4  Material und Methoden

Als Ausgangsplasmide für die Klonierung wurden die Vektoren pLXSN und pBluescript-vIL-10 (pBS-vIL-10) eingesetzt. Alle Standardmethoden, wie Plasmidpräparationen, Restriktionsspaltungen, gelelektrophoretische Trennungen, u.s.w. wurden nach Sambrook et al (1989) bzw. dem jeweiligen Protokoll des Herstellers durchgeführt. Alle für diese Arbeit relevanten, modifizierten Methoden werden hier aufgeführt.

Nach dem Restriktionsverdau der Vektoren pLXSN mit BamH I und Hpa I (blunt-end-cutter) und pBS-vIL-10 mit BamH I und EcoR V (blunt-end-cutter) wurden die DNA-Fragmente je nach Größe in einem 0,8-1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Herstellung des Agarosegels erfolgte in 1 x TAE-Puffer. Die Agarose wurde in Laufpuffer durch Aufkochen gelöst und mit Ethidiumbromid (ca. 20µgEB/100ml) versetzt. Die an der Elektrophoreseapparatur angelegte Spannung betrug in der Regel 100V. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die DNA-Fragmente mit UV-Licht anhand des fluoreszierenden, interkalierenden Ethidiumbromids detektiert. Mit Hilfe des Gel Imager Systems erfolgte die digitale Auswertung.

Die Isolierung von DNA-Fragmenten wurde nach Anleitung des Jetsorb-Kits von Genomed durchgeführt. Die Eluation der DNA aus der Glasmilch erfolgte in 3x 7µl H2O durch je 5 Minuten Inkubation bei 50°C. Die Konzentration der DNA wurde photometrisch oder durch Quantifizierung mit dem Gel Imager bestimmt.

Zur Ligation wurde das vIL-10 DNA-Fragment und der pLXSN-Vektor eingesetzt. In einem 10 µl Ansatz wurden zu 50 ng Vektor 1 µl des zehnfach konzentrierten OPA-Puffers, 1 µl einer 10 µmolaren ATP Lösung und 1 µl T4-Ligase pipettiert. Das Insert wurde in einer Konzentration eingesetzt, in welcher das Verhältnis der Kopienzahlen von Vektor/Insert 1:1 betrug.

Der Ansatz wurde über Nacht bei 14°C inkubiert und anschließend zur Transformation eingesetzt.

Die Herstellung und Lagerung der kompetenten Zellen erfolgte mit der Kalzium-Chlorid Methode nach Angaben des Maniatis. 150µl kompetenter E. coli DH5a Zellen wurden langsam auf Eis aufgetaut, mit 10 ng Vektor (10µl von dem Ligationsansatz) versetzt und für 30 min im Eisbad belassen. Der Ansatz wurde für exakt 45 Sekunden auf 42°C erhitzt und sofort auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 750µl LB-Medium wurden die Zellen 1h bei 37°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurden verschiedene Mengen des Transformationsansatzes auf antibiotikahaltigen Platten ausplattiert und über Nacht im Brutschrank bei 37°C kultiviert. Die Klone wurden durch die ‚Mini‘-Plasmidpräparation und anschließender Restriktion charakterisiert.

Zur kurzfristigen Lagerung wurden die Bakterien auf Agarplatten ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert und im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt. Zur Langzeitlagerung wurden 5 ml einer Über-Nacht-Kultur mit Glycerol im Verhältnis 4:1 vermischt und zu 1ml Aliquots bei –70°C gelagert.

Zur Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA in kleinen Mengen wurde neben eines Kit-Systems der Firma Qiagen auch eine Vorschrift der alkalischen Schnellisolation nach ´Maniatis´ angewandt.

Die Anzucht der Bakterien erfolgte in 3 ml LB-Medium mit einer Ampicillin-Endkonzentration von 100 µg/ml. Die Bakterienkultur wurde über Nacht bei 37°C im Schüttler bei 220 rpm inkubiert. Die Zellen wurden 10 min bei 1200 rpm, 4°C abzentrifugiert und das Pellet in 100 µl P1 resuspendiert. Nach Zugabe von 200 µl P2 und vorsichtigem Mischen wurde die Zellsuspension zur Lyse der Zellen 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150 µl P3 und Inkubation der Proben für 5 min auf Eis, um mit Hilfe der hohen Salzkonzentration denaturierte Proteine, chromosomale DNA und Zellreste zu präzipitieren. Nach 15 min Zentrifugation (14 000g, 4°C) wurde zu dem Überstand 0,7 Volumen Isopropanol hinzugegeben und die Plasmid-DNA während 15 min bei Raumtemperatur gefällt. Um das DNA-Pellet zu gewinnen, wurde wiederum 15 min, 14 000g, 4°C zentrifugiert, und anschließend einmal mit 400 µl 70%igen Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde 1-2 min in der Vakuumzentrifuge getrocknet und in 50 µl aqua dest. mit einer Endkonzentration von 100 µg/ml RNAse aufgenommen.

Um größere DNA Mengen zu isolieren (bis zu 2 µg/µl), wurde der Maxi-Prep-Kit von Qiagen verwendet.

Das retrovirale Gentransfersystem umfasst mindestens zwei Komponenten, die Verpackungszelllinie und den retroviralen Vektor (siehe Abb.2 in der Einleitung). Der retrovirale Vektor ist dahingehend modifiziert, dass die retroviralen Strukturgene gag, env und pol deletiert sind. Er verfügt mindestens über das Verpackungssignal Y und die retroviralen 5´- und 3´-LTRs, die eine Insertionsstelle für das zu übertragende Gen sowie ggf. einen Selektionsmarker flankieren. Die Verpackungszelllinie stellt die retroviralen Proteine gag, env

und pol (Helfergenom) zur Verfügung, die für die Verpackung der Vektor-RNA und somit für die Erzeugung retroviraler Partikel notwendig sind. Die Verpackungszelllinie wird hergestellt, indem das Helfergenom in eine Zellinie eingeführt wird. Das Verpackungssignal Y ist bei diesem Helfergenom deletiert, so dass virale RNA, die in der Verpackungszelllinie von dem Helfergenom abgelesen wird, nicht in Virionen verpackt wird. Nach Transfektion der Verpackungszellline mit dem retroviralen Vektor werden von diesem Transkripte hergestellt, die sowohl translatiert als auch als genomische RNA in neue Virionen verpackt werden, welche von der Verpackungszelllinie abgegeben werden. Mit Hilfe dieser Virionen, die replikationsdefekt sind (gag-, env-, pol-RNA fehlt), können Zielzellen infiziert werden, in deren Genom sich das von der übertragenen retroviralen RNA umgeschriebene Provirus stabil integriert. Voraussetzung dafür ist, dass sich die Zielzellen in der mitotischen Zellteilungsphase befinden, da ausschließlich zu diesem Zeitpunkt die Kernmembran aufgelöst ist und somit die Virus-DNA in das Wirtsgenom integrieren kann. In den transduzierten Zellen werden das zu übertragende Gen als auch der Selektionsmarker exprimiert. Das auf dem pLXSN vorhandene Resistenzgen Neomycin ermöglicht zum einen die Selektionierung von transfizierten Zellen der Verpackungszelllinie und zum anderen eine Selektionierung der erfolgreich transduzierten T-Lymphozyten mittels des synthetischen Neomycin Analogs G 418.

Die von NIH/3T3 Zellen abgeleitete Verpackungszelllinie GP+E 86 (Dr. Flügel, MPI für Neurobiologie, Abt. Neuroimmunologie, München) wurde in T75 Kulturflaschen in DMEM, 10% FKS, Penicillin, Streptomycin, Glutamin bei 5% CO₂ im Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden mit ca. 90% Konfluenz je nach Bedarf im Verhältnis 1:3 bis 1:10 aufgeteilt.

Einen Tag vor der Transfektion wurden 1x 10⁶ GP+E 86 Zellen je 6cm Schale ausplattiert, so dass sie am nächsten Tag 60-70% konfluent gewachsen waren. Zwei bis vier Stunden vor der Transfektion wurde das Medium gegen 4,5ml frisches Medium ausgetauscht. Anschließend wurde das Präzipitat, bestehend aus 10µg DNA, 31µl 2M CaCl₂,ad 250µl a. dest. und 250µl 2xHBSP-Puffer, hergestellt. Dabei wurde der 2x HBSP-Puffer mit einer 1ml-Pipette unter das Präzipitat pipettiert und anschließend ca. 15 Luftblasen in das Präzipitat entlassen. Es folgte eine Inkubation von 20 Minuten bei Raumtemperatur. Abschließend wurde das Präzipitat gemischt und tropfenweise zu den Zellen dazugegeben. Der Mediumwechsel erfolgte 12-16 h

nach der Transfektion. Nach weiteren 48 h Inkubation wurde der Virusüberstand (10²-10³ cfu/ml) abgenommen, sterilfiltriert und zur erneuten Infektion der GP+E 86 Zellen eingesetzt.

Die virale Transduktion in eine Verpackungszelline erzeugt einen höheren Titer als die Transfektion mit Plasmid-DNA. Um den Eintritt des Virus in die Verpackungszelllinie zu gewährleisten, muss die Oberflächenexpression des viralen Gens env und zunächst inhibiert werden. Dazu wurde die GP+E 86 Verpackungszelllinie für 16h mit Tunikamycin, 100ng/ml vorbehandelt. Anschließend wurden 2ml des zuvor generierten Virusüberstandes (10²-10³ cfu/ml) und Polybren (8µg/ml) auf die sub-konfluente Verpackungszelllinie gegeben. Nach 24 h Inkubation erfolgte ein Mediumwechsel und der Beginn der negativen Selektion mittels G 418 (1mg/ml) für ca. 2 Wochen.

Die polyklonale Verpackungszelllinie wurde mittels vIL-10 ELISA auf die Expression des Transgens getestet. Anschließend wurde zur Generierung einer monoklonalen Verpackungszelllinie mit einem hohen Titer eine Verdünnungsreihe („limited dilution“) nach folgendem Schema unter G 418 (1 mg/ml) Selektion angesetzt:

Nach 3-4 wöchiger Selektion wurden 12 von insgesamt 24 gewachsenen Klonen mittels vIL-10 ELISA auf die Expression von vIL-10 getestet. Des weiteren wurde eine virale Titerbestimmung nach dem Protokoll von Clontech durchgeführt. Hierzu wurden 5x10⁵ Zellen der Verpackungszelllinie in einer T 25 Kulturflasche für 48h inkubiert. Der Kulturüberstand wurde anschließend durch einen 0,45µm Filter sterilfiltriert und nach dem Clontech Protokoll analysiert, bzw. im ELISA quantifiziert. Der Klon mit der höchsten Transgen-Expression und dem höchsten viralen Titer wurde expandiert und mit einer Zellkonzentration von 1 x 10⁷ Zellen/Tube in Flüssigstickstoff gelagert bzw. für alle weiteren Transduktionsexperimente verwendet.

Bei allen Versuchen wurden die Rattenstämme Lewis (Le, RT1^l) und Dark Agouti (DA, RT1^avl) verwendet. Die Lewis T-Lymphozyten dienten zur Generierung der alloantigen-spezifischen T-Zelllinien und als Empfängertiere bei den Transplantationen. Die DA-Ratten dienten als Stimulator-Zellen in vitro und als Organspender in vivo. Die Ratten wurden mittels eines Narkose- und Tötungsgerätes durch ein Carbogen-Kohlendioxid-Gasgemisch getötet. Als erstes wurde die Haut von der Muskelfaszie abpräpariert und es erfolgte eine sofortige Öffnung des Thorax zur kardialen Blutentnahme und Thymuspräparation. Anschließend wurden die zervikalen, axillären, inguinalen und dermalen Lymphknoten sauber aus dem umliegenden Gewebe isoliert und in DMEM-Medium zum Transport gelagert.

Zur Serumgewinnung wurde das kardial gewonnene Blut bei 4500 rpm, 4°C für 10 min zentrifugiert und der so entstandene Serumüberstand abgenommen.

Zur Aufarbeitung der Lymphknoten und des Thymusgewebes wurden diese unter sterilen Bedingungen durch ein 100 µm Nylon-Zellstrainer gepresst, in DMEM 10% FKS aufgenommen und anschließend durch ein 40 µm Zellstrainer filtriert. Nach der Zentrifugation der Zellsuspension (1200rpm, 4°C, 5min) wurde das Pellet in T-Zell-Medium (TCM) aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Dieses erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer mittels Vitalfärbung mit Trypan-Blau. Die so gewonnene Zellanzahl variierte, je nach Tiergröße und Präparation zwischen 1-1,5x10⁹ Zellen je Thymus und 0,5-1,5 x10⁸ Zellen für die Lymphknoten. Für den Ansatz einer „primär-MLC“ wurden die als allogene Stimulatorzellen dienenden Lymphozyten der DA-Ratte mit 30 Gray bestrahlt. Für die Restimulationen wurden die Thymozyten der Lewis und DA Rattenstämme mit 30 Gray bestrahlt. Während der Bestrahlung und des Transportes der Zellen wurden diese auf Eis gelagert.

Zur Transduktion der Lymphozyten wurde die virusproduzierende Verpackungszellinie GP+E vIL-10 mit einer Konzentration von 3x10³ Zellen/well in eine 96-well Rundbodenplatte in einem Volumen von 50 µl/well in TCM ausgesät. Es folgte eine 2-4 stündige Inkubation der Zellen im Brutschrank (37°C, 5 % CO₂) zur Zelladhäsion. Anschließend wurde die primäre MLC wie folgt hinzu gegeben:

Die 96-well Rundbodenplatten wurden für drei Tage im Brutschrank inkubiert. Danach wurden die Lymphozyten vorsichtig, ohne sie zu resuspendieren, in eine 96-well Flachbodenplatte überführt und mit 100 µl TCM, 10 % Pferdeserum (56°C hitze-inaktiviert), 25 U/ml humanes Interleukin-2 versetzt. In Abhängigkeit der Proliferationsstärke und Morphologie der Lymphozyten, welche lichtmikroskopisch beobachtet wurden, wurde zwischen Tag 6-7 nach „primär-MLC“ mit der negativen Selektion der Lymphozyten durch Zugabe von 0,4 mg/ml G 418 zum Medium begonnen. Die erste Restimulation erfolgte am Tag 7-9. Die in regelmäßigen Abständen durchzuführende Aktivierung der primären Zellen ist notwendig, um die Zellen am Leben zu erhalten. Desweiteren werden die transgenen Zellen, durch ihre Proliferation während der Restimulation vermehrt.

Zur Generierung einer allospezifischen, für vIL-10 transgenen T-Zelllinie wurden die Lymphozyten alle 7-9 Tage restimuliert. Die Restimulationen wurden mit einem Gemisch aus 30 Gray bestrahlter Lewis und DA-Thymozyten unter G 418 Selektion durchgeführt. Die erste Restimulation fand im 96-well Flachboden statt, da nach der „primär-MLC“ nur ca. 10-20 % der Lymphozyten retroviral transduziert sind, liegt die Zahl der T_vIL-10-Lymphozyten pro 96-well zwischen 3-7x 10⁴ Lymphozyten.

Nach 3 Tagen Inkubation wurden die Lymphozyten gepoolt und in einer Zellkonzentration von 1 x10⁶ Zellen/ml in 6cm Schalen in TCM (10 % Pferdeserum, 25U/ml huIL-2, 0,4 mg/ml G 418) ausgesät. Alle weiteren Restimulationen fanden im Abstand von 7-9 Tagen in der 6 cm Schale wie folgt statt:

Nach 3 Tagen Inkubation wurden die Lymphozyten mit TCM (10 % Pferdeserum, 25U/ml hu IL-2, 0,4 mg/ml G 418) versetzt und bei starker Proliferation auf 10 cm Schalen expandiert. Nach 3-5 Restimulationen wurden die Zellen in Einfriermedium (FKS, 10% DMSO) mit einer Zellkonzentration von 2 x 10⁷ Zellen/Kryotube in Flüssigstickstoff gelagert. Die Einfrierungen erfolgten zwischen Tag 3-4 nach der letzten Restimulation. Für alle in vitro und in vivo Versuche wurden 3-5fach restimulierte transgene T_vIL-10-Lymphozyten eingesetzt.

Zur Aufreinigung der T_vIL-10-Lymphozyten wurde ein modifizierter Ficoll-Gradient durchgeführt. Dieser erfolgte zur Abtrennung der bestrahlten, toten Thymozyten und Gewinnung der vitalen transgenen Blasten, einen Tag vor Ansatz der in vitro Versuche oder des adoptiven Transfers. Die Zellen einer 10cm Kulturschale wurden mit 1200rpm für 5min bei 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Anschließend wurde das Zellpellet in 15ml kalten Human-Ficoll resuspendiert und mit 5ml DMEM überschichtet. Die Auftrennung des Gradienten erfolgte bei 3000rpm für 30min bei 4°C. Nach der Abnahme des Leukozytenrings

aus der Interphase wurden die Zellen 2x mit FKS-haltigen DMEM-Medium gewaschen und mit einer Zellkonzentration von 1-2 x10⁶ Zellen/ml in TCM, 10% Pferde Serum kultiviert.

Parallel zur Herstellung der allospezifischen vIL-10 transgenen T-Zelllinie wurden nach exakt demselben Protokoll zwei weitere T-Zelllinien hergestellt, die als Kontrollzellen in den in vitro und in vivo Versuchen eingesetzt wurden. Zum einen wurde eine allospezifische T-Zelllinie ohne Transgen (nicht-transgene Lymphozyten = T_MOCK-Lymphozyten) und zum anderen eine für das Reportergen EGFP transgene T-Zelllinie (T_EGFP-Lymphozyten) hergestellt.

Die biologische Aktivität von vIL-10 kann sowohl im Maus- und Ratten- als auch im humanen System nachgewiesen werden. Ein bereits bekannter Effekt von humanen IL-10 ist die Inhibierung der TNF-a Expression nach Aktivierung von humanen PBMCs. Aufgrund der hohen Homologie zwischen vIL-10 und hu IL-10 ist dieser Test auch mit vIL-10 durchführbar. Mit Hilfe des folgenden Versuchsansatzes wurde die biologische Aktivität von vIL-10, produziert von der Verpackungszelllinie, nachgewiesen. Humane periphere mononukleäre Blutlymphozyten (PBMC) wurden aus Heparin-Blut gewonnen. Der Versuch wurde nach Vorschrift des Milenia ex vivo Stimulations-Kits durchgeführt. Die PBMCs wurden mit 500pg/ml LPS stimuliert und für 4h bei 37°C inkubiert. Der Versuchsaufbau gliederte sich in:

1. Lymphozyten
2. Lymphozyten + 500pg/ml LPS
3. Lymphozyten + 500pg/ml LPS + 100ng/ml vIL-10 Überstand
4. Lymphozyten + 500pg/ml LPS + 10ng/ml vIL-10 Überstand
5. Lymphozyten + 500pg/ml LPS + 1ng/ml vIL-10 Überstand
6. Lymphozyten + 500pg/ml LPS + 50ng/ml rec. Hu IL-10
7. Lymphozyten + 500pg/ml LPS + 10ng/ml vIL-10 Überstand + 5µg/ml anti vIL-10 Ak
8. Lymphozyten + 500pg/ml LPS + 5µg/ml anti vIL-10 Ak

Nach der Inkubationszeit wurde die TNF-a Konzentration in Zellkulturüberstand der einzelnen Versuchsansätze am Immulite bestimmt.

3-5fach restimulierte T_vIL-10-Lymphozyten, T_EGFP-Lymphozyten und T_MOCK-Lymphozyten wurden in einer Konzentration von 1 x10⁵ Zellen mit je 3 x10⁵ bestrahlten LE und DA Thymozyten im 96-well Flachboden restimuliert und am Tag 2 mit TCM, 10% Pferdeserum, 25 U/ml hu IL-2, gefüttert. Am Tag 1-5 wurden die Zellen geerntet und Aliquots der Überstände, sowie das Zellpellet nach einmaligem Waschen der Zellen mit PBS bei –70°C weggefroren.

Zur Proteinbestimmung der Zellkulturüberstände wurden kommerzielle ELISA-Kits eingesetzt. Es wurde bei allen Proteinbestimmungen gemäß den Herstellervorgaben verfahren. Folgende Proteinbestimmungen wurden durchgeführt: vIL-10, rIFN-g, rIL-2, rIL-10, rIL-4. Die Auswertung fand am ELISA-reader Anthos 2001 statt.

Die mRNA-Isolation, cDNA-Synthese sowie die Durchführung der real-time TaqMan PCR wurde streng nach der Arbeitsanleitung (SOP) zur molekularbiologischen Bestimmung der Genexpression, erstellt 02/2001 im Institut für Medizinische Immunologie, durchgeführt.

Die bei -70°C gelagerten Zellpellets wurden zur RNA-Präparation in jeweils 200µl Lösung D mit 1,4µl b-Mercaptoethanol (14,2 M) aufgenommen. Anschließend erfolgte sofort die RNA-Präparation mit dem „StrataPrep Total RNA Miniprep Kit“ von Stratagene nach Vorschrift des Herstellers. Die gewonnene RNA wurde in einem Volumen von 2 x 20µl eluiert und mit Hilfe des Agilent 2100 Bioanalyzer quantifiziert. Es wurde das dazugehörige Kit „RNA Reagents & Supplies“ und der RNA-Marker von Ambion verwendet.

Vor der cDNA-Synthese erfolgte, zusätzlich zu dem DNase-Verdau während der RNA-Präparation, ein weiterer DNase-Verdau, um eine mögliche Kontamination der RNA mit genomischer DNA zu beseitigen. Dazu wurden 2µg RNA mit DEPC-H₂O auf ein Endvolumen

von 19µl gemischt. Nach der Zugabe von 2µl Random-Primer (0,1mg/ml) wurden die Proben gemischt und kurz abzentrifugiert. Anschließend wurde der Ansatz zur Beseitigung von Sekundärstrukturen für 10 Minuten bei 75°C im Thermocycler „TC1“ inkubiert. Pro Ansatz wurde ein Mix von 17,5µl wie folgt angesetzt:

Nach 2 min Inkubation der Proben auf Eis wurde je Probe 17,5µl Mix hinzupipettiert und vorsichtig gemischt. Anschließend folgte eine 30 minütige Inkubation bei 37°C, und darauf 5 min bei 75°C zur DNase-Inaktivierung. Die Proben wurden wieder für 2 min auf Eis gestellt und zu jeder Probe wurden jeweils 1µl Reverse Transkriptase (RT, 200U/µl) und RNase-Inhibitor (40U/µl) hinzugegeben. Die eigentliche cDNA-Synthese erfolgte bei 42°C für 60 Minuten. Zur Inaktivierung der Reversen Transkriptase wurden die Proben danach für 5 Minuten auf 94°C erhitzt. Die cDNA wurde bei –20°C gelagert. Die Testung der cDNAs erfolgte mittels der konventionellen PCR im Thermocycler 9600. Es wurde ein Primerpaar für das „house keeping gene“ HPRT benutzt. Die Annealingtemperatur betrug 65°C, die Zyklenzahl 30 und die Produktgröße 608 bp. Der Mix für eine Probe setzte sich wie folgt zusammen:

Nach Beendigung der PCR wurde die korrekte Größe der amplifizierten Produkte mittels Gelelektrophorese und anschließender Auswertung mit Hilfe des „Gel-Imager-Systems“ kontrolliert.

Analog zu der beschriebenen cDNA-Synthese wurde für jede Probe ein paralleler Ansatz ohne RT angesetzt. Diese Proben wurden in der folgenden „real-time“ TaqMan PCR als Kontrollen eingesetzt, um eine mögliche Kontamination der Proben mit genomischer DNA zu detektieren.

Die real-time TaqMan PCR ist eine sensitive, reproduzierbare und spezifische Methode zur Quantifizierung von mRNA. Bei dieser Methode kann die Amplifikation der Proben nach Abschluß der PCR sofort für jeden Zyklus analysiert werden, so dass keine weiteren post-PCR-Arbeitsschritte erforderlich sind. Neben den spezifischen Primern für das nachzuweisende Gen wird eine sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonde in die PCR eingesetzt. Diese ist am 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (6-Carboxyfluorescein, FAM) und am 3´-Ende mit einem Quencher-Farbstoff (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin, TAMRA) markiert. Ist die Sonde, die zwischen den spezifischen Primern bindet, intakt an der komplementären DNA gebunden, so wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes bei einer Fluoreszenzanregung auf Grund der räumlichen Nähe zum Quencher, durch einen Fluoreszenz-Energietransfer unterdrückt. Trifft während der Extensionsphase der PCR die Taq-Polymerase auf die hybridisierte Sonde, so wird diese durch die 5´-3´-Exonukleaseaktivität der Polymerase hydrolysiert. Es kommt zum Sondenbruch, und damit zur räumlichen Trennung der Farbstoffe, so dass das Fluoreszenzsignal des Reporter-Farbstoffes nicht mehr unterdrückt wird. Das Reportersignal steigt also in Abhängigkeit zu der Anzahl der PCR-Zyklen an, wobei der sogenannte Threshold Cycle (C_T-Wert) die Zyklenzahl ausdrückt, bei der zum ersten Mal ein statistisch signifikanter Anstieg der Reporter-Fluoreszenz über die Grundlinie erfaßt wird. Die Detektion des Fluoreszenzanstieges erfolgt für jeden Zyklus im geschlossenen Reaktionsgefäß mit Hilfe des ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detection Systems.

Zur Erstellung der Zytokinexpressionsmuster (Zeitkinetik Tag 1-5) der 3-4fach restimulierten nicht-transgenen, vIL-10 transgenen und EGFP transgenen Lymphozyten wurden folgende TaqMan-Panel und Sonden verwendet.

Die Primer und Sonden wurden mit Hilfe der Primer Express Software ermittelt. Die Etablierung des Primerpaares, die Primertitration und die Effizienzbestimmung mittels Standardkurvengenerierung wurden am Institut für Medizinische Immunologie (Charité Berlin) von Technischen Assistenten nach Vorschrift der SOP durchgeführt.

Zur Durchführung der PCR wurden folgende Bedingungen gewählt:

Der durch die „real-time“ PCR ermittelte „Threshold Cycle“ (C_T) gibt an, bei welchem Zyklus das erste Mal ein statistisch signifikanter Anstieg der Reporter Fluoreszenz meßbar ist. Je höher die Kopienanzahl der Probe, desto kleiner ist der C_T-Wert. Eine relative Quantifizierung der Expressionshöhe ist möglich, indem ein konstitutiv exprimiertes Gen („house keeping gene“, bei T-Zellen z.B. CD 3) derselben cDNA Probe amplifiziert wird.

Die Bildung des DC_T-Wertes erfolgt nach folgender Formel:

Das dimensionslose Ergebnis wird wie folgt angegeben:

Voraussetzung für diese Auswertungsmethode ist, dass die jeweiligen Bedingungen für die Primer- und Sondenpaare so gewählt sind, dass die Effizienzen der Amplifikation nahezu gleich bzw. im idealen Fall 1 sind. In diesem Fall kann von einer Verdopplung der Kopienzahl von Zyklus zu Zyklus ausgegangen werden.

Zur Analyse des Einflußes von T_vIL-10-Lymphozyten auf die Proliferation von naiven T-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Aktivierung wurde folgender Versuche angesetzt:

Tabelle 2: Proliferations-Test, Versuchsaufbau.

Die naiven Lewis-Lymphozyten wurden zuvor mit dem Membran-Farbstoff SNARF^TM angefärbt, um sie eindeutig von den Stimulatorzellen zu unterscheiden. Hierfür wurden die Zellen zwei Mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie mit einer Konzentration von 1x10⁷ Zellen/ml in einer 5µM SNARF-PBS Verdünnung für 4 min bei RT gefärbt. Es folgten drei Waschschritte mit 10% FCS haltigen Medium. Nach der Markierung der Zellen wurden die Ansätze nach der Tab.2 zusammen pipettiert und für 3 bzw. 4 Tage im Brutschrank, 5% CO₂, 37°C inkubiert. Am Tag 1 nach Versuchsansatz folgte die Einstellung der zu analysierenden Proben am FACS-Gerät. Da der Fluoreszenzfarbstoff SNARF bei der Zellteilung zu gleichen Teilen an die Tochterzellen weitergegeben wird, erfolgt eine Abnahme der Fluoreszenzintensität der Zellen, die sich geteilt haben. Die Proliferationsmessung erfolgte am Tag 3 und 4 mittels Durchflußzytometrie (FACS).

Zur Analyse des Einflußes von T_vIL-10-Lymphozyten auf die IFN-g Produktion von naiven T-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Aktivierung wurden folgende Versuche in TCM angesetzt:

Tabelle 3: Intrazelluläre IFN-g Färbung, Versuchsaufbau.

Analog zu dem Proliferations-Test wurden die naiven T-Zellen vor dem Versuch mit dem in der Fluoreszenz 1 strahlenden Membran- und Proteinfarbstoff CFDA-SE markiert. Die Färbung erfolgte nach exakt demselben Protokoll wie die SNARF-Färbung. Die Zellen wurden anschließend wie in Tab.3 dargestellt zusammen pipettiert. Für die intrazelluläre IFN-g Färbung am Tag 4 wurden die Ansätze zunächst für 3h mit PMA (10ng/ml) und Ionomycin (1µg/ml) inkubiert zur Verstärkung der schon vorhandenen Transkriptionsaktivität. Anschließend erfolgte die Zugabe von Brefeldin A (5µg/ml), einem Sekretionsblocker, über einen Zeitraum von 3h. Für die Färbung wurden die Zellen zentrifugiert (1200rpm, 5 min, 4°C) in 300µl FACS^{TM Permeabilisierungs-Lösung aufgenommen und für 15 min im dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf folgend wurde 800µl einer 0,2 %igen Saponin/PBS Lösung zu den Proben hizugegeben und wiederum zentrifugiert} (1200rpm, 5 min, 4°C). Alle Antikörper und Isotypenkontrollen wurden gemäß den Herstellerangaben für die Färbung eingesetzt. Die Antikörper-Färbung selbst wurde nach sorgfältigem Durchmischen der Proben bei 4°C für 15 min durchgeführt. Anschließend erfolgte nach einmaligen Waschen mit FACS-Puffer eine Fixierung der Zellen in 2% PFA. Die Messung wurde am Durchflußzytometer (FACS) nach Beendigung der intrazellulären IFN-g Färbung durchgeführt.

Eine Phänotypisierung der 3-4fach restimulierten T_vIL-10-Lymphozyten erfolgte mit den monoklonalen Antikörpern gegen TCR, CD4, CD8, CD25, L-Selektin und IFN-g im Durchflußzytometer (FACS). Alle Antikörper wurden nach Angaben des Herstellers eingesetzt. Die Färbung erfolgte für 15 min bei 4°C. Anschließend wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen und mit 2% PFA in PBS fixiert. Die intrazelluläre IFN-g Färbung wurde wie im Kapitel 4.2.6 beschrieben durchgeführt.

Um den Einfluß von Cyclosporin A auf die IFN-g Produktion und die Transgen-Expression der T_vIL-10-Lymphozyten zu untersuchen wurden 1x10⁵ T_vIL-10-Lymphozyten mit je 3x10⁵ bestrahlten Lewis und DA Thymozyten in TCM, 2% autologes Serum je 96-well ausgesät. Gleichzeitig erfolgte die Zugabe von Cyclosporin A in den Konzentrationen 500ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml, 10ng/ml und 0ng/ml . Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit TCM, 10% Pferde Serum, huIL-2 (25U/ml) versetzt. Die Zellkulturüberstände wurden am Tag 1-5 abgenommen und für die Proteinanalytik bei –70°C gelagert. Die IFN-g und vIL-10 Proteinbestimmung erfolgte durch kommerzielle ELISA-Kits, welche nach Vorschrift durchgeführt wurden.

Die Transplantationen wurden von unserem Mikrochirurgen Dr. Jun Yang durchgeführt. Als Empfänger-Tiere dienten männliche adulte Inzucht Lewis (Le, RT-1^l) Ratten und als Donor Dark Agouti (DA,RT-1^avl, MHC I/II inkompartibel) Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g. Empfänger und Donor Ratten wurden vor der Operation mit Gemisch aus Ketavet und Rompun intramuskulär anästhesiert. Die Transplantation wurde nach dem Protokoll von Ono und Lindsey durchgeführt (Ono et al, 1969). Die durchschnittliche Ischämie-Zeit betrug weniger als 25 min. Der adoptive Transfer der T_vIL-10-Lymphozyten oder T_MOCK-Lymphozyten erfolgte sofort nach Beendigung der Transplantation in die Penisvene des Empfängertieres. Zur Analyse des Migrationsverhaltens der PKH 26 markierten Zellen wurden diese Tag 1 nach der Transplantation nach demselben Protokoll appliziert.

Zur Analyse des spezifischen „homing“-Verhaltens der T_vIL-10-Lymphozyten und T_MOCK-Lymphozyten wurden diese vor dem adoptiven Transfer mit dem „PKH 26 red fluorescent cell linker kit“ markiert. Die große Stabilität und lange Halbwertzeit dieses Farbstoffes macht ihn zur idealen Technologie, um die Zellverteilung und Zellwanderung in vivo zu untersuchen. Die Markierung der Zellen wurde streng nach dem Hersteller-Protokoll (Sigma) durchgeführt. Nach der Markierung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in einer Konzentration von 15x10⁶ Zellen/500µl zur in vivo Applikation aufgenommen.

Nach adoptivem Transfer von PKH 26 markierten T_vIL-10-Lymphozyten und T_MOCK-Lymphozyten wurde die Anzahl der infiltrierenden Zellen im Transplantat und in Rezipienten-eigenen Organen (Herz, Leber, Lunge und Milz) bestimmt. Die Analyse erfolgte am Tag 4 nach Transplantation bzw. Tag 3 nach adoptivem Transfer. Hierzu wurden von den in flüssigem Stickstoff gelagerten Geweben 5µm dünne Kryostatschnitte angefertigt, auf einen mit Gelatine überzogenen Objektträger überführt und mit Crazy Glue fixiert. Die Auszählung der PKH26 markierten T-Lymphozyten erfolgte mit Hilfe des Zählgitters im Okular am Lasermikroskop. Es wurden 5 Sektionen mit 250 Gesichtsfeldern ausgezählt (Gesichtsfeld: 0,159mm²). Die Anzahl der PKH 26 markierter Zellen wurde in Zellen/mm² berechnet.

Für die Cyclosporin-Kombinationstherapie wurden den Empfänger-Tieren beginnend am Tag –1 (vor Transplantation) 0,5mg/kg/Tag Cyclosporin A s. c. appliziert. Die Transplantationen und der adoptive Transfer wurde wie bereits beschrieben durchgeführt.