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1  Zusammenfassung

Die allogene Organabstoßung stellt trotz des Einsatzes von modernen Immunsuppressiva das zentrale Problem in der Transplantationsmedizin dar. In den letzten Jahrzehnten intensiver Forschung ist deutlich geworden, dass CD4+ Lymphozyten eine bedeutende Rolle bei der spezifischen Transplantatabstoßung spielen. Die frühzeitige Inhibierung der Entstehung von Transplantat-infiltrierenden CD4+ Lymphozyten kann folglich zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit oder sogar zur Toleranz führen. Die Entstehung und Aktivierung dieser Zellen findet im regionalen Lymphknoten (LN) und im Transplantat (Tx) statt. Durch die lokale Überexpression von immuninhibitorischen und immunmodulatorischen Molekülen kann die Entstehung und Aktivierung dieser Transplantat-infiltrierenden CD4+ Zellen inhibiert werden. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass alloantigen-spezifische T-Lymphozyten ein geeignetes Transportvehikel für fluoreszierende Marker-Moleküle darstellen. Es konnte sowohl ein allospezifisches Migrationsverhalten dieser Zellen, als auch eine Expressionssteigerung des Reportergens unter alloantigen-spezifischer T-Zellaktivierung nachgewiesen werden. Aus diesem Grund stellt der adoptive Transfer von genetisch modifizierten und alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten eine Möglichkeit dar, therapeutisch wirksame Proteine lokal zu exprimieren, und die Immunantwort des Transplantatempfängers dahingehend zu verändern, dass es zur Transplantatakzeptanz oder Toleranz gegenüber dem Spenderorgan kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde an Stelle eines Marker-Proteins das immunmodulatorische Molekül virales Interleukin-10 (vIL-10) eingesetzt. Das vom Epstein-Barr-Virus abstammende Interleukin-10 Homolog wurde mittels retroviralen Gentransfer stabil in das Genom von alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten integriert. Dazu wurde als erstes der retrovirale Vektor pLXSN-vIL-10 hergestellt und anschließend eine Verpackungszelllinie für die stabile Produktion eines vIL-10 transgenen Retrovirus generiert. Durch die Kokultivierung der Verpackungszelllinie mit einer gemischten Lymphozytenkultur (MLC), bestehend aus den „responder“ T-Zellen und bestrahlten, als Alloantigen dienenden T-Zellen, wurden alloantigen-spezifische und für vIL-10 transgene T-Zellen generiert. Über mehrere Restimulations- und Selektionsschritte erfolgte die Herstellung einer spezifischen und das Transgen stabil exprimierenden T-Zelllinie (TvIL-10-Lymphozyten). Ein Vergleich der TvIL-10-Lymphozyten mit TEGFP-Lymphozyten und einer nicht transgenen T-Zelllinie (TMOCK-Lymphozyten) als Kontrollen ergab keine signifikanten Unterschiede im Zytokinexpressionsmuster auf Protein- und RNA-Ebene, so dass der Th1 Phänotyp der T-


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Lymphozyten durch die virale Transduktion und Expression von vIL-10 nicht verändert wurde. Der Phänotyp der TvIL-10-Lymphozyten (IL-10+, IFN-g+, CD25+, IL-4-) ähnelt dem von regulatorischen T-Zellen. Das immunmodulatorische Potential der TvIL-10-Lymphozyten konnte zunächst in vitro nachgewiesen werden. Sowohl die Proliferation als auch die IFN-g Produktion von naiven Lymphozyten konnte durch die Kokultivierung mit TvIL-10-Lymphozyten und gleichzeitiger allogener Stimulation signifikant verringert werden. Die Aktivierung von Transplantat-infiltrierenden CD4+ T-Lymphozyten und deren klonale Proliferation geht einher mit einer hohen Expression von IFN-g. Eine Inhibierung von IFN-g führt folglich zu einer verminderten Alloreaktivität der T-Zellen. Im Anschluss an die erfolgreichen in vitro Experimente wurden die alloantigen-spezifischen TvIL-10-Lymphozyten auf ihre Wirksamkeit in einem Ratten-Herz-Transplantationsmodell mittels adoptivem Transfer getestet. Eine erhöhte Einwanderung der TvIL-10-Lymphozyten in das allogene Transplantat konnte nachgewiesen werden. Es konnte jedoch keine Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit der heterotop transplantierten Herzen nach adoptivem Transfer von 15 Millionen TvIL-10 Lymphozyten erreicht werden. Auch der Einsatz einer suboptimalen, immunsuppressiven Kombinationstherapie mit Cyclosporin A (0,5 mg/kg Körpergewicht) und 3 bzw. 15 Millionen TvIL-10Lymphozyten führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit. Warum die TvIL-10-Lymphozyten ihr immunmodulatorisches Potential in vitro, aber nicht in vivo ausüben können, ist derzeit unklar und Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Hypothese:Das entwickelte System zur Inhibierung bzw. Modulierung der allogenen Immunantwort durch die Überexpression von therapeutischen Molekülen, mittels retroviral modifizierter T-Lymphozyten, ist in vitro erfolgreich. Aber der Th1 Phänotyp der TvIL-10-Lymphozyten inhibiert möglicherweise die Modulierung der Immunantwort in vivo. Die Entwicklung von TvIL-10-Lymphozyten, die einen Th2 Phänotyp besitzen und somit weniger bzw. kein IFN-g produzieren, verspricht Erfolge in vivo. Des weiteren sind ausführliche kinetische Untersuchungen zur zeitlichen Applikation der transgenen Zellen notwendig, um herauszufinden, wann die Anwesenheit von vIL-10 zu einen immunmodulatorischen Effekt in der initialen Immunantwort führt.


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24.10.2003