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5  Ergebnisse

5.1 Generierung des retroviralen pLXSN vIL-10 Vektors

Als Ausgangsvektor für die Klonierung diente pBluescript vIL-10, als Zielvektor pLXSN.

Abbildung 4: pLXSN vIL-10 Vektor

Abbildung 5: DNA-Sequenz vIL-10 (kodierender Bereich)

Der für vIL-10 kodierende Bereich wurde mit den Restriktionsenzymen BamH I und EcoR V aus dem Vektor pBluescript herausgeschnitten, gleichzeitig wurde die „multiple-cloning-site“ des Klonierungsvektors pLXSN mit den Enzymen BamH I und Hpa I geöffnet. Da die Enzyme EcoR V und Hpa I „blunt-end-cutter“ sind, konnte eine direkte Klonierungsstrategie angewendet werden. Nach der Auftrennung des Klonierungsvektors und des vIL-10 Fragments im 1,5%igen Agarosegel, wurden die DNA-Fragmente mittels Jetsorb-Kit von Genomed aus dem Gel isoliert, und es folgte die Ligation des vIL-10 in den retroviralen Vektor pLXSN über Nacht bei 14°C. Anschließend wurde der Ligationsansatz in kompetente DH5a E.coli Zellen transformiert, auf antibiotikahaltigen LB-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die gewachsenen Klone wurden mittels „Mini“-Plasmidpräparation und anschließender Restriktion charakterisiert. Zur Herstellung einer großen Menge Plasmid- DNA wurde der „Maxi-Prep-Kit“ von Qiagen verwendet. Zur Langzeitlagerung wurden Glycerol-Stocks, der mit pLXSN-vIL-10 transformierten E.coli Bakterien, bei –70°C angelegt. Die vIL-10 DNA wurde sequenziert und auf ihre Richtigkeit überprüft (Abb.5).


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Abbildung 6: Generierung des Vektors pLXSN vIL-10. Restriktionsverdau des retroviralen Vektors pLXSN-vIL-10 mit EcoR I und BamH I und anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente im 1,5%igen Agarosegel (M = 1kb Marker, V = pLXSN-vIL-10 nach Restriktionsverdau).

5.2 Generierung der retroviralen Verpackungszelllinie GP+E vIL-10

Zunächst wurde die Verpackungszelllinie GP + E 86 mit dem retroviralen Vektor pLXSN vIL-10, mittels Calzium-Phoshat Transfektion transfiziert. Der virale Titer dieser polyklonalen, nicht-stabilen Verpackungszelllinie liegt 48 h nach der Transfektion bei 1x102- 1x103 cfu/ml. Dieser geringe Titer reicht nicht aus, um primäre T-Lymphozyten zu transduzieren. Eine Transduktion dieses Virenüberstandes (1x102-1x103 cfu/ml) in eine nicht transduzierte Verpackungszelllinie hingegen führt zu einen weitaus höheren Virustiter der Zelllinie. Dieses liegt darin begründet, dass es bei der viralen Transduktion zu einer bedeutend besseren Aufnahme der Virus-RNA kommt, als es bei der Transfektion von Plasmid-DNA der Fall ist. Die höhere Aufnahme an Virus-RNA führt zu einer höheren Virusproduktion, und damit zu einem wesentlich höheren Virustiter der Verpackungszelllinie. Die Verpackungszelllinien sind gentechnologisch dahingehend verändert, dass sie stabil die viralen Gene gag, env und pol exprimieren. Diese Gene kodieren für die Virushülle (env), retrovirale Enzyme (pol) und für die virale Strukturmatrix (gag). Durch die stabile Expression der Proteine für die Virushülle werden die auf der Verpackungszelllinie exprimierten viralen Rezeptoren blockiert, so dass das Eindringen eines Virus über diesen Rezeptor verhindert wird. Eine Tunikamycinbehandlung der Verpackungszelllinie führt zur Inhibierung der Oberflächenexpression des viralen Gens env, welches eine Transduktion des Virus in die


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Verpackungszelllinie erst ermöglicht. Zur Generierung einer Verpackungszelllinie mit einem hohen Titer wurde der vorhandene Virusüberstand mit geringem Titer (1x102-1x103 cfu/ml) 48h nach der Transfektion geerntet, mittels 0,45µm Filter sterilfiltriert und zu einer nicht-transduzierten GP + E 86 Verpackungszelllinie hinzugegeben, die zuvor für 16h mit Tunikamycin inkubiert wurde. Einen Tag nach der Transduktion wurde mit der negativen Selektion mittels G 418 begonnen, so dass ausschließlich die transduzierten Zellen mit dem retroviralen Vektor und dem Resistenzgen überleben konnten. Für die Generierung eines monoklonalen, stabilen Verpackungszelllinien-Klones wurde die polyklonale GP + E vIL-10 Zelllinie in einer definierten Verdünnungsreihe („Limited Dilution“) in 96-well Platten unter G 418 Selektion ausplattiert. Diese Methode ermöglicht eine Selektionierung auf Einzel-Zell-Ebene. Während der 3-4 wöchigen Kultivierung wachsen Zellkolonien, die aus einer einzelnen Zelle hervorgegangen sind. Insgesamt wurden 24 Klone isoliert, expandiert und teilweise weiter analysiert. In der Verpackungszelllinie findet parallel zur Transkription und Verpackung der Viren auch die Translation und Sekretion der viralen Gene inklusive des Transgens statt. Dadurch ist auch das verwendete Transgen vIL-10 im virushaltigen Überstand der Verpackungszelllinie zu detektieren. Zwölf der insgesamt vierundzwanzig entstandenen Verpackungszelllinien-Klone für vIL-10 transgene Retroviren wurden hinsichtlich ihrer vIL-10 Expression im ELISA analysiert. Es konnte eine Expressionshöhe von über 500 ng/ml vIL-10 in einer der klonierten Verpackungszelllinien detektiert werden (Abb.7).


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Abbildung 7: vIL-10 Expression der Verpackungszelllinien-Klone. 3 x 106 Zellen/T75 Kulturflasche wurden für 48 h inkubiert. Die vIL-10 Expression von drei ausgewählten Klonen ist dargestellt.
Zum Nachweis dafür, dass die Verpackungszelllinie nicht nur das Transgen vIL-10 im hohen Ausmaß exprimiert, sondern auch ein infektiöses Virus bildet, wurde im Anschluss an den vIL-10 ELISA eine Titerbestimmung durchgeführt. Die Expressionshöhe des Transgens im Zellkulturüberstand korreliert mit der Höhe des Virus-Titers (pers. Mitteilung A. Flügel, MPI für Neurobiologie, Abt. Neuroimmunologie, München), d.h. eine hohe vIL-10 Expression bedeutet auch einen hohen Titer. Der virale Titer (cfu/ml) des Verpackungszelllinien-Klons 8 betrug 3-5x106 cfu/ml (Tab.4). Mit diesem Klon wurden alle weiteren Experimente durchgeführt.

Tabelle 4: Virale Titer der Verpackungszelllinien. 5 x 105 Zellen/5ml wurden für 48 h kultiviert. Der viraler Titer des Zellkulturüberstandes der GP+E Verpackungszelllinien mit vIL-10 oder EGFP als Transgen ist dargestellt (n = 5).

 

viraler Titer, (cfu/ml)

GP + E vIL-10

3-5 x 106 cfu/ml

GP + E EGFP

2-3 x 107 cfu/ml


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5.3  Bioaktivitätstest für vIL-10

Um zu untersuchen, ob das retroviral exprimierte vIL-10 noch seine biologische Aktivität besitzt, wurde eine Bioaktivitätstest für vIL-10 durchgeführt. Aufgrund der hohen Homologie zwischen vIL-10 und huIL-10 konnte ein humanes Testsystem angewendet werden. vIL-10 ist ebenso im Ratten- und Maussystem biologisch wirksam. Die Stimulation von humanen PBMCs mit LPS (500pg/ml) induziert die TNF-a Freisetzung durch Monozyten und B-Zellen. Diese ist blockierbar durch die Zugabe von rekombinanten humanen IL-10. Zur Testung der Bioaktivität von vIL-10 wurde das inhibitorische Potential des Zytokins auf die TNF-a Freisetzung von PBMCs nach LPS-Stimulation mittels Immulite-Technologie untersucht. vIL-10 inhibiert die TNF-a Produktion um ca. 80% bei einer eingesetzten Konzentration von 100ng/ml bzw. 10ng/ml und um ca. 30% bei 1ng/ml vIL-10 (Abb.8). Die Inhibierung konnte aufgehoben werden durch Zugabe eines neutralisierenden anti vIL-10 Antikörpers, womit der spezifische Effekt gezeigt werden konnte. Die Bioaktivität des von der Verpackungszelllinie gebildeten vIL-10 konnte somit durch diesen Versuch nachgewiesen werden.

Abbildung 8: Inhibierung der LPS induzierten TNF- Produktion durch vIL-10. PBMCs wurden 4h mit LPS (500pg/ml) und verschiedenen Konzentrationen von vIL-10, rek. hu IL-10 und einem neutralisierenden anti vIL-10 Antikörper (Ak) inkubiert. Dargestellt ist ein repräsentativer Versuch (n=3).


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5.4  Generierung der retroviral modifizierten, alloantigen spezifischen T-Zelllinie (TvIL-10-Lymphozyten)

Die Herstellung der TvIL-10-Lymphozyten erfolgte durch die Kombination von zwei zellbiologischen Methoden: der Virustransduktion und der gemischten Lymphozyten-Kultur (MLC). In einer Kokultur wurden 3,5x105 Lymphozyten einer Lewis-Ratte mit 3,5x105 bestrahlten (30 Gray) Lymphozyten einer DA-Ratte und 3x103 vIL-10-Virus produzierenden Verpackungszellen pro Vertiefung in einer 96-well Rundboden-Platte in TCM, 2% autologes Serum, 8µg/ml Polybren für 72 Stunden kultiviert. Während der MLC werden die T-Lymphozyten alloantigen-spezifisch aktiviert, und es kommt zur polyklonalen Proliferation. Die Proliferation wiederum ist die Voraussetzung für eine erfolgreiche retrovirale Transduktion, da es während der mitotischen Zellteilungsphase zur Auflösung der Kernmembran kommt und somit erst die Integration des Retrovirus in das Wirtsgenom ermöglicht wird. Am Tag drei erfolgte die Abtrennung der Lymphozyten von der adhärenten Verpackungszelllinie durch die Überführung der Zellen in 96-well Flachboden-Platten. Die Transduktionseffizienz betrug zu diesem Zeitpunkt 10-20% der Lewis-Lymphozyten. Des weiteren wurden die Zellen zur Verstärkung der Proliferation mit TCM, 10% Pferde-Serum, 25 U/ml rekombinantem humanem IL-2 gefüttert. Am Tag 7 nach der primären MLC erfolgte die erste Restimulation der TvIL-10-Lymphozyten unter G 418 Selektion (0,4 mg/ml). Das Neomycin-Resistenzgen wurde durch das Retrovirus in die Zellen eingeführt, wodurch eine positive Selektion der transduzierten Zellen ermöglicht wurde. Die Restimulationen wurden mit einem Gemisch aus bestrahlten Lewis- und DA-Thymozyten in einem Abstand von sieben Tagen durchgeführt. Ziel dieser Restimulationsschritte war, eine ausreichend große Population der für DA-Allogene spezifische und gleichzeitig für vIL-10 transgene T-Zelllinie zu generieren. Die TvIL-10-Lymphozyten wurden in einer Konzentration von ca. 2x107 Zellen/Einfrierröhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert und für alle in vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt.

Die vIL-10 Produktion von 5x105 TvIL-10-Lymphozyten/24h/200µl betrug 1-3 ng/ml vIL-10 (Abb.9). Physiologisch gesehen ist dies ein hohe Expression, da IL-10 in vivo meistens nur in sehr geringen Konzentrationen vorliegt.


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Abbildung 9: vIL-10 Produktion der T vIL-10 -Lymphozyten. 5x105 TvIL-10-Lymphozyten bzw. TMOCK-Lymphozyten wurden in 200µl TCM-Medium für 24h inkubiert. Die Zellkulturüberstände wurden mittels ELISA analysiert (n=5).

5.5 Charakterisierung der TvIL-10-Lymphozyten

Zur biologischen Charakterisierung der TvIL-10-Lymphozyten wurden Untersuchungen zur

  1. mRNA-Expression (TaqMan-Technologie)
  2. Sekretion von Proteinen (ELISA)
  3. und Oberflächenexpression membranständiger Proteine (FACS-Technologie)

durchgeführt.

Zunächst wurden 3-fach restimulierte TvIL-10-Lymphozyten hinsichtlich ihres Zytokinexpressionsmusters auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Die Analysen erfolgten in einer Zeitkinetik über 5 Tage nach der dritten Restimulation. Als Kontrolle wurden 3-fach restimulierte TEGFP-Lymphozyten bzw. TMOCK-Lymphozyten mitgeführt. Diese Gegenüberstellung sollte neben der Charakterisierung der TvIL-10-Lymphozyten Aufschluss darüber geben, inwieweit die retrovirale Transduktion selbst, bzw. die Wahl des therapeutischen Gens, zu signifikanten Unterschieden im Zytokinexpressionsmuster auf Protein- und mRNA-Ebene der Zellen führte. Auf mRNA-Ebene wurden mittels „real-time“


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Taqman-PCR die Expression der Gene rCD25, rIFN-g, rIL-2, rIL-10, rINOS, rFasL, rBcl2, rBag-1 und vIL-10 analysiert (Abb.10). Als „house-keeping“ Gen wurde bei allen TaqMan-Analysen das mit dem TCR assoziierte Polypeptid CD3 verwendet. Mit der TaqMan-Technologie ist nur eine relative Quantifizierung möglich. Es können keine absoluten mRNA-Mengen, sondern ausschließlich die Menge einer bestimmten mRNA in bezug auf die Expression des „house keeping gens“ derselben cDNA angegeben werden. Das Ergebnis wird mathematisch als 2- CT dargestellt. Der Vergleich verschiedener cDNAs untereinander ist möglich durch die Bildung von 2- CT. Um eine Regulierung von CD3 auszuschließen, wurden zusätzliche Kontrollansätze für die „house-keeping“ Gene GAPDH und beta-Aktin mitgeführt (Daten nicht gezeigt). Bei dem Vergleich der verschiedenen Zelllinien wurden keine signifikanten Unterschiede im Zytokinexpressionsmuster auf mRNA-Ebene gefunden.

Abbildung 10: Zytokinexpressionsmuster auf mRNA-Ebene von T vIL-10 -Lymphozyten, T EGFP -Lymphozyten und T MOCK-Lymphozyten. 3-4fach restimulierte TvIL-10-Lymphozyten, TEGFP-Lymphozyten und TMOCK-Lymphozyten wurden in einer Konzentration von 1 x105 Zellen mit je 3 x105 bestrahlten LE und DA Thymozyten im 96-well Flachboden restimuliert. Am Tag 1-5 wurden die Zellen geerntet. Nach der RNA-Isolation und cDNA-Synthese wurden die Proben mittels TaqMan PCR analysiert. A) rat IFN-g; B) rat CD25; C) rat IL-2; D) rat IL-10; E) rat Bag-1; F) rat bcl-2, G) rat FasL, H) rat INOS, I) vIL-10. Als „house-keeping“ Gen wurde CD3 verwendet. Dargestellt ist die relative Expressionshöhe der Moleküle als dimensionsloses Ergebnis bezogen auf CD3.


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Auf Protein-Ebene wurden mittels ELISA die sekretierten Proteine rIFN-g, rIL-2, rIL-10, vIL-10 und rIL-4 untersucht (Abb.11). Bei dem Vergleich der verschiedenen Zelllinien wurden keine signifikanten Unterschiede im Zytokinexpressionsmuster auf Protein-Ebene gefunden.

Die TMOCK-Lymphozyten zeigten die höchste Expression von IFN-g und die geringsten IL-10 Werte. Bei den TvIL-10-Lymphozyten wurden die geringsten IFN-g und die höchsten IL-10 Protein-Werte detektiert. IL-2 wurde in allen Zelllinien nur in geringer Konzentration nachgewiesen. vIL-10 wurde, wie zu erwarten, ausschließlich in den TvIL-10-Lymphozyten detektiert (Abb.11).


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Abbildung 11: Proteinexpressionsmuster von T vIL-10 -Lymphozyten, T EGFP -Lymphozyten und T MOCK -Lymphozyten. 3-4fach restimulierte TvIL-10-Lymphozyten, TEGFP-Lymphozyten und TMOCK-Lymphozyten wurden in einer Konzentration von 1 x105 Zellen mit je 3 x105 bestrahlten LE und DA Thymozyten im 96-well Flachboden restimuliert. Am Tag 1-5 wurden die Zellenkulturüberstände abgenommen und im ELISA gemessen. A) rat IFN-g; B) rat IL-10; C) rat IL-2, D) vIL-10. Ein repräsentatives Ergebnis ist dargestellt (n = 3).


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Eine zusammenfassende Darstellung der Zytokinexpressionsmuster der 3 Zelllinien auf mRNA- und Protein-Ebenen ist in Tabelle 5 abgebildet.

Tabelle 5: Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse auf mRNA- und Protein-Ebene (+ = sehr geringe Expression; + + = geringe Expression, + + + = hohe Expression, + + + + = sehr hohe Expression; = nicht vorhanden; n.g. = nicht gemessen).

 

TvIL-10-Lymphozyten

TEGFP-Lymphozyten

TMOCK- Lymphozyten

Molekül

mRNA

ELISA

mRNA

ELISA

mRNA

ELISA

IFN- g

+ + +

+ + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

IL-2

+

+

+

+

+

+

IL-4

n.g.

unterhalb der

Nachweisgrenze

n.g.

unterhalb der

Nachweisgrenze

n.g.

unterhalb der Nachweisgrenze

IL-10

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

virales IL-10

+ +

+ +

Æ

Æ

Æ

Æ

CD25

+ + +

n.g.

+ + +

n.g.

+ + +

n.g.

INOS

+

n.g.

+

n.g.

+

n.g.

FasL

+

n.g.

+

n.g.

+

n.g.

Bag-1

+ +

n.g.

+ +

n.g.

+ +

n.g.

Bcl-2

+ +

n.g.

+ +

n.g.

+ +

n.g.

Eine weitere Phänotypisierung der TvIL-10-Lymphozyten fand mittels FACS-Analyse statt. Die Zellen wurden im FACS als CD4+, CD25+ (aktivierungsabhängig) und TCR+ identifiziert, wohingegen CD8 und L-Selektin nur auf einer geringen Prozentzahl (<10%) der Zellen exprimiert wurden (Tab.6).

Tabelle 6: Oberflächenmarker und Zytokinprofil der T vIL-10 -Lymphozyten. 1x106 TvIL-10-Lymphozyten wurden mit direkt markierten monoklonalen Ak gegen TCR, CD4, CD8, CD25, L-Selektin und IFN-g angefärbt und mittels FACS analysiert. Zellkulturüberstände der Zellen wurden im ELISA auf IFN-g und IL-4 untersucht (n = 3).

 

TvIL-10-Lymphozyten / FACS

ELISA

TCR

> 90% positiv

-

CD4

> 90% positiv

-

CD8

< 10% negativ

-

CD25

> 90% positiv

-

L-Selektin

< 5% positiv

-

IFN- g

> 90% positiv

positiv

IL-4

-

negativ

5.6 Funktionstests der TvIL-10-Lymphozyten in vitro

Bei der akuten Rejektion spielen Transplantat-infiltrierende T-Lymphozyten eine große Rolle. Diese Zellen zeichnen sich durch ein ausgeprägtes Th1 Zytokinexpressionsmuster aus. Sie produzieren IL-2 und IFN-g, und weisen eine starke Proliferation auf. In den folgenden zwei Funktionstests wurden die in vitro generierten alloantigen-spezifischen TvIL-10-Lymphozyten auf ihr immunomodulatorisches Potential getestet, die Proliferation bzw. IFN-g Produktion in naiven T-Lymphozyten nach allogener Stimulation zu hemmen.

5.6.1 Einfluss der TvIL-10-Lymphozyten auf die Proliferation naiver T-Zellen

Bei der gemischten Lymphozyten-Kultur werden die Stimulator-Zellen (DA) bestrahlt, so dass ausschließlich die „responder“ T-Zellen (LE) allogen-spezifische aktiviert werden und proliferieren. Um den Einfluss von TvIL-10-Lymphozyten auf die Proliferation von naiven T-Zellen während der allogenen Stimulation zu untersuchen, wurde folgender Versuch entwickelt. Zu einer Standard-MLC (3,5x105 LE, 3,5x105 DA (irr)) wurden 5% alloantigen-spezifische TvIL-10-Lymphozyten hinzugegeben (Simulation einer Situation, wie sie im Transplantat vorstellbar ist) und für 3 bzw. 4 Tage im Brutschrank inkubiert. Die naiven Lewis


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T-Lymphozyten wurden vor dem Zellkulturansatz mit dem Membranfarbstoff SNARF markiert. Dieses war notwendig, um die naiven T-Lymphozyten von den allogenen DA T-Zellen und TvIL-10-Lymphozyten im FACS zu unterscheiden. Bei einer Zellteilung wird der Membranfarbstoff zu gleichen Teilen an die Tochterzellen abgegeben, so dass die Abnahme der Fluoreszenzintensität ein Maß für die Proliferationsstärke der T-Zellen darstellt. Nach 3 bzw. 4 Tagen erfolgte die Auswertung am Durchflußzytometer (FACS) an Hand der Fluoreszenzstärke der mit SNARF markierten Lymphozyten. Die Fluoreszenzintensität ist als Verhältnis der mittleren SNARF Fluoreszenzstärke - bezogen auf die allogene Kontrolle - dargestellt. Eine Inhibierung der Proliferation naiver T-Zellen am Tag 3 und 4 der MLC durch Kokultivierung mit TvIL-10-Lymphozyten konnte nachgewiesen werden (Abb.12). Als Kontrollen dienten MLC-Ansätze mit 5% alloantigen-spezifische TEGFP-Lymphozyten, MLC-Ansätze ohne transgene Zellen, sowie syngene Ansätze (3,5x105 LE, 3,5x105 LE (irr)). Die Inhibierung der Proliferation von naiven T-Zellen durch TvIL-10-Lymphozyten betrug am Tag 3 ca. 15% und am Tag 4 der MLC ca. 30%, bezogen auf die Proliferation der allogenen Kontrolle. EGFP-transgene T-Lymphozyten hingegen führten sogar zu einer gesteigerten Proliferation der naiven T-Zellen auf über 200% am Tag 3 und ca. 150% am Tag 4 der MLC, bezogen auf die Proliferation der allogenen Kontrolle.


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Abbildung 12: Inhibierung der Proliferation von naiven T-Lymphozyten durch TvIL-10-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Stimulation. Die naiven LE-Lymphozyten wurden vor dem Versuch mit dem Membranfarbstoff SNARF markiert. 3,5x105 LE-Lymphozyten wurden durch bestrahlte DA-Lymphozyten (3,5x105) allogen stimuliert, bei gleichzeitiger Inkubation mit 5% TvIL-10-Lymphozyten oder TEGFP-Lymphozyten. Nach 3 (A) bzw. 4 Tagen (B) erfolgte die Auswertung am FACS-Gerät an Hand der Fluoreszenzstärke der mit SNARF markierten Lymphozyten. Die Daten sind als Verhältnis der mittleren SNARF Fluoreszenz-Intensität bezogen auf die allogene Kontrolle dargestellt. Syn = syngene Stimulation mit bestrahlten LE-Lymphozyten; allo = allogene Stimulation mit bestrahlten DA-Lymphozyten. Die Standardabweichung zeigen die Variationen innerhalb von 5 Experimenten (n =5). Signifikanz: allo/vIL-10 p<0,05 Mann-Whitney-Test; allo/EGFP p<0,01 T-Test; vIL-10/EGFP p<0,01 T-Test.


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5.6.2  Einfluss der TvIL-10-Lymphozyten auf die IFN-g Produktion naiver T-Zellen

Analog zu den Proliferations-Untersuchungen wurde ein ähnlicher Versuchsaufbau entwickelt, um den Einfluss von alloantigen-spezifischen TvIL-10-Lymphozyten auf die IFN-g Produktion von naiven LE-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Stimulation zu analysieren. Zur Unterscheidung der naiven Lymphozyten von den Stimulator-Zellen und den TvIL-10-Lymphozyten wurden diese vor Versuchsbeginn mit dem kovalent bindenden Fluoreszenzfarbstoff CFDA-SE markiert. Dieser Farbstoff ist im Kanal 1 des FACS-Gerätes detektierbar. Zu Standard-MLCs (3,5x105 LE, 3,5x105 DA (irr)) wurden 5% TvIL-10-Lymphozyten hinzugegeben. Als Kontrolle dienten syngene und allogene MLCs ohne Kokultur mit vIL-10 transgenen Zellen. Zur Analyse des Einflusses von alloantigen-spezifischen TEGFP-Lymphozyten wurden diese ebenfalls in einer Konzentration von 5% zu einer Standard MLC hinzugegeben, wobei in diesem Ansatz die naiven T-Lymphozyten nicht CFDA-SE markiert wurden, da die EGFP-transgenen Zellen ebenfalls im Kanal 1 zu detektieren sind. Im Laufe des Versuches stellte sich heraus, dass durch die Permeabilisierung der Zellmembran während der intrazellulären IFN-g Färbung die EGFP-Moleküle aus den Zellen austreten, so dass die Fluoreszenzintensität der TEGFP-Lymphozyten deutlich abnimmt. Aufgrund der unterschiedlichen Versuchsbedingungen (keine CFDA-SE Markierung der naiven T-Zellen bei Ko-Kultivierung mit TEGFP-Lymphozyten) sind die Ergebnisse nicht in Abb.14 dargestellt.

Nach 4 Tagen Inkubation wurden die Zellen zunächst für 3h mit dem Mitogen PMA/Ionomycin stimuliert und anschließend mit dem Sekretionsblocker BrefeldinA weitere 3h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen intrazellulär mit einem PE-markierten Antikörper gegen IFN-g angefärbt (Kanal 2). Es konnte eine signifikante Inhibierung der IFN-g Produktion in naiven T-Lymphozyten nachgewiesen werden. In Abbildung 13 sind exemplarisch eine allogene Kokultur mit TvIL-10-Lymphozyten und TEGFP-Lymphozyten sowie eine syngene und allogene Kontrolle im Dot-Plot dargestellt.


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Abbildung 13: Intrazelluläre IFN-g Expression naiver T-Lymphozyten nach Kokultur mit TvIL-10-Lymphozyten oder TEGFP-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Stimulation. Die naiven LE T-Lymphozyten wurden vor der Kokultur mit CFDA-SE markiert, außer für den Ansatz mit TEGFP-Lymphozyten (EGFP strahlt selbst im Kanal 1). Kokulturansatz: A) syn: 3,5x105 LE, 3,5x105 LE (irr); B) allo: 3,5x105 LE, 3,5x105 DA (irr); C) vIL-10: allo, 5% TvIL-10-Lymphozyten; D) EGFP: allo, 5% TEGFP-Lymphozyten. Nach 4 Tagen Inkubation erfolgte die intrazelluläre IFN-g Färbung nach vorheriger Stimulation mit PMA/Ionomyzin in Gegenwart des Sekretionsblockers BrefeldinA. Die Daten sind im Dot-Blot CFDA-SE gegen IFN-g PE dargestellt. Ein repräsentatives Experiment ist dargestellt (n=5).


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Sowie die Anzahl der IFN-g produzierenden Zellen als auch die Expressionshöhe wurde durch die Kokultur mit TvIL-10-Lymphozyten um ca. 50% inhibiert (Abb.14). Bei einem weiteren Versuch wurden die Ko-Kulturansatz ausschließlich alloantigen-spezifisch stimuliert ohne PMA/Ionomyzin. Auch in diesen Versuchen konnte eine Inhibierung der IFN-g Synthese detektiert werden, die bei ca. 30% lag (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 14: Intrazelluläre IFN- Expression naiver T-Lymphozyten nach Kokultur mit T vIL-10 -Lymphozyten. Die Daten sind als Verhältnis der mittleren IFN-g Fluoreszenz-Intensität zwischen allogener Kontrolle und Versuchsansatz dargestellt. A) Anzahl der IFN-g positiven Zellen; B) Mittlere Fluoreszenz Intensität (MFI) der IFN-g positiven Zellen. Syn = Stimulation mit bestrahlten LE-Lymphozyten; allo = Stimulation mit bestrahlten DA-Lymphozyten; vIL-10 = allo + 5%TvIL-10-Lymphozyten. Die Standardabweichung zeigen die Variationen innerhalb 5 Wiederholungen (n =5). Signifikanz: A) allo/vIL-10 p<0,05 Mann-Whitney-Test; B) allo/vIL-10 p<0,05 Mann-Whitney-Test.


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5.7  Migrations- und Funktionsanalysen der TvIL-10-Lymphozyten nach adoptivem Transfer im allogenen Herz-Transplantationsmodell

Nach Abschluss der erfolgreichen in vitro Untersuchungen wurden die TvIL-10-Lymphozyten hinsichtlich ihres immunmodulatorischen Potentials in vivo mittels adoptivem Transfer im Ratten-Herz-Transplantationsmodell getestet. Als Empfänger-Tiere dienten männliche adulte Inzucht Lewis (LE, RT1l) Ratten und als Spender-Tiere Dark Agouti (DA, RT1avl) Ratten. Es wurde also eine donorspezifische Transplantation in gleicher Stammkombination wie bei der Generierung der transgenen alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten gewählt. Das DA Spender-Herz wurde heterotop in das Abdomen des Empfängertieres transplantiert. Die erfolgreiche Transplantation wurde an Hand des Herzschlages des Transplantates täglich festgestellt. Bei einem rejizierten Organ ist kein Herzschlag mehr spürbar. Für den adoptiven Transfer wurden alloantigen-spezifische 3-4-fach restimulierte TvIL-10-Lymphozyten oder TMOCK-Lymphozyten verwendet, Tag 7-9 nach der letzten Restimulation. Die Zellen waren zu diesem Zeitpunkt ruhend, so dass eine erneute Aktivierung nach dem Antigenkontakt im Tier erfolgen konnte. Die Zellen wurden immer einen Tag vor dem adoptiven Transfer aufgereinigt. Dieses wurde durch einen modifizierten Ficoll-Gradienten erreicht, der es erlaubt, ausschließlich die blastischen Zellen herauszuselektionieren. Für den adoptiven Transfer wurden die Zellen in verschiedenen Zellkonzentrationen in einem Volumen von 500µl PBS in die Penisvene des transplantierten Tieres appliziert.

5.7.1 Untersuchung zur Gewebeverteilung der ex vivo generierten T-Lymphozyten in den Organen

In vorangegangenen Arbeiten konnte ein spezifisches Migrationsmuster von TEGFP-Lymphozyten nach adoptivem Transfer in die verschiedenen Organe gezeigt werden (Hammer et al, 2002). Das Einbringen und die Expression eines therapeutischen Moleküls könnte zur Veränderung dieses spezifischen „Homing-Verhaltens“ führen, was wiederum ein verändertes Wirkungsspektrum zur Folge haben könnte. Deshalb wurden alloantigen-spezifische TMOCK-Lymphozyten und TvIL-10-Lymphozyten vor dem adoptiven Transfer mit dem Membranfarbstoff PKH 26 markiert. PKH 26 ist ein Fluoreszenz-Farbstoff zur eindeutigen Detektion von markierten Zellen in Gewebeschnitten. Der adoptive Transfer erfolgte Tag 1 nach der Transplantation (beschrieben in Hammer et al, 2002). Zur Untersuchung der Gewebeverteilung wurden bestimmte Organe (Herz Tx, endogenes Herz, Leber Lunge, Milz)


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am Tag 4 nach der Transplantation entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Detektion der PKH 26 positiven Zellen erfolgte mittels Auszählung im Kryostatschnitt am Lasermikroskop. Im Vergleich zum syngenen Transplantat (Kontrolle) fand eine 3-fach höhere Einwanderung der alloantigen-spezifischen TMOCK-Lymphozyten in das allogene Transplantat statt (Abb.15, A). Die Anzahl der TvIL-10-Lymphozyten im allogenen Transplantat lag sogar um das 10-fache höher (Abb.15, B). Im Rezipienten-eigenen Herz dagegen wurden bei allen Versuchen nur vereinzelt PKH 26 positive Zellen gefunden. Dieses Ergebnis spiegelt das alloantigen-spezifische „Homing-Verhalten“ wieder, dass in vorangegengenen Versuchen schon mit TEGFP-Lymphozyten untersucht wurde (Hammer et al, 2002). Die Verteilung der PKH 26 positiven TMOCK-Lymphozyten in den Organen Milz und Leber ist vergleichbar mit den Ergebnissen der TEGFP-Lymphozyten. Die TvIL-10-Lymphozyten dagegen zeigen im Verhältnis eine leicht erhöhte Einwanderung in die Leber und die Milz und eine stark erhöhte in das Lungengewebe. Im Vergleich zur syngenen Kontrolle ist die Einwanderung der TvIL-10-Lymphozyten in die Lunge um ca. 50% erhöht. TMOCK-Lymphozyten wandern dagegen in gleicher Höhe in das Lungengewebe ein.

Abbildung 15: Verteilung der PKH 26 markierten alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten nach adoptivem Transfer in den Organen. 15 x 106 PKH 26 markierte Zellen wurden am Tag 1 nach der Transplantation i. v. appliziert. Tag 4 nach der Tx wurden die Organe entnommen und 5µm Kryostatschnitte angefertigt. Am Lasermikroskop wurden 5 Schnitte mit 250 Gesichtsfeldern ausgezählt (Gesichtsfeld: 0,159mm2). Die Anzahl der PKH 26 markierten Zellen wurde in Zellen/mm2 berechnet. A) syngene und allogene Transplantationen mit adoptivem Transfer von TMOCK-Lymphozyten; B) syngene und allogene Transplantationen mit adoptivem Transfer von TvIL-10-Lymphozyten. (n =3).


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Interessanterweise fanden sich bei dem Vergleich der absoluten Anzahl der eingewanderten Zellen nur ca. 2/3 der TvIL-10-Lymphozyten im Vergleich zu den TMOCK-Lymphozyten in allen Organen wieder (Abb.16). Eine leicht erhöhte Einwanderung der TvIL-10-Lymphozyten in Milz und Leber konnte detektiert werden im Vergleich zu den TMOCK-Lymphozyten bei der allogenen Transplantation. Die Einwanderung in die Lunge ist dagegen um die Hälfte reduziert.


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Abbildung 16: Verteilung der PKH 26 markierten alloantigen-spezifischen T MOCK -Lymphozyten mit T vIL-10 -Lymphozyten. 15 x 106 PKH 26 markierte Zellen wurden am Tag 1 nach der Transplantation i. v. appliziert. Tag 4 nach der Tx wurden die Organe entnommen und 5µm Kryostatschnitte angefertigt. Am Lasermikroskop wurden 5 Sektionen mit 250 Gesichtsfeldern ausgezählt (Gesichtsfeld: 0,159mm2). Die Anzahl der PKH 26 markierter Zellen wurde in Zellen/mm2 berechnet (n = 3).

Zur weiteren Dokumentation der Ergebnisse wurden Photos von den PKH 26 markierten Zellen in den Schnitten angefertigt. Bei der syngenen Transplantation ist nach adoptivem Transfer von TMOCK-Lymphozyten und TvIL-10-Lymphozyten nur vereinzelt eine markierte Zelle pro Gesichtsfeld zu finden. Bei der allogenen Transplantation ist hingegen, nach dem Transfer von TMOCK-Lymphozyten oder TvIL-10-Lymphozyten, eine 6-10-fach höhere Zellkonzentration von PKH 26 markierten Zellen zu detektieren (Abb.17).


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Abbildung 17: Detektion der PKH 26 markierten alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten nach adoptivem Transfer im Ratten-Herz-Transplantationsmodell. 15 x 106 PKH 26 markierte Zellen wurden am Tag 1 nach der Transplantation i. v. appliziert. Tag 4 nach der Tx wurden die Organe entnommen, 5µm Kryostatschnitte angefertigt und mikroskopisch ausgewertet. In den Abbildungen A-D sind repräsentative Gewebe-Schnitte der transplantierten Organe dargestellt. A) syngene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TMOCK-Lymphozyten; B) allogene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TMOCK-Lymphozyten; C) syngene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TvIL-10-Lymphozyten; D) allogene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TvIL-10-Lymphozyten.

5.7.2 Transplantatüberlebenszeiten nach adoptivem T-Zell Transfer

Für den adoptiven Transfer, zur Untersuchung des Einflusses auf die Verhinderung der Transplantatabstoßung, wurden TMOCK-Lymphozyten und TvIL-10-Lymphozyten in einer Konzentration von 15 x 106 Zellen/500µl PBS/Tier verwendet. Der Transfer erfolgte in diesem Fall unmittelbar nach der Transplantation. Der Herzschlag des heterotop transplantierten Herzens wurde zwei Mal am Tag kontrolliert. Als Kriterium für eine Transplantatabstoßung wurde der Herzstillstand festgelegt. Das verwendete Transplantationsmodell DA auf Lewis ist ein starkes Abstoßungsmodell und weist einen kompletten „Mismatch“ innerhalb der MHC I


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und MHC II Gene auf. Die durchschnittliche Überlebenszeit der Transplantate ohne Behandlung lag bei 6-7 Tagen. Der adoptive Transfer von 15 x 106 alloantigen-spezifischen TvIL-10-Lymphozyten führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit, auch hier lag der Zeitpunkt der Abstoßung zwischen Tag 6-7 (Tab.7). Eine direkte Zytotoxizität der TvIL-10-Lymphozyten konnte ausgeschlossen werden, indem gezeigt werden konnte, dass der Transfer von 15 x 106 transgenen Zellen im syngenen Transplantations-Modell keine Abstoßung zur Folge hatte. Die Transplantate überlebten länger als 30 Tage (Tab.7). Ebenso kam es im allogenen Modell, bei den eingesetzten Zellkonzentrationen von 15 x106 Zellen, zu keiner akzelerierten Abstoßung des Transplantates. Desweiteren konnte unsere Kooperationsgruppe in Rostock (Lehmann M.) zeigen, dass der adoptive Transfer von 15 x106 EGFP transgenen Lymphozyten in derselben Stammkombination (Nieren-Transplantation), unter „low-dose“ anti CD4-Behandlung, zu keiner Transplantatabstoßung führt.

Tabelle 7: Transplantatüberlebenszeiten nach adoptivem Transfer von T MOCK -Lymphozyten und T vIL-10 -Lymphozyten. Heterotope Herztransplantation mit sofortiger Applikation von 15x 106 TMOCK-Lymphozyten oder TvIL-10-Lymphozyten in 500µl PBS in die Penisvene der Ratten. Die Kontrolle des Herzschlages erfolgte zwei Mal am Tag. Das Transplantat wurde bei Ausbleiben des Herzschlages als abgestoßen gewertet.

Gruppen/Behandlung

Anzahl (n)

allo-Transplantat Überlebenszeit

syn + 15x106 TvIL-10-Zellen

3

> 30 Tage

allo unbehandelt

4

6,7,6,6

allo + 15x106 TvIL-10-Zellen

4

6,8,6,7

allo + 15x106 TMOCK-Lymphozyten

4

6,7,6,6

5.7.3 Auswirkung von Cyclosporin A auf die vIL-10 und IFN-g Expression der transgenen Zellen in vitro.

Cyclosporin A wird als effektives Immunsuppressivum in der Transplantationsmedizin eingesetzt. Die Wirkung wird hauptsächlich durch die Inhibierung von NFkB und die daraus resultierende verminderte Expression der Zytokingene (IL-2, IFN-g) vermittelt. Die Applikation einer geringen, suboptimalen Dosis Cy A (0,5mg/kg/Tag) führt nicht zu einer Verlängerung der Transplantat-Überlebenszeit im Modell DA-Lewis. Die Kombination einer geringen Dosis Cy A mit dem adoptivem Transfer von TvIL-10-Lymphozyten könnte den


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transgenen Zellen eine größere Chance geben, ihr immunmodulatorisches Potential zu entfalten. So besteht die Möglichkeit, dass eine suboptimale Dosis Cyclosporin A einerseits die Proliferation und IFN-g Produktion der Rezipienten T-Zellen inhibiert, anderseits aber die regulative Wirkung, vermittelt über die TvIL-10-Lymphozyten, zulässt. Ein wichtiger Aspekt bei dieser Hypothese ist die Frage, ob die vIL-10 Expression ebenso durch Cyclosporin A inhibiert wird. Da vIL-10 Expression über den retroviralen LTR-Promoter kontrolliert wird, sind wir davon ausgegangen, dass die vIL-10 Expression nur geringfügig inhibiert wird.

Um diese Hypothese zu untersuchen wurde zunächst die inhibitorische Wirkung von unterschiedlichen Dosen Cy A (500ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml, 10ng/ml) auf die Transgen-Expression und IFN-g Produktion der TvIL-10-Lymphozyten in vitro untersucht. TvIL-10-Lymphozyten wurden restimuliert unter Anwesenheit unterschiedlicher Cy A Konzentrationen. Die Zellkulturüberstände wurden zwischen Tag 1-5 auf ihren vIL-10 und IFN-g Gehalt mittels ELISA analysiert. Die Transgen-Expression wird 2-5 fach dosisabhängig durch Cy A inhibiert (Abb.18A). Die IFN-g Expression dagegen wird dosisabhängig 8-100 fach reduziert (Abb.18B).


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Abbildung 18: Dosis-Wirkungskurve von Cyclosporin A auf die vIL-10 und IFN- Expression von T vIL-10 -Lymphozyten in vitro. 1x105 TvIL-10-Lymphozyten wurden mit je 3x105 bestrahlten LE und DA Thymozyten unter Anwesenheit von 500ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml, 10ng/ml und 0ng/ml Cyclosporin A restimuliert. Tag 1-5 wurden die Zellkulturüberstände auf die vIL-10 (A) und IFN-g Expression (B) analysiert. Die Expressionshöhe der Zytokine ist als Ratio versus allogener, nicht mit Cy A behandelter Kontrolle, dargestellt (n = 5).


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5.7.4  Kombinationstherapie von Cyclosporin A und adoptivem Transfer von TvIL-10-Lymphozyten in vivo.

Bei der Kombinationstherapie wurden die Empfänger-Ratten vom Tag vor der Transplantation an mit 0,5mg/kg/Tag Cyclosporin A s.c. behandelt. Die Transplantation und der adoptive Transfer wurde nach demselben Ablauf wie in den vorangegangenen Versuchen durchgeführt. Auch die Kombinationstherapie von Cy A mit 15x106 bzw. 3x106 transgenen Zellen führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit (Tab.8). Die geringer dosierte Applikationsform von 3x106 Zellen wurde gewählt, da die Expressionshöhe der TvIL-10-Lymphozyten in vitro sehr hoch ist, so dass die Möglichkeit besteht, dass bereits eine kleinere Menge der TvIL-10-Lymphozyten zur Immunmodulation ausreicht.

Tabelle 8: Transplantatüberlebenszeiten bei der Kombinationstherapie von Cy A mit TvIL-10-Lymphozyten. Beginnend am Tag –1 wurden die Empfänger Tiere mit 0,5mg/kg/Tag Cyclosporin A behandelt. Am Tag 0 wurde die heterotope Herztransplantation mit anschließendem adoptivem Transfer von 3x106 bzw. 15x106 TvIL-10-Lymphozyten in die Penisvene durchgeführt. Die Kontrolle des Herzschlages erfolgte zwei Mal am Tag. Das Transplantat wurde bei Ausbleiben des Herzschlages als abgestoßen gewertet.

Gruppen/Behandlung

Anzahl (n)

Allo-Transplantat Überlebenszeit

allo + Cyclosporin A

4

7,7,7,7

allo + Cyclosporin A + 15x106 TvIL-10-Zellen

4

6,7,6,7

allo + Cyclosporin A + 3x106 TvIL-10-Zellen

4

7,6,7,6


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24.10.2003