR Produkt kloniert wird, kann auf eine artifizielle Verlängerung der PCR Primer verzichtet werden.
Die PCR Amplifikationen (Gesamtvolumen 50-100 µl) erfolgen nach einem Standardprotokoll mit ca. 100 ng DNA Template und je 20 pmol Primer für die 12S rDNA , bzw. 10 pmol je Primer für die Genbereiche cox1 und EF-1a. Nach einer einmaligen Denaturierung der DNA für 3-5 min folgen 35-40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 94°C (30 s), ``primerannealing´´ bei 40-53°C für 45 s und einer Elongation bei 72°C (45 s bis 1 min15 s). Eine einmalige Extension bei 72°C für 3-7 min beenden die Amplifikation. Durch die je nach gewünschtem Gen eingesetzten Primer werden für die 12S rRNA ein Amplifikat von durchschnittlich 500 bp., für das Gen EF-1a Produkte von 1063-~1200 bp. (inklusive
Von sämtlichen PCR Produkten wird ein Aliquot von 5 µl auf einem 1-1,2% igen Agarosegel näherungsweise quantifiziert. In der Regel kann erfahrungsgemäß für die Sequenzierung und Elektrophorese auf ALF-Sequenzern auf eine Aufreinigung der PCR-Produkte verzichtet werden. Sofern allerdings die Analyse auf dem Agarosegel eine noch erhebliche Menge an freien Primern oder Primerdimeren zeigt und das PCR Produkt in nur geringer Menge generiert werden konnte, werden die PCR Produkte mittels Microcon PCR 50 Ultrafiltrationsröhrchen (Millipore) gefiltert. Nicht incorporierte Primer bzw. Dimere werden auf diese Weise quantitativ entfernt. Gleichzeitig wird der PCR Ansatz auf ein erheblich kleineres Volumen (5-10 µl) konzentriert, sodass sich vielfach eine schwache Amplifikation trotzdem für eine anschließende direkte Sequenzierung als adäquat erweist. Die Filtration der PCR Produkte ist nur bei einigen Spezies nötig.
Die Sequenzierung erfolgt mittels der von Sanger und Kollegen Sanger et al. (1977) entwickelten Methode des Strangaufbaus und definierten Strangabbruchs durch den Einsatz von Dideoxynukleotiden. Die Kettenabbruchmethode ist inzwischen die Routinemethode zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen einer DNA und hat sich in der Laborroutine gegenüber der Maxam-Gilbert Sequenzierung Maxam undGilbert (1977) durchgesetzt: DNA-Doppelstränge werden hierbei zunächst denaturiert (durch Hitze- oder Alkalibehandlung). Zur Neusynthese von DNA mit einer DNA-Polymerase ist immer ein kurzer Doppelstrangbereich erforderlich, bei dem ein 3’-Ende anhand des überstehenden 5’-Endes des Gegenstranges als Template verlängert werden kann. Solch eine kurze Doppelstrangregion wird zur Sequenzierung (wie bei der PCR-Reaktion) künstlich durch einen Oligonukleotid-Primer erzeugt, der mit der einzelsträngigen Template-DNA hybridisieren muß. An dem auf diese Weise gebildeten 5’-Überhang kann nun die Neusynthese ansetzen. Die Neusynthese geschieht in Gegenwart der vier monomeren dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP). Um nun einen definierten Strangabbruch zu erzeugen, werden der Reaktion zusätzlich Dideoxynukleotide zugefügt. Diesen ddNTPs fehlt ausser in der 2’- Position auch in der 3’- Positon der Ribose eine OH-Gruppe, d.h. es steht keine notwendige OH-Gruppe zur Bildung einer folgenden Phosphodiesterbindung zur Verfügung, die Synthese bricht ab. In vier verschiedenen Ansätzen mit jeweils einem Didesoxynukleotid, neben den normalen vier dNTPs, entsteht so eine Population unterschiedlich langer Moleküle, deren jeweils letztes Nukleotid dem zuvor eingesetzten ddNTP entspricht. Statistisch gesehen enthält so z.B. die ddATP-Reaktion an jedem im Template auftretenden Thymidin eine detektierbare Menge an Abbrüchen. Die vier Reaktionsansätze einer Sequenzierung werden getrennt (im Fall des ALF Sequenziersystems) der Elektrophorese zugeführt (im idealen Fall einem Sequenzautomaten). Ein Polyacryamidgel hat die Auflösekraft um Moleküle mit nur einer Base Unterschied in der Kettenlänge voneinander zu unterscheiden. Um die Moleküle detektieren zu können, ist der in der Sequenzreaktion eingesetzte Primer an seinem 5’-Ende mit einem Fluoreszenfarbstoff markiert (für die hier eingesetzten Systeme
Um die Syntheseeffizienz zu erhöhen, wird auch hier zur Sequenzierung (wie bei der PCR) mit thermostabilen Polymerasen gearbeitet, die es erlauben, in einem Ansatz, in mehreren Zyklen eine neue Synthese zu starten (Cycle-Sequenzierung). Diese Synthese verläuft allerdings linear, da nur ein Primer eingesetzt wird, im Gegensatz zur exponentiellen Synthese der PCR mit zwei gegenläufigen Primern. Die Methode der PCR-Direktsequenzierung hat des weiteren den Vorteil, dass mögliche Fehler beim Strangaufbau, die durch den Einsatz von Taq-Polymerase für die Amplifikation entstehen, ausgemittelt werden.
Sofern die Amplifikation ein in Qualität und Quantität ausreichendes Produkt ergibt, wird das Amplifikat direkt sequenziert. Die einzusetzende Menge an Template richtet sich nach Menge und Länge desselben. Es werden ca. 0,5 µg Template pro 500 bp. Länge (des PCR Produktes) eingesetzt. Die Cyclesequenzierungen erfolgen mit dem Thermosequenase Kit nach Herstellerangaben (Amersham Pharmacia) mit 4 pmol Primer pro Sequenzierung und einer Annealingtemperatur von 57°C.
Alle 12S und cox1- PCR Produkte werden doppelsträngig sequenziert. Als Sequenzierprimer für die Gene 12S und cox1 wurden die Standardprimer M13 universe bzw. reverse (12S) und T7term bzw. T7prom (cox1) eingesetzt.
Das Gen EF-1a konnte zunächst nur von zwei Branchiopoda-Spezies (Sida und Lepidurus) mit den Literaturprimern amplifiziert werden. Diese Amplifikate wurden mit M13 universe und M13 reverse ansequenziert und aus den Sequenzen wurden sowohl PCR spezifische universelle Primer für die erfolgreiche Amplifikation anderer Branchiopoda abgeleitet, als auch weiterführende (sogenannte interne Primer), soweit möglich universelle Sequenzierprimer, die es in den folgenden Sequenzreaktionen ermöglichen, die Exons der Produkte doppelsträngig zu sequenzieren (``primerwalking´´). Introns werden zumeist nur einzelsträngig sequenziert.
Für die Gene 12S und cox1 werden durchschnittlich 0,3 - 0,5 µg PCR Produkt eingesetzt, für das Gen EF-1a ca. 0,8-1 µg.
Die Sequenzgel-Elektrophorese erfolgt auf ALF- Sequenzern (bei Fluorescein-markierten Sequenzen) bzw. auf ALF Express Sequenzern, sofern die Sequenzierungen mit CY5 gelabelten Primern durchgeführt wurden. Die Herstellung des 6,5% Polyacrylamid- Sequenzgels erfolgt nach Angaben des Herstellers (Pharmacia). Die Auftrennung der Sequenzierungen im elektrischen Feld wird bei einer Temperatur von 50°C, 30 Watt, 1500 Volt, 38 mA und einer Laserpower von 3 mW durchgeführt.
Im Falle quantitativ ungenügender Amplifikation wird kloniert, um eine Sequenzierung zu ermöglichen.
Die Ligationen der PCR Produkte werden mit dem Kit „TA Cloning“ (Invitrogen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Anschließend werden die Plasmide (Vektor pCR 2.1 + 1 Molekül des PCR Produktes) mittels Elektroschock (1 Puls á 2,5 kV mit einer Feldstärke von 12,5 kV/cm) in den elektrokompetenten E.coli Stamm DH5a transformiert und auf LB+Ampicillin (50 µg/ml) Medium in Gegenwart von IPTG (24 µg/ml) und X-Gal (50 µg/ml) selektioniert. Von allen Transformationen werden 10-15 Klone auf das Vorhandensein eines Inserts und auf die Richtigkeit überprüft. Dazu werden 10-15 Kolonien einzeln gepickt und in 5 µl H20 für 5 min bei 96°C lysiert. Anschließend wird das Lysat bei maximaler Geschwindigkeit (13.000 rpm) 5 min. zentrifugiert um Zelltrümmer zu pelletieren. 1 µl des Überstandes wird als Template in einen 50 µl PCR Ansatz mit je 2,5 pmol LacZ A (5'-GGTAGTGGGATACGACGATA) und LacZ B (5'-CAACAATCGATCCTACTAAA) Primern gegeben. Der Vektor pCR2.1 enthält die ``priming sites´´ der Standardprimer LacZ A und B, sodass man auf diese Weise in einfacher und sehr effizienter Weise positive, d.h. Plasmide mit erfolgreich kloniertem PCR Produkt von negativen Klonen unterscheiden kann. Alle positiven PCR Produkte werden danach direkt cyclesequenziert. Die ausgewerteten Inserts werden mittels eines ``Blast-Search´´ Altschul et al. (1997), mit allen in der Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) vorhandenen Sequenzen verglichen und die Richtigkeit der Inserts bestätigt.
Alle im Rahmen dieser Arbeit generierten Sequenzdaten wurden phylogenetisch ausgewertet. Zur Klärung der Aussengruppenfrage der Phyllopoda (Branchiopoda) wurde ein Arthropodenalignment, basierend auf den konservierten Bereichen der Aminosäuresequenzen mitochondrialen Proteine, herangezogen Hwang et al. (2001) und durch einige seitdem neu publizierte mitochondrialen Proteinsequenzen ergänzt (weitere Erläuterungen dazu siehe Kapitel: 3.1.2.1).
Im Folgenden werden die in dieser Arbeit angewendeten Methoden in umgekehrter Reihenfolge, zuerst die Berechnungmethoden der Cladogramme und anschließend die Erstellung der Alignments, beschrieben. Dies erscheint sinnvoll, da das hier u.a. verwendete Programm POY sowohl Alignments als auch Topologien erzeugt.
Eine gegebene DNA Datenmatrix (Alignment) ist definiert durch die Anzahl an Taxa (Arten) und die Anzahl an Merkmalen (Nukleotide, bzw. Aminosäuren). Anhand der Formel
N(u) = (2n-5) ! / [2 n-3 (n-3) !]
lassen sich von „n“ Taxa „N(u)“ ungewurzelte Topologien erzeugen Cavalli-Sforza undEdwards (1967). D.h. für 10 Taxa wären 2x106, bei 20 Taxa schon 2x1020 Topologien theoretisch möglich. Um aus dieser Fülle von ungewurzelten Topologien die sinnvollen herauszufinden, sind verschiedene Rechenalgorithmen nutzbar. Man unterscheidet hier zunächst zwischen heuristischen und exakten Verfahren. Das exakte Verfahren garantiert, unter der gegebenen Berechnungsmethode (Parsimonie oder Maximum Likelihood), den wahrscheinlichsten bzw. kürzesten Stammbaum zu finden, weil alle Möglichkeiten berechnet werden. Dies ist allerdings nur für maximal 10-12 Taxa durchführbar, da sonst die Rechenkapazitäten gängiger PCs nicht ausreichen. Größere Artenzahlen werden mit heuristischen Verfahren berechnet. Hierbei wird zunächst durch schrittweises Hinzufügen jeweils eines Taxons (``stepwise addition´´) an zunächst optimal erscheinende Stellen und anschließendes Variieren der einzelnen Äste (``branch swapping´´) die kürzeste (Parsimonie) oder wahrscheinlichste (Maximum Likelihood) Topologie gesucht.
Die im Folgenden beschriebenen Methoden Maximum Parsimonie und Maximum Likelihood betrachten die Nukleotidpositionen als Einzelmerkmale und versuchen die Merkmalsänderungen in der Rekonstruktion des Stammbaums zu reflektieren.
Alle im Rahmen dieser Arbeit sequenzierten Gene und zusätzlich die in der Datenbank oder Literatur erhältlichen Daten werden zunächst gesondert und dann auch als kombinierte Datensätze phylogenetisch ausgewertet.
Parsimonie Methoden waren die ersten, die zur Rekonstruktion von Phylogenesen breite Anwendung fanden. Ihnen liegt die Philosophie des sogenannten „Occam’s razor“ -die größtmögliche Sparsamkeit- zugrunde, d.h. es wird hier die generelle Vorstellung der Naturwissenschaft umgesetzt, zunächst die einfachere gegenüber einer komplizierteren Hypothese zu bevorzugen und ad hoc Hypothesen weitestgehend zu vermeiden Swofford et al. (1996). Ziel der Maximum Parsimonie Methode in der Systematik ist es, das Cladogramm zu finden, welches die geringste Anzahl von Evolutionsschritten benötigt, um den beobachteten Datensatz zu erklären. Parsimonie Methoden berücksichtigen nur variable Positionen, sogenannte Parssimonie-informative Merkmale. Tritt in einer Position des Alignments nur ein bestimmtes Nukleotid oder Aminosäure auf, so ist dieses Merkmal nicht informativ. Wird in nur einem Taxon eine andere Merkmalsausprägung beobachtet, so ist diese Position ebenfalls nicht informativ. Treten hingegen in mehr als einem Taxon unterschiedliche Nukleotide (Aminosäuren) auf, so ist dieses Merkmal Parsimonie-informativ und wird durch die entsprechenden Algorithmen
Die Idee, die den Maximum Likelihood Verfahren zugrunde liegen, beruht auf der Vermutung, dass Evolution auf der Ebene von DNA Molekülen ein stochastischer Prozess ist, d.h. es wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit der eine gegebene Topologie durch einen Datensatz unter der Annahme eines Modells begründbar ist.
Unter einem gegebenen Modell, welches die Wahrscheinlichkeiten der beobachteten Ereignisse (Substitutionen) spezifiziert, kann der ``likelihood´´ L für den gegebenen Datensatz berechnet werdenals
Ltree = P (D | H),
wobei P (D |H) die Wahrscheinlichkeit ist, einen Datensatz D unter einer gegebenen Hypothese H zu beschreiben. Da der ``likelihood´´ L sehr klein ist, wird der Wert als ``log likelihood´´, bzw. als natürlicher Logarithmus einer Wahrscheinlichkeit (lnL) ausgedrückt.
Die zugrunde liegenden Algorithmen zur Berechnung von Nukleotiddatensätzen wurden von Felsenstein Felsenstein (1973),Felsenstein (1981) entwickelt.
Zwei gegebene Sequenzen (1 und 2) unterscheiden sich durchschnittlich um d Substitutionen pro Position. Diese Distanz d entspricht µt, wobei µ die Mutationsrate ist und t die Zeit. Gegeben ist im Folgenden ein Substitutionsmodell (siehe unten), sodass für jede Position die Wahrscheinlichkeit P ij(d) berechnet werden kann, dass diese beiden Sequenzen, separiert durch d, die Nukleotide i bzw. j aufweisen. Die Wahrscheinlichkeit ist nun der ``likelihood´´ der Substitution der betrachteten Position, der beiden Sequenzen (Taxa). Der ``log likelihood´´ die gegebenen Daten zu erklären, ist folglich die Summe der ``log likelihoods´´ jeder individuellen Position.
Auch in diesem Fall werden in einer heuristischen Suche eine große Anzahl an ungewurzelten Topologien ermittelt.
Die Gesamttopologie, die mit höchster Wahrscheinlichkeit den gegebenen Datensatz unter dem angenommenen Modell erklärt, wird als Maximum Likelihood Baum präsentiert. Hier ist anzumerken, dass der ``output´´ ein gewurzeltes Dendrogramm darstellt. Die Wurzel wird Eingangs vom Benutzer
Besondere Bedeutung kommt der Wahl des Evolutionsmodells zu. Es dient der Schätzung der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer Substitution. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurde eine Vielzahl von Modellen entwickelt, die in immer differenzierterer Weise versuchen, den unterschiedlichen Substitutionsraten Rechnung zu tragen. Im Gegensatz zum einfachsten Jukes-Cantor- Modell (gleiche Mutationsrate von a = 0,25 für jedes Nukleotid) Jukes undCantor (1969) bedienen sich alle weiteren Modelle der Annahmen, dass
die Häufigkeit der beobachteten Nukleotide in einem Alignment (Basenfrequenz) nicht gleich sein muß (z.B. sind tierische mitochondriale Genome sehr A/T reich) und daher für jedes Nukleotid im Durchschnitt ermittelt wird (p i) und
Transitionen und Transversionen unterschiedliche Substitutionsraten haben. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Transition a (Purin « Purin, Pyrimidin « Pyrimidin) ist höher als die Wahrscheinlichkeit einer Transversion b (Purin « Pyrimidin), andererseits hat eine Base nur eine Möglichkeit via Transition in ein anderes Nukleotid zu substituieren, dagegen kann sie aber via Transversion in zwei andere Basen substituieren. In den hier vorgestellten Analysen der Nukleotidsequenzen kommen folgende Modelle zum Einsatz:
- HKY: Hasegawa-Kishino-Yano Hasegawa et al. (1985) mit zwei Parametern: Variable Basenfrequenz und Transitionen:Transversionen.
- TN: Tamura-Nei Tamura undNei (1993) mit drei Substitutionstypen: Variable Basenfrequenz, Transitionen:Transversionen und Y:R-Transitionsparameter.
Optional kann jedes Modell mit der zusätzlichen Forderung der Variabilität eines Merkmals, abhängig von seiner Position, die sogenannte „rate heterogeneity“, versehen werden. Hierbei wird der Beobachtung Rechnung getragen, dass Nukleotide abhängig von ihrer Position unterschiedliche Evolutionsgeschwindigkeiten aufweisen. Diese Evolutionsraten können nach der Gamma Verteilung Yang (1993) spezifiziert werden.
Für die Maximum Likelihood Analysen werden alle Nukleotiddatensätze mit dem Programm TREE-PUZZLE Vers. 5.0 Schmidt et al. (1999-2000),Schmidt et al. (2002),Strimmer undvon Haeseler (1996) berechnet. In einem ersten Schritt werden die Alignments jeweils unter den oben genannten Modellen einmal ohne Berücksichtigung und einmal mit Berücksichtigung der ``rate heterogeneity´´ im ``fast approximate´´ Modus berechnet. Für die genauen Berechnungen wird dann das Modell, das die höchste Wahrscheinlichkeit ergab, gewählt und erneut im ``exact slow´´ Modus berechnet. Die Option ``list puzzling step trees´´ wird aktiviert, um eine Liste aller gefundenen Topologien zu erhalten. Die Liste aller Topologien wird im weiteren mittels des Kishino-Hasegawa-Tests Kishino undHasegawa (1989) getestet. Der ``output´´ dieses Tests stellt eine Liste dar, aus der die Topologie mit der höchsten Wahrscheinlichkeit erkennbar ist (``best tree´´), aber auch allen Topologien, die nicht signifikant schlechter sind als der ``best tree´´ (``not significantly worse´´) und die Topologien die das Signifikanzlevel von 5% nicht erreichen (``significantly worse´´). Sofern die Gesamtanzahl der errechneten Topologien einen vertretbaren, d.h. im ``textfile´´ überschaubaren Umfang aufweisen (bis
Die Anzahl aller möglichen Quartet-Puzzle-Topologien errechnet sich durch
wobei die obere Grenze der Gesamttopologien programmbedingt auf 10.000 Topologien limitiert ist.
Streng genommen spiegelt ein Alignment in sich schon die Evolutionsgeschichte wieder und muß daher mit besonderer Sorgfalt aufgestellt werden.
Prinzipiell entspricht der Aufbau eines Alignments dem einer morphologischen Datenmatrix, wobei die einzelnen Nukleotide, bzw. Aminosäuren für die verschiedenen Spezies so untereinander geschrieben werden, dass die daraus resultierenden Nukleotid- (Aminosäure) Spalten als homolog zueinander hypothetisiert werden (Positionshomologie). Folglich ist jede Spalte (Position) eines Alignments ein Merkmal, die Art der Nukleotide (Aminosäuren) in dieser Position sind dagegen die unterschiedliche Ausprägungen des Merkmals. Während des Alignmentprozesses wird die Anzahl der übereinstimmenden Nukleotide (Aminosäuren) durch das Einfügen von Lücken (``gaps´´ oder ``indels´´) maximiert. Die biologische Bedeutung von ``gaps´´ sind im Lauf der Evolution erfolgte Insertionen oder Deletionen. Das Einsetzten von ``gaps´´ ist insbesondere bei ribosomalen Genen, die keinen ``reading frame´´ aufweisen, im höchsten Maß hypothetisch. Um ein aussagekräftiges Alignment zu erhalten, können die Parameter (Maluspunkte) zur Eröffnung bzw. Verlängerung von ``gaps´´ variiert werden.
Zur Erstellung eines Alignments werden verschiedene Computerprogramme im Internet angeboten, die auf der Basis unterschiedlicher Algorithmen arbeiten. Die in dieser Arbeit verwendeten Programme sind Clustal X Thompson et al. (1997) und POY Gladstein undWheeler (1996-2000). Darüberhinaus kommt für das ribosomale Gen (12S) ein drittes, visuell erstelltes Alignment zur Anwendung.
Dieses sogenannte ``multiple alignment´´ Verfahren Thompson et al. (1997) gehört zu den am weitesten genutzten Programmen, um homologe Sequenzen miteinander zu vergleichen.
Hierbei werden aus einem gegebenen Datensatz alle Sequenzen paarweise miteinander verglichen, und eine Distanzmatrix für den gegebenen Datensatz wird errechnet. Auf der Basis der Distanzmatrix wird ein, den multiplen Alignmentprozess initiierender, sogenannter ``guide tree´´ erstellt. Im zweiten Schritt werden jeweils die Sequenzen miteinander aligned, die die geringsten Distanzen zueinander aufweisen. Von jedem paarweisen Alignment wird eine Consensussequenz generiert und anschließend die paarweisen Alignments bzw. deren Consensussequenzen, wieder auf der Basis der kleinsten Distanzen, zueinander aligned. Während des multiplen Alignmentprozesses werden, wo dies notwendig erscheint, ``gaps´´ eingeführt.
Clustal X wird unter Verwendung der vorgegebenen Parameter (``default´´) Optionen zur Erstellung von Alignments für die Gene 12S (im Vergleich zum POY Alignment), EF-1α der Branchiopoda, cox1, 12S der Astacoidea und für die Vervollständigung des Arthropodendatensatzes (Aminosäuren) verwendet.
Das Programm POY ist im eigentlichen Sinn kein ``stand alone´´ Alignmentprogramm, sondern verbindet Alignment mit der phylogenetischen Analyse in einem Schritt. Hierbei wird aus einem gegebenen Datensatz in einer heuristischen Suche eine Vielzahl möglicher Alignments generiert und anschließend in einer phylogenetischen Rekonstruktion nach dem Parsimonie Prinzip für jedes ermittelte Alignment eine Topologie erzeugt, für die dann schließlich die benötigte Anzahl der Substitutionen (Schritte) berechnet wird. Dieser Vorgang wird so häufig wiederholt, bis das Alignment und die dazugehörige Topologie mit der kürzesten Schrittanzahl festgestellt ist. Somit wird ein konsequenter Weg der gewählten Parameter garantiert, von der Erzeugung eines Alignments bis zur phylogenetischen Rekonstruktion Phillips et al. (2000). Insbesondere für die Analyse nicht-proteincodierender Gene, bei denen das Einfügen von ``indels´´(=Insertion/Deletion) die
Um Qualität und Stabilität der Cladogramme, insbesondere einzelner Monophyliehypothesen, zu testen, bieten sich mittlerweile eine große Anzahl verschiedener Testmöglichkeiten an, von denen hier eine kleine Auswahl zum Einsatz kommen.
Dieser Test wurde für alle Parsimonie Cladogramme angewendet. Die ``bootstrap´´ Analyse (Felsenstein, 1985) besteht aus einer Generierung von zufällig veränderten Datensätzen (Replikaten). Die Änderung des ursprünglichen Datensatzes erfolgt in der zufälligen Löschung einzelner Merkmale und gleichzeitiger Verdopplung anderer Merkmale im Alignment. Für jedes auf diese Weise generierte Alignment (i.d.R. 1000 Replikate) wird die optimale Topologie berechnet. Aus allen Topologien wird im zweiten Schritt ein Consensusbaum berechnet, der an jedem Monophylum die prozentuale Unterstützung ausweist, also die Häufigkeit mit der dieses Monophylum in allen artifiziellen Datensätzen vorkommt. Sofern im Text erwähnt, werden die ``bootstrap´´ Werte mit „BA“ abgekürzt.
Die Berechnung des Bremer ``supports´´ Bremer (1994) ist eine indirekte Überprüfung, durch wieviele Apomorphien ein Monophylum gestützt wird Wägele (2000) und wird hier als Alternative oder parallel zum ``bootstrap´´ Verfahren angewendet. Der Bremer Index gibt für jedes Monophylum eines Cladogramms an, wieviele Schritte notwendig sind, um eine Schwestergruppenbeziehung zu Fall zu bringen. Die angegebenen Werte sind ganze Zahlen von 1 - ¥ (abhängig von der Anzahl der Apomorphien in einer Schwestergruppenbeziehung). Im Text wird der ``decay´´ Index mit „DI“ abgekürzt. Zur Berechnung der ``decay´´ Indices wird das Programm NONA genutzt.
Dieser Test ist im Programm TREE-PUZZLE Vers. 5.0 implementiert und wird für die ML Analysen der beiden 12S Alignments für alle Branchiopoda, sowie die der Astacoidea angewendet. Der ``Quartet-Puzzling-support´´, im folgenden ``QP-support´´ genannt, ist der ``bootstrap´´ Analyse insofern ähnlich, als das für jedes Monophylum eine prozentuale Unterstützung errechnet wird. Dieser Wert ermittelt sich allerdings nicht aus der artifiziellen Änderung des Datensatzes (s. o. ``bootstrap´´ Analyse), sondern beschreibt die Häufigkeit der gefundenen Monophyla während des Quartet-
Mittels einer Sensitivitätsanalyse Wheeler (1995) (´``gap X´´ oder ``molecularmatrix Y´´) wird der 12S rDNA-Datensatz unter verschiedenen Gewichtungsannahmen berechnet (Transitionen: Transversionen: Indels = 1:1:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:2:4, 1:1:10). Auf diese Weise können Aussagen über die Robustheit einzelner Monophylien in der Gesamttopologie gemacht werden. Das Schema 1:1:2 gilt hierbei als die für Arthropoda favorisierte Gewichtung Wheeler (1995),Whiting et al. (1997).
Durch dieses Testverfahrens ist es möglich, verschiedene Hypothesen (Topologien) bezüglich ihrer Signifikanz zu überprüfen. Es erlaubt eine Bewertung von unterschiedlichen Cladogrammen bzw. Dendrogrammen auf der Basis des 5% Signifikanzlevels. Der K-H-Test Kishino undHasegawa (1989) kommt in zweifacher Hinsicht zum Einsatz, einerseits bei der Ermittlung der wahrscheinlichsten und aller nicht signifikant schlechteren Topologien nach einer Quartet-Puzzle-Analyse (wie oben beschrieben) andererseits für eine Hypothesenbewertung der Topologien aus den Parsimonie und ML Analysen. Dabei werden von jeweils beiden Hypothesen die ``log likelihood´´ Werte unter den Parametern der zugrundegelegten Modelle verglichen, d.h. beide Hypothesen werden bezüglich ihrer Signifikanz in den Wahrscheinlichkeitswerten gegeneinander getestet.
Das ``likelihood mapping´´´´Strimmer undvon Haeseler (1997) (implementiert im Programm TREE-PUZZLE, Vers. 5) ist eine graphische Methode, die die phylogenetische Information eines Datensatzes a priori visualisiert und einen ersten Eindruck über die Qualität der zu erwartenden phylogenetischen Analyse vermittelt. Die Methode basiert auf der Wahrscheinlichkeitsberechnung aller möglichen Quartet-Topologien. Jede Topologie wird mittels eines Punktes in einem Dreieck dargestellt, wobei die Aussage über die Wahrscheinlichkeit einer Topologie durch die Lage im Dreieck bestimmt wird. Die drei Eckpunktregionen repräsentieren die Situation, in der eine Topologie über die beiden anderen klar favorisiert werden kann. Punkte im Bereich der Seitenkanten repräsentieren die Situationen, in denen nicht eindeutig eine Topologie favorisiert wird. Das Zentrum umfasst die Menge der Topologien, die nicht aufgelöst sind (``star-like´´). Das heißt, je stärker sich die Punktwolken in den Eckpunkten des Dreiecks konzentrieren, desto größer ist das phylogenetische Signal des Datensatzes.
Beide Methoden des ``likelihood mappings´´ finden für die Datensätzen der Astacoidea Anwendung.
In der vorliegenden Arbeit werden zwei Alignments des 12S rRNA Datensatzes für die Parsimonie Analysen und Maximum Likelihood Analysen der Branchiopoda erstellt. Ein Alignment folgt hierbei strikt dem Parsimonie Prinzip und wird mit dem Programm POY berechnet, ein weiteres Alignment wird visuell anhand der Sekundärstruktur erstellt (siehe auch Kapitel: 3.1.2.5), wobei die ``loop´´-Bereiche (sofern in Länge zwischen den Taxa unterschiedlich) mit Clustal X (``default´´) aligned werden.
Für die POY Analyse wird der 12S Datensatz zunächst in drei sinnvolle Teile geteilt, wobei jeder Teilbereich mit einer ``stem´´-Hälfte beginnt und endet. Die drei Teildatensätze werden im ersten Schritt getrennt voneinander aligned, jeweils die kürzeste Schrittanzahl benötigend und im zweiten Schritt zusammengesetzt.
Der erste Datensatz umfasst die ``stem´´-Hälften 27’, 22’ und 31’, der zweite Datensatz erstreckt sich von ``stem´´ 32 bis 33’ und der letzte Datensatz von ``stem´´ 48 bis 32’ (Abbildung 5). Es sei an dieser Stelle deutlich darauf hingewiesen, dass die Analyse der Sekundärstruktur für diese Berechnung nur zur sinnvollen Teilung des Datensatzes herangezogen wird. Die Berechnung der drei Datensätze erfolgt nicht auf der Basis der sich innerhalb der Datensätze befindlichen Sekundärstrukturen.
Die POY Analysen werden mittels der Kommandokaskade „maxtrees 10, fitchtrees, checkslop 10, multibuild 10, treefuse, buildmaxtrees 5, treefuse, random 100, stopat 5 und minstop 3“ durchgeführt. Aus den so ermittelten, gleich sparsamen Cladogrammen wird das ``strict consensus´´ Cladogramm mit der favorisierten Gewichtung 1:1:2 ermittelt (jack2hen.exe) errechnet. ``Decay´´ Indices Bremer (1994) werden mit dem Programm PHAST kalkuliert: „ hold X, sub Y, find, bs“. Anschließend wird noch eine Sensitivitätsanalyse durchgeführt, um die Stabilität einzelner Verzweigungen unter anderen Gewichtungen zu überprüfen (siehe Kapitel: 2.2.7.5.4).
Der 12S rRNA Datensatz der Astacida wird mit dem Programm Clustal X (``default´´) aligned und visuell bezüglich der korrekten Positionshomologien anhand der Sekundärstruktur der dritten Domäne überprüft.
Die proteinkodierenden Bereiche der Gene EF-1α der Branchiopoda und cox1 der Astacida werden ohne Ambiguitäten aligned, insofern stellt sich hier die Frage nach dem „richtigen“ Alignment nicht. Es wird das Programm Clustal X unter ``default´´ Optionen angewendet. Während der Datenerhebung offenbarte sich die Existenz kleiner hochvariabler Introns im Gen EF-1α der Branchiopoda. Eine Homologisierung der Intronsequenzen lässt sich allerdings nicht rechtfertigen, daher werden die Intronsequenzen vor der Erstellung des Alignments entfernt.
Die in dieser Arbeit untersuchten Fragestellungen werden mehrteilig unter unterschiedlichen Aspekten dargestellt. Die beiden Hauptabschnitte präsentieren die Resultate der phylogenetischen Untersuchungen der Phyllopoda (Branchiopoda) und der Astacoidea (Astacida) mit jeweils einer Einleitung zur Organismengruppe, den dazugehörigen Analysen und einer Diskussion. Die Analysen sind jeweils unterteilt in die computerkladistischen Einzelanalysen der Gene und den Analysen der kombinierten Datensätzen. Alle Analysen werden unter Parsimonie und Maximum Likelihood Kriterien und im Fall der Phyllopoda mit verschiedenen Alignmentmethoden dargestellt. Im Abschnitt Phyllopoda werden zusätzlich die Resultate der Sekundärstrukturanalyse der 12S rRNA beschrieben und ein auf dieser Basis erstelltes Alignment mit der anschließenden computerkladistischen Auswertung den anderen Ergebnissen gegenübergestellt. Die im Gen EF-1α existierenden Introns werden bezüglich ihrer Position gesondert betrachtet.
Die Branchiopoda, auch Blattfußkrebse genannt, sind mit ca. 800 beschriebenen Arten weltweit verbreitet. Das bislang älteste bekannte Fossil, Rehbachiella kinnekullensis (Anostraca), das in den südschwedischen Fundschichten "Orsten" entdeckt wurde, wird auf das Obere Kambrium vor ca. 500 Millionen Jahren datiert Walossek (1993).
Das Taxon Branchiopoda vereinigt in der traditionellen Classifikation vier rezente Gruppen: Die Anostraca (Feenkrebse), Notostraca (Rückenschaler), Conchostraca (Muschelschaler) und Cladocera (Wasserflöhe). Sie sind vermutlich marinen Ursprungs, die meisten Vertreter sind aber schon vor langer Zeit ins Süßwasser ausgewichen. Dieser Habitatwechsel wurde wahrscheinlich durch räuberische Fische ausgelöst Kerfoot undLynch (1987). Seitdem leben einige Gruppen der Branchiopoda, wie Anostraca, Notostraca und Conchostraca, in temporären Süßgewässern wie z.B. Tümpel und Laken. Diese sehr instabilen Habitate, die durch periodisches Austrocknen oder Ausfrieren gekennzeichnet sind, erfordern ein hohes Maß an Anpassung an z.B. Temperaturtoleranz oder auch wechselnden Sauerstoffgehalt. So können bespielsweise die Eier von Triops cancriformis (Notostraca) mehrere Jahrzehnte im Trockenschlamm „überleben". Bei erneut eintreffenden günstigen Bedingungen wie Regen und Temperaturoptima, beginnt die Entwicklung der Embryonen, sodass mit dem Schlüpfen der Larven ein neuer Lebenszyklus beginnt. Die meisten Arten der Cladocera (Wasserflöhe) leben dagegen in permanenten Süßgewässern, einige Vertreter sogar in marinen Gewässern.
Schon bei oberflächlicher Betrachtung der Morphologie unterscheiden sich die einzelnen Branchiopoden-Taxa erheblich voneinander. So haben die Notostraca einen schildförmigen, platten Carapax, während die Conchostraca und Cladocera einen zweiklappigen oder muschelförmigen Carapax besitzen. Die Conchostraca werden durch ihren Carapax fast vollständig umhüllt, während der Carapax bei den Cladocera den Rumpf umschließt oder sehr stark reduziert ist und häufig als Brutbeutel fungiert. Die Anostraca besitzen keinen Carapax, wobei nicht geklärt ist, ob der Carapax nie angelegt war oder ob es sich um eine völlige sekundäre Reduktion handelt. Laut Ax (1999) bestehen keine Indizien für eine sekundäre Reduktion, sodass man das Fehlen eines Carapax (wie auch bei den Cephalocarida) als plesiomorph bewerten müsse. Innerhalb der einzelnen Branchiopoden-Taxa, ausgenommen bei den Cladocera, ist die Morphologie sehr konserviert. So gleichen z.B. die rezenten Arten der Notostraca und Conchostraca weitestgehend den fossilen Funden aus dem Silur Walossek (1993). Auch die rezenten Anostraca verfügen über einen sehr konservierten Phänotyp. Morphologisch unterscheiden sie sich allerdings erheblich von den Phyllopoda, da sie keinen Carapax besitzen. Das ausgestorbene Taxon Rehbachiella kinnekullensis, welches einen Carapax aufweist, wird von Walossek Walossek (1995) allerdings als Vertreter der Stammlinie der Anostraca gewertet. Insofern muss das Fehlen eines Carapax bei den Anostraca als sekundärer Verlust gewertet werden.
Im Gegensatz zu allen anderen Hauptgruppen der Branchiopoda erfahren die Vertreter der Cladocera eine enorme morphologische Vielfalt, was die Bewertung der verwandtschaftlichen Verhältnisse der Taxa zueinander in der Vergangenheit sehr erschwerte.
Phylogenie
Die Branchiopoda werden von den meisten Autoren als monophyletisch anerkannt, was auf morphologischen Negrea et al. (1999),Walossek (1995),Wingstrand (1978) und auch jüngeren molekularen Analysen Spears undAbele (2000) beruht (Abbildung 1 A). Es sei jedoch erwähnt, dass von Ax (1999) eine entgegengesetzte Auffassung vertreten wird: In seinem Buch „Das System der Metazoa, Band 2“ werden die Branchiopoda als paraphyletisch gewertet, mit den Anostraca gegenüber den verbleibenden Phyllopoda. Die Phyllopoda bilden, laut Ax, ein Schwestergruppenverhältnis mit den Malacostraca (Abbildung 1 B). Auch Preuss wies schon 1951 darauf hin Preuss (1951), dass die Branchiopoda häufig nur aufgrund plesiomorpher Merkmale als geschlossene Abstammungsgemeinschaft beschrieben wurden - ein Vorgehen, das nach phylogenetischer Methode unzulässig ist.
Heutige phylogenetische Rekonstruktionen innerhalb der Branchiopoda gehen auf das von Calman Calman (1909) aufgestellte System zurück . Dieses System gruppiert die branchiopoden Crustacea in vier Ordnungen: Die Anostraca, Notostraca, Conchostraca und die Cladocera. Notostraca, Conchostraca und Cladocera werden zu dem gut begründeten Monophylum Phyllopoda zusammengefaßt Olesen (1998) und den Anostraca als Schwestergruppe gegenübergestellt Walossek (1995). Als Apomorphie
Über die phylogenetischen Beziehungen innerhalb der Phyllopoda entstanden in den letzten Jahrzehnten kontroverse Diskussionen. Die wesentlichen hier im Folgenden beschriebenen Diskussionspunkte sind in Abbildung 1 C-D dargestellt. Als Schwerpunkte sind hier die traditionell als Monophyla angesehenen Conchostraca und Cladocera zu nennen: Obwohl einige Autoren auf die enormen Unterschiede innerhalb der Conchostraca (Laevicaudata und Spinicaudata) hinweisen Linder (1945), werden beide Subtaxa traditionell zu den Conchostraca vereinigt. Die Taxa Anomopoda, Ctenopoda, Haplopoda und Onychopoda werden in der traditionellen Sichtweise zum Monophylum Cladocera zusammengefaßt. Da aber innerhalb der Cladocera eine enorme Diversität besteht, bekamen auch die Teiltaxa Anomopoda, Ctenopoda, Onychopoda und Haplopoda von Fryer Fryer (1987b) den Status von Ordnungen. Nach Fryers eingehender Analyse aller Branchiopoden Teiltaxa Fryer (1987a) wurden von ihm 10 Ordnungen benannt, phylogenetische Beziehungen der einzelnen Taxa zueinander bezeichnet er jedoch nicht.
Walossek Walossek (1993),Walossek (1995) beschreibt zwei Hauptlinien innerhalb der Phyllopoda: Die Calmanostraca (das Taxon vereinigt die Notostraca und die ausgestorbenen Kazacharthra) und die Onychura (Conchostraca und Cladocera) als Schwestergruppe zu den Calmanostraca. Mit diesem System folgt er einer schon durch Gerstaecker Gerstaecker (1866-1979) formulierten Idee, dass Conchostraca und Cladocera zusammen ein Monophylum bilden. Gerstaecker fasst beide Gruppen als Diplostraca zusammen; der von Walossek verwendete Begriff „Onychura" wird erstmals 1934 von Eriksson Eriksson (1934) eingeführt. Onychura und Diplostraca werden als Synonyme verwendet.
Hervorgerufen durch die unklaren Beziehungen der Laevicaudata und Spinicaudata (Conchostraca), Martin undCash-Clark (1995),Olesen et al. (1996) und der vier Teiltaxa der Cladocera Schminke (1996) innerhalb der Phyllopoda, wurde auch das Monophylum „Diplostraca“ immer wieder hinterfragt. Durch molekulare Analysen der 18S rDNA Spears undAbele (2000) und der 18S rRNA Sekundärstruktur der V4 und V7 Regionen Crease undTaylor (1998) wird eine Paraphyly der Conchostraca unterstützt. Demnach sind die Spinicaudata paraphyletisch, da Cyclestheria hislopi (einziger rezenter Vertreter der Cyclestheriidae und traditionell zu den Spinicaudata gehörig) Schwestertaxon zu den Cladoceren ist. Konsequenterweise muß Cyclestheria hislopi daher aus den verbleibenden Spinicaudata ausgeschlossen werden; das Monophylum Spinicaudata würde damit zerfallen (Abbildung 1D). Dieses
Die Stellung der Laevicaudata innerhalb der Phyllopoda ist ungewiss. Fryer Fryer (1987a) deutet zwar einerseits auf die oberflächlich betrachtete Ähnlichkeit der Laevicaudata und der Spinicaudata hin und spricht damit insbesondere den zweiklappigen Carapax an, der die Tiere fast oder vollständig umhüllt, wertet aber die meisten in der Literatur angeführten potentiellen Apomorphien, die für ein Schwestergruppenverhältnis der Laevicaudata zu den Spinicaudata sprechen, als Konvergenzen. Botnariuc Botnariuc (1947) wies auf die ähnlichen Strukturen des ersten Rumpfbeinpaares bei den Männchen beider Taxa hin. Dieses Beinpaar fungiert als Greiforgan während der Kopulation. Er betont allerdings die unterschiedliche Entwicklung dieses Greiforgans und bewertet es deshalb als konvergent. Im Gegensatz dazu steht wiederum die unterschiedliche Anordnung der Antennenmuskulatur bei Laevicaudata und Spinicaudata. Die Anordnung der Muskulatur der Laevicaudata weist gewisse Ähnlichkeiten zu der Anordung in den Cladocera auf Fryer (1987a). Einer morphologischen Analyse zufolge kamen Negrea et al. Negrea et al. (1999) zu dem Resultat, dass die Laevicaudata Schwestergruppe zu den Spinicaudata (ohne Cyclestheria hislopi) sind. Molekulare Analysen der 18S rDNA zur Stellung der Laevicaudata sind wiederum ohne Auflösung Spears undAbele (2000).
Schon Claus (1876) wurde von Claus die Hypothese aufgestellt, dass die Cladocera möglicherweise durch Neotenie aus verschiedenen Conchostraca Linien hervorgegangen sein könnten . Die Konsequenz wäre, dass die Conchostraca paraphyletisch und die Cladocera polyphyletisch sind Schminke (1981),Schminke (1996). Bezogen auf die Cladocera betont Fryer Fryer (1987b) die immensen morphologischen Unterschiede zwischen den vier Gruppen Anomopoda, Ctenopoda, Haplopoda und Onychopoda und kommt zu dem Ergebnis, dass die Cladocera keine geschlossene taxonomische Einheit bilden. Martin und Cash-Clark Martin undCash-Clark (1995) hingegen postulieren die Monophyly der Cladocera und nehmen an, dass die Stammart ein cyclestheriiden-artiger Vorfahre war. Die Annahme der Monophylie der Cladocera wird auch durch neue morphologische und molekulare Analysen gestützt Negrea et al. (1999),Olesen (1998),Olesen (2000),Spears undAbele (2000).
Die Schwestergruppenbeziehungen innerhalb der Cladocera werden seit einigen Jahrzehnten kontrovers diskutiert. Mordukhai-Boltovskoi Mordukhai-Boltovskoi (1968) ging sogar soweit, anzunehmen, die Subtaxa Onychopoda und Haplopoda seien möglicherweise keine Branchiopoda. Die Annahme begründet sich auf das Fehlen der typischen blattartigen Thoracopoden mit Epipoditen, die als Atmungsorgane fungieren. Diese Hypothese ist jedoch eine Ausnahme. Im allgemeinen ist akzeptiert, dass die Subtaxa Anomopoda, Ctenopoda, Haplopoda und Onychopoda dem Taxon Branchiopoda angehören. So wird einerseits durch morphologische und molekulare Daten die Hypothese gestützt, dass Onychopoda und Haplopoda Schwestergruppen sind (Abbildung 1 E), die zusammen als Gymnomera bezeichnet werden Braband et al. (2002),Olesen (1998),Richter et al. (2001),Schwenk et al. (1998),Taylor et al. (1999), andererseits werden die Haplopoda den verbleibenden drei Subtaxa als Schwestergruppe gegenüber gestellt und als Eucladocera zusammengefaßt Bowman undAbele (1982),Eriksson (1934),Spears undAbele (2000),Wingstrand (1978) bzw. als Leptodorida bezeichnet Negrea et al. (1999) (Abbildung 1D und F). Letztere Hypothese stützt sich auf den
Die Anomopoda und Ctenopoda werden als zweite Entwicklungslinie diskutiert und bilden nach den Ergebnissen von Negrea et al. Negrea et al. (1999) ein Schwestergruppenverhältnis (Calyptomera). Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Befunden von Martin und Cash-Clark Martin undCash-Clark (1995), die eine basale Stellung der Ctenopoda innerhalb der Cladocera favorisieren. DNA-Daten der mitochondrial codierten großen ribosomalen Untereinheit (16S) unterstützen letztere Hypothese Schwenk et al. (1998).
Die hier nur im Ansatz beschriebene Historie von Hypothesenbildungen zur Phylogenie der Branchiopoda und der dazugehörenden Gruppen ist in Abbildung 1 zusammenfassend dargestellt. Die Klärung der Stellung der Laevicaudata und Spinicaudata im System der Phyllopoda und deren Beziehung zu den Cladocera betrifft im erheblichen Maß die Existenz eines Monophylums Diplostraca (Spinicaudata + Laevicaudata + Cladocera), schließt aber zunächst nicht die Monophyla der einzelnen Teiltaxa mit ein.
Desweiteren sind die verwandtschaftlichen Beziehungen innerhalb der Cladocera nach wie vor ungeklärt. Dies betrifft die beiden kontroversen Hypothesen der Eucladocera (Leptodorida) und das Gymnomera Konzept.
Folgende Fragestellungen bezüglich der Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Phyllopoda werden anhand des mitochondrialen Gens 12S rRNA, des kerncodierten Gens EF-1α nebst seiner Intronpositionen und einer Analyse der Sekundärstruktur der 3. Domäne der kleinen ribosomalen Untereinheit betrachtet:
Die Wahl der Aussengruppe zur Klärung der verwandtschaftlichen Beziehungen innerhalb der Phyllopoda.
Sind die vier Haupttaxa innerhalb der Phyllopoda, die Notostraca, Laevicaudata, Spinicaudata, Cladocera, monophyletisch?
Welche Hypothese bezüglich der verwandtschaftlichen Beziehungen der Haupttaxa zueinander kann durch die Datensätze favorisiert werden? Das heißt im Einzelnen:
- Kann ein Taxon Diplostraca (Spinicaudata, Laevicaudata, Cladocera) durch die Daten gestützt werden?
- Sind die Conchostraca (Laevicaudata + Spinicaudata) monophyletisch?
- Welche phylogenetische Stellung nimmt Cyclestheria hislopi innerhalb der Phyllopoda ein?
- Sind die Cladoceromorpha (C. hislopi + Cladocera) monophyletisch und damit die Spinicaudata im traditionellen Sinn (incl. C. hislopi) paraphyletisch?
- Sind die drei Taxa der Cladocera (Anomopoda, Ctenopoda und Onychopoda) monophyletisch?
Um einen Beitrag zur Klärung der Probleme innerhalb der Phyllopoda zu leisten, ist zunächst die Frage nach der Außengruppenwahl zu stellen. Dies betrifft ganz entscheidend die Frage, ob die Branchiopoda (Anostraca und Phyllopoda) monophyletisch sind bzw. in welcher Beziehung die Anostraca zum gut begründeten Monophylum der Phyllopoda stehen. Da das hier verwendete Gen 12S rRNA sehr variable Regionen aufweist, sollte die Außengruppe in recht naher Verwandtschaft zu den Phyllopoda stehen. Zur Klärung wird hier ein Cladogramm auf der Basis von 12 Aminosäuresequenzen des mitochondrialen Genoms gezeigt. Als Basis wird ein Alignment Hwang et al. (2001) aus der EBI Datenbank (
Narceus annularus (Myriapoda; Diplopoda), Lavrov et al. (2002), (NC003343)
Thyropygus sp. (Myriapoda; Diplopoda), Lavrov et al. (2002), (NC003344)
Tetrodontophora bielanensis (Collembola), Nardi et al. (2001), (NC002735)
Platynereis dumerilii (Annelida; Polychaeta), Boore undBrown (2000), (NC000931)
Panulirus japonicus (Crustacea; Malacostraca), Yamauchi et al. (2002), (NC004251)
Tigriopus japonicus (Crustacea; Maxillopoda), Machida et al. (2002), (NC003979)
Triops cancriformis (Branchiopoda; Phyllopoda), Umetsu et al. (2002), (NC004465)
Abbildung 2 zeigt eine Gegenüberstellung der Maximum Likelihood Analyse (``strict´´ consensus´´, siehe auch Kapitel: 2.2.7.3) und der Parsimonie Analyse der mitochondrialen Proteinsequenzen. Für die Maximum Likelihood Berechnung wurde das Modell mtRev24+Γ4 Adachi undHasegawa (1996) verwendet. Diese Berechnungsgrundlage, sowie die Wahl der Außengruppen folgt den Angaben der Autoren Hwang et al. (2001). Die Parsimonie Analyse (``heuristic search, TBR branch swapping´´) ohne Gewichtung einzelner Merkmale resultierte in einem kürzesten Baum mit einer Schrittlänge von 12077. Die ``bootstrap´´ Analyse wurde mit 1000 Replikaten durchgeführt.
Bezüglich der Branchiopoda sind beide Analysen inkongruent. Die ML Analyse (Abbildung 2A) zeigt mit hoher Unterstüzung eine Paraphylie der Branchiopoda mit dem Maxillopoden Tigriopus japonicus als Schwestergruppe zu den Anostraca (vertreten durch Artemia franciscana), die Parsimonie Analyse (Abbildung 2B) favorisiert dagegen ein Monophylum Branchiopoda, allerdings nur mäßig unterstützt.
In Abbildung 3 wird die phylogenetische Analyse des Gens EF-1α dargestellt. Die Wahl der Außengruppe richtete sich für diese Berechnung nach der Verfügbarkeit von Daten in der Genbank. Es wurde jeweils an Limulus polyphemus (Chelicerata, U90051, Regier undShultz (1997) und Scutigera coleoptrata (Myriapoda, AF251763-67, Carapelli et al. (2000) gewurzelt. Der Maxillopode Eurytemora affinis (Copepoda, AF063408, Regier undShultz (1998) wurde bezüglich seiner möglichen näheren verwandtschaftlichen Beziehungen zu den Branchiopoda, bzw. Artemia spec. (Anostraca) mit in die Berechnungen aufgenommen. Die ML Analyse (Abbildung 3A) wurde mit dem Modell TN+Γ8 durchgeführt. Die Grundlage für die Parsimonie Berechnung (Abbildung 3B) sind: ``heuristic search´´, ``TBR branch swapping´´ mit einer ``bootstrap´´ Analyse von 1000 Replikaten.
Sowohl die Parsimonie- als auch die Maximum Likelihood Analyse weisen die Branchiopoda als Monophylum aus. Die Unterstützung ist allerdings mit knapp über 50 % in beiden Analysen als relativ gering anzusehen. Die Phyllopoda werden dagegen in beiden Analysen gut unterstützt (QP 76 % und BA 96 %), sodass von einer Monophylie der Phyllopoda ausgegangen werden kann.
Die Analyse der mitochondrialen Proteinsequenzen und die des Gens EF 1-α zeigen übereinstimmend eine nähere Verwandtschaft der Anostraca zu den Phyllopoda. Die Monophylie der Branchiopoda findet nur geringe Unterstützung, wird allerdings ebenfalls von mehreren morphologischen Walossek (1993),Walossek (1995),Wingstrand (1978) und auch molekularen Studien Giribet et al. (2001),Giribet undRibera (2000),Regier undShultz (1997),Spears undAbele (2000) einheitlich unterstützt. Für alle weiteren phylogenetischen Analysen bieten sich als Außengruppe daher die Anostraca an.
Trotz der universell einsetzbaren PCR-Primer kam es in einigen Fällen vor, dass die gewünschten Genbereiche in nur so geringer Menge amplifiziert werden konnten, dass auch eine Aufkonzentration der PCR nicht ausreichend gewesen wäre, um das Produkt direkt zu sequenzieren. In diesen seltenen Fällen erwies sich eine Klonierung als sinnvoll. Es wurden folgende Produkte kloniert: 12S von Leptodora, Ceriodaphnia, Evadne und Polyphemus.
Insgesamt sind für die Branchiopoda 35 Taxa (12S rDNA) sequenziert. Der Datensatz umfasst 41 Taxa (inclusive weiterer sechs Taxa aus der Literatur, Hanner undFugate (1997)).
Der erste Schritt zur Durchführung einer phylogenetischen Analyse mit DNA- Daten ist die Erstellung eines Alignments, d.h. einer Datenmatrix basierend auf den erhobenen Sequenzdaten. Diese Matrix ist Ausgangspunkt für eine Vielzahl von unterschiedlichen computercladistischen Methoden bzw. Rechenalgorithmen wie z.B. Maximum Parsimonie oder Maximum Likelihood. Die Ergebnisse dieser Berechnungen ermöglichen, am Ende eine Aussage über das phylogenetische Signal eines gewählten Genabschnittes zur Bearbeitung eines Taxons zu treffen und die phylogenetischen Beziehungen innerhalb dieses Taxons zu evaluieren.
Um einen besseren Einblick über beide Alignmentverfahren (Clustal X und POY) zu erhalten, wurde die Auswirkung beider Alignments auf die ``likelihood´´ Werte unter dem Modell TN+ Γ8 und auch der Schrittanzahl unter Parsimonie Kriterien (NONA) zuvor getestet und miteinander verglichen. Das Ergebnis dieses Vergleichs rechtfertigte die Verwendung des unter Parsimonie Kriterien maximierten Alignments (1:1:2) für die Maximum Likelihood Analysen. Dieser etwas ungewöhnliche Weg wurde gewählt, um die Vergleichbarkeit der einzelnen Topologien zu gewährleisten.
Tabelle 4zeigt eine Gegenüberstellung eines in POY generierten Alignments mit einem entsprechenden Alignment des Programms Clustal X (unter ``default´´ Optionen). Beide Alignments wurden als Basis für eine Parsimonie- und eine Maximum Likelihood Analyse berechnet.
Für eine effizientere Nutzung von POY wurde der 12S Datensatz in drei Teile geteilt Giribet (2001). Die Teilung des Datensatzes wurde auf der Basis der ribosomalen Sekundärstruktur vorgenommen, d.h. jeder Datensatz beginnt und endet mit verhältnismäßig konservierten ``stem´´-Bereichen. Um diese ``stem´´-Regionen zu definieren wurden Informationen des Sekundärstrukturmodells für Artemia franciscana
Van de Peer et al. (2000) aus der Antwerpener RNA Datenbank (
Die Gesamtlänge der Alignments unterscheidet sich in beiden Fällen um 56 Positionen. Das ergibt sich durch Insertionen 56 zusätzlicher ``gaps´´ in POY. Demgegenüber ist aber zu bemerken, dass die Anzahl der Parsimonie-informativen Merkmale nahezu gleich bleiben (280 zu 281). Erwartungsgemäß resultierte die Parsimonie Analyse des POY Alignments in einem kürzesten Baum mit deutlich weniger Schritten, als das unter Zugrundelegung des Clustal X Alignments der Fall war. Interessanterweise ergibt das POY Alignment auch unter Maximum Likelihood Kriterien ein signifikant wahrscheinlicheres Dendrogramm als das Clustal X Alignment. Wegen dieser wesentlich höheren Wahrscheinlichkeit liegt auch dem dargestellten Dendrogramm, welches unter Maximum Likelihood Kriterien errechnet wurde, das 12S Alignment des Programmes POY zugrunde.
In Abbildung 4 ist die beste Maximum Likelihood Analyse (A) und das strikte Consensus-Cladogramm der Parsimonie Analyse (B) von 35 Phyllopoda Taxa und 6 Anostraca Spezies als Aussengruppe dargestellt. Zur Berechnung der ML Topologie wurde das Modell TN+Γ8 zugrundegelegt. Die beste ML Analyse wurde mittels des Kishino-Hasegawa-Tests aus 10.000 intermediären ``Quartet-Puzzling- steps´´ (QP) ermittelt (siehe Kapitel: 2.2.7.5.3) und hat eine Wahrscheinlichkeit von logL –7778.04. Die Unterstützung der einzelnen Äste wird als ``QP-support´´ gezeigt und ermittelte sich aus den zuvor errechneten QP-Schritten. Es wurden nur die Werte ≥ 50 % angegeben.
Für die Parsimonie Analyse wurde das favorisierte Gewichtungsschema (1:1:2) genutzt und resultierte in drei gleich sparsamen ``most parsimonious trees´´ mit jeweils 2126 Schritten. Abbildung 4B zeigt den strikten Consensusbaum. Die Unterstützungen der Dichotomien wird einerseits mit ``decay´´ Indices belegt, andererseits befinden sich für die jeweiligen Gewichtungsschemen der Sensitivitätsanalyse Symbole an den Verzweigungen (siehe Kapitel: 2.2.7.5.4).
Die Ergebnisse beider Analysen sind im wesentlichen kongruent bezüglich der Monophyla der Phyllopodenhaupttaxa. Die Monophyla der Notostraca, Laevicaudata und Spinicaudata (exclusive Cyclestheria hislopi) werden in der Maximum Likelihood Analyse (``QP-support´´ für Spinicaudata ohne C. hislopi 67 %, Notostraca 80 % und Laevicaudata 96 %), sowie mit den meisten Gewichtungen der Sensitivitätsanalyse in der Parsimonie Analyse unterstützt (``decay´´ Index für Matrix 1:1:2 = 11 für Spinicaudata, exclusive C. hislopi, 22 für Notostraca und 20 für Laevicaudata). Eine sichere
Die Abstammung der Laevicaudata ist in beiden Analysen inkongruent. Die ML Analyse zeigt ein nicht signifikantes Schwestergruppenverhältnis (< 50%) von Laevicaudata und Notostraca. Dieses Ergebnis wurde, ebenfalls nur gering unterstützt, auch in einigen Analysen der 18S rDNA erzielt Spears undAbele (2000). Die direkte Optimierung der Parsimonie Analyse (POY) favorisiert dagegen unter drei verschiedenen Gewichtungsschemen eine basale Stellung der Laevicaudata als Schwestergruppe zu allen übrigen Phyllopoda. Die Parsimonie Analyse unter der Gewichtung 1:2:2 unterstützt, ebenso wie die ML Analyse, das Schwestergruppenverhältnis zwischen Notostraca und Laevicaudata (Parsimonie Cladogramm hier nicht gezeigt). In keiner der Analysen konnte jedoch ein Schwestergruppenverhältnis der Laevicaudata zu den Spinicaudata Walossek (1995), und Cladocera bzw. Cladoceromorpha gezeigt werden. Somit kann anhand der mitochondrialen 12S rDNA Analyse ein Monophylum der Diplostraca (Laevicaudata + Spinicaudata + Cladocera, respektive Cladoceromorpha) nicht unterstützt werden.
Für die wesentlichen hier zu erörternden Fragen der Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Cladoceren-Taxa zeigen beide Analyseverfahren kongruente Ergebnisse. Die Ctenopoda und auch die Onychopoda werden sowohl in der ML Analyse, als auch in allen fünf Gewichungsschemata übereinstimmend als Monophylum gezeigt. Eine Monophylie der Anomopoda wird dagegen nicht unterstützt. In dieser Studie erscheinen sie paraphyletisch. Dies betrifft auch das verwandtschaftliche Verhältnis von Cyclestheria hislopi zu den Cladocera. Beide Berechnungen unterstützen das Cladoceromorpha- Konzept, wonach Cyclestheria hislopi in näherer Verwandtschaft zu den Cladocera steht als zu den verbleibenden Spinicaudata. Die Cyclestheriidae haben allerdings ein Schwestergruppenverhältnis zu den Chydoridae (Eurycercus lamellatus und Pseudochydorus globosus). Dieses Resultat zeigt sich in der ML Analyse und in der Parsimonie Analyse mit der favorisierten Gewichtung 1:1:2. Es sei jedoch erwähnt, dass durch die Gewichtungen 1:2:2 und 1:2:4 eine Schwestergruppenbeziehung von Cyclestheria hislopi zu den in diesen Fällen monophyletischen Cladoceren unterstützt wird. Die inkongruenten Ergebnisse der Sensitivitätsanalyse zeigen zumindest, dass eine Monophylie der Cladocera anhand dieses Datensatzes nicht gezeigt werden kann. Die Resultate bezüglich der Stellung von Leptodora kindtii innerhalb der Cladocera (Gymnomera- versus Eucladocera- Konzept) zeigen übereinstimmend die Monophylie der Gymnomera mit einem Schwestergruppenverhältnis von L. kindtii zu den Onychopoda. Das Verhältnis wird durch zwei
Innerhalb der Spinicaudata werden die drei Familien (Leptestheriidae, Cyzicidae, Limnadiidae) in der Parsimonie Analyse als Monophyla ausgewiesen. Keine Unterstützung finden die Cyzicidae in der ML Analyse. Hier erscheint Eocyzicus spec. als Schwestertaxon zu den Limnadiidae. Auch die Stellung der Leptestheriidae als Schwestertaxon zu den Cyzicidae und Limnadiidae (vier Gewichtungen, DI 5) findet keine Unterstützung in der ML Analyse. Dieses Ergebnis ist unter dem Gesichtspunkt der unterschiedlichen Analyseformen (Parsimonie und Maximum Likelihood) bemerkenswert, da ein offensichtlich gut unterstütztes Schwestergruppenverhältnis (Leptestheriidae (Cyzicidae, Limnadiidae)) in der Parsimonie Analyse keine Kongruenz in der ML Analyse findet.
Die meisten rRNA Alignments, die die strukturellen Komponenten einer ribosomalen RNA berücksichtigen, basieren auf einem comparativen Ansatz jeder einzelnen Sequenz mit einem (oder mehreren) Modell(en).
Das in Abbildung 5 dargestellte Modell der 12S rRNA von Artemia franciscana (X69067) wird als Grundlage für die weiteren Betrachtungen der dritten Domäne und partiell der zweiten Domäne (beide grau) der 12S rRNA der Branchiopoda verwendet. Auf diese Weise konnten die konservierten Helixregionen für die ``stems´´ 31, 32, 33, 34, 35, 36 und 38 relativ leicht identifiziert werden. Schwieriger stellte es sich allerdings für die in Abbildung 5 in den gelb markierten Bereichen zu findenden ``stems´´ 39-42 und ``stems´´ 45-48 dar. Die Bereiche um die ``stems´´ 39 bis 40 und 45 bis 48 weisen in ihrer primären RNA- Struktur wenig Ähnlichkeiten zu dem vorgegebenen Modell auf (siehe unten).
Für ``stem´´ 27 liegen die Sequenzdaten nicht vollständig vor, dennoch konnte aufgrund einer recht hohen Konservierung das Ende der ``stem´´-Hälfte 27, sowie der Beginn der korrespondierenden ``stem´´-Hälfte 27’ festgelegt werden.
Um die potentiellen Nukleotidhomologien der Bereiche 39-42 und 45-48 für ein entsprechendes Alignment zu erkennen, wurde für die Regionen das vorgeschlagene Modell von Hickson et al. Hickson et al. (1996) verwendet. Ausschnitte des Modells sind ebenfalls in Abbildung 5 in generalisierter Form dargestellt. Das Modell weicht in den fraglichen Bereichen leicht vom Vorschlag der Antwerpener Datenbank De Rijk et al. (2000) ab und wurde aufgrund größerer Übereinstimmung mit dem Datensatz der Branchiopoda übernommen. Für einige Vertreter aller Haupttaxa der Branchiopoda sind die Bereiche von ``stem´´ 38 bis 42 und 45 bis 48 (Abbildung 6) schematisch dargestellt.
Alle folgend beschriebenen Sequenzmotive sind in den Abbildung 5 und Abbildung 6 rot bzw. grün dargestellt. Im Text beschriebene Ambiguitäten (z.B. „R“) richten sich nach dem IUPAC- IUB ``ambiguity set´´ Code und verweisen darauf, dass diese Positionen innerhalb der Metazoa zwischen – im genannten Beispiel - zwei Basen (A/G) variabel sind. Kleine Buchstaben bezeichnen einen Konservierungsgrad von 78% innerhalb aller von Hickson et al. Hickson et al. (1996) untersuchten Metazoa.
Die dritte Domäne beginnt unmittelbar nach dem unpaaren Bereich stromabwärts der ``stem´´-Hälfte 31’ mit ``stem´´ 32 , der bei allen Branchiopoda in der angenommenen Form gefunden werden kann. Das Motiv „GRCGG“ (R=G/A) der ``stem´´-Hälfte 32 wird auch hier, wie in allen zuvor untersuchten Metazoa Hickson et al. (1996) realisiert. ``Stem´´ 33 ist ebenfalls mit einer Länge von fünf Basenpaaren konserviert und verfügt über eine signifikante GU-Basenpaarung, die 100%-ig in allen weiteren untersuchten Branchiopoda vorkommen. Zwei der sogenannten ``non Watson-Crick´´ (GU) Basenpaarungen werden auch im folgenden ``stem´´ 34 als nicht variabel innerhalb der Branchiopoda beobachtet. Ein nicht paarendes Adenin in der ``stem´´-Hälfte 34’, wie bei Artemia beobachtet wird, kann für die Branchiopoda für nur fünf Taxa bestätigt werden. In den meisten Fällen wird hier ein Guanosinrest beobachtet. ``Stem´´ 35 ist zwei Basenpaare lang, wobei das zweite Basenpaar (GC)
Während van de Peer ``stem´´ 39 als zwei basenpaarigen ``stem´´ beschreibt, besteht dieser ``stem´´ nach Hickson et al. Hickson et al. (1996) und Gutell Gutell et al. (1994) für gewöhnlich aus sechs Nukleotidpaarungen und folgt unmittelbar auf ein konserviertes Adenin. Sowohl der Adeninrest (100% bei Branchiopoda), als auch die postulierten Nukleotidpaarungen „ry“ und „yr“ können bei den Branchiopoda gefunden werden, allerdings weicht die Nukleotidkomposition in der ``stem´´-Hälfte 39’ an diesen Positionen häufig ab. ``Stem´´-Hälfte 40 („yyy“) folgt ohne unpaaren Bereich im Modell nach Hickson et al. Hickson et al. (1996) sofort auf ``stem´´-Hälfte 39 und ist zu 88% bei den Branchiopoda zu finden (Ausnahme: Anostraca mit „urr“). ``Stem´´-Hälfte 40’ mit dem Motiv „rrr“ kommt in den Branchiopoda zu 76% vor. Die ``stem´´-Hälften 40’ und 39’ sind i.d.R. durch ein Nukleotid voneinander getrennt, wobei hier eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden innerhalb der Metazoa beobachtet wird und für die Spezies Simocephalus innerhalb der Branchiopoda bestätigt werden kann. Die ``hairpin´´-Struktur des ``stems´´ 42 wird als drei bis vier basenpaarige hochvariable Helix mit dem in der dritten Domäne
``Stem´´ 48 ist ebenfalls in Länge und Position variabel und beginnt mit dem letzten Nukleotid des konservierten ``loop´´-Motivs „GUAA“, welches auch in der Consensussequenz der Branchiopoda invariabel vorkommt. Die genaue Länge des ``stems´´ kann allerdings innerhalb der Branchiopoda nicht festgestellt werden aufgrund einer offensichtlich erheblich längeren Deletion innerhalb der Anostraca und Pseudochydorus (Cladocera). Als einzige konservierte Nukleotidpaarung kann hier lediglich die Bindung A-U beobachtet werden. Diese Bindung definiert Beginn und Ende der jeweiligen ``stem´´-Hälften.
Auf der Basis der für die Branchiopoda definierten Sekundärstruktur wurde ein manuelles Alignment erstellt. Bereiche, deren homologe Positionen nicht klar manifestiert werden konnten (z.B. ``stem/loop´´ 48, ``hairpinloop´´ 42), wurden gesondert aligned (Clustal X) und nachträglich eingesetzt. Das auf diese Weise generierte Alignment weist mit einer Gesamtlänge von 408 Nukleotiden im Vergleich zum POY Alignment (465 Merkmale) wesentlich weniger Positionen auf, was sich in der Anzahl der ``gaps´´ wiederspiegelt. Diese ``indels´´ befinden sich im POY Alignment im wesentlichen in den ``loop´´ Bereichen aber auch in einigen ``stem´´-Hälften (z.B. ``stem´´-Hälfte 38 und ``stem´´-Hälfte 34’). Übereinstimmungen zwischen den beiden Alignments finden sich bei den ``stems´´ 31, 32, 35 und 36. Die anderen ``stems´´ wurden durch das POY Alignmentverfahren entweder nicht gefunden (``stems´´ 42, 45, 47) oder weichen in Einzelpositionen (``stems´´ 34, 38) innerhalb der ``stems´´ vom Strukturalignment ab. Beide Alignments sind als Anhang der Arbeit beigefügt.
Zur Verdeutlichung der Unterschiede der Alignments ist in Abbildung 7 ein Ausschnitt des POY Alignments und der korrespondierende Ausschnitt des Sekundärstrukturalignments im Vergleich dargestellt. Betrachtet wird hier beispielsweise die ``stem´´-Hälfte 38 und die flankierenden ``loop´´-Bereiche (s.a. Abbildung 5). Das POY Alignment favorisiert einen erheblich größeren Anteil an Insertionen / Deletionen im proximalen ``loop´´-Bereich, wobei der endständige Adenosinrest (rot dargestellt; zu 93% vorhanden in den Branchiopoda) nicht einheitlich homologisiert wird. Die Homologisierung des endständigen Adenosinrestes im Sekundärstrukturalignment führte hier zunächst zu einer erheblichen Stauchung des ``loops´´ (Eliminierung von ``gaps´´). Desweiteren wurden derartige Nukleotide homologisiert, wie z.B. der Uracilrest von Cyclestheria und Eulimnadia im POY Alignment, verdeutlicht durch den vertikal verlaufenden Pfeil oder auch der Adenosinrest im stromaufwärts gelegenen ``loop´´-Bereich zwischen Lepidiurus bilobatus und Triops longicaudatus (grün dargestellt). Die ``stem´´-Hälfte 38 wurde durch das POY Alignment ebenfalls mit einigen zusätzlichen ``gaps´´ versehen, die durch die Homologisierung des ``loop´´-endständigen Nukleotidrestes einiger Taxa (dargestellt durch gebogene Pfeile) mit dem ersten Nukleotid der
Abbildung 8 zeigt das Ergebnis der Maximum Likelihood Analyse (A) und der Parsimonie Analyse (B) mit der Gewichtung Transition: Transversion: ``gaps´´ (1:1:2). Beide Analysen zeigen in den wesentlichen Punkten übereinstimmend die Monophylie der Haupttaxa Notostraca, Laevicaudata und Cladocera. Cyclestheria hislopi erscheint hier als Schwestergruppe zu den Cladocera. Somit zerfällt auch in dieser Analyse das traditionelle Taxon Spinicaudata. Die verbleibenden Spinicaudata bilden die Schwestergruppe zu den Cladoceromorpha (C.hislopi + Cladocera). Wie auch in der Einzelanalyse ohne Betrachtung der Sekundärstruktur bilden in der ML Analyse die Laevicaudata die Schwestergruppe zu den Notostraca und beide zusammen die Schwestergruppe zu allen übrigen Phyllopoda. Das Taxon Diplostraca findet hier in der ML Analyse abermals keine Unterstützung, wohl aber wird eine Schwestergruppenbeziehung der Laevicaudata zu den Spinicaudata und Cladoceromorpha in der Parsimonie Analyse gezeigt, jedoch ohne nennenswerte Unterstützung. Innerhalb der Cladocera bilden die Onychopoda in beiden Analysen ein Monophylum. Eine phylogenetisch nahe Verwandtschaft des Haplopoden Leptodora kindtii zu den Onychopoda kann auch hier gezeigt werden. Die Ctenopoda bilden in der ML Analyse ein Schwestergruppenverhältnis zu den Daphniidae.
Insbesondere bezüglich der Stellung von C.hislopi und seiner Beziehung zu den Cladocera bringt die phylogenetische Analyse auf der Basis eines anhand der Sekundärstruktur visuell korrigierten Alignments eine Verbesserung. In beiden Analysen wird C. hislopi als Schwestertaxon zu den Cladocera gezeigt. Eine vollständige Kongruenz zwischen beiden Methoden kann allerdings auch hier nicht erreicht werden. Dies betrifft besonders die Stellung der Laevicaudata. Insgesamt sind die einzelnen Unterstützungen im Durchschnitt allerdings als eher mäßig zu bewerten, was vermutlich mit der Kürze des Genabschnittes zusammenhängt.
Auffällig sind in der Parsimonie Analyse einige Splits innerhalb der Notostraca und Spinicaudata. Die durch die zuvor mittels POY favorisierten Schwestergruppenverhältnisse der Triopsidae ((L.apus, L. bilobatus) (T.cancriformis, T. australiensis, T. longicaudatus)) werden durch das Sekundärstukturalignment nicht mehr gestützt. Gleiches gilt auch für die Limnadiidae innerhalb der Spinicaudata. In Abbildung 8 werden sie als Monophylum dargestellt, dieses Verhältnis wird durch die Analyse des Sekundärstrukturalignments nicht bestätigt. Das Ergebnis der ML Analyse weicht im Vergleich zur ML Analyse des POY Alignments in diesen Gruppen nicht voneinander ab.
Das zugrundeliegende Nukleotidalignment der 19 Arten mit 942 Merkmale weist keine Ambiguitäten auf (0 ``gaps´´). Es schien daher zweckmäßig die Sequenzen mit dem Programm Clustal X unter den vorgegebenen (``default´´) Optionen zu alignen. Abbildung 9A und B zeigen die Ergebnisse der Maximum Likelihood- und Parsimonie Analysen. Es wurden zunächst alle Nukleotidpositionen in die Analyse mit einbezogen (Abbildung 9) und in einer weiteren Berechnung die dritte Codonposition eliminiert (Abbildung 10). Für die ML Analysen (jeweils A) erwies sich ebenfalls das Modell TN+Γ8 als das geeignetste Modell (mit dem signifikant höchsten ``log likelihood´´). In der Parsimonie Analyse wurde keine Gewichtung zugrunde gelegt. Basierend auf allen Codonpositionen resultierte die Berechnung in einem sparsamsten Cladogramm (Parsimonie) mit einer Länge von 1411 Schritten. Die ``bootstrap´´ Analyse umfasste 1000 Replikate. Als Maximum Likelihood Analyse ist der strikte Consensus aus 391 Quartet-Puzzle-Topologien dargestellt.
In beiden Analysen erhalten auch hier, wie schon in den 12S Analysen, die gezeigten Monophyla der Notostraca (BA 70%, CML 96%) und Spinicaudata ohne C. hislopi (BA 94%, CML 94)sehr gute Unterstützung. Die Cladocera sind hier weder in der Parsimonie-, noch in der Maximum Likelihood Analyse monophyletisch. Innerhalb der Cladocera erfahren die Onychopoda ebenfalls eine gute bis sehr gute Unterstützung. (BA 88%, CML 100%). Obwohl eine Monophylie der Cladocera hier nicht gezeigt werden kann, da der Haplopode Leptodora kindtii (Parsimonie) bzw. L.kindtii und die Ctenopoda (ML) nicht innerhalb der Cladocera zu finden ist, sondern jeweils als Schwestergruppe der Spinicaudata (ohne C. hislopi) gezeigt wird, ist die relative Position von (Laevicaudata (Notostraca (Spinicaudata + Cladocera))) ähnlich den Beziehungen, die in der vorherigen 12S Analyse (Abbildung 4B) gezeigt wird. Einen wesentlichen Unterschied stellt die Beziehung von Cyclestheria hislopi zu den übrigen Phyllopoda dar. Diese Aufspaltung wird zwar verhältnismäßig gut in der Parsimonie Analyse gestützt (BA 76%), jedoch nicht in der ML Analyse. In der ML Analyse erscheint C. hislopi nicht in der Innengruppe. Die hier aufgezeigte basale Stellung von C. hislopi innerhalb der Phyllopoda oder sogar als Aussengruppe scheint artifiziell zu sein. Wie folgend gezeigt wird, gibt es Hinweise dafür, dass diese Stellung durch eine hohe Saturation der dritten Codonposition ausgelöst wird. Zu diesem Zweck wurde eine weitere Analyse unter Ausschluss der dritten Codonposition durchgeführt (Abbildung 10). In dieser Analyse erscheint das Taxon C.hislopi in näherer Verwandtschaft zu den Spinicaudata und Cladocera und ist in dieser Beziehung kongruent zu den zuvor gezeigten12S Analysen.
Eine entsprechende Analyse der alignten Aminosäuresequenzen resultierte mit beiden Methoden in einer nicht aussagekräftigen Polytomie (hier nicht gezeigt), was auf den starken Konservierungsgrad des Gens zurückzuführen ist.
Dieser Analyse liegt das manuell erstellte 12S rRNA-Alignment kombiniert mit dem EF-1α Datensatz (exclusive der 3. Codonposition) zugrunde und hat eine Gesamtlänge von 1036 Positionen. Es wurden die 19 Spezies, für die beide Sequenzen vorliegen, berücksichtigt. Abbildung 11A zeigt ein ML Consensusdendrogramm (logL –7341.78) aus 260 verschiedenen QP-Topologien. Insgesamt wurden 974 Topologien zuvor getestet. Auch hier bezeichnen die angegebenen prozentualen Werte die Erscheinungshäufigkeiten der Dichotomien in den 260 Einzeltopologien. Das Ergebnis des besten ML Stammbaums mit einem logL von –7336.12 (hier nicht gezeigt) ist in vollständiger Übereinstimmung mit dem Consensusbaum.
Abbildung 11B zeigt das strikte Consensuscladogramm der Parsimonie Analyse, wobei keine Positionsgewichtung vorgenommen wurde. Dieser Weg wurde gewählt, um den Einfluss des EF-1α Datensatzes nicht zu unterdrücken. Die Analyse resultierte in drei gleich sparsamen Topologien mit 1406 Schritten. Die ``bootstrap´´ Analyse umfasste 1000 Replikate.
Beide Analysen ergaben kongruente Ergebnisse. Abermals werden die Hauptgruppen (Notostraca, Cladocera, Laevicaudata) mit hoher Unterstützung als jeweils monophyletisch ausgewiesen. Ein einheitliches Bild ergibt sich auch bei dem Schwestergruppenverhältnis C. hislopi zu den Cladocera. Dieser Split wird im Consensus der ML Topologien sehr hoch unterstützt (CML 94%), in der Parsimonie Analyse jedoch nur moderat (BA 62%). Die Gymnomera innerhalb der Cladoceraerhalten in beiden Analysen hohe Unterstützung (CML 87% und BA 86%).
Bemerkenswert ist die Stellung der Laevicaudata. Beide Analysemethoden ergeben übereinstimmend eine Schwestergruppenbeziehung der Laevicaudata zu den Spinicaudata + Cladoceromorpha. Somit wird erstmalig in den hier gezeigten Stammbäumen das Konzept der Diplostraca kongruent mit beiden Analysemethodenunterstützt.
Um zu testen, inwieweit die verschiedenen Topologien, die auf der Grundlage verschiedener Methoden berechnet wurden, vergleichbar sind, wurde der Kishino-Hasegawa-Test Kishino undHasegawa (1989) mit einem statistischen Signifikanzlevel von 5% angewendet. Die Maximum Likelihood Analyse wurde jeweils als Hypothese A gesetzt, die Parsimonie Analyse (Gewichtungsschema 1:1:2 bei den 12S Analysen) als Hypothese B (Tabelle 5).
Die Testkriterien wurden, wie bei den ML Analysen, gemäß dem Substitutionsmodell TN+Γ8 festgelegt. Das Ergebnis, dass die Maximum Likelihood Hypothesen als die jeweils besseren gewertet werden (Ausnahme: kombinierte Analyse), erscheint nicht verwunderlich. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Differenz der ``log likelihoods´´ beider Methoden bei der Berechnung des kombinierten Datensatzes erheblich kleiner ist als in den 12S-Einzelanalysen, was sicherlich mit der Kongruenz der Ergebnisse erklärbar ist. Der Vergleich macht es daher möglich, die verschiedenen Hypothesen gleichwertig zu diskutieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Gen EF-1α von 17 Taxa sequenziert (s. Tabelle 1). Die für die Amplifikation notwendigen Primer wurden so gewählt, dass ein 1063 Basenpaare langes Fragment zu erwarten war. Die erhaltenen PCR- Fragmente wiesen allerdings, abhängig vom Taxon, Längen von 1063 bp bis ~1200 bp auf. In der anschließenden Sequenzanalyse zeigte sich, dass die codierende Region bei vielen Taxa von kleinen ca 60-65 bp. langen spliceosomalen Introns durchbrochen ist.
Die codierende Region des Gens EF-1α erwies sich als sehr G/C- reich. Im Gegensatz dazu sind die Introns stark A/T- haltig (ca. 85% pro Intron). Die Adenosin-, bzw. Thymidin- Reste sind zudem häufig in langen sogenannten ``stretches´´ angeordnet. Insgesamt sind die Intronsequenzen hochvariabel. Versuche diese Sequenzen zu alignen waren aus diesen Gründen unmöglich. Darüber hinaus wäre eine Homologie der Intronsequenzen schwerlich postulierbar, da von einem gleichen Sequenzursprung nicht notwendigerweise ausgegangen werden kann (siehe Kapitel: 1.2.3). Im Gegensatz dazu sind die Positionen der Introns stark konserviert innerhalb der fünf Hauptaxa. Sie wurden immer bezüglich der einzelnen Haupttaxa in identischer Position homologer Tripletts gefunden. Aus diesem Grund werden die Positionen der Introns homologisiert und dienen als Argumentationsgrundlage für eine phylogenetische Betrachtung.
Abbildung 12 zeigt (A) den sequenzierten codierenden Bereich im Vergleich zur Referenzsequenz von Artemia spec. (X03704-08) mit der relativen Lage der Introns, der putativen Splicingstellen und den korrespondierenden Aminosäureresten. Insgesamt wurden fünf verschiedene Intronpositionen gefunden, die die Bezeichnungen A-E erhalten. Tabelle B der Abbildung 12 enthält Informationen zum Vorkommen der verschiedenen Introns in allen sequenzierten Spezies. Zusätzlich wird die Lage der Introns in den genomischen Referenzsequenzen von Artemia spec. (Anostraca), einigen Insecta, einem Nematoda und einigen Deuterostomia (Hemichordata, Urochordata, Chephalochordata, Echinodermata) als Aussengruppe mit berücksichtigt.
Die meisten hier sequenzierten Arten enthalten mindestens ein Intron in der betrachteten Region. Ausnahmen stellen die Spinicaudata und L. kindtii dar, die intronfrei sind. Die meisten Introns (drei) wurden bei den Cladocera beobachtet, wobei alle Cladoceren (ausser L. kindtii) ein Intron in Position A haben. Zusätzlich zur Position A werden in den Anomopoda Introns in den Positionen C und D gefunden (Ausnahme: Ceriodaphnia megops; Fehlen eines Introns in Position C). Die Ctenopodenspezies Sida crystallina zeigt ebenfalls das Verteilungsmuster der Anomopoda (A, C, D), im Gegensatz dazu fehlen Diaphanosoma brachyurum (Ctenopoda) die Introns in den Positionen C und D. Innerhalb der Cladocera scheint das Intronverteilungsmuster der Onychopoda ebenfalls abgeleitet zu sein, da Podon leuckarti nur die Introns A und D, Evadne nordmanni nur noch ein Intron in Position A hat.
Introns in Position D konnten nur in den Cladoceren nachgewiesen werden und können daher bezüglich des vorliegenden Datensatzes als Apomorphie der Cladocera gewertet werden. Der
Es kann gezeigt werden, dass die Intronposition A innerhalb der Phyllopoda sehr stabil ist und ebenfalls in den Aussengruppen Anostraca, Apterygota und Deuterostomia zu finden ist.. Gleiches gilt für Intron E, welches innerhalb der Phyllopoda nur die Laevicaudata (Lynceus tatei) haben, diesen Zustand aber mit den Anostraca und darüber hinaus den Hymenoptera, Nematoda und Deuterostomia teilen. Beide Introns befinden sich bezüglich ihrer relativen Lage zu den Tripletts in Phase 0, d.h. zwischen der dritten Cosdonposition des vorangehenden Tripletts und der ersten Position des nachstehenden Tripletts. Das Vorkommen der Introns A und E innerhalb der hier betrachteten Bilateria-Taxa deutet auf den plesiomorphen Ursprung der Introns A und E hin. Eine eingehende Diskussion der Intronverteilung folgt in Kapitel: 3.1.3.2. der Diskussion.
Für das Teilprojekt „Phyllopoda“ wurden ein Bereich der mitochondrialen 12S rDNA von 33 Taxa und des nuklearen Gens EF-1α von 17 Taxa sequenziert und in Verbindung mit einigen bereits in der Datenbank bzw. der Literatur Hanner undFugate (1997) existierenden Sequenzen phylogenetisch ausgewertet. In der Übersicht der Abbildung 13 werden die Ergebnisse zusammenfassend bezüglich der zu diskutierenden Fragestellungen dargestellt.
Die hier vorliegenden Analysen der 12S rDNA (Abbildung 13A), des Sekundärstrukturalignments (Abbildung 13B) sowie des kombinierten Datensatzes (Abbildung 13D) beider Gene zeigen eindeutig die Monophylie der Notostraca, Laevicaudata und Spinicaudata (exclusive C. hislopi).
Ebenso begründet erscheint das Cladoceromorpha Konzept Ax (1999),Braband et al. (2002),Crease undTaylor (1998),Spears undAbele (2000),Taylor et al. (1999), wobei Cyclestheria hislopi die Schwestergruppe zu den Cladocera ist. Letzteres kann jedoch in den Analysen der einzelnen Gene nicht eindeutig gezeigt werden (Ausnahme: Analyse des 12S Sekundärstrukturalignments). Dennoch wird in allen Einzelanalysen deutlich, dass das Taxon Cyclestheria hislopi eine enge Beziehung zu den Cladocera hat. Wie die Analyse des 12S Sekundärstrukturalignments zeigt (Abbildung 8), wird die undeutliche Stellung der Cladocera zu C. hislopi im wesentlichen auf fehlerhafte Positionshomologien innerhalb des Alignments (generiert durch POY) zurückgeführt. Möglicherweise wurden diese Fehler durch die sehr restriktive Taxonauswahl der Anomopoda innerhalb der Cladocera ausgelöst. Einige bedeutsame Taxa der Anomopoda (z. B. weitere Chydoridae und Macrothricidae) wurden in den Analysen nicht in ausreichendem Maß berücksichtigt, da hier weitere Proben nicht zur Verfügung standen. Das Vorhandensein des Introns C im Gen EF-1α in C. hislopi und den meisten Cladocera
Innerhalb der Hauptgruppen der Branchiopoda gestaltet sich die Diskussion der korrekten Position der Laevicaudata am schwierigsten. Die Einzelanalysen ergeben ein sehr unterschiedliches Bild. Auffällig ist hier, dass die Ergebnisse aus einem Genbereich von der angewandten Berechnungsmethode abhängig sind. Während die Maximum Likelihood Analysen der 12S rDNA (DNA=ohne Berücksichtigung der Sekundärstruktur) und auch 12S rRNA (RNA=unter Einbeziehung von Sekundärstrukturelementen im Alignment) ein Schwestergruppenverhältnis der Notostraca und Laevicaudata favorisieren, zeigen die Parsimonie Analysen zum einen eine zu allen Phyllopoda basale Stellung der Laevicaudata (12S rDNA), zum anderen ein Schwestergruppenverhältnis der Laevicaudata zu Spinicaudata und Cladoceromorpha (12S rRNA). In jedem Fall erhalten die erwähnten Splits keine nennenswerten Unterstützungen. Ähnlich verschieden fallen die Ergebnisse mit dem Gen EF-1α aus. Die Kombination der Datensätze dagegen ergibt ein sehr einheitliches und damit bezüglich der Datensätze meines Erachtens nach überzeugendes Bild mit beiden Methoden, obwohl die Unterstützung der Monophylie der Diplostraca (mit einer basalen Stellung der Laevicaudata innerhalb der Diplostraca) nur moderat ist. Morphologische Merkmale wie: 1. Embryonen verbunden mit der dorsalen Verlängerung des Exopoditen Olesen et al. (1996), 2. zweiklappiger Carapax Walossek (1993) und 3. Umbildung des ersten Thoracopodenpaars zum Klammerorgan Martin undBelk (1988); Olesen et al. Olesen et al. (1996) erhärten die Monophylie der Diplostraca, obwohl diese Merkmale bezüglich ihrer phylogenetischen Aussagekraft nach wie vor heftig umstritten sind Fryer (1999),Fryer (2001),Fryer (2002),Olesen (2000),Olesen (2002). Ein mögliches Schwestergruppenverhältnis der Laevicaudata zu den Spinicaudata (ohne C. hislopi) wie durch Negrea et al. Negrea et al. (1999) diskutiert, kann in keinem Fall bestätigt werden. Weitere molekulare Analysen Spears undAbele (2000) und der EF-1α Intronpositionen konnten bezüglich der Diplostraca keine überzeugende Unterstützung finden.
Die durchgeführten phylogenetischen Analysen zeigen für die vier Hauptgruppen der Cladocera (Anomopoda, Ctenopoda, Onychopoda und Haplopoda) übereinstimmend die Monophylie der Ctenopoda und (Haplopoda + Onychopoda) (Abbildung 13C). Die Anomopoda sind in fast allen Analysen paraphyletisch (Ausnahme: Abbildung 13B, wobei die gezeigte Monophylie nur schlecht unterstützt wird). Die Paraphylie wird jedoch aufgrund des unausgewogenen ``taxon samplings´´ als möglicherweise artifiziell bewertet (siehe Kapitel: 4.2). Innerhalb der Anomopoda werden die Daphniidae gut unterstützt. Bezüglich der Stellung von
Hingewiesen sei in diesem Zusammenhang auch auf das morphologische Merkmal „Vorhandensein eines Ephippiums“ als mögliche Synapomorphie der Cladoceromorpha. Innerhalb der Cladocera verfügen nur die Anomopoda über ein Ephippium. Cyclestheria hislopi verfügt über eine dem Ephippium ähnliche Struktur mit einer ähnlichen Funktion (Aufbewahrung der Eier), die Homologie zum Ephippium der Anomopoda ist jedoch höchst fraglich Roessler (1995). Inwiefern dieses Merkmal einem Grundmuster der Cladoceromorpha zuzuordnen wäre, hängt damit von einer gesicherten Homologie des Ephippiums von C. hislopi und den Anomopoda ab. Die Ctenopoda und Gymnomera besitzen kein Ephippium. Auf der Basis des hier gewonnenen Ergebnisses, nebst der Bestätigung durch Swain und Taylor Swain undTaylor (2003), einer basalen Stellung der Anomopoda innerhalb der Cladocera, muss das Vorhandensein eines Ephippiums innerhalb der Cladocera als plesiomorph bewertet werden. Damit kann das Fehlen eines Ephippiums als abgeleitetes Merkmal die Ctenopoda + Gymnomera vereinen.
Hier bedarf es sicherlich weiterer eingehener morphologischer und entwicklungsbiologischer Untersuchungen, um die Frage des Merkmalkomplexes „Ephippium“ zu klären.
Zusammenfassend wird auf der Basis der Analysen des kombinierten Datensatzes die Paraphylie der Conchostraca favorisiert durch 1. das Ausscheiden von C. hislopi aus dem Monophylum der Spinicaudata und 2. die Paraphylie von (Laevicaudata + Spinicaudata). Diese Paraphylie betrifft allerdings nicht die hier favorisierte Hypothese zur Monophylie der Diplostraca. Das Konzept der Diplostraca bedarf jedoch weiterer Reevaluierung, insbesondere mit neuen molekularen Datensätzen und auch unter Einbeziehung nicht analysierter Taxa der Laevicaudata wie Lynceiopsis und
Eine phylogenetische Bewertung der Verteilung spleiceosomaler Introns im Gen EF-1α kann nur über die Abschätzung plesiomorpher oder apomorpher Intronpositionen erfolgen. Um hier ein mögliches Evolutionsszenarium aufstellen zu können, ist es notwendig, vorhandene Literaturdaten über EF-1α Intronpositionen einzubeziehen. Wada et al. Wada et al. (2002) stellte eine detaillierte Analyse der Intronpositionen und deren mögliche Evolution innerhalb der Deuterostomia vor. Carapelli et al. Carapelli et al. (2000) untersuchten die phylogenetische Verteilung der Intronpositionen in den Diplura (Hexapoda). Desweiteren existieren Daten über die Lage zweier Introns in Hymenoptera Sanchis et al. (2001), Drosophila melanogaster (Diptera) Hovemann et al. (1988) und Caenorhabditis elegans (Nematoda) Wilson (1998). Abbildung 14 zeigt eine mögliche Evolution der Introns unter Berücksichtigung der vorhandenen Literaturdaten. Zu diesem Zweck wird die Verteilung der Introns anhand des in dieser Arbeit favorisierten Branchiopoda Stammbaums (Abbildung 11 und Abbildung 13D) diskutiert.
Demnach ergeben sich für Intron A zwei Möglichkeiten.
Unter der Annahme, Intron A ist spätestens an der Basis der Bilateria insertiert (Abbildung 14, links oben), würde dies bedeuten, dass das Intron innerhalb der Phyllopoda zweimal unabhängig voneinander verloren ging.
Intron A ging vor Abspaltung der Phyllopoda verloren, mit der Konsequenz der zweimaligen, unabhängigen Neuinserierung bei den Laevicaudata und Cladoceromorpha (Abbildung 14, oben rechts).
Daraus resultiert unter Zugrundelegung des Parsimonie Prinzips, dass die erste Hypothese aufgrund der geringeren Schrittzahl (2 gegenüber 3) Unterstützung findet.
Für Intronposition E ergeben sich ebenfalls zwei Möglichkeiten.
Intron E war bereits an der Basis der Metazoa oder Bilateria vorhanden. Die Konsequenz wäre der zweimalige Verlust innerhalb der Notostraca und innerhalb des Monophylums Spinicaudata (exclusive C. hislopi) + Cladoceromorpha (Abbildung 14, zweite Reihe links).
Intron E ist vor der Abspaltung der Phyllopoda verloren gegangen und müsste demnach zweimal unabhängig neu entstanden sein, bei den Anostraca und Laevicaudata (Abbildung 14, zweite Reihe rechts).
Die Existenz der Intronpositionen B, C und D wurde bislang nur innerhalb der Phyllopoda beobachtet, d. h. anhand des vorhandenen Datensatzes ist zu vermuten, dass es sich hier um Neuerwerbungen innerhalb der Phyllopoda handelt (Abbildung 14, dritte Reihe). Innerhalb der Cladocera zeigt die Verteilung der Introns C und D kein einheitliches Muster. Arten, wie z.B. Diaphanosoma und Ceriodaphnia müssen demnach unabhängig voneinander die für Cladocera typischen Introns (C und / oder D) verloren haben.
Da die Intronpositionen A und E offensichtlich plesiomorphen Ursprungs sind, scheiden sie für eine phylogenetische Betrachtung innerhalb der Branchiopoda aus. Intron B kann ebenfalls nicht in Betracht gezogen werden, da dies ein autapomorphes Merkmal der Notostraca zu sein scheint. Einzig Intronpositionen C und D lassen eine phylogenetische Aussage zu:
Das Schwestergruppenverhältnis von C. hislopi zu den Cladocera wird repräsentiert durch die Hypothese des Neuerwerbs eines Introns in Position C.
Die Monophylie der Cladocera wird gestützt durch den Neuerwerb des Introns D. Beide Hypothesen hätten demnach den mehrfach unabhängigen Verlust der Introns innerhalb der Monophyla zur Konsequenz.
In Abbildung 14B wird Gewinn und Verlust von Introns im Gen EF-1α zusammenfassend dargestellt. Introns A und E müssen während der Evolution der Phyllopoda zweimal unabhängig voneinander verloren gegangen sein, in der Linie zu den Notostraca und der Kronengruppe der Spinicaudata + Cladoceromorpha. Intron B ist einmalig in der Stammart der Notostraca inseriert. An der Basis der Cladoceromorpha ist eine Neuerwerbung (Intron C) zu beobachten. Intron C ist somit als eine Apomorphie der Cladoceromorpha aufzufassen. Intron D stellt wiederum eine Apomorphie der Cladocera dar. Dieses mögliche Szenarium umfasst sechs Schritte unter der Annahme, die Verluste der Introns A und E sind in den Notostraca als einmaliges Ereignis zu interpretieren. Die Annahme zweier voneinander unabhängigen Deletionen der fraglichen Introns würde die Schrittanzahl auf sieben Schritte erhöhen.
Die Datenlage für die Eukaryonten stellt sich folgendermaßen dar (SPAN database:
Die sicherlich mit zu den bekanntesten Vertretern der Krebse gehörenden Flusskrebse spielen als Forschungsobjekte in vielen zoologischen Diziplinen aber auch wirtschaftlich als Nahrungsmittel eine große Rolle Scholtz (1995).
Wie schon der englische Trivialname "freshwater crayfish" verrät, sind die Astacida i. d. R. süßwasserbewohnend. Die Astacida sind weltweit sowohl in der Nord- als auch in der Südhemisphäre verbreitet, wobei im tropischen Gürtel nahe des Äquators und interessanterweise auch auf dem afrikanischen Festland, sowie auf dem indischen Subkontinent keine Flusskrebse vorkommen.
Ein großer Teil des mitteleuropäischen Flusskrebsbestandes ist durch das Auftreten der Krebspest (erstmalig ca. 1860 im Bereich des Po, Italien) vernichtet worden. Der Erreger der Krebspest ist der Fadenpilz Informationen über die Krebspest sind der Internetseite der „Arbeitsgemeinschaft wirbellose Tiere der Binnengewässer“ (
Die Position der Astacida innerhalb der Reptantia (Decapoda)
Die Decapoda werden im klassischen Sinn geteilt in die Natantia (garnelenartige Crustaceen) und die Reptantia (z.B. Langusten, Hummer, Flusskrebse), wobei die Natantia paraphyletisch sind Scholtz undRichter (1995), die Reptantia als Monophylum hingegen akzeptiert sind Ax (1999).
Traditionellerweise werden die Astacida innerhalb der Repantia mit den Homarida in einem Monophylum Astacura vereinigt Gruner (1993). Scholtz und Richter Scholtz (1995) begründeten allerdings die Nicht-Monophylie der Astacura. Ihrer phylogenetischen Analyse zufolge sind die Homarida nicht näher mit den Astacida verwandt. Sämtliche morphologischen Übereinstimmungen beider Gruppe seien als plesiomorph zu bewerten. Dieser Analyse zufolge gehören die Flusskrebse zusammen mit den Thalassinida, Anomura und Brachyura zu der großen Gruppe der Fractosternalia
Molekulare Daten (18s, 16s und 28s rDNA) widersprechen dieser These und favorisieren die traditionelle Ansicht eines Schwestergruppenverhältnisses zwischen Astacida und Homarida Crandall et al. (2000).
Die Astacida werden in drei große Gruppen unterteilt: Die Astacidae und Cambaridae, die zu den Astacoidea zusammengefaßt werden und die Parastacoidea, die den Astacoidea gegenübergestellt werden Hobbs Jr. (1988).
Die Frage, ob die Astacida monophyletisch sind, wurde bislang kontrovers diskutiert. Aufgrund des Vorhandenseins von Gonopoden (Petasmata) bei den Astacoidea und des Fehlens der Petasmata bei den Parastacoidea wurde von einigen Autoren die unabhängige Entstehung der Astacoidea und Parastacoidea vertreten Huxley (1880),Smith (1912). Ortmann Ortmann (1897) hypothetisierte hingegen die Monophylie der Astacida. Auf der Basis einer phylogenetischen Analyse sensu Hennig von sowohl embryonalen - als auch Adultmerkmalen schlußfolgert Scholtz Scholtz (1993) ebenfalls die Monophylie der Astacida, wobei die Astacoidea die Schwestergruppe zu den Parastacoidea wären.
Die Astacoidea sind ausschließlich in der nördlichen Hemisphäre verbreitet, die Parastacoidea besiedeln die südliche Hemisphäre. Die auf der Nordhalbkugel lebenden Astacidae (z.Z. 12 anerkannte Arten) besiedeln Europa, Vorderasien und Nordamerika, westlich der Rocky Mountains. Die Cambaridae (ca. 200 Arten) leben im Osten und im Zentrum Nord- und Mittelamerikas und in Ostasien. Die Parastacidae auf der Südhalbkugel besiedeln Südamerika, Madagaskar, Neu-Guinea,
Die zwei großen Taxa innerhalb der Astacida (Astacoidea und Parastacoidea) bilden jeweils ein gut begründbares Monophylum. So besitzen die Astacoidea z.B rückwärtsgekrümmte Haken an den distalen Gliedern des ersten Pereiopoden in den ersten Juvenilstadien. Die Kiemen in den 6. und 7. Thoraxsegmenten sind bei den Astacoidea zu fädigen Anhängen reduziert. Die Parastacoidea tragen in den ersten beiden postembryonalen Stadien spezielle Haken an den Dactyli der 4. und 5. Pereiopoden um sich am Muttertier festzuhalten. Desweiteren ist der Hinterrand des Schwanzfächers nur schwach kalzifiziert und daher weich.
Innerhalb der Astacoidea werden die Cambaridae ebenfalls als gesichertes Monophylum betrachtet. Insbesondere die Ausbildung einer Spermathek (Annulus ventralis) bei den Weibchen, die bei den Astacidae fehlt, dient hierbei als Argument für die Monophylie der Cambaridae. Die Monophylie der Astacidae ist nicht gesichert zu begründen. Hier wird z.B. das Vorhandensein einer Borstenanlage rundum das Telson im ersten postembryonalen Stadium Holdich undReeve (1988) als mögliche Autapomorphie diskutiert.
In Verbindung mit der Phylogenie der Astacida stellt sich auch die Frage nach der einmaligen oder mehrmaligen unabhängigen Einwanderung in das Süßwasser. Die Tatsache, dass alle rezenten Astacida Süßwasserbewohner sind, legt den Schluss nahe, dass bereits die Stammart der Astacida in Süßgewässern lebte Scholtz (1995). Scholtz’ Ansicht zufolge deuten gemeinsame Merkmale der Astacida, wie z.B. das Fehlen der Zoealarve und das Anheften der Jungtiere mittels eines Telsonfadens als Schutz vor Verdriftung in Fließgewässern, auf eine Anpassung an Süß- bzw.
Vor dem Hintergrund der hier beschriebenen Probleme bezüglich der Radiation der Astacoidea gilt es zu klären, ob die Taxa Astacidae und Cambaridae monophyletisch oder möglicherweise paraphyletisch sind und in welcher verwandtschaftlichen Beziehung sie zueinander stehen.
Um einen Beitrag zur Klärung der verwandtschaftlichen Verhältnisse innerhalb der Astacoidea zu leisten, wurde von 13 Spezies (Astacoidea) und drei Spezies (Parastacoidea) das 12S rRNA Gen (3. Domäne) und das ebenfalls mitochondrial codierte Proteingen cox1 (hier allerdings nur eine Spezies der Parastacoidea) sequenziert.
Die phylogenetische Berechnung des 12S Gens wurde unter der zusätzlichen Verwendung von Sequenzen einiger weiterer Taxa der Parastacoidea aus der Datenbank durchgeführt.
Geocharax falcata Munasinghe et al. (2003), (AF492785)
Engaeus strictifrons Munasinghe et al. (2003), (AF492786)
Euastacus bispinosus Munasinghe et al. (2003), (AF492787)
Cherax quinquecarinatus, Haplotypus 4 Munasinghe et al. (2003), (AF492774)
Für das cox1-Alignment standen nur 14 Taxa zur Verfügung. Aus diesen Gründen wurde auch der kombinierte Datensatz auf der Basis von 14 Taxa berechnet.
Bilden die beiden Hauptgruppen der Astacidae und Cambaridae jeweils ein Monophylum?
Sollten die Astacidae paraphyletisch sein, in welcher phylogenetischen Beziehung stehen ihre Teiltaxa zu den Cambaridae und vice versa?
Wie kann ein mögliches Szenarium der Radiation der Astacoidea in der nördlichen Hemisphäre anhand der Ergebnisse beschrieben werden?
Welche phylogenetische Position nimmt der bislang nicht beschriebene Marmorkrebs innerhalb der Astacoidea ein?
Um das phylogenetische Signal der sequenzierten Bereiche des 12S Gens, cox1 und des kombinierten Datensatzes vorab zu testen, wurde die Methode des ``likelihood mappings´´ aus dem Programm Tree-Puzzle angewendet (siehe auch Kapitel: 2.2.7.5.6). Abbildung 17 zeigt jeweils einen Plot der Verteilung der P-Vektoren und die prozentuale Auswertung für die Bereiche innerhalb des Dreiecks. In Abbildung 17A ist das Ergebnis des 12S rRNA Datensatzes für 20 Taxa dargestellt. Der Anteil an nicht aufgelösten Quartetten im Zentrum ist mit 12,5% mäßig. Die prozentualen Anteile für eine „Baumhaftigkeit“ sind dagegen recht hoch (Eckpunkte des Dreiecks, insgesamt 83,4%). Für das cox1 Gen (14 Taxa) wurde die Auswertung zunächst für alle Codonpositionen durchgeführt und im weiteren nur für die erste und zweite Triplettpositionen (Abbildung 17B). Die Betrachtung aller Codonpositionen (obere Abbildung 17B) resultiert in einem Ergebnis, dass dem der 12S Berechnung sehr ähnlich ist. Auch hier ist der Anteil der nicht aufgelösten Topologien mäßig, während die prozentualen Anteile der Eckbereiche relativ hoch ist (insgesamt 81,3%). Die Eliminierung der dritten Codonposition (untere Abbildung 17B) resultiert dagegen in einem sprunghaften Ansteigen der unaufgelösten Quartette und legt den Schluß nahe, dass das phylogenetische Signal relativ gering ist. Eine entsprechende phylogenetische Analyse würde einen sehr hohen Anteil an Polytomien aufweisen. Für den kombinierten Datensatz von ebenfalls 14 Taxa liegen daher alle Positionen des cox1 Gens, sowie der 12S zugrunde (Abbildung 17C). Der Anteil der vollständig aufgelösten Topologien erhöht sich auf 84.5%. Der Anteil der nicht aufgelösten Topologien verringert sich auf 11.6%, was sicherlich auch mit der höheren Anzahl an Alignmentpositionen zusammenhängt Strimmer undvon Haeseler (1997). Der relativ hohe Anteil an aufgelösten Topologien lässt vermuten, dass viele Dichotomien mit einer recht hohen Unterstützung bewertet werden. Für die folgende phylogenetische Analyse des cox1 Datensatzes liegen aufgrund des Ergebnisses des ``likelihood mappings´´ alle Codonpositionen zugrunde.
Das in Clustal X unter „default“ Optionen erstellte Alignment weist verhältnismäßig wenig ``gaps´´ auf (insgesamt elf ``gaps´´ in den kürzesten Sequenzen). Nach einem entsprechenden Vergleich des Alignments mit dem Sekundärstrukturmodell für Artemia (Abbildung 5) stellte sich heraus, dass
Für die Maximum Likelihood Berechnung erwies sich das Modell HKY+Γ4 als adäquat. Die Annahmen anderer Modelle resultierten in jeweils geringfügig, nicht signifikant niedrigeren Likelihood Werten. In Abbildung 18 ist das Resultat der 12S rRNA Analyse dargestellt. (A) zeigt den ``50% majority rule consensus´´ Baum (logL –1812.87) aus insgesamt 988 errechneten Topologien. Diese Topologien wurden einem K-H-Test unterzogen. Dabei zeigte sich, dass lediglich ca. 25% aller Topologien schlechter als die beste Topologie sind, d.h. der erstellte Consensusbaum ergibt sich aus der besten (logL –1802.99) und einem Großteil der nicht signifikant schlechteren Topologien. Abbildung 18B zeigt das ``most parsimonious´´ Cladogramm mit 331 Schritten. Es wurde keine Gewichtung der Positionen angenommen.
Beide Cladogramme sind im wesentlichen kongruent. Weder das Taxon Cambaridae noch das Taxon Astacidae wird als monophyletisch unterstützt. Monophyletisch hingegen erscheinen die Cambaridae aus Nordostamerika, die in Europa lebenden Astacidae und die asiatische Gattung Cambaroides. In beiden Analysen wird die asiatische Gattung Cambaroides als basales Taxon mit guter Unterstützung angenommen, während die nordamerikanischen Cambaridae das Schwestertaxon der europäischen Astacidae bilden. Überraschend ist die Stellung der westamerikanischen Spezies Pacifastacus leniusculus (Astacidae). In beiden Analysen bildet sie ein Schwestergruppenverhältnis zu den amerikanischen Cambaridae. Dieses Monophylum wird aber nur mäßig (QP 62%) bis schlecht (BA <50%) unterstützt.
Um die Möglichkeit des Phänomens der ``long branch attraction´´ von P. leniusculus zu den Cambaridae zu überprüfen, wurde eine entsprechende phylogenetische Analyse ohne P. leniusculus durchgeführt. Das Resultat ergibt, dass eine eventuell artifizielle Aufspaltung dieses Taxons keinen Einfluss auf das Schwestergruppenverhältnis der amerikanischen Cambaridae zu den europäischen Astacidae hat (nicht gezeigt).
Der einzige Unterschied in beiden hier gezeigten Analysen betrifft die Verhältnisse innerhalb der Cambaroides. Diese sind in der Parsimonie Analyse vollständig aufgelöst, wenn auch ohne nennenswerte Unterstützung. Im Maximum Likelihood Dendrogramm werden die verwandtschaftlichen Verhältnisse dagegen nicht aufgelöst.
Für diese Berechnung werden die hier generierten Daten für 14 Taxa verwendet. Als Außengruppe wird Astacopsis franklini (Parastacoidea) eingesetzt. Das erstellte Nukleotidalignment (Clustal X) weist keine Ambiguitäten auf und hat eine Länge von 423 Positionen. Aufgrund des ``likelihood mapping´´ Ergebnisses wurden den Analysen alle Codonpositionen zugrunde gelegt. Abbildung 19 zeigt (A) den Quartett Puzzle-Stammbaum (´´50% majority rule consensus´´, logL –2172.60) aus 448 getesteten Topologien (13% aller Topologien sind signifikant schlechter als die beste ML Topologie mit logL -2159.46). Der Unterschied zur besten Topologie besteht in der Stellung von Orconectes limosus. Diese Spezies stellt in der ``best ML´´ Topologie das basale Taxon der amerikanischen Cambaridae dar. Der hier gezeigten ML Berechnung ist das ``most parsimonious´´ Cladogramm mit 383 Schritten gegenübergestellt (Abbildung 19B).
Das Ergebnis zeigt Inkongruenz bezüglich der Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb der Haupttaxa Cambaroides, amerikanische Cambaridae und Astacidae. Deutlich unterstützt ist jedoch auch in diesem Ergebnis ein Monophylum der amerikanischen Cambaridae mit den Astacidae (QP 98%, BA 82%). Innerhalb dieses Monophylums werden die amerikanischen Cambaridae relativ hoch unterstützt (Abbildung 19B), dieses Ergebnis wird jedoch nicht durch die Maximum Likelihood Analyse bestätigt. Ähnliches gilt für die Astacidae. Während die Parsimonie Analyse ein Monophylum favorisiert (niedrige Unterstützung; BA <50%), ist das Taxon in der Maximum Likelihood Analyse nicht aufgelöst. Beide Analysen zeigen die asiatischen Cambaridae paraphyletisch, basal zum Monophylum der amerikanischen Cambaridae + Astacidae, wobei die Verhältnisse innerhalb von Cambaroides unklar bleiben. Lediglich die Spezies der Cambaroides des asiatischen Festlandes (C. dauricus, C. schrenckii) inklusive der Halbinsel Korea (C. similis) werden im Puzzle- Stammbaum als Monophylum hoch gestützt (QP 93%). Die japanische Spezies Cambaroides japonicus befindet sich hier nicht innerhalb der Innengruppe. In der Parsimonie Analyse ist C. japonicus innerhalb der Astacoidea, aber zu allen übrigen paraphyletisch erscheinenden Cambaroides das basalste Taxon.
Verglichen mit der Analyse des 12S Datensatzes zeigt aber auch die phylogenetische Auswertung der cox1 Berechnung die gleiche relative Lage der Haupttaxa zueinander (Cambaroides (amerikanische Cambaridae + Astacidae)).
Die Maximum Likelihood- und Parsimonie Analyse des kombinierten Datensatzes, bestehend aus 681 Positionen, ist in Abbildung 20 dargestellt. Als Außengruppe wurde Astacopsis franklini (Parastacoidea) berücksichtigt, da nur für diese Spezies beide Gene sequenziert wurden. (A) zeigt wiederum den Quartet- Puzzle- Stammbaum (``50% majority rule´´) aus 223 getesteten Topologien, wobei sich lediglich 18% als signifikant schlechter erwiesen.
Mit einer Ausnahme (C. japonicus) sind beide Analysen kongruent und bestätigen die zuvor gezeigte Paraphylie der Cambaridae (amerikanische Cambaridae und Cambaroides) und die Paraphylie der Astacidae. Auch hier bilden die amerikanischen Cambaridae und die europäischen Astacidae ein Schwestergruppenverhältnis, wobei die nordwestamerikanische Spezies Pacifastacus leniusculus Schwestertaxon der amerikanischen Cambaridae ist und insofern eine Nicht-Monophylie der Astacidae begründet. Ein Monophylum der asiatischen Cambaridae (Cambaroides) wird ebenfalls im Parsimonie Cladogramm nicht unterstützt mit ( Cambaroides-Festland) C. japonicus).
Die phylogenetische Berechnungen der Gene 12S rRNA, cox1 und des kombinierten Datensatzes zeigen übereinstimmend die Paraphylie der Cambaridae (amerikanische Cambaridae + Cambaroides). Mit Ausnahme in der cox1 Analyse wird des weiteren P. leniusculus als Schwestertaxon zu den amerikanischen Cambaridae favorisiert. Damit wären auch die Astacidae paraphyletisch. Um diese den klassischen Hypothesen widersprechenden Ergebnisse zu überprüfen, wird mittels der ``likelihood mapping´´ Methode Strimmer undvon Haeseler (1997) anhand des kombinierten Datensatzes getestet, inwieweit die Resultate der Hypothesentests (in ihrer Eindeutigkeit) die Ergebnisse der Stammbäume reflektieren oder aber Ausdruck eines hohen
Hypothese A: Hier wurden die Parastacoidea, amerikanischen Cambaridae, asiatischen Cambaroides und die Astacidae (inclusive P. leniusculus) jeweils als Monophylum postuliert. Das Ergebnis zeigt eindeutig 100% ige Unterstützung einer Schwestergruppenbeziehung amerikanischer Cambaridae zu Astacidae.
Hypothese B: Die Cluster wurden, wie in Hypothese A beschrieben, gesetzt, mit dem Unterschied, dass P.leniusculus den amerikanischen Cambaridae zugeordnet wurde. Das Ergebnis ist identisch mit dem oben beschriebenen Resultat.
Aus den Ergebnissen von A und B wird ersichtlich, dass die Zuordnung von P. leniusculus (einmal zu den Astacidae und im anderen Fall zu den amerikanischen Cambaridae) keinen Einfluß auf das nähere Verwandtschaftsverhältnis der amerikanischen Cambaridae zu den Astacidae hat.
Hypothese C: In dieser Analyse wurden die Astacidae (A), die amerikanischen Cambaridae (C) und die asiatischen Cambaroides (D) jeweils als Monophylum definiert und P.leniusculus als einzige Spezies dem Cluster B zugeordnet. Das Resultat spiegelt die in der phylogenetischen Analyse gezeigten Verwandtschaftsbeziehungen der amerikanischen Cambaridae zu P.leniusculus wieder (72%). Erstaunlich ist hier, dass ein Schwestergruppenverhältnis der Astacidae zu P.leniusculus gar keine Unterstützung erfährt, der hohe prozentuale Wert im Zentrum (25%) allerdings deutlich den hohen Grad an Homoplasie von P. leniusculus zu den übrigen Astacoidea aufzeigt.
Dieser bezüglich seines phylogenetischen Ursprungs unbekannte Flusskrebs wurde in allen phylogenetischen Analysen der Flusskrebse mit einbezogen. Unabhängig vom Datensatz und der Berechnungsmethode ist der Mamorkrebs in allen gezeigten Cladogrammen das Schwestertaxon zu Procambarus fallax und gehört somit dem Taxon der amerikanischen Cambaridae an. Das Ergebnis wird jeweils mit hohen ``bootstrap´´- bzw. QP-Werten unterstützt.Bezogen auf den kompletten Datensatz (cox1 + 12S rRNA) differieren nur 2,2% der Nukleotide zwischen den beiden Arten Scholtz et al. (2003). Das Resultat dieser Untersuchung steht somit im Einklang mit morphologischen Ergebnissen.
Um einen Beitrag zur Phylogenie der Astacoidea zu leisten, wurden Ausschnitte der beiden mitochondrialen Gene der kleinen ribosomalen Untereinheit 12S rRNA und cox1 von 13 Taxa der Innengruppe Astacoidea und drei Taxa (12S) bzw. einem Taxon (cox1) der Aussengruppe der Parastacoidea sequenziert. Die daraus resultierenden Alignments wurden mit Parsimonie- und Maximum Likelihood Verfahren als Einzelanalysen und einer kombinierten Analyse zur Rekonstruktion der Phylogenien herangezogen.
Der Großteil aller hier durchgeführten Analysen zeigen die Nicht-Monophylie der Cambaridae und der Astacidae, wobei die Gattung Cambaroides (Asien) die Schwestergruppe zu einem Monophylum bestehend aus Cambaridae (Amerika) und den polyphyletischen Astacidae (Nordwest-Amerika und Europa) bilden. Innerhalb des letztgenannten Monophylums bilden die Pacifastacidae die Schwestergruppe zu den amerikanischen Cambaridae. Dieses Monophylum stellt im weiteren das Schwestertaxon zu den monophyletischen europäischen Astacidae dar. Die nähere Verwandtschaft der amerikanischen Cambaridae zu den Astacidae und die basale Stellung der Cambaroides wird in allen Analysen hoch unterstützt und gewinnt dadurch an Glaubwürdigkeit. Andererseits steht das Ergebnis dieser Analysen im eklatanten Widerspruch zu den Ansichten der klassischen Systematik, die zweifelsfrei von der Monophylie der Cambaridae ausgehen Fitzpatrick Jr. (1995),Scholtz (1998),Scholtz (1999),Scholtz (2002). Wenig widersprüchlich erscheint dieses Ergebnis allerdings zu den bereits publizierten molekularen Daten zu sein: Ein kombinierter Datensatz aus 16S, 28S und 18S Daten suggeriert ebenfalls die Nicht-Monophylie der Cambaridae und Astacidae Crandall et al. (2000). Andererseits ist die genaue Topologie dieser Analyse schwer zu bewerten, da das ``taxon sampling´´ innerhalb von Cambaroides und Pacifastacidae (mit jeweils nur einer Spezies repräsentiert) sehr restriktiv ist. Eine Analyse, ausschließlich basierend auf 18S rDNA Daten der gleichen Autoren, unterstützt wiederum die Monophylie der asiatischen und amerikanischen Cambaridae (allerdings mit einem ``bootstrap´´ Wert von unter 50%).
In der vorliegenden Analyse ist das ``taxon sampling´´ von Cambaroides wesentlich umfangreicher, sodass auch aus diesem Grund die daraus resultierende stabile Stellung der Gruppe relativ zu den
Im Licht zweier konkurierender Hypothesen werden im folgenden sowohl morphologische Merkmale als auch zoogeographischen Verbreitungsmuster diskutiert (Abbildung 22).
Das hier vorliegende Resultat hat weitreichende Konsequenzen für ein mögliches Evolutionsszenarium der aufgeführten Merkmale innerhalb der Astacoidea. Die Haken am Ischium der Männchen, die ausgebildete Spermienfurche und das Vorhandensein eines Annulus ventralis werden als abgeleitete Merkmale diskutiert, die die Cambaridae zu einem Monophylum vereinen und den Astacidae, die diese Merkmale nicht aufweisen als Schwestergruppe gegenüberstellt (Hypothese 1).
Durch die gezeigten molekularen Studien (Hypothese 2) muß allerdings die Paraphylie der Cambaridae, mit einer basalen Stellung der Cambaroides der ersten Hypothese gegenübergestellt werden. Dies impliziert die möglicherweise plesiomorphe Natur oben genannter Merkmale, die dann einmal (bei einer Monophylie der Astacidae) oder mehrmals unabhängig voneinander (im Fall ihrer Nicht-Monophylie) verlorengegangen sein könnten.
Beide Hypothesen sind innerhalb der Astacoidea für jedes betrachtete Merkmal gleich sparsam, sofern man von einer Monophylie der Astacidae ausgeht. Eine Nicht-Monophylie der Astacidae würde eine weniger sparsame Lösung nach sich ziehen.
Zwei der drei Merkmale beziehen sich direkt auf den Reproduktionsapparat der Cambaridae, der Annulus ventralis der Weibchen und dazu passend die Spermienfurche der Männchen, wobei beide Strukturen offensichtlich als unabhängige Merkmale in die phylogenetischen Betrachtungen eingehen. Beide Merkmale sind in dieser strukturellen Ausprägung bei den Männchen und Weibchen der Astacidae nicht vorhanden. Die Spermienpakete werden in dieser Gruppe ventral verteilt auf dem Sternum abgelegt. Es stellt sich hier also die Frage, in wieweit diese beiden Merkmale tatsächlich voneinander unabhängig sind: Geht der Annulus ventralis der Weibchen verloren, wozu benötigt das Männchen eine hochspezialisierte Samenfurche oder vice versa? Ein in der Qualität ähnliches Szenarium wäre für Merkmal 1 denkbar. Die Haken der Männchen zum Fixieren der Weibchen während der Kopulation könnten bei den Astacidae möglicherweise überflüssig sein, da sicherlich anzunehmen ist, dass das zufällig verteilte, ventrale Aufbringen der Spermapakete einfacher und schneller zu vollziehen ist, als dass gezielte Einbringen in den Annulus ventralis. Unter der Annahme einer gegenseitigen Abhängigkeit der genannten Merkmale (mit anderen Worten ein deutlich niedrigerer Selektionsdruck für die Beibehaltung von zwei der drei Merkmale) erscheint der Verlust dieser Merkmale bei den Astacidae weniger dramatisch und damit denkbar.
Die oben angeführten Lösungen gehen von der Homologie der genannten Merkmale innerhalb der Astacoidea aus. Diese Homologie ist allerdings keinesfalls für jedes Merkmal gesichert. Der Annulus ventralis der Cambaroides ist beispielsweise wesentlich einfacher („urtümlich erscheinend“) aufgebaut, als der der amerikanischen Cambaridae. Einer phylogenetischen Analyse fossiler und rezenter Arten zufolge Rode undBabcock (2003) sind die Cambaroides ebenfalls nicht näher verwandt mit den amerikanischen Cambaridae. In dieser Studie bilden die Cambaroides (vertreten durch eine Spezies) ein Schwestergruppenverhältnis zu den Astacidae. Dies impliziert, dass der Annulus ventralis auch konvergent entstanden sein könnte und damit keine Argumentationsgrundlage für die phylogenetischen Beziehungen der Astacoidea bietet. Selbiges kann für die Ischiumhacken der
Die Rekonstruktion einer Phylogenie erlaubt es, in Verbindung mit den Erkenntnissen der Geographie zur Kontinentaldrift, vorläufige Hypothesen der zoogeographischen Verteilung der Astacoidea aufzustellen und zu diskutieren.
Die Monophylie aller Flusskrebse begründet sich nach Scholtz Scholtz (1995) neben einigen Adultmerkmalen auch auf einer ganzen Reihe von embryologischen Merkmalen (z.B. die an Anzahl variablen Ektoteloblasten oder die direkte Entwicklung, d.h. das Fehlen einer für die marinen Reptantia typischen Zoealarve) und der typischen Brutpflege des Muttertieres, wie die Verankerung des ersten postembryonalen Stadiums an den Pleopoden der Mutter mit Hilfe eines Telsonfadens. Dieser Telsonfaden dient dem Verdriftungsschutz der Jungen. Die hier nur im Ansatz aufgeführten apomorphen Merkmalskomplexe der Embryonal- und Juvenilentwicklungen gelten allgemein als Anpassungen an Süß- und Fließgewässer und führen Scholtz Scholtz (1995) begründet zu der Annahme, dass bereits die Stammart der Kronen-Astacida die marinen Habitate verlassen haben muß. Das wiederum zieht die Konsequenz einer kontinentalen Besiedlung zu Zeiten des „Superkontinentes“ Pangea (Trias vor ca. 200 Mill. Jahren und früher) nach sich. Nach dem Zerfall des Kontinentes in Laurasia und Gondwana während der Jurazeit (vor ca. 190-135 Mill.Jahren) haben sich demnach die heutigen Unterschiede zwischen den auf der Südhalbkugel lebenden Parastacoidea und den auf der Nordhalbkugel verbreiteten Astacoidea herausgebildet Scholtz (1995).
Für die phylogenetische Analyse wurden nur einige Parastacoidea (Australien und Neuseeland) als Außengruppe verwendet, daher können die Interpretationsprobleme der Verbreitungsmuster südlich des Äquators (z.B. das vollständige Fehlen von Flusskrebsen auf dem afrikanischen Festland, siehe auch Kapitel: 3.2.1) in diesem Rahmen nicht weiter thematisiert werden. Die vorliegenden Analysen
Ausgehend von der klassischen Vorstellung der Monophylie der Cambaridae Hobbs Jr. (1988) und einer Monophylie der Astacidae erscheint die holarktische Verbreitung der Astacoidea disjunctiv (Abbildung 16): Es gibt ausschließlich in Ostasien und in Nordostamerika Spezies der Cambaridae. Die Vorkommen der Astacidae beschränken sich dagegen auf den europäischen und den nordwestamerikanischen Bereich. Scholtz Scholtz (1993),Scholtz (1995),Scholtz (1999) kommt demzufolge zu dem Ergebnis, die Astacidae könnten ihren Ursprung in einer nördlichen Region Laurasiens genommen haben und die Cambaridae in einer südlich angesiedelten Population. Die heute eher nördliche Besiedlung der Astacidae und die tropische bis subtropische Ausbreitung der Cambaridae spricht für diese Annahme. Nach dem Zerfall von Laurasia müssen demzufolge Radiationen der Astacidae vorwiegend im europäischen-westasiatischen Bereich erfolgt sein, während die Cambaridae ihre Radiation vorwiegend im nordostamerikanischen Bereich erfuhren. Die rezenten Vertreter der ostasiatischen Cambaroides und die nordwestamerikanischen Astacidae wären demnach als Reliktpopulationen, durch Gebirgszüge isoliert, zu interpretieren. Eine ähnliche Auffassung vertritt auch Schram Schram (2001), datiert die Radiation jedoch in die frühe Trias (237 Mill. Jahre) zu Zeiten Pangeas und entwirft, ebenfalls ausgehend von der Monophylie der Cambaridae und Astacidae, eine subtropische-nördlich gemäßigte Radiation der Astacidae ausgehend vom heutigen Nordwest-Amerika Richtung dem heutigen Europa. Eine weiter südlich gelegene tropische-subtropische Radiation ausgehend vom heutigen Süden Nord-Amerikas entlang der nördlichen Küste der Paleo-Tethys See bis zum heutigen ostasiatischen Raum würde die Verteilung der Cambaridae erklären.
Die hier vorgestellte Hypothese der verwandtschaftlichen Beziehungen der Haupttaxa der Astacoidea geht im folgenden von einer Paraphylie der Cambaridae und einem Schwestergruppenverhältnis der Astacidae zu den amerikanischen Cambaridae aus. Bezüglich der zoogeographischen Verteilung müsste die Radiation ihren Ursprung im asiatischen Raum genommen haben und sich entlang der Nordküste der Thethys See Richtung europäischen Raum ausgeweitet haben. Von Europa aus könnte die weitere Verbreitung über die transatlantische Landbrücke vor ca. 70-45 Millionen Jahren stattgefunden haben. Diese Landbrücke verband den westpaleoarktischen Raum mit dem ostnearktischen Raum (Grönland) über die protobritischen Inseln. Letzteres würde die nähere Beziehung der Astacidae zu den amerikanischen Cambaridae erklären.
Die Hypothese eines Radiationsursprunges der Cambaroides in Ostasien mit einer weiteren Verbreitung westwärts wird ebenfalls von mehreren Autoren vertreten Scholtz (2002).
Aufgrund der unklaren Stellung der Gattung Pacifastacus wäre eine Aussage über den weiteren Radiationsverlauf der amerikanischen Cambaridae und Pacifastacus leniusculus höchst spekulativ. Sanmartin et al. Sanmartín et al. (2001) vermuten derartige Radiationsereignisse in einem Zeitraum vor weniger als 20 Millionen Jahren, d.h. lange nach Schließung des Midcontinentalen Seeweges. Würde sich ein derartiges Schwestergruppenverhältnis bestätigen, wäre dieses Ereignis im Radiationsverlauf der Astacoidea vermutlich das jüngste.
Die einfache Hälterung und die Gewährleistung ausreichend großer Populationen bedingt durch die parthenogenetische Reproduktion machen den Marmorkrebs zu einem geeigneten Modellorganismus für unterschiedliche biologische Disziplinen. Andererseits könnte der Marmorkrebs aufgrund seiner hohen Reproduktionsrate eine erhebliche Gefahr für natürliche Biotope sein, im Fall eines bewussten oder unbewussten Einbringens von nur einem Individuum Scholtz et al. (2003). Die Eingangs bereits erwähnte Krebspest (siehe Kapitel: 3.2.1), die auch heute noch immer wieder einzelne Populationen europäischer Astacidae extrem gefährden kann, macht das ökologische Gefahrenpotential deutlich. Vor diesem Hintergrund erscheint es besonders wichtig, die Herkunft dieses nur aus dem deutschen Aquarienhandel bekannten Flusskrebses zu untersuchen. Um ein Verwandtschaftsverhältnis des Marmorkrebses einzugrenzen, wurden die generierten Daten der 12S rDNA und des cox1 Gens mit in die phylogenetischen Analysen aufgenommen. Das Ergebnis verdeutlicht zweifelsfrei eine nahe Verwandtschaft des Marmorkrebses zur nordostamerikanischen Spezies Procambarus fallax (Cambaridae), beheimatet in Florida. Der auffallend ähnliche Habitus zu P. fallax und das Vorhandensein eines Annulus ventralis bestätigt das Ergebnis. Dennoch bleibt die wahre Identität des Mamorkrebses ungelöst. Insgesamt wurden nur 2,2% unterschiedliche Nukleotidpositionen zu P. fallax im kombinierten Alignment gefunden. Aufgrund der geringen Substitutionsrate ist nicht auszuschließen, dass es sich hierbei tatsächlich um die Art P. fallax handelt und die wenigen Austausche auf eine innerartliche Variabilität zurückzuführen ist. Diese Möglichkeit kann aber nur in ausgeweiteten populationsgenetischen Untersuchungen getestet werden Fetzner undCrandall (2002).
Die eindeutige Identifizierung des Marmorkrebses als ein Vertreter der Cambaridae, seine parthenogenetische Reproduktionsweise und die sorglose kommerzielle Verbreitung in Deutschland macht die Gefahr für hiesige Süßwasserökosysteme deutlich. Als eine amerikanische Spezies der Cambaridae ist der Marmorkrebs in jedem Fall als potentieller Überträger des Pilzes Aphanomyces astaci ernstzunehmen und kann damit einheimische Bestände gefährden. Desweiteren stellt die hohe parthenogenetische Reproduktionsrate ein nachhaltiges Problem resultierend aus der Hobbyaquaristik dar, wenn bedingt durch falsch verstandene Tierliebe überschüssige Nachkommen in europäische Biotope entlassen werden.
Zu Beginn einer phylogenetischen Arbeit steht die Wahl der zu bearbeitenden Merkmale, die eine möglichst hohe widerspruchsfreie Auflösung innerhalb der fraglichen Organismengruppe zulassen.
Eine konkrete Einschätzung des phylogenetischen Signals eines gewählten Gens oder DNA Abschnittes vor dem eigentlichen Beginn der Datenerhebung ist nur bedingt möglich. Dies ist natürlich vom Umfang der bereits vorhandenen Sequenzeinträge für ähnliche taxonomische Einheiten in den Genbanken abhängig.
Zu Beginn dieser Arbeit waren für die Crustacea die Sequenzen lediglich zweier mitochondrialer Genome (Artemia franciscana und Daphnia pulex) in der Datenbank verfügbar. Aufgrund der hohen morphologischen Diversität innerhalb der Phyllopoda, speziell innerhalb der Cladocera, fiel hier zunächst die Wahl auf die ribosomale 12S rRNA, die i. a. wegen ihrer sehr variablen Bereiche für relativ niedrige taxonomische Ebenen als tauglich bewertet wird. Um den zusätzlichen sehr alten Splits der Branchiopoda (z.B. Spinicaudata|Cladocera) Rechnung zu tragen, wurde die dritte Domäne, bekannt als innerhalb der 12S konservierteste Domäne, gewählt. Bezüglich der Phylogenese innerhalb der Phyllopoda ergab sich selbst bei denen als sehr alt einzuschätzenden Aufspaltungen eine recht zufriedenstellende Auflösung. Um über die phylogenetisch noch älteren Aufspaltungen plausible Aussagen treffen zu können (z.B. Notostraca|Diplostraca), versprach zunächst das sehr konservierte, proteincodierende Gen EF-1α ein geeigneter Kandidat zu sein. Die Analyse des generierten EF-1α Datensatzes (siehe Kapitel: 3.1.2.7) erlaubten zwar keine eindeutigen Aussagen bezüglich der Spinicaudata-Cladocera Beziehungen, die Paraphylie der Spinicaudata mit einer höheren Affinität von C. hislopi zu den Cladocera zeigte sich aber auch hier. Es erwies sich daher als zweckmäßig die Datensätze zu kombinieren. Die Kongruenz der ML- und MP Ergebnisse des kombinierten Datensatzes lässt darauf schließen, dass sich beide Genbereiche bezüglich ihrer Homoplasieeffekte gegenseitig kompensieren.
Für die Astacida kam neben dem mitochondrialen 12S rRNA Gen auch das ebenfalls mitochondrial codierte cox1 Gen zum Einsatz. Hier zeigte sich der 12S Datensatz eindeutig als überlegen dem cox1 Datensatz, insbesondere bezüglich der Auflösung innerhalb der europäischen Astacidae und der amerikanischen Cambaridae. Der erheblich höhere Konservierungsgrad des cox1 Gens verursacht besonders bei diesen Aufspaltungsereignissen Polytomien. Auch hier zeigt die Kombination der Datensätze im Vergleich zu den Einzelanalysen weitgehend kongruente ML-und MP Ergebnisse.
Unzureichendes ``taxon sampling´´ wird häufig als Fehlerquelle für Missinterpretationen phylogenetischer Analysen angesehen Johnson (2001),Murphy et al. (2001). In einer experimentellen Studie zur Phylogenie eines Taxons sollten die gewählten Spezies Repräsentanten jeder Teilgruppe darstellen (``stratified sampling´´, Hillis (1998)). Dieser Empfehlung konnte bezüglich der zu erörternden Fragestellungen innerhalb der Phyllopoda und Astacoidea im großen und ganzen nachgekommen werden, sodass eine Aussage über die Beziehungen der Hauptgruppen zueinander möglich wurde.
Innerhalb der Cladocera weist der Probenumfang bei den Anomopoda ein Ungleichgewicht auf. Aus den Teilgruppen Chydoridae, Macrothricidae konnten nur einige wenige Spezies berücksichtigt werden. Daher kann keine zuverlässige Aussage über die Stellung der Anomopoda innerhalb der Cladocera getroffen werden (siehe unten). Ähnlich kritisch ist das ``taxon sampling´´ in einer Teilgruppe der Flusskrebse zu bewerten. Von dem westamerikanischen Taxon Pacifastacidae (fünf Spezies bekannt) stand nur eine Species (Pacifastacus leniusculus) zur Verfügung. Es hat sich zwar einerseits gezeigt, dass die Eliminierung von P. leniusculus aus dem Datensatz keinen Einfluß auf die nähere Verwandtschaft von amerikanischen Cambaridae zu europäischen Astacidae hat, andererseits muß eine mögliche Nicht-Monophylie der Astacidae Scholtz (1999) auf der Basis dieser Datensätze kritisch bewertet werden.
Die Anzahl der Merkmale, die zur Analyse der jeweils kombinierten Datensätze eingesetzt wurden, sind ausreichend. Inkongruenzen, resultierend aus den Einzelanalysen der Datensätze mit beiden Rechenverfahren, werden in der Regel aufgelöst, legt man die kombinierten Datensätze zugrunde. Obwohl generelle Übereinstimmung darüber besteht, dass die Betrachtung möglichst vieler Taxa eine phylogenetische Analyse stark verbessert Graybeal (1998),Hillis et al. (2003),Lecointre et al. (1993),Poe (1998),Zwickl undHillis (2002) muß dies immer im Zusammenhang mit der Anzahl der betrachteten Merkmale stehen. Wie Graybeal Graybeal (1998) in einer Simulation zeigen konnte, nimmt die Präzision der Analyse stark ab, wenn die Anzahl der Merkmale zu gering ist. Darüber hinaus wird von einigen Autoren die Beobachtung gemacht, dass die Länge der Datenmatrix einen höheren Einfluß auf die Präzision einer phylogenetischen Berechnung haben kann als die Anzahl der Taxa. Poe undSwofford (1999),Rosenberg undKumar (2003). Die Abhängigkeit der Analysequalität von Taxonanzahl und Länge des Datensatzes zeigt sich auch in dieser Studie in der kombinierten Analyse der Phyllopoda (Abbildung 11). Bei einer Merkmalsanzahl von 1036 konnte mit einer erheblich reduzierten Anzahl an Taxa ein einheitliches Ergebnis erzielt werden. Im umgekehrten Fall der 12S Analyse mit nur 408 bzw. 465 Merkmalen und 41 Taxa konnte eine kongruente ML-und MP Aussage nicht für alle Teiltaxa erzielt werden (Abbildung 4 und Abbildung 8).
Zu einer ausreichend gesicherten Hypothese der Phylogenese der Crustacea kann keine Aussage gemacht werden. Dies liegt sicherlich daran, dass nach wie vor Teiltaxa wie Remipedia, Cephalocarida, weitere Maxillopoda (z.B. Ostracoda, nach der Klassifikation von Brusca und Brusca Brusca undBrusca (1990) ein Teiltaxon der Maxillopoda) und auch eher basal stehende Malacostraca aufgrund fehlender Daten nicht berücksichtigt werden konnten. Daher erscheint die hier gezeigte Nicht-Monophylie der Crustacea relativ zu allen weiteren Arthropodataxa fragwürdig (siehe Kapitel: 3.1.2.1 und Abbildung 2). Um sichere Aussagen zu erhalten, ist sicherlich die Sequenzierung einerseits sehr basaler und andererseits langsam evolvierender Taxa der Crustacea erforderlich. Auf diese Weise können ``long branch´´ Effekte aufgehoben werden Graybeal (1998),Hendy undPenny (1989),Rosenberg undKumar (2001),Rosenberg undKumar (2003). Dies dürfte die bestehenden Hypothesen über die Teiltaxa der Arthropoda (Mandibulata-Tetraconata) eher beeinflussen als die Vergrößerung des Artenumfanges bereits ausreichend repräsentierter Teiltaxa.
Beide Berechnungsmethoden lassen keine zuverlässige Aussage über die Stellung der Copepoda (Maxillopoda) innerhalb der Crustacea zu. Darüber hinaus wird die durch T. japonicus gezeigte Polyphylie der Crustacea in der Parsimonie Analyse als Ergebnis einer ``long branch attraction´´ bewertet. Dieses Phänomen Felsenstein (1978) auch „Felsenstein-Zone“ genannt, kann durch extrem schnelle Sequenzevolutionsraten ausgelöst werden (``long branch´´), was zu einem artifiziellen Split (häufig an der Basis des Cladogramms) führt, d.h. dieses Taxon wird durch die phylogenetisch sehr entfernte Aussengruppe, die per se einen ``long branch´´ darstellt, „angezogen“ Philippe undLaurent (1998). Felsensteins Simulationen Felsenstein (1978) zeigen, dass Parsimonie Methoden besonders anfällig für dieses Phänomen sind.
Dennoch konnte eine höhere Affinität der Crustacea zu den Hexapoda als zu den Myriapoda gezeigt werden und bestätigt damit vormals publizierte Ergebnisse Shultz undRegier (2000).
Erreichtes Ziel dieser Analyse war jedoch eine recht gezielte Determinierung einer geeigneten Außengruppe für die Phyllopoda. Die Außengruppe sollte einerseits phylogenetisch relativ nah verwandt zur Innengruppe der Phyllopoda sein, andererseits keine zu schnelle Sequenzevolution durchlaufen haben. Die Analysen zeigen eindeutig, dass die Anostraca näher verwandt sind mit den Phyllopoda als die Malacostraca, wie durch Ax Ax (1999) favorisiert.
Für die phylogenetische Analyse der 12S Daten der Phyllopoda wurden zwei verschiedene Alignmentverfahren gewählt. Einerseits ein durch das Programm POY generiertes Alignment, was sich strikt an die Idee der Parsimonie Methode hält und das Alignment errechnet, dessen Generierung der kürzesten Schrittanzahl bedarf und andererseits ein Alignment, dass vor dem Hintergrund eines Sekundärstrukturmodells visuell erstellt wurde. Der Vorteil letzterer Methode ist der Einsatz des vermutlich stärksten und gelehrigsten Werkzeugs -das Gehirn- und erlaubt die Integration zusätzlicher Daten, wie Strukturdomänen Graur undLi (2000). Der wesentliche Nachteil ist die Subjektivität mit der man auf der Basis eines bestehenden Modells als a priori Annahme Hypothesen über die jeweilige Positionshomologie erstellt. Dennoch liefern vergleichende Studien der 16S-artigen Moleküle verschiedener Metazoa- Taxa mit denen der bakteriellen Vorläufermoleküle gute Argumente für die konservierten ``stem´´-Bereiche innerhalb des betrachteten Moleküls Gutell et al. (1994),Konings undGutell (1995), sodass hier von einer gemeinsamen Struktur ausgegangen werden kann. Darüber hinaus zeigen viele Untersuchungen, dass die visuelle Korrektur eines rDNA Alignments im Hinblick auf seine zugrunde liegende Sekundärstruktur eine phylogenetische Analyse im starken Maß verbessern kann Billoud et al. (2000),Hickson et al. (1996),Hickson et al. (2000),Springer undDouzery (1996).
Die auf Sekundärstrukturbasis generierten Alignments für die Phyllopoda und Astacoidea wurden im vollen Umfang, sowohl mit ``loop´´- als auch ``stem´´-Bereiche zur Rekonstruktion der Phylogenie herangezogen. In der Literatur besteht kein allgemeiner Consens zur Frage der Eliminierung von Datenblöcken aus Alignments. Während von einigen Autoren vorgeschlagen wird, vorrangig die gepaarten Regionen (``stems´´) zu berücksichtigen (aufgrund der gesicherten Positionshomologie) Lake (1991),Olsen undWoese (1993) und ``loop´´-Regionen bei zu hoher Unsicherheit zu eliminieren, kommen Wheeler und Honeycutt Wheeler undHoneycutt (1988) zu dem Ergebnis, dass im Gegenteil die ``stem´´-Regionen ein zu geringes phylogenetisches Signal aufweisen und daher geringer zu gewichten sind. Dixon und Hillis Dixon undHillis (1993) weisen in einer sehr umfangreichen Studie darauf hin, dass die Eliminierung von entweder ``stem´´- oder auch ``loop´´-Bereichen in jedem Fall zu einem erheblichen Verlust an Daten führt, der sich negativ auf die phylogenetische Analyse auswirken kann, insofern als dass entweder jüngere Aufspaltungen möglicherweise nicht sicher aufgelöst werden (im Fall von nicht bedachten ``loop´´-Regionen) oder basale Aufspaltungen verrauschen (bei zu geringer Gewichtung von ``stem´´-Bereichen). Um dieser Gefahr zu entgehen und um den sowieso schon relativ kurzen Datensatz nicht noch künstlich weiter zu verkürzen, war es hier angebracht den jeweils kompletten Datensatz zu bearbeiten.
Ziel dieser Arbeit war die Rekonstruktion der phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehungen der Phyllopoda (Branchiopoda, Crustacea) und der Astacoidea (Astacida, Decapoda, Crustacea) mit Hilfe molekularer Datensätze. Zu diesem Zweck wurden Sequenzdaten von 33 Spezies der Branchiopoda und 16 Spezies der Astacida erhoben. Für die Phyllopoda kam das recht variable mitochondriale Gen 12S rRNA (3. Domäne) und das hochkonservierte nukleare Gen EF-1α zum Einsatz. Die Astacida wurden ebenfalls mit den mitochondrial codierten Genen 12S rRNA und cox1 bearbeitet. Bei Einbeziehung vorhandener Daten aus der Genbank bzw. Literatur Hanner undFugate (1997),Munasinghe et al. (2003) wurden die Daten unter Berücksichtigung zweier verschiedener Gesichtspunkte phylogenetisch ausgewertet: Für den ribosomalen Datensatz der Branchiopoda kam gemäß der bestehenden Debatte über die Qualität unterschiedlicher Alignmentstrategien sowohl ein computergestütztes Alignment (POY), als auch ein auf der Basis der zuvor analysierten Sekundärstruktur manuell erstelltes Alignment zum Einsatz. Anhand der phylogenetischen Berechnung der Datensätze konnte gezeigt werden, dass ein unter Einbeziehung von Sekundärstrukturinformationen erstelltes Alignment das Ergebnis positiv beeinflusst (im Fall eines deutlichen Verwandtschaftsverhältnis zwischen Cladocera und C. hislopi) und das sogenannte „Rauschen“ aufgrund von Homoplasie, bedingt durch falsche Positionshomologien, für einige Splits minimieren kann. Alle Datensätze sowohl für die Branchiopoda, als auch für die Astacida wurden mit Maximum Likelihood- und Parsimonie Verfahren berechnet. Die Verwendung dieser beiden Methoden gibt die zusätzliche Möglichkeit, die Gefahr von Missinterpretationen durch artifizielle Teilergebnisse zu minimieren. Daher wurden konsequenterweise nur in beiden Methoden kongruente Ergebnisse als verlässlich diskutiert.
Die Phylogenie der Branchiopoda ist vor allem im Hinblick auf die Abstammungsverhältnisse der übergeordneten Taxa weitgehend ungelöst. Die Anwendung verschiedener molekularer Datensätze (12S rRNA und EF-1α) und verschiedener Stammbaumalgorithmen erbrachte für die wesentlichen Fragestellungen verlässliche Ergebnisse. So konnte die Paraphylie der Spinicaudata gezeigt werden und damit einhergehend das Cladoceromorpha- Konzept favorisiert werden. Auch für die viel diskutierte Hypothese der Diplostraca lassen sich Evidenzen finden, die allerdings aufgrund der nur mäßigen Unterstützung der hier generierten Daten mit weiteren molekularen Daten getestet werden sollte.
Innerhalb der sehr diversen Cladocera konnte betreffend der zwei konkurrierenden Hypothesen der Eucladocera und Gymnomera, dem Gymnomera- Konzept (Haplopoda + Onychopoda) der Vorzug gegeben werden. Ein Schwestergruppenverhältnis der Ctenopoda zu den Gymnomera wird ebenfalls gezeigt. Der Widerspruch zur klassischen Annahme der basalen Stellung der Ctenopoda wird hinsichtlich der vorliegenden Ergebnisse diskutiert.
Die Phylogenie der Phyllopoda (Außengruppe Anostraca) lässt sich zusammenfassend wie folgt hypothetisieren.
Innerhalb der monophyletischen Cladocera werden auf der Basis der Datensätze folgende Verwandtschaftsverhältnisse gestützt:
(Anomopoda (Ctenopoda (Haplopoda (Onychopoda))))
Eine Besonderheit dieser Arbeit liegt in der phylogenetischen Auswertung der Intronpositionen des Gens EF-1α innerhalb der Branchiopoda. Hier konnten aus der vorhandenen Datenlage innerhalb der Metazoa drei für Phyllopoda typische Intronpositionen ermittelt werden. Zwei Introns sind jeweils Autapomorphien der Notostraca (Intron B) und der Cladocera (Intron D), während ein Intron als Synapomorphie von C.hislopi und den Cladocera gewertet werden kann (Intron C). Damit ergibt sich ein zusätzliches, starkes Argument für die Cladoceromorpha.
Die hier auf der Basis der vorliegenden molekularen Resultate der Astacoidea (Außengruppe Parastacoidea) zu stellenden Hypothesen stehen im Widerspruch zu der traditionell als unbestritten geltenden Vorstellung eines Monophylums der amerikanischen Cambaridae und der asiatischen Cambaroides, gemeinschaftlich zum Taxon Cambaridae vereint.
Die vorhandenen Ergebnisse aus der Auswertung der 12S rRNA und cox1 Datensätze rechtfertigen überzeugend die Hypothese einer Nicht-Monophylie der amerikanischen Cambaridae + Cambaroides. Vielmehr bilden die amerikanischen Cambaridae die Schwestergruppe zu den europäischen Astacidae. Da in der Nomenklatur nicht zwischen den amerikanischen Cambaridae + Cambaroides - gemeinschaftlich als Cambaridae bezeichnet - differenziert wird, sollte hier, sofern sich dieses Ergebnis verifizieren lässt, eine Namensänderung der amerikanischen Cambaridae angestrebt werden. Die basale Stellung der Cambaroides deutet ferner darauf hin, dass die Verbreitung der Astacoidea ihren Ursprung im ostasiatischen Raum genommen hat.
Desweiteren konnte die Herkunft des parthenogenetischen Marmorkrebses (Astacida, Astacoidea, amerikanische Cambaridae) eingegrenzt werden. In diesem Zusammenhang wurde auf die Gefahr einer sorglosen Hälterung bzw. Freisetzung in europäische Binnengewässer hingewiesen.
12S rRNA Alignment der Branchiopoda der 3. Domäne und partiell der 2. Domäne, erstellt auf der Basis einer Sekundärstrukturanalyse. Blau markierte Nukleotide bezeichnen die ``stem´´- Regionen.
Ein durch POY generiertes Alignment der 12S rRNA der Branchiopoda (ohne Berücksichtigung der Sekundärstruktur). Die blau markierten Nukleotide entsprechen denen in Abb. 22 definierten ``stem´´- Bereichen.
12S rRNA Alignment der Astacida generiert mit dem Alignmentprogramm Clustal X unter ``default´´- Optionen.
BA = ``bootstrap´´
CML = Prozentuale Unterstützung der Splits in „n“ Topologien. CML wird für Consensus Stammbäume angewendet, die auf der Basis von Maximum Likelihood berechnet wurden.
DI = ``decay´´ Index
IUPAC Code für Nukleotide (``ambiguities´´):
M= A oder C, W= A oder T, D= A,G oder T, V= A,C oder G
K= G oder T, S= G oder C, H= A, C oder T, N= A, C, G oder T
R= A oder G, Y= T oder C, B= C,G oder T
ML = Maximum Likelihood
MP = Maximum Parsimonie
``One letter code´´ für hier angemerkte Aminosäuren:
A = Alanin, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenylalanin, G = Glycin, I = Isoleucin, K = Lysin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutamin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin
Prof. Dr. Gerhard Scholtz danke ich für die Bereitstellung des Themas der Phylogenie der Flusskrebse und für die Möglichkeit diese Arbeit in den Räumlichkeiten der Humboldt- Universität zu beenden.
Priv. Doz. Dr. Stefan Richter sei für die unermüdliche Jagd und Bestimmung der vielen verschiedenen Branchiopoden gedankt und auch für die Diskussionsbereitschaft über das Thema Phylogenie. Dies war sicherlich trotz einiger Dissonanzen für beide Seiten lehrreich.
An dieser Stelle möchte ich mich bei Dr. Jørgen Olesen, Prof. Dr. Walter Hödl und vielen mir leider persönlich nicht bekannten Wissenschaftlern für die Bereitstellung einiger systematisch relevanter Spezies bedanken.
Prof. Dr. Arndt von Haeseler möchte ich für die ständige Gesprächsbereitschaft, die vielen Tips und vor allem die geduldigen Erklärungen zum Umgang mit Maximum Likelihood Berechnungen danken, die mir sehr geholfen haben, diese für einen Laien schwierig umsetzbare Herausforderung zu meistern.
Einen Dank allen Mitgliedern der AG für eine angenehme und lustige Zeit.
Meiner Mutter und auch der Familie Hiesel bzw. Stickel sei herzlich gedankt für die großen Hilfen, insbesondere in der Zeit, als schwere Krankheit und Existenznot fast alles zum Erliegen brachte. Ohne diese Hilfen hätte ich die Arbeit nicht fertig stellen können.
Mein größter Dank geht an Dr. Rudolf Hiesel, der mein wichtigster Begleiter in diesen Jahren war. Seine Idee zu dieser Arbeit, sein Engagement bei der Suche eines geeigneten Doktorvaters, die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und der entsprechenden Geräte in seiner Firma Replicon GmbH, seine unermüdliche Diskussionsfreude über alle Fragen der Phylogenie und nicht zuletzt sein großes molekularbiologisches und zoologisches Wissen, das er an mich weitergegeben hat, machen ihn nicht nur zum Initiator dieser Arbeit, sondern zu meinem eigentlichen Lehrer.
A. Braband, vormals A. Giese
Giese, A., Thalheim, C., Brennicke, A., Binder, S. (1996) Correlation of nonanucleotide motifs with transcription initiation of 18S rRNA genes in mitochondria of pea, potato and Arabidopsis. Mol. Gen. Genet. 252: 429-436.
Richter, S; Giese, A.; Hiesel, R.; Scholtz, G. (1998): Aspects of cladoceran phylogeny inferred by DNA data. Proceedings and abstracts of the 4th International Crustacean Congress Amsterdam, 20. – 24.07.1998.
Giese, A.; Richter, S.; Hiesel, R.; Scholtz, G. (1999): Die molekular-systematische Verwendbarkeit der mitochondrialen 12S rDNA am Beispiel der Branchiopoda. 9. Crustaceologentagung in Deutschland, Berlin, 25. – 28.02.1999.
Richter, S.; Giese, A., Aladin, N.V.; Scholtz, G. (1999): Aspekte der Phylogenie und Evolution der Onychopoda (Cladocera). 9. Crustaceologentagung in Deutschland, Berlin, 25. – 28.02. 1999.
Braband, A., Richter, S., Hiesel, R., Scholtz, G. (2000) Phylogeny of the Branchiopoda (Crustacea) inferred by DNA data. Zoology 103, Supplement III (DZG 93.1), 99.
Richter, S.; Braband, A.; Aladin, N.; Scholtz, G. (2001): The phylogenetic relationships of ‚predatory water-fleas’ (Cladocera: Onychopoda, Haplopoda) inferred from 12S rDNA. Mol. Phylogenet. Evol. 19: 105-113
Braband, A.; Richter, S.; Hiesel, R.; Scholtz, G. (2001): Phylogenetic relationships of the Branchiopoda inferred by DNA data. Fourth International Large Branchiopod Symposium, La Paz – Mexiko 23. – 27.1.2001.
Braband, A., Richter, S., Hiesel, R., Scholtz, G. (2002) Phylogenetic relationships within the Phyllopoda (Crustacea, Branchiopoda) based on mitochondrial and nuclear markers. Mol. Phylogenet. Evol. 25: 229-244.
Scholtz, G., Braband, A., Tolley, L., Reimann, A., Mittmann, B., Lukhaup, C., Vogt, G. (2003): An enigmatic parthenogenetic crayfish: a promising model organism or a threat to freshwater ecosystems? Nature 421: 806.
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel erarbeitet und verfasst habe.
Diese Arbeit wurde keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Anke Braband