[Seite 7↓]

2  Einleitung

Die Transplantation von Geweben und Organen stellt heute bei Patienten mit irreversiblen Nieren-, Haut-, Herz-, Lungen, Kornea- und Leberschäden eine bedeutende therapeutische Option dar. Die Erfolge der Organtransplantation mit einem Patienten- und Transplantatüberleben von teilweise deutlich über 80% nach einem Jahr sind neben einer Verbesserung der operativen Technik, der Organkonservierung und der Patientenselektion vor allem auf den Einsatz von immunsuppressiv wirkenden Medikamenten zur Verhinderung der Transplantatabstoßung zurückzuführen (Ciancio et al, 2000). Diese Fortschritte in der modernen Transplantationsmedizin in den letzten 20 Jahren resultieren im wesentlichen aus den Erkenntnissen der Zusammenhänge von Aufbau und Funktionsmechanismen des menschlichen Immunsystems. Trotz der großen Erfolge ist das Problem der Transplantatabstoßung noch lange nicht zufriedenstellend gelöst. Zum einen führt der Einsatz der konventionellen Immunsuppression (Glukokortikoide, Calcineurinantagonisten, Proliferationshemmer) zur Schwächung des gesamten Immunsystems. Dadurch kann es zu Komplikationen mit opportunistischen viralen Infektionen (EBV, CMV), zur Manifestation von Tumoren oder zu toxischen Auswirkungen der Medikamente auf nichtimmunologische Organe kommen (Reinke et al, 1999; Penn, 2000). Zum anderen ist das Problem der chronischen Transplantatabstoßung nicht gelöst, so dass es zu keiner Verbesserung der Langzeitüberlebensraten der transplantierten Organe in den letzten Jahren gekommen ist (Tejani and Emmett, 2001). Die heutigen Behandlungsprotokolle in der Transplantationsmedizin führen lediglich zu einer Akzeptanz, nicht aber zu einer Toleranz des Spenderorgans. Ziel der Transplantationsforschung ist deshalb die Induktion einer spender-spezifischen lebenslangen Toleranz, bei der die Immunkompetenz des Empfängers erhalten bleibt.

2.1 Transplantation und Rejektion

Das Humane-Leukozyten-Antigen-System (HLA-System) des Menschen umfaßt ein komplexes System von Gewebeantigenen (membranassoziierte Glykoproteine), die auf allen kernhaltigen Körperzellen unterschiedlich stark exprimiert werden. Verantwortlich für die genetische Kodierung des HLA-Systems, auch Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC) genannt, sind Genorte auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6. Auf Grund eines extremen genetischen Polymorphismus existiert eine ungeheuer große Anzahl verschiedener


[Seite 8↓]

HLA-Phänotypen. Die HLA-Antigene auf den Organzellen des Spenders sind die wichtigsten Auslöser einer allogen gerichteten Immunantwort des Transplantatempfängers. Die an der Immunantwort beteiligten T-Zellen erkennen dabei spenderstämmige Peptide in Assoziation mit auf dem Transplantat exprimierten MHC-Antigenen. Die Bindung von T-Zellen an körpereigene MHC-Moleküle führt in der Regel zu keiner immunologischen Reaktion, wohingegen die Erkennung von allogenen MHC-Molekülen die Abstoßungsreaktion einleitet. Die Transplantatabstoßung wird auf Grund ihrer Geschwindigkeit, der Mediatoren und der beteiligten Zelltypen in 3 Stadien eingeteilt:

A) Die hyperakute Abstoßung setzt innerhalb von Minuten bis Stunden nach der Transplantation ein und führt in der Regel zu einem sofortigen und irreversiblen Organverlust (v.a. bei der Nierentransplantation). Sie beruht auf dem Vorhandensein von vorbestehenden Antikörpern der Klasse IgG und IgM beim Empfänger gegen Oberflächenantigene des Spendergewebes (Ito et al, 1984). Durch die Bindung dieser präformierten Antikörper an das Komplement findet eine Aktivierung der Komplementkaskade und damit eine Schädigung der Endothelzellauskleidung der Blutgefäße statt. Weiter ergibt sich eine intensive Infiltration des Spenderorgans durch polymorphkernige Leukozyten, die zur Bildung von Thromben und Nekrosen im Organ führt (Hernandez-Fuentes et al, 1999). Ursache ist oft ein vorangegangener Kontakt des Empfängers mit Fremdgewebe (Bluttransfusion, vorangegangene Transplantation, mehrfache Schwangerschaften), die zur Bildung entsprechender Antikörper und damit zu einer Sensibilisierung geführt haben. Eine hyperakute Abstoßung kann durch eine Kreuztestung verhindert werden, in der das Serum des Empfängers auf die Anwesenheit von zytotoxischen Antispenderantikörpern untersucht wird. Damit ist diese Abstoßungsform heute sehr selten geworden.

B) Die akute Abstoßung ist die typische, T-Zell-vermittelte Immunantwort, die am häufigsten zwischen der 2. und 6. Woche nach Transplantation auftritt. Sie wird ausgelöst durch die Alloantigenerkennung der empfänger-eigenen T-Lymphozyten, die als Folge dieses Kontaktes eine komplexe Kaskade von Effektormechanismen hervorruft. Eine wesentliche Rolle spielen dabei Botenstoffe (sogenannte Interleukine), die der Signalübermittlung von aktivierten Lymphozyten zu weiteren Abwehrzellen dienen und die damit einen wichtigen Angriffspunkt für die immunsuppressive Therapie darstellen. Histologisch kommt es bei der akuten Abstoßung zu einer massiven Infiltration von mononukleären Empfängerzellen in das Transplantat, welche zu einer beginnenden Gewebsschädigung führt. Die akute Abstoßung


[Seite 9↓]

kann heutzutage durch die Kombination geeigneter Medikamente in vielen Fällen vollständig verhindert werden. Eine Schwächung des Immunsystems durch die Immunsuppressiva und die damit verbundenen Komplikationen ist jedoch unumgänglich.

C) Die chronische Abstoßung tritt viele Monate oder sogar erst Jahre nach einer Transplantation auf und führt zu einer allmählichen Funktionsverschlechterung. Mikroskopisch findet man dabei unter anderem Verdickungen und Vernarbungen der kleinen Blutgefäße und der Glomerula (Niere) bzw. einen Verlust der Gallenwege (Leber), auch Herz und Lunge sind besonders von der vaskulären Abstoßungsform bedroht. Die genauen Mechanismen sind noch nicht vollständig erforscht. Diskutiert werden antigen-unabhängige und antigen-abhängige Mechanismen, die zur Vaskularisierung der Organe führen (Orosz and Pelletier, 1997). Weiter bestehen Zusammenhänge zwischen früheren akuten und späteren chronischen Abstoßungen, dem Grad der Vorschädigung des Transplantates (Spenderalter, Ischämiebelastung), der Vorbelastung des Transplantatempfängers mit bestimmten Virusinfektionen (CMV), sowie bestimmten Medikamenten, um nur einige Einflussgrößen zu nennen (Weis and von Scheidt, 1997). Insgesamt ist heute die chronische Abstoßung für den größten Teil der Transplantatverluste nach erfolgreicher Transplantation verantwortlich. Es gibt derzeit noch keine befriedigende Therapiemöglichkeit dafür.

2.2 Immunsuppressiva

Die neueren Immunsuppressiva nehmen einen selektiven Einfluss auf die Funktion des Immunsystems, indem sie die Bildung und Wirkung von Interleukinen verhindern, die Proliferation der T-Zellen verhindern, zur Antigenerkennung erforderliche Rezeptoren blockieren oder auf den intrazellulären Stoffwechsel der aktivierten T-Zellen einwirken. Besonders die Calcineurininhibitoren (Cyclosporin A, FK506) werden in der Transplantationsmedizin verstärkt eingesetzt. Es handelt sich um aus Pilzen gewonnene Substanzen, die eine ähnliche pharmakologische Aktivität besitzen. Insbesondere durch die Einführung des Cyclosporin A, ein zyklisches Decapeptid, ist es zu einer sprunghaften Verbesserung der Transplantationserfolge gekommen. Das Medikament führt zu einer Verminderung der Expression von Zytokinen, unter anderem der IL-2-Produktion, welches als Wachstumssignal für T-Zellen fungiert und eine Schlüsselfunktion in der Frühphase des Abstoßungsgeschehens besitzt. Der Wirkungsmechanismus wird vermittelt durch die Inhibierung der Phosphatase Calcineurin. Die Bindung von Cyclosporin A an Immunophiline


[Seite 10↓]

resultiert in der Inaktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT, welcher unter anderem die Transkription des IL-2 Gens steuert. Neben dieser sehr erwünschten Wirkung haben die Calcineurininhibitoren jedoch auch ein relevantes Toxizitätsprofil, vor allem können sie eine Störung der Nierenfunktion, Neurotoxizität, Hyperkaliämie und Hypertension bewirken (Dunn et al, 2001).

In den meisten Transplantationszentren werden heutzutage Kombinationstherapien mit verschiedenen Vertretern von Immunsuppressiva durchgeführt. Dadurch lassen sich im günstigen Fall die erwünschten immunsuppressiven Eigenschaften addieren, während die Toxizitäten der einzelnen Substanzen begrenzt werden können.

2.3 Die spezifische Immunantwort in der Transplantation

2.3.1 T-Zell Aktivierung und Kostimulatorische Moleküle

Die Aktivierung naiver T-Zellen durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs) ist der entscheidende erste Schritt der adaptiven Immunantwort. Die Erkennung eines Antigens erfolgt im Kontext mit dem MHC-Molekül über den T-Zell Rezeptor(Auchincloss and Sultan, 1996). Man unterscheidet zwei Typen von MHC-Antigenen . Klasse-I-Moleküle (HLA-A,-B,-C) werden konstitutiv auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert. Über sie findet im wesentlichen die Präsentation von intrazellulären Peptiden von Pathogenen statt, welche anschließend an den T-Zell-Rezeptor von CD8+ T-Zellen binden können. Neuere Untersuchungen zeigen, dass eine Aktivierung der CD8+ T-Zellen ebenso über professionelle APCs, die extrazelluläre Antigene von nicht-lymphatischen Geweben in Assoziation mit dem MHC I Molekül präsentieren, möglich ist. Dieser Mechanismus wird als „cross-presentation“ bezeichnet (Williams et al, 2002). Er ermöglicht dem Immunsystem, auf Mikroorganismen zu reagieren, die ausschließlich nicht-lymphatische Gewebe infizieren. Klasse-II-Moleküle (HLA-DR,-DQ) werden vorwiegend konstitutiv auf der Oberfläche von APCs, aber auch von aktivierten Endothelzellen exprimiert. Als professionelle APCs fungieren dendritische Zellen (DC), B-Lymphozyten, Langerhans-Zellen und Monozyten / Makrophagen. Antigene, die von aufgenommenen extrazellulären Erregern oder Toxinen stammen, werden nach der Phagozytose und proteolytischen Degradation von MHC-II-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert. Über den MHC-II-Antigen-Komplex findet die Aktivierung von CD4+ Zellen statt. Die Expressionshöhe der MHC-Moleküle kann durch Zytokine wie IFN-g erhöht werden. Die Bindung des T-Zell Rezeptors an das entsprechende Antigen in Kontext mit dem MHC-


[Seite 11↓]

Molekül wird als antigen-spezifisches Signal 1 der T-Zell Aktivierung bezeichnet. Zur vollständigen Aktivierung einer T-Zelle mit klonaler Proliferation und Differenzierung ist ein weiteres, nicht antigen-spezifisches, kostimulatorisches Signal 2 notwendig (Frauwirth and Thompson, 2002). Die am besten charakterisierten kostimulatorischen Signale werden über B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) auf den APCs und CD28 auf der T-Zelle, bzw. die CD40/ CD40L Interaktion vermittelt (Sharpe and Freeman, 2002). Erst die Kombination von Signal 1 und Signal 2 führt zur Aktivierung verschiedener zellulärer Transkriptionsfaktoren (NFAT, NFkB), welche wiederum zur verstärkten Synthese von Interleukin-2 (IL-2) beitragen (Shannon et al, 1995). Der T-Zell Wachstumsfaktor IL-2 bindet autokrin an den hochaffinen Interleukin-2 Rezeptor (IL-2R) und verstärkt die Aktivierung und Proliferation der aktivierten T-Zellen (Waldmann, 1993).

2.3.2 Effektormechanismen der T-Lymphozyten

Die spezifische Aktivierung der T-Lymphozyten spielt bei der initialen Abstoßungsreaktion eine zentrale Rolle. Nacktmäuse (Mäuse ohne reife T-Zellen) oder neonatal thymektomierte Ratten stoßen Transplantate nicht ab (Pennycuik, 1971). Bei jedem dieser Tiere kann die Fähigkeit zur Gewebsabstoßung mit der Inokulation von T-Zellen desselben Stammes wiederhergestellt werden (Kindred, 1974). Des weiteren wird die kritische Rolle der T-Lymphozyten durch die Tatsache verdeutlicht, dass die Depletion von CD3-positiven Zellen durch OKT3 (monoklonaler Antikörper gegen CD3) das Transplantat vor der Abstoßung schützt (Ode-Hakim et al, 1996). Studien mit CD4 bzw. CD8 T-Zell-depletierten Mäusen haben gezeigt, dass eine Abstoßung nur bei CD8 Depletion möglich ist (Campos et al, 1995). Dies lässt den Schluss zu, dass die T-Helfer-Zellen (Th-Zellen) die Initiatoren der Rejektion sind. Eine naive CD4+ T-Zelle differenziert sich nach ihrer spezifischen Aktivierung über den MHC-II-Antigen-Komplex zur unreifen Effektor T-Zelle (Th0) (Liew, 2002). Diese Zellen produzieren Zytokine wie z.B. IL-2, IFN-g und IL-4, die zur Stimulation der Effektormechanismen erforderlich sind. Aber auch andere Zellen des Immunsystems (Gedächtniszellen, Mast-Zellen, NK-Zellen, aktivierte Makrophagen) können diese Zytokine nach ihrer Aktivierung sekretieren. Die gebildeten Zytokine wirken parakrin auf CD8+ T-Lymphozyten, Makrophagen und B-Lymphozyten, indem sie ihre Proliferation und Differenzierung fördern. Naive CD8+ T-Zellen können auch direkt über professionelle APCs („cross-presentation“) und unabhängig von einer CD4+ T-Zell-Hilfe aktiviert werden, IL-2 zu


[Seite 12↓]

produzieren (Vasilakos and Michael, 1993). Dieses wirkt aurokrin auf die Proliferation und Differenzierung der CD8+ T-Zelle und trägt somit zur Entstehung von zytotoxischen Effektor T-Zellen bei. Dazu benötigen die Zellen jedoch eine hohe Präsenz an kostimulatorischen Molekülen auf den APCs. Auch hohe Dosen von Selbst-Antigenen können über APCs „cross-präsentiert“ werden, welches nicht zu einer Autoimmunität, sondern zu einem Antigen-induzierten Zelltod der CD8+ T-Zellen führt (Miller et al, 1998). Geringe Dosen an Selbst-Antigenen werden nicht „cross-präsentiert“. Der zytotoxische Effekt von CD8+ T-Lymphozyten nach Antigenerkennung kann über zwei Mechanismen vermittelt werden. Zum einen über die Bildung von lytischen Proteinen wie Granzymen und Perforin, und zum anderen über die Bindung des auf aktivierten zytotoxischen T-Zellen exprimierten Fas-Liganden an seinen Rezeptor Fas (Russell and Ley, 2002). Fas wird konstitutiv oder nach Aktivierung auf vielen Zellen exprimiert. Beide Mechanismen führen zur Apoptose der Zielzelle. Eine weitere Möglichkeit der Vermittlung von Effektorfunktionen durch zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten ist die Ausschüttung von Zytokinen, z.B. IFN-g (Pathan et al, 2000). Auf die CD4+ T-Zellen wirken die von Th0-Zellen synthetisierten Zytokine autokrin, indem sie ihre Differenzierung in Th1- oder Th2-Zellen fördern. Th1-Zellen zeichnen sich durch ein Zytokinprofil mit der Produktion von IL-2, IFN-g und TNF-a aus, welche wiederum Makrophagen aktivieren können und zur B-Zell abhängigen Produktion von opsonierenden Antikörpern führen. Es kommt zu einer zellvermittelten Entzündungsreaktion. Aktivierte Makrophagen und Endothelzellen wiederum können über die Produktion von Zytokinen zu der „Delayed-Type-Hypersensitivity“ (DTH)-Reaktion führen, eine der wichtigsten von CD4+ T-Lymphozyten induzierten Effektormechanismen (Lowry et al, 1996). Ausgehend vom Th1/Th2 Paradigma sind in der frühen Phase der Abstoßung hauptsächlich Th1 Zellen beteiligt (Mosmann et al, 1989). Die Aktivierung von Th2 Zellen führt zu einer vermehrten Produktion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13. Dadurch wird die Entstehung einer humoralen Immunantwort gefördert, einhergehend mit der Bildung von neutralisierenden Antikörpern durch aktivierte B-Zellen (Romagnani, 1991). Neben den Helfer- und Effektorfunktionen der CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten besitzen diese Zellen eine Gedächtnis- und eine regulatorische Funktion. Die Gedächtnisfunktion wird durch eine schnelle Aktivierung der Immunantwort nach erneutem Antigenkontakt vermittelt. Regulatorisch können diese T-Lymphozyten die Immunantwort inhibieren oder aktivieren über die Synthese anti-inflammatorischer bzw. regulatorischer Zytokine (IL-10, TGF-b) oder die


[Seite 13↓]

Expression von regulatorisch wirkenden kostimulatorischen Molekülen, z. B. CTLA-4 und ICOS (Shevach et al, 2001). Der CTLA-4 Rezeptor auf der T-Zelle besitzt eine höhere Affinität zu B7.1 und B7.2 als CD28 und verhindert als negativer Regulator eine chronische Stimulation der T-Zellen (Perez et al, 1997). ICOS hingegen induziert eine höhere IL-10 Produktion und erhöht somit die humorale Immunantwort (Hutloff et al, 1999). Neue Studien zeigen, dass die ICOS-Ligand Expression auf Endothelzellen zu einer verstärkten Sezernierung von Th1 und Th2 Zytokinen durch CD4+ Gedächtnis-T-Zellen führt (Khayyamian et al, 2002). Effektorzellen und Gedächtniszellen zeichnen sich im Besonderen dadurch aus, dass sie bei wiederholter Aktivierung auch ohne das kostimulatorische Signal 2 aktiviert werden können.

2.3.3 Th1 versus Th2

Bis zum heutigen Tag ist nicht vollständig geklärt, welche Mechanismen zur Ausbildung einer Th1 bzw. Th2 Immunantwort führen. Die Entdeckung von zwei unterschiedlichen T-Helfer Subpopulationen von Mosmann und Coffman im Jahr 1986 hat bis heute zahlreiche Fragen aufgeworfen. Es konnte gezeigt werden, dass Zytokine, die von Th1- (IFN-g) bzw. Th2- Zellen (IL-4) produziert werden, einerseits eine autokrine Wirkung als Wachstumsfaktor zur weiteren Expansion der eigenen Zellpopulation besitzen und gleichzeitig als reziproke Inhibitoren auf den anderen Zelltyp wirken (Gajewski et al, 1988). Weiter konnte in den kommenden Jahren gezeigt werden, dass IL-4, gebildet von Gedächtnis-T-Zellen, NK-Zellen, Mast-Zellen oder eosinophilen Granulozyten essentiell ist für die Induktion von antigen-spezifischen Th2-Zellen, abstammend von naiven Vorläufer T-Zellen (Swain et al, 1990). Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die Entwicklung einer T-lymphozytären Th2 Antwort in vivo in kompletter Abwesenheit von IL-4 möglich ist (Ouyang et al, 2000; Finkelman et al, 2000). Für die Ausbildung einer Th1-Antwort ist IL-12, gebildet von aktivierten Makrophagen oder Dendritischen Zellen in Kombination mit der T-Zell-Rezeptor Aktivierung ausschlaggebend.


[Seite 14↓]

Abbildung 1: Th1 und Th2 Immunantwort verändert nach Liew, Nature Rev Immunol. 2002 (THP = Vorläufer T-Helferzelle, TH0 = aktivierte, nicht polarisierte T-Helferzelle).

Durch zahlreiche klinische und experimentelle Untersuchungen liegen Hinweise vor, dass Th1 Zytokine eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der akuten Transplantatabstoßung spielen. So konnte im Ratten-Modell gezeigt werden, dass die Th1 Zytokinexpression in Transplantaten nach Toleranzinduktion, vermittelt durch einen nicht-depletierenden anti-CD4 Antikörper, deutlich supprimiert ist (Siegling et al, 1994a; Lehmann et al, 1997). Der Mechanismus dieser Toleranzinduktion ist nicht völlig klar, vor allem da eine Depletion von CD4+ T-Zellen nicht notwendig ist. Welche Rolle die Th2 Zytokine bei der Transplantatabstoßung spielen, ist nicht geklärt. Bei toleranten Tieren kommt es durch die alleinige Th2-Antwort nicht zur Transplantatabstoßung. Inwieweit Th2 Zytokine regulativ oder suppressiv auf die Th1 Zytokinexpression und Transplantat-infiltrierenden Zellen einwirken können, ist Gegenstand


[Seite 15↓]

vieler Forschungsprojekte. Untersuchungen mit IL-4 zeigen widersprüchliche Ergebnisse und werden kontrovers diskutiert. So führt die Applikation von rekombinantem IL-4 zu einer starken Reduzierung der Frequenz von IFN-g produzierenden Zellen (Merville et al, 1993). Der adenovirale Gentransfer in Transplantate führte aber in einigen Modellen nicht zur Verlängerung der Transplantatakzeptanz (Smith et al, 1997). Die Bedeutung der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 bzw. des ursprünglich aus EBV stammenden viralen Interleukin-10 (vIL-10) ist im Gegensatz zu IL-4 weniger umstritten. In unterschiedlichsten Modellen führt die virale oder nicht-virale Applikation der Zytokine zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit (Qin et al, 1995,DeBruyne et al, 1998). Das größte Problem vieler Arbeiten zum Zytokingentransfer liegt in ihrer Applikation. Bedingt durch die kurze Halbwertzeit von Zytokinen im Serum, muss nach einer Möglichkeit gesucht werden, das therapeutische Molekül lokal und stabil zu exprimieren, um eine systemische Applikation und die damit verbundenen Nebenwirkungen zu verhindern.

2.3.4 Direkte und indirekte Antigenerkennung

Die Voraussetzung einer spezifischen T-Zell-vermittelten Immunantwort ist die vollständige Aktivierung der T-Lymphozyten zu alloreaktiven Effektor-T-Zellen. Diese können direkt an die allogenen MHC I Moleküle des Transplantates oder an die MHC II Moleküle des allogenen Endothels bzw. der mit dem Transplantat transferierten Spender-APCs binden. Die stärksten Stimulatoren der T-Zelle sind die APCs oder dendritischen Zellen, die nicht nur das Fremdpeptid präsentieren, sondern auch die kostimulatorischen Aktivitäten aufweisen (Croft, 1994). Des weiteren wird die Rolle des Endothels in der T-Zell Aktivierung diskutiert (Pober et al, 1996).

Die T-Zell Aktivierung kann durch zwei unterschiedliche Arten der Antigenpräsentation vermittelt werden. Die direkte Antigenpräsentation wird über Donor-APCs z.B. sogenannte „passenger“-Leukozyten (DC) oder aktivierte Endothelzellen vermittelt. Diese wandern, z.B. durch den Stress der Transplantation angeregt, aus dem Organ heraus, und migrieren zum regionalen Lymphknoten. Dabei kommt es zur Hochregulation der kostimulatorischen Moleküle. Im Lymphknoten findet das „priming“ der naiven Rezipienten T-Lymphozyten statt, die den entsprechenden T-Zell-Rezeptor tragen. Anschließend wandern die geprimten alloreaktiven T-Lymphozyten in das Transplantat und können dort direkt auf die Donor-Antigene in Form einer alloreaktiven Effektor-T-Zelle reagieren (Lalor and Adams, 2000).


[Seite 16↓]

Konsequenterweise führtdie Depletion der im Transplantat enthaltenen Donor-APCs, z.B. durch Antikörper, zu einer verzögerten Transplantatabstoßung (Benichou, 1999). Die indirekte Antigenpräsentation findet über die Rezipienten-APCs statt (Sayegh and Carpenter, 1996). Dazu werden die Fremdproteine des Spenderorgans durch einwandernde DCs und APCs des Rezipienten phagozytiert, prozessiert und anschließend in Verbindung mit den benötigten kostimulatorischen Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert. Das „priming“ von naiven T-Lymphozyten findet wie bei der direkten Antigenpräsentation in den regionalen Lymphknoten statt (Gould and Auchincloss, 1999). In der frühen Phase der Abstoßung überwiegt der direkte Weg der Antigenpräsentation und führt zu starken Immunreaktionen. Bei der chronischen Rejektion ist der indirekte Weg dominant. Die Immunantwort ist dabei schwächer ausgeprägt als bei der direkten Antigenpräsentation. Grundlage dafür ist das Absterben der „passenger“-Leukozyten in sämtlichen Organen mit Ausnahme der Leber (Cjte et al, 2001). Die hohe Frequenz alloreaktiver T-Lymphozyten in starken Abstoßungsmodellen wird der direkten Antigenpräsentation zugeschrieben, ebenso wie die direkte Zytotoxizität ausschließlich durch eine direkte Alloantigen-Erkennung hervorgerufen werden kann. Nichtsdestoweniger sind indirekt „geprimte“ T-Lymphozyten für die Aktivierung von Makrophagen verantwortlich, was zur Infiltration dieser Zellen in das Gewebe und zur Fibrosierung führt. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass indirekt geprimte T-Lymphozyten eine Rolle bei der Entwicklung einer Alloantikörper-Antwort gegen das Transplantat spielen.

2.3.5 Migration von T-Lymphozyten

Die primären lymphatischen Organe sind der Hauptort der Lymphopoese. Bei Säugetieren reifen T-Lymphozyten im Thymus und die B-Lymphozyten in der fetalen Leber sowie im Knochenmark. Zu den sekundären lymphatischen Organen zählen die Lymphknoten, die Milz und Schleimhautstrukturen wie Tonsillen und Peyer-Plaques im Darm. Das Gewebe des sekundären lymphatischen Systems bildet die Umgebung, in welcher die Lymphozyten miteinander und mit den Antigenen reagieren, und es dient dazu, eine angelaufene Immunantwort in Gang zu halten. Nach der Reifung im Thymus verlassen die Lymphozyten diesen und zirkulieren zwischen den sekundären lymphatischen Organen, dem Gewebe und der Blutbahn. Als Austrittspforte aus der Blutbahn werden spezialisierte postkapilläre Venolen, die ein hohes Endothel besitzen (high endothelial venule, HEV) bevorzugt. Bei lokalen Entzündungen führt die Bildung der Zytokine IL-1, TNF-a und IFN-g zu einer Aktivierung der umgebenen Endothelzellen mit verstärkter Expression der Adhäsionsmoleküle


[Seite 17↓]

P-Selektin, E-Selektin, ICAM und VCAM (Pober et al, 1996; Hammer et al, 2001). Außerdem werden Chemokine wie IL-8 oder MCP-1 gebildet und den Leukozyten über die Kopplung von Proteoglykanen präsentiert. Die auf der aktivierten Endotheloberfläche „entlangrollenden“ Lymphozyten erkennen die Chemokine, was wiederum zu der verstärkten Expression der Integrine LFA-1 und VLA-4 auf der Lymphozytenoberfläche führt (Briscoe et al, 1998). Die feste Bindung der Integrine an ihre Liganden ICAM und VCAM führt anschließend zu einer verstärkten Transmigration der Leukozyten ins Gewebe (Kirbey, 1996; Coito and Kupiec-Weglinski, 1996).

2.4 Toleranz

Als Toleranz wird das Ausbleiben einer Immunantwort gegen ein spezifisches Antigen bezeichnet, ohne dass die normale Immunkompetenz beeinflusst wird (Medawar et al, 1986). Die Toleranz gegen Selbst-Antigene ist eine essentielle Grundlage unseres Immunsystems, ohne die das Immunsystem das eigene Gewebe zerstören würde, wie es z.B. bei Autoimmunerkrankungen der Fall ist. Bei der Entstehung einer Transplantattoleranz haben die T-Lymphozyten eine Schlüsselfunktion, die auf ihre bedeutende Rolle bei den Rejektionsprozessen zurückzuführen ist. Es konnte bereits eine Toleranzinduktion in Nagern durch die Behandlung der Transplantatempfänger mit einem anti-CD4 mAk induziert werden (Lehmann et al, 1992). Dieser Ak ist gegen den CD4-Rezeptor gerichtet und modifiziert das TCR-vermittelte Signal 1. Die benötigte Dosis an Ak ist jedoch so hoch, dass eine Übertragung in das humane System kaum möglich ist, so dass alternative Wege zur Toleranzinduktion von großer Bedeutung sind. Es wird, in Abhängigkeit des Entstehungsortes, zwischen zentraler (Induktion im Thymus) und peripherer Toleranz (Induktion im peripheren lymphatischen System) unterschieden. Weiter können mindestens vier verschiedene Mechanismen bei der Toleranzentstehung unterschieden werden:

1) Die zentrale Deletion von T-Zellen im Thymus. Dieser als negative Selektion bezeichnete Prozess zeichnet sich durch die Deletion aller Thymozyten aus, die Autoantigene auf den Selbst-MHC-Komplex der APCs im Thymus erkennen. In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass nach Injektion von allogenen Peptiden oder Zellen in den Thymus des Transplantatempfängers eine Toleranz gegenüber dem Allo- Transplantat entsteht (Shimomura et al, 1995; Oluwole et al, 1997).


[Seite 18↓]

2) Die periphere Deletion von T-Lymphozyten. Diese kann einerseits durch Fas/FasL-Wechselwirkung verursacht werden, so dass es zur Apoptose von CD4+ als auch CD8+ T-Zellen kommt (Van Parijs and Abbas, 1998). Weiter spielt die vorhandene Antigenmenge, die mittels Peptid-MHC-Komplexes präsentiert wird, eine große Rolle. Hohe Antigenmengen sowie die Applikation von hohen Dosen an anti-CD3-Antikörpern fördern die Induktion der Apoptose (Witzke et al, 1998).

3) Anergie: Die Antigenerkennung von naiven T-Zellen in Abwesenheit von kostimulatorischen Molekülen induziert einen Zustand der „Nichtreaktivität“, auch als Anergie bezeichnet. Die Zellen können kein eigenes IL-2 produzieren, wodurch sie weder proliferieren noch zu Effektorzellen ausdifferenzieren können. Auch ein erneuter Antigenkontakt der anergen Zelle mit einer APC und dem erforderlichen kostimulatorischen Signal 2 führt nicht zu einer Aktivierung dieser Zelle. Dieser reaktionslose Zustand kann in vitro durch die Zugabe von hohen Konzentrationen IL-2 aufgehoben werden (Beverly et al 1992). Die Anergie spielt eine große Rolle bei der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz gegen Gewebsantigene, die nicht im Thymus während der negativen Selektion präsentiert wurden.

4) Regulation/Suppression: Das Vorhandensein von regulatorischen bzw. suppressiv wirkenden T-Zell-Populationen kann durch das Modell der „infektiösen Toleranz“ erklärt werden (Cobbold and Waldmann, 1998; Onodera et al, 1998). In diesem Modell kann die Abstoßung eines transplantierten Organs durch den adoptiven Transfer von T-Zellen, die aus einem toleranten Tier (a-CD4) gewonnen wurden, vollständig verhindert werden (Qin et al, 1993). Des weiteren konnte gezeigt werden, dass der Transfer von diesen regulatorisch wirkenden T-Zellen zu einer Umprogrammierung der naiven alloreaktiven T-Zellen zu regulatorischen Zellen im Rezipienten führt. Allerdings gelang der Versuch nur in einem schwachen Abstoßungsmodell. Mit Hilfe eines nicht-depletierenden anti-CD4 mAk gelang es, dieses auch in einem starken Transplantat-Rejektionsmodell der Ratte zu zeigen (Onodera et al, 1996).

Es konnte gezeigt werden, dass eine lang anhaltende Stimulation mit IL-10 in vitro zu der Generierung von regulativen T-Zellen führt. Diese Zellen besitzen das Potential, durch die Inhibierung der Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten, die Entstehung einer akuten Schleimhautentzündung des Dickdarms (Kolitis) zu verhindern (Groux et al, 1996; Groux et al, 1997). Verstärkte Bemühungen gehen in die Richtung, regulatorische oder suppressive


[Seite 19↓]

Zellen in vivo durch die Applikation von immunmodulatorischen Substanzen zu erzeugen. Dafür werden vor allem Moleküle eingesetzt, die die T-Zell Aktivierungssignale 1 und/oder 2 hemmen z.B. monoklonale nicht-depletierende Antikörper gegen CD4, CD8 oder CTLA-4Ig. Bis heute konnte keine exakte Charakterisierung und Phänotypisierung der regulatorischen Zellen erreicht werden. Hilfreiche Oberflächenmarker zur Unterscheidung zwischen funktionellen Gruppen der CD4+ T-Lymphozyten sind CD25 (a-Kette des IL-2 Rezeptors) und CD45RB (Maus), CD45RO (Human) bzw. CD45RC (Ratte). CD45RB ist die niedermolekulare Isoform von CD45, die auf Gedächtnis-T-Zellen exprimiert ist. Es konnte gezeigt werden, dass der Transfer von CD25+ depletierten Milzzellen in Nacktmäuse zur Entwicklung einer organspezifischen Autoimmunerkrankung führt, wohingegen der Kotransfer von CD25+ Zellen dieses verhinderte (Annacker et al, 2001). Zahlreiche Versuche konnten bestätigen, dass eine CD4+CD25+ T-Zell-Population existiert, die regulatorische und auch suppressive Eigenschaften besitzt (Sawitzki et al, 2001). So verhindert der adoptive Transfer von ex vivo kultivierten CD4+CD25+ T-Zellen eine Immunreaktion, ausgelöst von den Immunzellen des Spenderorgans (graft-versus-host disease, GVHD) (Taylor et al, 2002). Es ist aber bislang weder geklärt, wie der exakte Mechanismus dieser Zellen aufgebaut ist, noch ob diese Zellen im Thymus oder in der Peripherie gebildet werden. Der Thymus scheint jedoch eine wichtige Funktion bei der Entstehung von Toleranz zu besitzen. So kommt es zu keiner Entstehung von regulatorischen Zellen in thymektomierten Tieren während einer anti CD4-Therapie (Kazuhiko et al, 1998). Neuere Untersuchungen zeigen, dass der Funktionsmechanismus der CD4+CD25+ Zellen nicht antigen-spezifisch ist (Thornton and Shevach, 2000). Eine direkte Suppression der CD8+ durch CD4+CD25+ T-Zellen konnte in vitro gezeigt werden. Sowohl die Proliferation als auch die IFN-g Produktion der CD8+ Zellen wurde in Abwesenheit von APCs inhibiert, als Wirkungsmechanismus werden Zell-Zell-Kontakte diskutiert (Piccirillo et al, 2001). In den letzten Jahren wurde außerdem eine CD4+CD25- T-Zell Population identifiziert, die in die Toleranzinduktion bei Transplantationen involviert ist und immunregulatorische Eigenschaften besitzt (Graca et al, 2002). Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellpopulation bei der Unterdrückung einer entzündlichen Darmerkrankung (IBD) (Annacker et al, 2000) und beim Schutz gegen den autoimmun vermittelten Diabetes eine Rolle spielt (Stephens and Mason,2000). Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen Zytokinexpression und der Entstehung von regulatorischen T-Zellen konnte bis heute noch nicht nachgewiesen werden (Baecher-Allan et al, 2001). Die


[Seite 20↓]

Applikation von neutralisierenden Antikörpern gegen IL-4, IL-10 oder TGF-b führt nicht zur Verminderung der durch CD4+CD25+ T-Zellen vermittelten Suppression. Weiter zeigen auch die CD25+ T-Zell-Populationen von IL-4-/- und IL-10-/- „knock-out“-Mäusen kompetente suppressive Eigenschaften in vitro (Thornton et al, 1998). Andere Untersuchungen in Haut-Transplantationsmodellen zeigen, dass die Blockade von IL-10 und CTLA-4 zu einer Verminderung der immunregulatorischen Eigenschaften von CD4+CD25+ T-Zellen führt (Kingsley et al, 2002). Dies deutet auf einen direkten Zusammenhang zwischen IL-10 und CTLA-4 Expression und regulativen Potential von CD4+CD25+ Zell-Populationen hin. Die Vielzahl der Untersuchungen und Ergebnisse machen deutlich, wie komplex die Immunregulation aufgebaut ist, und dass viele Regulationsmechanismen und alternative Wirkungswege noch nicht aufgeklärt sind. IL-10 und zelloberflächen-gebundenes TGF-b werden als wichtige Zytokine im Zusammenhang mit suppressiv und regulatorisch wirkenden T-Zellen diskutiert (Nakamura et al, 2001). Regulatorische CD4+ T-Zellen scheinen in vielen Modellen eine wesentliche Rolle für den Erhalt und möglicherweise auch für die Induktion der Toleranz zu spielen.

2.5 Gentherapeutische Ansätze in der Transplantation

Gentherapeutische Ansätze sind definiert als das gezielte Einbringen von DNA-Molekülen in eine Zielzelle und die anschließende Expression des Proteins. Die gentherapeutischen Strategien zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit umfassen den Transfer von immunsuppressiven, immunmodulatorischen und Transplantat-protektiven Molekülen. Welche Methode für den Gentransfer eingesetzt wird, hängt von zwei wichtigen Parametern ab: Zum einen von dem Expressionsort des Transgens (intrazelluläre und membranständige Moleküle verlangen einen effizienteren Gentransfer als sezernierte Proteine) und zum anderen von der Zielzelle (ruhende / proliferierende Zelle oder Expression des viralen Rezeptors auf der Zielzelle). Weitere wichtige Aspekte sind die Expressionshöhe und Regulierbarkeit des Transgens (Wood and Prior, 2001). Der Einsatz von gentherapeutischen Methoden in der Transplantation bietet ein enormes experimentelles und therapeutisches Potential. Vor allen die Möglichkeit der lokalen Expression von immunsuppressiven Molekülen könnte zu einer effizienten, örtlich begrenzten Immunmodulation führen, wobei systemische Effekte weitgehend reduziert werden. Aber auch systemische Anwendungen können bei einigen Erkrankungen zu Erfolgen führen. So konnte in einem Tiermodell des humanen Typ I


[Seite 21↓]

Diabetes die Entstehung des autoimmun vermittelten Diabetes durch die intramuskuläre Applikation von IL-10 exprimierenden Adenoviren verhindert werden (Goudy et al, 2001). Weiter besteht die Möglichkeit des ex vivo Gentransfers in das Organ des Spenders oder in Zellen des Immunsystems. Auf Grund dieser Kriterien steht nicht nur eine Vielzahl unterschiedlicher Expressionssysteme, sondern auch eine breitgefächerte Auswahl an potentiell therapeutischen Molekülen zur Verfügung. Die verschiedenen Ansatzmöglichkeiten innerhalb der gentherapeutischen Applikation lassen sich untergliedern in:

  1. Genexpression im Transplantat. Bei diesem gentherapeutischen Ansatz werden Zellen des Transplantates ex vivo transduziert und anschließend wird das Organ transplantiert. Vor allem der adenovirale und retrovirale Gentransfer wird bei diesem System genutzt, um verschiedenste therapeutische Moleküle in den Spenderzellen zu exprimieren. Der Vorteil liegt bei der anschließenden lokalen Expression der exprimierten Moleküle. Aber gerade der adenovirale Gentransfer zeichnet sich durch eine transiente Genexpression aus, so dass die Expression und die damit verbundene protektive Wirkung des therapeutischen Gens zeitlich begrenzt ist. Alternativen dazu bietet der retrovirale Gentransfer, der sich durch eine stabile, langanhaltende Genexpression auszeichnet. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei diesen Modellen ist der Umstand, dass die allogene Immunantwort nicht ausschließlich im transplantierten Organ, sondern auch in den sekundären lymphatischen Organen initiiert wird. Eine lokale Genexpression ausschließlich im Transplantat nimmt nur geringen Einfluss auf die immunologische Aktivierung der T-Zellen in den regionalen Lymphknoten, so dass es trotzdem zu einer Rejektion des Organs kommen kann.
  2. Genexpression in Zellen des Immunsystems. Die meisten Zellen des Immunsystems zeichnen sich durch ihre hohe Beweglichkeit innerhalb des lymphatischen und nicht-lymphatischen Systems aus. Des weiteren besitzen diese Zellen ein spezifisches Migrationsverhalten in Abhängigkeit der immunologischen Umgebung und Antigenpräsentation (Hammer et al, 2002). Der Gentransfer in bestimmte Zellen des Immunsystems (T-Lymphozyten, Dendritische Zellen, Vorläufer Knochenmark-Zellen) ermöglicht dadurch die lokale Expression von immunmodulatorischen und inhibitorischen Molekülen, die ein „Microenvironment“ ausbilden können, welches einen direkten Einfluss auf die Zellen oder Moleküle hat, die in der Transplantat-Erkennung und Destruktion involviert sind. Da sowohl die T-Zellen als auch die Dendritischen Zellen initial an der allogenen Immunantwort beteiligt sind, stellt die Überexpression von therapeutischen [Seite 22↓] Molekülen eine sehr gute Möglichkeit dar, lokal und vor allem an einem sehr frühen Zeitpunkt die allogenen Immunantwort zu modulieren. Der Gentransfer in Zellen des Immunsystems ist zur Zeit am effektivsten mittels retroviralem Gentransfer zu verwirklichen. In den letzten Jahren hat der Einsatz von Immunzellen als therapeutisches Transportvehikel immer mehr an Bedeutung gewonnen (Kirk et al, 2000; Bollard et al, 2001; Takayama et al, 2001).

Des weiteren stehen, bedingt durch die Komplexibilität des Immunsystems, eine große Auswahl an möglichen immunmodulatorischen und protektiven Molekülen für gentherapeutische Ansätze zur Verfügung.

  1. Die Blockade der kostimulatorischen Signale. Hauptansatzpunkt ist die Blockade der B7/CD28 und CD40L/CD40 Interaktionen mittels CTLA4Ig und anti-CD40L (Knechtle et al, 1999; Najafian et al, 2000; Yamada et al, 2001; Laskowski et al, 2002). Es konnte in verschiedenen Transplantationsmodellen gezeigt werden, dass die Blockade von kostimulatorischen Signalen zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führt, aber nicht zu einer permanenten Akzeptanz bzw. Toleranz (Guillot et al, 2002). Die größten Erfolge wurden in Transplantationsmodellen mit nicht-humanen Primaten erzielt (Kirk er al, 1999). Die Applikation der Ak oder Immunglobuline ist systemisch und kann zu Komplikationen, wie z.B. der Bildung von Thrombosen führen. Der Gentransfer von CTLA4Ig ist assoziiert mit einer nicht-spezifischen Inhibierung einiger, aber nicht aller Immunzellen. Interessanterweise führt die adenovirale CTLA4Ig Transduktion von Spender-DCs nach adoptiven Transfer in den Rezipienten zu einer stark verlängerten Transplantatakzeptanz (Lu et al, 1999; Takayama et al, 2000).
  2. Expression von anti-inflammatorischen Molekülen und Immundeviation. Bei diesen Ansätzen soll durch die Überexpression von Th2 Zytokinen (IL-4) oder anti-inflammatorischen Zytokinen (TGF-b, IL-10, vIL-10) die Th1 Zytokinexpression und zusätzlich partiell die Funktionen von APCs und Makrophagen inhibiert werden. In Abhängigkeit der verwendeten Modelle führt die Überexpression von IL-4 zur Verlängerung der Transplantatakzeptanz oder zeigt keinen immunmodulatorischen Einfluss (Ritter et al, 1999; Ke et al, 2000; Kato et al, 2000;Pleyer et al, 2000). In vielen unterschiedlichen Modellen konnte nach Überexpression von IL-10 oder vIL-10 eine Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit und Inhibierung der Th1 Immunantwort
    [Seite 23↓] gezeigt werden (Qin et al, 1996; Qin et al, 1997). So verhindert der adenovirale Gentransfer von IL-10 oder vIL-10 die Entstehung eines autoimmun vermittelten Diabetes in einem Nacktmaus-Modell (Yang et al, 2002). Eine verlängerte Transplantatakzeptanz nach IL-10 Gentransfer konnte im Leber- und im Herz-Transplantationsmodell nachgewiesen werden (David et al, 2000; Tashiro et al, 2000). Die adenovirale Überexpression von TGF-b inhibiert im Herz-Transplantationsmodell die Th1 Immunantwort (Chan et al, 2000).
  3. Expression von Spender-MHC-Antigen. Durch den Gentransfer von Spender-MHC-Genen in die Knochenmarkzellen des Empfängers kommt es zur Verlängerung der Transplantatakzeptanz (Sachs et al, 1993; Emery et al,1997; Geissler et al, 2000).
  4. Expression von Molekülen, die zur Apoptose von Immunzellen führt. Die Expression von FasL auf dem Endothelzellen des Transplantates soll zu einer Induktion von Apoptose der alloreaktiven T-Zellen führen, die Fas exprimieren (Bellgrau et al, 1995; Ke et al, 2000). Dieses Modell hat seinen Ursprung in der Funktion von immunprivilegierten Organen (z.B. Auge, Hoden), bei denen die Expression von FasL auf verschiedenen Zelltypen eine wichtige anti-inflammatorische Rolle spielt (Greil et al, 1998). Unterschiedliche Resultate wurden beobachtet in Bezug auf die Überlebenszeit des Transplantates, in Abhängigkeit der viralen Vektors und des Modells.
  5. Expression von anti-apoptotischen und zytoprotektiven Genen in Zellen des Transplantates. Die in vitro Expression von anti-apoptotischen Molekülen, wie Bcl-2, Bag-1, Bcl-xL und A20 in Endothelzellen führt nicht nur zum Schutz vor Apoptose, sondern inhibiert ebenso ihre Aktivierung (Zytokinsynthese) durch NF-kB abhängige Mechanismen (Badrichani and Ferran, 2001; Contreras et al, 2001; Sawitzki et al, 2002). Auch die Inhibierung von Enzymen, die in der Aktivierung des Zellzyklus beteiligt sind, bieten einen Ansatz für die Toleranz-Induktion.

Trotz der großen Fortschritte in der Gentherapie ist noch kein gentherapeutisches Modell entwickelt worden, das zu einer Toleranzinduktion führt. Der Grund dafür liegt in den noch nicht vollständig aufgeklärten zellulären Prozessen, die in die allogene Rejektion involviert sind und in der noch nicht ausgereiften Entwicklung viraler Expressionssysteme. Die größten Bemühungen zielen derzeit auf die Entwicklung niedrig-immunogener Expressionssysteme mit der Möglichkeit einer stabilen Integration des therapeutischen Moleküls in das Wirtsgenom.


[Seite 24↓]

Des weiteren spielen das exakte „targeting“, die Regulierbarkeit und die gewebespezifische Expression des therapeutischen Gens eine große Rolle.

2.5.1 Virale Expressionssysteme in der Gentherapie

In Abhängigkeit von der Applikation werden unterschiedliche Ansprüche an virale und nicht-virale Expressionssysteme gestellt. Allen gemeinsam ist jedoch der Transfer einer angemessenen Menge des therapeutischen Gens, eine möglichst geringe Immunogenität und Toxizität des viralen Vektors und eine höchst mögliche Biosicherheit der verwendeten Modelle. Nicht-virale Transduktionssysteme zeichnen sich durch eine hohe Biosicherheit aus Nishikawa et al, 2001). Die Transfektion von primären Zellen (T-Zellen, DC, hämatopoetische Vorläuferzellen) ist jedoch bislang noch sehr ineffizient. Viren dagegen sind biologische Systeme, die ihre Gene effizient in die Wirtzellen einschleusen. Dieses wird bei der Entwicklung von viralen Vektor-Systemen ausgenutzt. Der adenovirale Gentransfer zeichnet sich durch ein großes Wirtsspektrum, einen hohen Titer und meist sehr gute Transduktionseffizienzen aus. Der Nachteil liegt klar bei der starken Immunogenität und der transienten Expression des Transgens, da das Virus episomal in der Zelle vorliegt (Ritter et al, 2002). Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind weniger immunogen, haben aber nur eine sehr begrenzte Verpackungskapazität. Retroviren dagegen lassen sich bislang nur mit geringen Titern herstellen, weisen aber den Vorteil auf, dass sie stabil in das Wirtsgenom integrieren und mittels Lentiviren sogar ruhende Zellen transduziert werden können (Naldini, 1998). Die Integration von Retroviren in das Wirtsgenom erfolgt über die LTR-Integrationssequenzen, die gleichzeitig als Promoter für das Transgen fungieren (Naviaux and Verma, 1992). Die Entstehung von Onkogenen durch die Transduktion in das Wirtsgenom stellt das größte Risiko dar.


[Seite 25↓]

Tabelle 1: Virale Expressionssysteme

virale Vektoren

Expression

Virusart

Verpackungs-kapazität

Infektion von ruhenden Zellen

Titer

Immunogenität

Adenovirus

transient

DNA

< 8 kb

ja

hoch

hoch

(AAV) Adeno-assoziierte Viren

stabil

DNA

4,1-4,9 kb

ja

hoch

gering

Herpes Simplex Virus

transient

DNA

< 50 kb

ja

hoch

hoch

Epstein-Barr Virus

stabil extrachromo-somal

DNA

<150 kb

ja

 

gering

Retroviren

stabil

RNA

< 10 kb

nein

gering

gering

Lentiviren

stabil

RNA

< 10 kb

ja

gering

gering

2.5.2 Verpackungszelllinien für Retroviren

Alle bisherigen Untersuchungen zur genetischen Manipulation von primären T-Zellen zeigen deutlich, dass die Transduktion mittels Retroviren die bislang effektivste Methode darstellt therapeutische Moleküle stabil in T-Zellen zu exprimieren. Um die Biosicherheit dieses Transduktionssystems zu gewährleisten, wurden retrovirale Verpackungszelllinien entwickelt. Retroviren gehören zu den RNA-Viren, die über ein DNA-Intermediat (Provirus), welches sich stabil in das Genom der Zielzelle integriert, replizieren. Das Genom replikationskompetenter und infektiöser Retroviren besteht aus zwei identischen einzelsträngigen RNA-Molekülen mit einer Länge von 7 - 8 Kb (Levy, 1992). Rekombinante Retroviren für gentherapeutische Applikationen wurden in erster Linie auf der Basis muriner Retroviren, vor allem des Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV), entwickelt. Mit Hilfe der Pseudotypisierung ist es möglich Retroviren mit unterschiedlichen Wirtspektrum zu generieren. Die murinen Retroviren werden in Abhängigkeit ihres Wirtsspektrums als ekotroph oder amphotroph bezeichnet. Der Wirtsbereich ekotropher muriner Retroviren ist eingegrenzt auf Zellen von Mäusen und Ratten. Amphotrophe murine Retroviren besitzen einen breiteren Wirtsbereich, der sowohl murine als auch nicht-murine Zellen einschließt.


[Seite 26↓]

Zunehmend werden bei der Entwicklung rekombinanter Retroviren die Hüllproteine der murinen Retroviren modifiziert oder ausgetauscht. Dadurch wird ein breiterer Wirtsbereich, ein auf einen bestimmten Zelltyp ausgerichteten Wirtstropismus oder eine höhere Stabilität des Virions erreicht. Hierbei gewinnt unter anderen das Gibbon Ape Leukämie Virus (GaLV) als Spender des env-Proteins vermehrt an Bedeutung (Miller et al, 1991). GaLV weist einen gegenüber amphotrophen murinen Retroviren anderen Wirtsbereich auf, da es in der Lage ist, z.B. auch Rinder- und Hamsterzellen, hingegen keine Mäusezellen, effizient zu infizieren. GaLV weist auch eine bessere Transduktionsrate besonders für humane Zellen auf. Das G-Glykoprotein (VSV-G) des Vesicular Stomatitis Virus (VSV) kann verwendet werden, um murine Retroviren mit einem breiteren Wirtsbereich auszustatten, der zusätzlich die Infektion von Hamster- und Fischzellen ermöglicht (Burns et al, 1993). Darüber hinaus weisen VSV-G-Pseudotypretroviren eine höhere Partikelstabilität auf, die eine Konzentrierung der infektiösen Viruspartikel durch Ultrazentrifugation erlaubt. Ein spezifischer Zelltropismus kann erreicht werden, indem ein Ligand für ein zelluläres Oberflächenprotein, wie z.B. dieErkennungsdomäne eines Antikörpers, in das Hüllprotein muriner Retroviren inseriert wird (Russel et al, 1993).

Abbildung 2: Herstellung rekombinanter replikationsdefekter Retroviren. Transfektion des retroviralen Vektors (LTR: „long terminal repeat“, Integrationsstelle des retroviralen Plasmides in die DNA der Zielzelle mit intrinsischer Promoteraktivität; MCS: „multiple-
cloning-site“; SV40: Polyadenylierungssignal; Amp, Neo: Resistenzgen) mit dem zu übertragenden Gen in die Verpackungszelllinie. Diese exprimiert die retroviralen Strukturgene konstitutiv, so dass von dem retroviralen Vektor Transkripte hergestellt werden, die sowohl translatiert als auch als genomische RNA mit Hilfe der viralen Strukturproteine zu neuen Virionen verpackt werden (gag, env, pol: retrovirale Proteine zur Bildung der Hülle, Strukturmatrix und Enzyme des Retrovirus).

2.5.3 T-Zellen als Vektoren in der Gentherapie

In dem Kapitel 2.4 wurde die Bedeutung von regulatorischen T-Zellen für die Erhaltung bzw. Induktion einer Toleranz dargestellt. Eine in vitro Generierung dieser T-Zellen wäre daher von enormer Bedeutung. Bislang ist es jedoch noch nicht gelungen, in vivo generierte regulatorische Zellen längere Zeit in Kultur zu halten oder sogar zu vermehren. Die Wachstums- und Überlebensfaktoren, die zur Kultivierung von regulatorischen T-Zellen benötigt werden, sind noch nicht genau bekannt. Untersuchungen in den letzten Jahren zeigen, dass regulatorische Zellen durchaus keine homogene Population darstellen, sondern dass unterschiedliche „Subsets“ mit verschieden Eigenschaften vorhanden sind (Roncarolo and Levings, 2000). Es erscheint daher ein sinnvoller Ansatz, regulatorische Zellen durch die gezielte Überexpression von regulatorischen und anti-inflammatorischen Molekülen in vitro zu generieren und in vivo mittels adoptiven Transfer einzusetzen. Von allen bekannten Gentransfer-Systemen hat sich in den letzten Jahren der retrovirale Transfer als besonders geeignet herausgestellt, T-Zellen zu transduzieren. Es wurde gezeigt, dass retroviral transduzierte T-Zellen in der Lage sind, stabil und dauerhaft ein Protein zu exprimieren (Blaese et al, 1995). Außerdem exprimieren aktivierte T-Zellen vermehrt ihr Transgen (Quinn et al, 1998; Hammer et al, 2000). Mittels einer viralen Transduktion mit gleichzeitiger allogener Stimulation, kann in vitro eine Zell-Population generiert werden, die nicht nur transgen für ein Reportergen (EGFP) ist, sondern auch alloantigen-spezifische Eigenschaften aufweist. Über weitere Restimulationen und Selektionsschritte können T-Zelllinien generiert werden, die einen einheitlichen Phänotyp besitzen und ihr Transgen EGFP stabil exprimieren (Flügel et al, 1999). Weiter migrieren alloantigen-spezifische T-Lymphozyten nach adoptiven Transfer spezifisch zu den entscheidenden Orten der Antigenpräsentation (Transplantat, Lymphknoten, Milz) und exprimieren allo-spezifisch ihr Reportergen EGFP (Flügel et al, 2001; Hammer et al, 2002). Dies ist eine wichtige Voraussetzung dafür, wenn immunregulatorische Proteine (z.B. IL-10, vIL-10, TGF-b) nach retroviralem Gentransfer zur


[Seite 28↓]

Verhinderung der Transplantatrejektion exprimiert werden sollen. Die T-Zell-aktivierungabhängige Hochregulation des Transgens konnte durch Blockierung des Signals 1 und Signal 2 inhibiert werden (Hammer et al, 2000). Außerdem weisen diese retroviral transduzierten T-Zellen den gleichen Phänotyp (CD25+, CD45RClow) wie die bereits beschriebenen Toleranz-induzierenden T-Zellen auf (Hammer et al, 2002). Ein weiteres wichtiges Argument ist die lange Lebensdauer der T-Zellen und die unkomplizierte Isolierung und Kultivierung der Zellen in vitro. Die aufgeführten Argumente machen deutlich, welch enormes Potential T-Zellen besitzen, wenn sie als Transportvehikel für therapeutische Gene eingesetzt werden. Eine systemische Applikation ist möglich, die Expression des Transgens erfolgt jedoch alloantigen-spezifisch und wird über die Aktivierung der T-Zellen noch verstärkt.

Abbildung 3: Migration EGFP transgener und alloantigen-spezifischer T-Zellen nach adoptiven Transfer im Nierentransplantationsmodell (Hammer et al, 2002, J. Am. Soc. Nephrol.).


[Seite 29↓]

2.6  Virales Interleukin-10 als immunmodulatorisches Molekül

Das vom Epstein-Barr Virus abstammende Interleukin-10 (IL-10) Homolog virales IL-10 (vIL-10) hat in den letzten Jahren im Mittelpunkt vieler Forschungsprojekte gestanden. Es zählt zu den anti-inflammatorischen Zytokinen und weist eine ca. 90%ige Homologie zum humanen IL-10 (hu IL-10) auf (Moore et al, 2001). IL-10 wird vor allem von Monozyten/Makrophagen und T-Zellen gebildet. Es weist ein breites Spektrum von anti-inflammatorischen Eigenschaften auf. Es wurde gezeigt, dass IL-10 die Expression von MHC II Molekülen und kostimulatorischen Molekülen auf Monozyten und dendritischen Zellen inhibiert (de Waal Malefyt et al, 1991b;Moore et al, 2001). Auch die Produktion inflammatorischer Zytokine wie IFN-g, IL-1, IL-12, IL-18 und TNF-a wird durch IL-10 vermindert (Kawamoto et al, 2001). Ein weiterer wichtiger anti-inflammatorischer Effekt von IL-10 ist die Unterdrückung der Proliferation von allogen aktivierten Lymphozyten (de Waal Malefyt et al, 1991a; Qin et al, 1997). IL-10 hat neben den immunsuppressiven Effekten auch stimmulatorische Effekte auf T- und B-Zellen. So wird z.B. die Expression von MHC-II-Molekülen auf B-Zellen erhöht und damit ihre Aktivierung unterstützt. Virales IL-10 besitzt trotz der hohen Sequenzhomologie zum zellulären IL-10 diese immunstimulatorischen Eigenschaften nicht. Das Ausbleiben einer Aktivierung der humoralen Immunantwort durch vIL-10 in Kombination mit seinen immuninhibitorischen Eigenschaften macht dieses Molekül zu einem interessanten Kandidaten für die Immunmodulation und ist als wirkungsvolleres Immunsuppressivum als cIL-10 anzusehen. In den letzten Jahren wurden weitere anti-inflammatorische Effekte, vermittelt durch vIL-10, entdeckt. So werden dendritische Zellen nicht nur in ihrer Reifung und Funktion inhibiert, sondern auch in ihrem Migrationsverhalten beeinflusst. Dieses wird über die Inhibierung des Chemokinrezeptors CCR7 vermittelt (Takayama et al, 2002). Eine verminderte MHC I Expression auf B-Zellen durch die Inhibierung von TAP 1 wird ebenso über vIL-10 vermittelt (Zeidler et al, 1997). TAP 1 ist die kleinere Untereinheit des dimeren Proteins TAP, welches auf die Translokation zytosolischer Proteine in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums spezialisiert ist (Neefjes et al, 1993). An einem Modell der Thrombose konnte gezeigt werden, dass die Expression von vIL-10 zur Inhibierung der Adhäsionsmoleküle P- und E-Selektin und ICAM führt (Henke et al, 2000). In einigen Transplantationsmodellen und im Zusammenhang mit der Generierung von regulatorischen Zellen wurde vIL-10 und auch IL-10 bereits untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass IL-10 in vitro regulatorische T-Zellen generieren kann (Groux et al, 1997). Eine


[Seite 30↓]

mehrfache in vitro Stimulation von humanen oder murinen CD4+ T-Lymphozyten in Gegenwart von IL-10 führt zu der Entstehung einer neuen T-Zell-Population. Diese zeichnet sich durch eine geringe Proliferations-Kapazität, eine hohe IL-10 und IFN-g Produktion und geringe Expression von IL-2 bzw. keine IL-4 Expression aus. Dieses Zytokinprofil unterscheidet sich eindeutig von den in der Literatur beschriebenen Zytokinmustern der Th0, Th1 und Th2 Populationen. IL-10, wie auch TGF-b werden als Wachstumsfaktoren von regulatorischen T-Zellen beschrieben, scheinen aber nicht essentiell für ihre Entstehung zu sein. In verschiedenen allogenen Herztransplantations-Modellen führt die adenovirale oder retrovirale Überexpression von TGF-b und vIL-10 zur Verlängerung der Transplantatakzeptanz (Qin et al, 1995, 1996). Weiter konnte gezeigt werden, das der virale Gentransfer von zellulärem IL-10 zur permanenten Akzeptanz im Lebertransplantationsmodell (Shinozaki et al, 1999) und zur Verlängerung der Transplantatüberlebenzeit im Herz-Transplantationsmodell der Ratte führt (David et al, 2000).

Auf Grund der bisherigen Ergebnisse wird deutlich, dass eine Kombination aus

1) einem geeigneten immunmodulatorischen und –inhibitorischen Molekül (vIL-10)

2) retroviraler Transduktion des Moleküls in T-Zellen

3) und gleichzeitiger allogener Stimulation der T-Zellen

eine neue Möglichkeit darstellt, regulativ wirkende T-Zellen zu generieren. Das spezifische Migrationsverhalten und die T-Zellaktivierungsabhängige Expression des Transgens untermauern noch das Potential dieser in vitro generierten T-Zellen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
24.10.2003