Methoden Molekularbiologische Standardmethoden

Alle hier im Text aufgeführten Standardmethoden, wie Chloroformextraktionen, Alkoholfällungen und Agarosegelelektrophorese und die Präparation kompetenter Bakterienzellen (sofern erforderlich) werden nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt.

Datenerhebung

Die zur Datenerhebung durchgeführten Methoden umfassen die Gesamtnukleinsäurenpräparation, die anschließende PCR Amplifikation des gewünschten Genabschnittes mit universellen Primern und die Direktsequenzierung der PCR Produkte. In Ausnahmefällen, z.B. wenn das PCR Produkt zu schwach ist, um direkt sequenziert zu werden, werden diese Produkte kloniert. Im Regelfall wurden 10 positive Klone gescreent und auf die Richtigkeit ihrer Inserts mittels Sequenzierung überprüft.

DNA Präparation

Von ca. 1-20 Individuen (Branchiopoda) und ca. 10-20 mg Muskelgewebe der Astacida werden Nukleinsäureextraktionen mit dem 4%- igen Lysepuffer CTAB (s. Kap. 2.1.4) in abgewandelter Form nach der Methode von Doyle & Doyle Doyle undDoyle (1990) angefertigt. Die Homogenisation findet direkt in 500 µl Lysepuffer + 100 mM b- Mercaptoethanol in Gegenwart einiger Körnchen Seesand statt. Durch die Zugabe von Seesand wird die Menge der extrahierten Nukleinsäuren enorm erhöht, da das Gewebe der zum Teil sehr kleinen Tiere besser aufgeschlossen werden konnte. Besonders in Fällen, wo nur ein bis zwei sehr kleine Individuen zur Verfügung standen, ermöglicht erst die Zugabe von Seesand eine Extraktion in ausreichender Menge. Das Homogenisat wird nach einer Inkubationszeit von ca. 30 min bei 65°C mit einem Volumen Chloroform versetzt und ca. 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Anschließend werden die Nukleinsäuren mit 0,8 Volumen Isopropanol aus dem Überstand gefällt. Die Nukleinsäure-Pellets werden je nach ihrer Größe in 5 - 30 µl TE Puffer aufgenommen und bei –20°C gelagert. Menge und Qualität von je 1 µl der Präparationen wurde auf einem 1%- igen Agarosegel abgeschätzt. In einigen Fällen, in denen die DNA Präparationen einer folgenden enzymatischen Reaktion nicht zugängig waren, wird mit 8 M LiCL (2 h bei 65°C) erneut präzipitiert.

Primerdesign und PCR Amplifikation

Der Einsatz von universell anwendbaren PCR Primern ermöglicht es, mit nur einem Primerpaar einen definierten Genbereich unterschiedlicher Spezies zu amplifizieren.

Die zur Anwendung kommenden PCR Primer (Tabelle 3) werden an ihrem 5’-Ende artifiziell verlängert, sofern die PCR Produkte direkt in der Cyclesequenzierung eingesetzt werden können. Als zusätzliche Sequenzen werden die ``primingsites´´ von Standardprimern gewählt: Die Primer, die zur Amplifikation der Branchiopoda des 12S und EF-1a Gens genutzt werden, werden mit den Sequenzen für die Standardprimer M13 universe und M13 reverse verlängert. Die Primer zur Amplifikation der Gene 12S und cox1 der Astacoidea werden mit den ``primingsites´´ für T7_term und T7_prom verlängert. Die Methode der künstlichen Verlängerung der PCR Primer Cho et al. (1995) ermöglicht die routinemäßige Cyclesequenzierung unterschiedlicher Templates bei einer gegebenen Temperatur mit den angegebenen Standardprimern. In den Fällen, in denen das PCR Produkt kloniert wird, kann auf eine artifizielle Verlängerung der PCR Primer verzichtet werden.

Die PCR Amplifikationen (Gesamtvolumen 50-100 µl) erfolgen nach einem Standardprotokoll mit ca. 100 ng DNA Template und je 20 pmol Primer für die 12S rDNA , bzw. 10 pmol je Primer für die Genbereiche cox1 und EF-1a. Nach einer einmaligen Denaturierung der DNA für 3-5 min folgen 35-40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 94°C (30 s), ``primerannealing´´ bei 40-53°C für 45 s und einer Elongation bei 72°C (45 s bis 1 min15 s). Eine einmalige Extension bei 72°C für 3-7 min beenden die Amplifikation. Durch die je nach gewünschtem Gen eingesetzten Primer werden für die 12S rRNA ein Amplifikat von durchschnittlich 500 bp., für das Gen EF-1a Produkte von 1063-~1200 bp. (inklusive Introns) und für das Gen cox1 Produkte mit einer Länge von 450 bp. generiert. Die genauen Annealingtemperaturen werden, sofern sie abweichend zum Standard sind, in einem Gradientencycler (Eppendorf) optimiert. Annealingtemperaturen sind der Tabelle 3 zu entnehmen.

Von sämtlichen PCR Produkten wird ein Aliquot von 5 µl auf einem 1-1,2% igen Agarosegel näherungsweise quantifiziert. In der Regel kann erfahrungsgemäß für die Sequenzierung und Elektrophorese auf ALF-Sequenzern auf eine Aufreinigung der PCR-Produkte verzichtet werden. Sofern allerdings die Analyse auf dem Agarosegel eine noch erhebliche Menge an freien Primern oder Primerdimeren zeigt und das PCR Produkt in nur geringer Menge generiert werden konnte, werden die PCR Produkte mittels Microcon PCR 50 Ultrafiltrationsröhrchen (Millipore) gefiltert. Nicht incorporierte Primer bzw. Dimere werden auf diese Weise quantitativ entfernt. Gleichzeitig wird der PCR Ansatz auf ein erheblich kleineres Volumen (5-10 µl) konzentriert, sodass sich vielfach eine schwache Amplifikation trotzdem für eine anschließende direkte Sequenzierung als adäquat erweist. Die Filtration der PCR Produkte ist nur bei einigen Spezies nötig.

Cyclesequenzierung der PCR Produkte

Die Sequenzierung erfolgt mittels der von Sanger und Kollegen Sanger et al. (1977) entwickelten Methode des Strangaufbaus und definierten Strangabbruchs durch den Einsatz von Dideoxynukleotiden. Die Kettenabbruchmethode ist inzwischen die Routinemethode zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen einer DNA und hat sich in der Laborroutine gegenüber der Maxam-Gilbert Sequenzierung Maxam undGilbert (1977) durchgesetzt: DNA-Doppelstränge werden hierbei zunächst denaturiert (durch Hitze- oder Alkalibehandlung). Zur Neusynthese von DNA mit einer DNA-Polymerase ist immer ein kurzer Doppelstrangbereich erforderlich, bei dem ein 3’-Ende anhand des überstehenden 5’-Endes des Gegenstranges als Template verlängert werden kann. Solch eine kurze Doppelstrangregion wird zur Sequenzierung (wie bei der PCR-Reaktion) künstlich durch einen Oligonukleotid-Primer erzeugt, der mit der einzelsträngigen Template-DNA hybridisieren muß. An dem auf diese Weise gebildeten 5’-Überhang kann nun die Neusynthese ansetzen. Die Neusynthese geschieht in Gegenwart der vier monomeren dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP). Um nun einen definierten Strangabbruch zu erzeugen, werden der Reaktion zusätzlich Dideoxynukleotide zugefügt. Diesen ddNTPs fehlt ausser in der 2’- Position auch in der 3’- Positon der Ribose eine OH-Gruppe, d.h. es steht keine notwendige OH-Gruppe zur Bildung einer folgenden Phosphodiesterbindung zur Verfügung, die Synthese bricht ab. In vier verschiedenen Ansätzen mit jeweils einem Didesoxynukleotid, neben den normalen vier dNTPs, entsteht so eine Population unterschiedlich langer Moleküle, deren jeweils letztes Nukleotid dem zuvor eingesetzten ddNTP entspricht. Statistisch gesehen enthält so z.B. die ddATP-Reaktion an jedem im Template auftretenden Thymidin eine detektierbare Menge an Abbrüchen. Die vier Reaktionsansätze einer Sequenzierung werden getrennt (im Fall des ALF Sequenziersystems) der Elektrophorese zugeführt (im idealen Fall einem Sequenzautomaten). Ein Polyacryamidgel hat die Auflösekraft um Moleküle mit nur einer Base Unterschied in der Kettenlänge voneinander zu unterscheiden. Um die Moleküle detektieren zu können, ist der in der Sequenzreaktion eingesetzte Primer an seinem 5’-Ende mit einem Fluoreszenfarbstoff markiert (für die hier eingesetzten Systeme ALF und ALF-Express sind Fluoreszein bzw. CY5-Fluoreszenzfarbstoffe erforderlich). Eine automatische Lesevorrichtung erlaubt die simultane Erfassung auf einem Computer nach Anregung und Detektierung des Farbstoffes (und damit des Moleküls) durch einen Laserstrahl.

Um die Syntheseeffizienz zu erhöhen, wird auch hier zur Sequenzierung (wie bei der PCR) mit thermostabilen Polymerasen gearbeitet, die es erlauben, in einem Ansatz, in mehreren Zyklen eine neue Synthese zu starten (Cycle-Sequenzierung). Diese Synthese verläuft allerdings linear, da nur ein Primer eingesetzt wird, im Gegensatz zur exponentiellen Synthese der PCR mit zwei gegenläufigen Primern. Die Methode der PCR-Direktsequenzierung hat des weiteren den Vorteil, dass mögliche Fehler beim Strangaufbau, die durch den Einsatz von Taq-Polymerase für die Amplifikation entstehen, ausgemittelt werden.

Sofern die Amplifikation ein in Qualität und Quantität ausreichendes Produkt ergibt, wird das Amplifikat direkt sequenziert. Die einzusetzende Menge an Template richtet sich nach Menge und Länge desselben. Es werden ca. 0,5 µg Template pro 500 bp. Länge (des PCR Produktes) eingesetzt. Die Cyclesequenzierungen erfolgen mit dem Thermosequenase Kit nach Herstellerangaben (Amersham Pharmacia) mit 4 pmol Primer pro Sequenzierung und einer Annealingtemperatur von 57°C.

Alle 12S und cox1- PCR Produkte werden doppelsträngig sequenziert. Als Sequenzierprimer für die Gene 12S und cox1 wurden die Standardprimer M13 universe bzw. reverse (12S) und T7_term bzw. T7_prom (cox1) eingesetzt.

Das Gen EF-1a konnte zunächst nur von zwei Branchiopoda-Spezies (Sida und Lepidurus) mit den Literaturprimern amplifiziert werden. Diese Amplifikate wurden mit M13 universe und M13 reverse ansequenziert und aus den Sequenzen wurden sowohl PCR spezifische universelle Primer für die erfolgreiche Amplifikation anderer Branchiopoda abgeleitet, als auch weiterführende (sogenannte interne Primer), soweit möglich universelle Sequenzierprimer, die es in den folgenden Sequenzreaktionen ermöglichen, die Exons der Produkte doppelsträngig zu sequenzieren (``primerwalking´´). Introns werden zumeist nur einzelsträngig sequenziert.

Für die Gene 12S und cox1 werden durchschnittlich 0,3 - 0,5 µg PCR Produkt eingesetzt, für das Gen EF-1a ca. 0,8-1 µg.

Die Sequenzgel-Elektrophorese erfolgt auf ALF- Sequenzern (bei Fluorescein-markierten Sequenzen) bzw. auf ALF Express Sequenzern, sofern die Sequenzierungen mit CY5 gelabelten Primern durchgeführt wurden. Die Herstellung des 6,5% Polyacrylamid- Sequenzgels erfolgt nach Angaben des Herstellers (Pharmacia). Die Auftrennung der Sequenzierungen im elektrischen Feld wird bei einer Temperatur von 50°C, 30 Watt, 1500 Volt, 38 mA und einer Laserpower von 3 mW durchgeführt.

Klonierungen

Im Falle quantitativ ungenügender Amplifikation wird kloniert, um eine Sequenzierung zu ermöglichen.

Die Ligationen der PCR Produkte werden mit dem Kit „TA Cloning“ (Invitrogen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Anschließend werden die Plasmide (Vektor pCR 2.1 + 1 Molekül des PCR Produktes) mittels Elektroschock (1 Puls á 2,5 kV mit einer Feldstärke von 12,5 kV/cm) in den elektrokompetenten E.coli Stamm DH5a transformiert und auf LB+Ampicillin (50 µg/ml) Medium in Gegenwart von IPTG (24 µg/ml) und X-Gal (50 µg/ml) selektioniert. Von allen Transformationen werden 10-15 Klone auf das Vorhandensein eines Inserts und auf die Richtigkeit überprüft. Dazu werden 10-15 Kolonien einzeln gepickt und in 5 µl H₂0 für 5 min bei 96°C lysiert. Anschließend wird das Lysat bei maximaler Geschwindigkeit (13.000 rpm) 5 min. zentrifugiert um Zelltrümmer zu pelletieren. 1 µl des Überstandes wird als Template in einen 50 µl PCR Ansatz mit je 2,5 pmol LacZ A (5'-GGTAGTGGGATACGACGATA) und LacZ B (5'-CAACAATCGATCCTACTAAA) Primern gegeben. Der Vektor pCR2.1 enthält die ``priming sites´´ der Standardprimer LacZ A und B, sodass man auf diese Weise in einfacher und sehr effizienter Weise positive, d.h. Plasmide mit erfolgreich kloniertem PCR Produkt von negativen Klonen unterscheiden kann. Alle positiven PCR Produkte werden danach direkt cyclesequenziert. Die ausgewerteten Inserts werden mittels eines ``Blast-Search´´ Altschul et al. (1997), mit allen in der Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) vorhandenen Sequenzen verglichen und die Richtigkeit der Inserts bestätigt.

Phylogenetische Analyse

Alle im Rahmen dieser Arbeit generierten Sequenzdaten wurden phylogenetisch ausgewertet. Zur Klärung der Aussengruppenfrage der Phyllopoda (Branchiopoda) wurde ein Arthropodenalignment, basierend auf den konservierten Bereichen der Aminosäuresequenzen mitochondrialen Proteine, herangezogen Hwang et al. (2001) und durch einige seitdem neu publizierte mitochondrialen Proteinsequenzen ergänzt (weitere Erläuterungen dazu siehe Kapitel: 3.1.2.1).

Im Folgenden werden die in dieser Arbeit angewendeten Methoden in umgekehrter Reihenfolge, zuerst die Berechnungmethoden der Cladogramme und anschließend die Erstellung der Alignments, beschrieben. Dies erscheint sinnvoll, da das hier u.a. verwendete Programm POY sowohl Alignments als auch Topologien erzeugt.

Phylogenetische Stammbäume

Eine gegebene DNA Datenmatrix (Alignment) ist definiert durch die Anzahl an Taxa (Arten) und die Anzahl an Merkmalen (Nukleotide, bzw. Aminosäuren). Anhand der Formel

N(u) = (2n-5) ! / [2 n-3 (n-3) !]

lassen sich von „n“ Taxa „N(u)“ ungewurzelte Topologien erzeugen Cavalli-Sforza undEdwards (1967). D.h. für 10 Taxa wären 2x10⁶, bei 20 Taxa schon 2x10²⁰Topologien theoretisch möglich. Um aus dieser Fülle von ungewurzelten Topologien die sinnvollen herauszufinden, sind verschiedene Rechenalgorithmen nutzbar. Man unterscheidet hier zunächst zwischen heuristischen und exakten Verfahren. Das exakte Verfahren garantiert, unter der gegebenen Berechnungsmethode (Parsimonie oder Maximum Likelihood), den wahrscheinlichsten bzw. kürzesten Stammbaum zu finden, weil alle Möglichkeiten berechnet werden. Dies ist allerdings nur für maximal 10-12 Taxa durchführbar, da sonst die Rechenkapazitäten gängiger PCs nicht ausreichen. Größere Artenzahlen werden mit heuristischen Verfahren berechnet. Hierbei wird zunächst durch schrittweises Hinzufügen jeweils eines Taxons (``stepwise addition´´) an zunächst optimal erscheinende Stellen und anschließendes Variieren der einzelnen Äste (``branch swapping´´) die kürzeste (Parsimonie) oder wahrscheinlichste (Maximum Likelihood) Topologie gesucht.

Die im Folgenden beschriebenen Methoden Maximum Parsimonie und Maximum Likelihood betrachten die Nukleotidpositionen als Einzelmerkmale und versuchen die Merkmalsänderungen in der Rekonstruktion des Stammbaums zu reflektieren.

Alle im Rahmen dieser Arbeit sequenzierten Gene und zusätzlich die in der Datenbank oder Literatur erhältlichen Daten werden zunächst gesondert und dann auch als kombinierte Datensätze phylogenetisch ausgewertet.

Parsimonie

Parsimonie Methoden waren die ersten, die zur Rekonstruktion von Phylogenesen breite Anwendung fanden. Ihnen liegt die Philosophie des sogenannten „Occam’s razor“ -die größtmögliche Sparsamkeit- zugrunde, d.h. es wird hier die generelle Vorstellung der Naturwissenschaft umgesetzt, zunächst die einfachere gegenüber einer komplizierteren Hypothese zu bevorzugen und ad hoc Hypothesen weitestgehend zu vermeiden Swofford et al. (1996). Ziel der Maximum Parsimonie Methode in der Systematik ist es, das Cladogramm zu finden, welches die geringste Anzahl von Evolutionsschritten benötigt, um den beobachteten Datensatz zu erklären. Parsimonie Methoden berücksichtigen nur variable Positionen, sogenannte Parssimonie-informative Merkmale. Tritt in einer Position des Alignments nur ein bestimmtes Nukleotid oder Aminosäure auf, so ist dieses Merkmal nicht informativ. Wird in nur einem Taxon eine andere Merkmalsausprägung beobachtet, so ist diese Position ebenfalls nicht informativ. Treten hingegen in mehr als einem Taxon unterschiedliche Nukleotide (Aminosäuren) auf, so ist dieses Merkmal Parsimonie-informativ und wird durch die entsprechenden Algorithmen rechnerisch erfasst. Je mehr allerdings eine Position variiert, desto stärker kann unter Umständen ihr Homoplasiegehalt sein und damit ein ungewolltes „verrauschen“ phylogenetischer Signale verursachen. Desweiteren können unterschiedliche Substitutionsereignisse (Transitionen versus Transversionen versus ``gaps´´) pro Position unterschiedlich gewichtet werden. Damit wird dem Umstand Rechnung getragen, dass in der Regel Transitionen häufiger vorkommen als Transversionen. Zusätzlich können ``gaps´´ als fünftes Merkmal mit in die Berechnung einfliessen.

Maximum Likelihood

Die Idee, die den Maximum Likelihood Verfahren zugrunde liegen, beruht auf der Vermutung, dass Evolution auf der Ebene von DNA Molekülen ein stochastischer Prozess ist, d.h. es wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit der eine gegebene Topologie durch einen Datensatz unter der Annahme eines Modells begründbar ist.

Unter einem gegebenen Modell, welches die Wahrscheinlichkeiten der beobachteten Ereignisse (Substitutionen) spezifiziert, kann der ``likelihood´´ L für den gegebenen Datensatz berechnet werdenals

Ltree = P (D | H),

wobei P (D |H) die Wahrscheinlichkeit ist, einen Datensatz D unter einer gegebenen Hypothese H zu beschreiben. Da der ``likelihood´´ L sehr klein ist, wird der Wert als ``log likelihood´´, bzw. als natürlicher Logarithmus einer Wahrscheinlichkeit (lnL) ausgedrückt.

Die zugrunde liegenden Algorithmen zur Berechnung von Nukleotiddatensätzen wurden von Felsenstein Felsenstein (1973),Felsenstein (1981) entwickelt.

Zwei gegebene Sequenzen (1 und 2) unterscheiden sich durchschnittlich um d Substitutionen pro Position. Diese Distanz d entspricht µt, wobei µ die Mutationsrate ist und t die Zeit. Gegeben ist im Folgenden ein Substitutionsmodell (siehe unten), sodass für jede Position die Wahrscheinlichkeit P _ij(d) berechnet werden kann, dass diese beiden Sequenzen, separiert durch d, die Nukleotide i bzw. j aufweisen. Die Wahrscheinlichkeit ist nun der ``likelihood´´ der Substitution der betrachteten Position, der beiden Sequenzen (Taxa). Der ``log likelihood´´ die gegebenen Daten zu erklären, ist folglich die Summe der ``log likelihoods´´ jeder individuellen Position.

, wobei k= Anzahl der Merkmale und i = Position 1-k

Auch in diesem Fall werden in einer heuristischen Suche eine große Anzahl an ungewurzelten Topologien ermittelt.

Die Gesamttopologie, die mit höchster Wahrscheinlichkeit den gegebenen Datensatz unter dem angenommenen Modell erklärt, wird als Maximum Likelihood Baum präsentiert. Hier ist anzumerken, dass der ``output´´ ein gewurzeltes Dendrogramm darstellt. Die Wurzel wird Eingangs vom Benutzer festgelegt, geht aber nicht als gegebene Forderung in die Berechnung der Wahrscheinlichkeiten ein. Die Leserichtung ist daher als a posteriori Entscheidung anzusehen.

Besondere Bedeutung kommt der Wahl des Evolutionsmodells zu. Es dient der Schätzung der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer Substitution. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurde eine Vielzahl von Modellen entwickelt, die in immer differenzierterer Weise versuchen, den unterschiedlichen Substitutionsraten Rechnung zu tragen. Im Gegensatz zum einfachsten Jukes-Cantor- Modell (gleiche Mutationsrate von a = 0,25 für jedes Nukleotid) Jukes undCantor (1969) bedienen sich alle weiteren Modelle der Annahmen, dass

die Häufigkeit der beobachteten Nukleotide in einem Alignment (Basenfrequenz) nicht gleich sein muß (z.B. sind tierische mitochondriale Genome sehr A/T reich) und daher für jedes Nukleotid im Durchschnitt ermittelt wird (p_i) und

Transitionen und Transversionen unterschiedliche Substitutionsraten haben. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Transition a (Purin « Purin, Pyrimidin « Pyrimidin) ist höher als die Wahrscheinlichkeit einer Transversion b (Purin « Pyrimidin), andererseits hat eine Base nur eine Möglichkeit via Transition in ein anderes Nukleotid zu substituieren, dagegen kann sie aber via Transversion in zwei andere Basen substituieren. In den hier vorgestellten Analysen der Nukleotidsequenzen kommen folgende Modelle zum Einsatz:
- HKY: Hasegawa-Kishino-Yano Hasegawa et al. (1985) mit zwei Parametern: Variable Basenfrequenz und Transitionen:Transversionen.
- TN: Tamura-Nei Tamura undNei (1993) mit drei Substitutionstypen: Variable Basenfrequenz, Transitionen:Transversionen und Y:R-Transitionsparameter.

Optional kann jedes Modell mit der zusätzlichen Forderung der Variabilität eines Merkmals, abhängig von seiner Position, die sogenannte „rate heterogeneity“, versehen werden. Hierbei wird der Beobachtung Rechnung getragen, dass Nukleotide abhängig von ihrer Position unterschiedliche Evolutionsgeschwindigkeiten aufweisen. Diese Evolutionsraten können nach der Gamma Verteilung Yang (1993) spezifiziert werden.

Für die Maximum Likelihood Analysen werden alle Nukleotiddatensätze mit dem Programm TREE-PUZZLE Vers. 5.0 Schmidt et al. (1999-2000),Schmidt et al. (2002),Strimmer undvon Haeseler (1996) berechnet. In einem ersten Schritt werden die Alignments jeweils unter den oben genannten Modellen einmal ohne Berücksichtigung und einmal mit Berücksichtigung der ``rate heterogeneity´´ im ``fast approximate´´ Modus berechnet. Für die genauen Berechnungen wird dann das Modell, das die höchste Wahrscheinlichkeit ergab, gewählt und erneut im ``exact slow´´ Modus berechnet. Die Option ``list puzzling step trees´´ wird aktiviert, um eine Liste aller gefundenen Topologien zu erhalten. Die Liste aller Topologien wird im weiteren mittels des Kishino-Hasegawa-Tests Kishino undHasegawa (1989) getestet. Der ``output´´ dieses Tests stellt eine Liste dar, aus der die Topologie mit der höchsten Wahrscheinlichkeit erkennbar ist (``best tree´´), aber auch allen Topologien, die nicht signifikant schlechter sind als der ``best tree´´ (``not significantly worse´´) und die Topologien die das Signifikanzlevel von 5% nicht erreichen (``significantly worse´´). Sofern die Gesamtanzahl der errechneten Topologien einen vertretbaren, d.h. im ``textfile´´ überschaubaren Umfang aufweisen (bis zu 1000 Topologien) und die Anzahl der signifikant schlechteren Topologien mehr als 50% aller errechneten Möglichkeiten überschreitet, wird aus allen signifikant guten Topologien ein ``strict´´ Consensusbaum (im Programm Phylip, Vers. 3.5c) generiert, der auch mittels prozentualer Angaben die Unterstützungen einzelner Verzweigungen angibt, die aus allen im Consensus repräsentierten Topologien ermittelt werden. Für die erzeugte Consensustopologie wird die Wahrscheinlichkeit und die entsprechenden Astlängen gesondert als ``user tree´´ mit TREE-PUZZLE berechnet. Mit dieser Methode kann garantiert werden, dass der Consensusbaum aus allen wahrscheinlichsten Topologien resultiert. Anderenfalls würde in diesen Fällen bei einem durch TREE-PUZZLE automatisch generierten ``50% majority consensus tree´´ ein gewisser Anteil an signifikant schlechteren Topologien repräsentiert sein. Die Anwendung dieser Methode erwies sich in einigen Fällen als adäquat, da weit weniger als 50% aller Topologien das Signifikanzlevel erreichten. Die Unterstützung der Dichotomien gibt die Prozentualität an, mit der diese Verzweigung in allen Topologien vertreten ist und wird im Folgenden mit „CML“ (Consensus ML) abgekürzt. Sofern die Anzahl der signifikant schlechteren Topologien unter 50% der Gesamtanzahl blieb, wurde der durch TREE-PUZZLE erzeugte ``50% majority rule consensus tree´´ verwendet. Bei einer Gesamtanzahl von über 1000 zu testenden Topologien wird die nach dem entsprechenden Kishino-Hasegawa-Test als ``best tree´´ ausgewiesene Topologie gezeigt.

Die Anzahl aller möglichen Quartet-Puzzle-Topologien errechnet sich durch

= , wobei n = Anzahl der Taxa

wobei die obere Grenze der Gesamttopologien programmbedingt auf 10.000 Topologien limitiert ist.
Alignmentmethoden
Streng genommen spiegelt ein Alignment in sich schon die Evolutionsgeschichte wieder und muß daher mit besonderer Sorgfalt aufgestellt werden.

Prinzipiell entspricht der Aufbau eines Alignments dem einer morphologischen Datenmatrix, wobei die einzelnen Nukleotide, bzw. Aminosäuren für die verschiedenen Spezies so untereinander geschrieben werden, dass die daraus resultierenden Nukleotid- (Aminosäure) Spalten als homolog zueinander hypothetisiert werden (Positionshomologie). Folglich ist jede Spalte (Position) eines Alignments ein Merkmal, die Art der Nukleotide (Aminosäuren) in dieser Position sind dagegen die unterschiedliche Ausprägungen des Merkmals. Während des Alignmentprozesses wird die Anzahl der übereinstimmenden Nukleotide (Aminosäuren) durch das Einfügen von Lücken (``gaps´´ oder ``indels´´) maximiert. Die biologische Bedeutung von ``gaps´´ sind im Lauf der Evolution erfolgte Insertionen oder Deletionen. Das Einsetzten von ``gaps´´ ist insbesondere bei ribosomalen Genen, die keinen ``reading frame´´ aufweisen, im höchsten Maß hypothetisch. Um ein aussagekräftiges Alignment zu erhalten, können die Parameter (Maluspunkte) zur Eröffnung bzw. Verlängerung von ``gaps´´ variiert werden.

Sofern ``gaps´´ in den Alignments vorkommen, werden diese in den nachfolgenden phylogenetischen Rechenverfahren unterschiedlich bewertet. Hier ist zunächst anzumerken, dass Parsimonie Verfahren eine Wertung der ``gaps´´ als fünftes Merkmal (bei Nukleotidalignments) oder 21stes Merkmal (bei Aminosäurealignments) erlauben, Maximum Likelihood Verfahren werten ``gaps´´ grundsätzlich nicht.

Zur Erstellung eines Alignments werden verschiedene Computerprogramme im Internet angeboten, die auf der Basis unterschiedlicher Algorithmen arbeiten. Die in dieser Arbeit verwendeten Programme sind Clustal X Thompson et al. (1997) und POY Gladstein undWheeler (1996-2000). Darüberhinaus kommt für das ribosomale Gen (12S) ein drittes, visuell erstelltes Alignment zur Anwendung.
Clustal X
Dieses sogenannte ``multiple alignment´´ Verfahren Thompson et al. (1997) gehört zu den am weitesten genutzten Programmen, um homologe Sequenzen miteinander zu vergleichen.

Hierbei werden aus einem gegebenen Datensatz alle Sequenzen paarweise miteinander verglichen, und eine Distanzmatrix für den gegebenen Datensatz wird errechnet. Auf der Basis der Distanzmatrix wird ein, den multiplen Alignmentprozess initiierender, sogenannter ``guide tree´´ erstellt. Im zweiten Schritt werden jeweils die Sequenzen miteinander aligned, die die geringsten Distanzen zueinander aufweisen. Von jedem paarweisen Alignment wird eine Consensussequenz generiert und anschließend die paarweisen Alignments bzw. deren Consensussequenzen, wieder auf der Basis der kleinsten Distanzen, zueinander aligned. Während des multiplen Alignmentprozesses werden, wo dies notwendig erscheint, ``gaps´´ eingeführt.

Clustal X wird unter Verwendung der vorgegebenen Parameter (``default´´) Optionen zur Erstellung von Alignments für die Gene 12S (im Vergleich zum POY Alignment), EF-1α der Branchiopoda, cox1, 12S der Astacoidea und für die Vervollständigung des Arthropodendatensatzes (Aminosäuren) verwendet.
POY
Das Programm POY ist im eigentlichen Sinn kein ``stand alone´´ Alignmentprogramm, sondern verbindet Alignment mit der phylogenetischen Analyse in einem Schritt. Hierbei wird aus einem gegebenen Datensatz in einer heuristischen Suche eine Vielzahl möglicher Alignments generiert und anschließend in einer phylogenetischen Rekonstruktion nach dem Parsimonie Prinzip für jedes ermittelte Alignment eine Topologie erzeugt, für die dann schließlich die benötigte Anzahl der Substitutionen (Schritte) berechnet wird. Dieser Vorgang wird so häufig wiederholt, bis das Alignment und die dazugehörige Topologie mit der kürzesten Schrittanzahl festgestellt ist. Somit wird ein konsequenter Weg der gewählten Parameter garantiert, von der Erzeugung eines Alignments bis zur phylogenetischen Rekonstruktion Phillips et al. (2000). Insbesondere für die Analyse nicht-proteincodierender Gene, bei denen das Einfügen von ``indels´´(=Insertion/Deletion) die Positionshomologie der benachbarten Nukleotide enorm beeinflussen, findet das Programm breite Zustimmung. Ein großer Nachteil ist, dass die Analyse eine enorm hohe Rechenzeit benötigt.
Testverfahren bezüglich der Zuverlässigkeit einzelner Topologien
Um Qualität und Stabilität der Cladogramme, insbesondere einzelner Monophyliehypothesen, zu testen, bieten sich mittlerweile eine große Anzahl verschiedener Testmöglichkeiten an, von denen hier eine kleine Auswahl zum Einsatz kommen.
``Bootstrap´´ Analyse
Dieser Test wurde für alle Parsimonie Cladogramme angewendet. Die ``bootstrap´´ Analyse (Felsenstein, 1985) besteht aus einer Generierung von zufällig veränderten Datensätzen (Replikaten). Die Änderung des ursprünglichen Datensatzes erfolgt in der zufälligen Löschung einzelner Merkmale und gleichzeitiger Verdopplung anderer Merkmale im Alignment. Für jedes auf diese Weise generierte Alignment (i.d.R. 1000 Replikate) wird die optimale Topologie berechnet. Aus allen Topologien wird im zweiten Schritt ein Consensusbaum berechnet, der an jedem Monophylum die prozentuale Unterstützung ausweist, also die Häufigkeit mit der dieses Monophylum in allen artifiziellen Datensätzen vorkommt. Sofern im Text erwähnt, werden die ``bootstrap´´ Werte mit „BA“ abgekürzt.
``Decay´´ Index oder Bremer ``support´´
Die Berechnung des Bremer ``supports´´ Bremer (1994) ist eine indirekte Überprüfung, durch wieviele Apomorphien ein Monophylum gestützt wird Wägele (2000) und wird hier als Alternative oder parallel zum ``bootstrap´´ Verfahren angewendet. Der Bremer Index gibt für jedes Monophylum eines Cladogramms an, wieviele Schritte notwendig sind, um eine Schwestergruppenbeziehung zu Fall zu bringen. Die angegebenen Werte sind ganze Zahlen von 1 - ¥ (abhängig von der Anzahl der Apomorphien in einer Schwestergruppenbeziehung). Im Text wird der ``decay´´ Index mit „DI“ abgekürzt. Zur Berechnung der ``decay´´ Indices wird das Programm NONA genutzt.
``Quartet- Puzzling- support´´ (TREE-PUZZLE)
Dieser Test ist im Programm TREE-PUZZLE Vers. 5.0 implementiert und wird für die ML Analysen der beiden 12S Alignments für alle Branchiopoda, sowie die der Astacoidea angewendet. Der ``Quartet-Puzzling-support´´, im folgenden ``QP-support´´ genannt, ist der ``bootstrap´´ Analyse insofern ähnlich, als das für jedes Monophylum eine prozentuale Unterstützung errechnet wird. Dieser Wert ermittelt sich allerdings nicht aus der artifiziellen Änderung des Datensatzes (s. o. ``bootstrap´´ Analyse), sondern beschreibt die Häufigkeit der gefundenen Monophyla während des Quartet-Puzzling -Prozesses unter dem ``50% majority rule consensus´´ Margush undMcMorris (1981). Dieser ``QP-support´´ wird anschließend auf die dargestellten besten ML Stammbäume (Branchiopoda) bzw. ``50% majority rule consensus´´ Dendrogramme der Astacoidea übertragen.
Sensitivitätsanalyse (POY)
Mittels einer Sensitivitätsanalyse Wheeler (1995) (´``gap X´´ oder ``molecularmatrix Y´´) wird der 12S rDNA-Datensatz unter verschiedenen Gewichtungsannahmen berechnet (Transitionen: Transversionen: Indels = 1:1:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:2:4, 1:1:10). Auf diese Weise können Aussagen über die Robustheit einzelner Monophylien in der Gesamttopologie gemacht werden. Das Schema 1:1:2 gilt hierbei als die für Arthropoda favorisierte Gewichtung Wheeler (1995),Whiting et al. (1997).
Kishino-Hasegawa-Test
Durch dieses Testverfahrens ist es möglich, verschiedene Hypothesen (Topologien) bezüglich ihrer Signifikanz zu überprüfen. Es erlaubt eine Bewertung von unterschiedlichen Cladogrammen bzw. Dendrogrammen auf der Basis des 5% Signifikanzlevels. Der K-H-Test Kishino undHasegawa (1989) kommt in zweifacher Hinsicht zum Einsatz, einerseits bei der Ermittlung der wahrscheinlichsten und aller nicht signifikant schlechteren Topologien nach einer Quartet-Puzzle-Analyse (wie oben beschrieben) andererseits für eine Hypothesenbewertung der Topologien aus den Parsimonie und ML Analysen. Dabei werden von jeweils beiden Hypothesen die ``log likelihood´´ Werte unter den Parametern der zugrundegelegten Modelle verglichen, d.h. beide Hypothesen werden bezüglich ihrer Signifikanz in den Wahrscheinlichkeitswerten gegeneinander getestet.
``Likelihood mapping´´
Das ``likelihood mapping´´´´Strimmer undvon Haeseler (1997) (implementiert im Programm TREE-PUZZLE, Vers. 5) ist eine graphische Methode, die die phylogenetische Information eines Datensatzes a priori visualisiert und einen ersten Eindruck über die Qualität der zu erwartenden phylogenetischen Analyse vermittelt. Die Methode basiert auf der Wahrscheinlichkeitsberechnung aller möglichen Quartet-Topologien. Jede Topologie wird mittels eines Punktes in einem Dreieck dargestellt, wobei die Aussage über die Wahrscheinlichkeit einer Topologie durch die Lage im Dreieck bestimmt wird. Die drei Eckpunktregionen repräsentieren die Situation, in der eine Topologie über die beiden anderen klar favorisiert werden kann. Punkte im Bereich der Seitenkanten repräsentieren die Situationen, in denen nicht eindeutig eine Topologie favorisiert wird. Das Zentrum umfasst die Menge der Topologien, die nicht aufgelöst sind (``star-like´´). Das heißt, je stärker sich die Punktwolken in den Eckpunkten des Dreiecks konzentrieren, desto größer ist das phylogenetische Signal des Datensatzes.

Das ``likelihood-mapping´´ kann auch zur Überprüfung von Hypothesen herangezogen werden Strimmer undvon Haeseler (1997). Zu diesem Zweck werden verschiedene Spezies des Alignments in einem Cluster zusammengefasst und einem oder mehreren anderen zu definierenden Clustern gegenübergestellt (maximal vier Cluster). Jedes Cluster wird somit als Monophylum behandelt. Nach dem gleichen Prinzip wie oben beschrieben, werden die Beziehungen dieser Cluster (Monophyla) zueinander in einem Dreieck dargestellt, wobei jede Ecke eine Hypothese bezüglich der wahrscheinlichen Schwestergruppenbeziehungen der maximal vier Cluster darstellt.

Beide Methoden des ``likelihood mappings´´ finden für die Datensätzen der Astacoidea Anwendung.
Die 12S Datensätze der Branchiopoda und Astacida Branchiopoda
In der vorliegenden Arbeit werden zwei Alignments des 12S rRNA Datensatzes für die Parsimonie Analysen und Maximum Likelihood Analysen der Branchiopoda erstellt. Ein Alignment folgt hierbei strikt dem Parsimonie Prinzip und wird mit dem Programm POY berechnet, ein weiteres Alignment wird visuell anhand der Sekundärstruktur erstellt (siehe auch Kapitel: 3.1.2.5), wobei die ``loop´´-Bereiche (sofern in Länge zwischen den Taxa unterschiedlich) mit Clustal X (``default´´) aligned werden.

Für die POY Analyse wird der 12S Datensatz zunächst in drei sinnvolle Teile geteilt, wobei jeder Teilbereich mit einer ``stem´´-Hälfte beginnt und endet. Die drei Teildatensätze werden im ersten Schritt getrennt voneinander aligned, jeweils die kürzeste Schrittanzahl benötigend und im zweiten Schritt zusammengesetzt.

Der erste Datensatz umfasst die ``stem´´-Hälften 27’, 22’ und 31’, der zweite Datensatz erstreckt sich von ``stem´´ 32 bis 33’ und der letzte Datensatz von ``stem´´ 48 bis 32’ (Abbildung 5). Es sei an dieser Stelle deutlich darauf hingewiesen, dass die Analyse der Sekundärstruktur für diese Berechnung nur zur sinnvollen Teilung des Datensatzes herangezogen wird. Die Berechnung der drei Datensätze erfolgt nicht auf der Basis der sich innerhalb der Datensätze befindlichen Sekundärstrukturen.

Die POY Analysen werden mittels der Kommandokaskade „maxtrees 10, fitchtrees, checkslop 10, multibuild 10, treefuse, buildmaxtrees 5, treefuse, random 100, stopat 5 und minstop 3“ durchgeführt. Aus den so ermittelten, gleich sparsamen Cladogrammen wird das ``strict consensus´´ Cladogramm mit der favorisierten Gewichtung 1:1:2 ermittelt (jack2hen.exe) errechnet. ``Decay´´ Indices Bremer (1994) werden mit dem Programm PHAST kalkuliert: „ hold X, sub Y, find, bs“. Anschließend wird noch eine Sensitivitätsanalyse durchgeführt, um die Stabilität einzelner Verzweigungen unter anderen Gewichtungen zu überprüfen (siehe Kapitel: 2.2.7.5.4).
Astacida
Der 12S rRNA Datensatz der Astacida wird mit dem Programm Clustal X (``default´´) aligned und visuell bezüglich der korrekten Positionshomologien anhand der Sekundärstruktur der dritten Domäne überprüft.
Erstellung der Nukleotidalignments der proteincodierenden
Gene der Branchiopoda und Astacida
Die proteinkodierenden Bereiche der Gene EF-1α der Branchiopoda und cox1 der Astacida werden ohne Ambiguitäten aligned, insofern stellt sich hier die Frage nach dem „richtigen“ Alignment nicht. Es wird das Programm Clustal X unter ``default´´ Optionen angewendet. Während der Datenerhebung offenbarte sich die Existenz kleiner hochvariabler Introns im Gen EF-1α der Branchiopoda. Eine Homologisierung der Intronsequenzen lässt sich allerdings nicht rechtfertigen, daher werden die Intronsequenzen vor der Erstellung des Alignments entfernt.