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6  Diskussion

Bei den akuten Abstoßungsprozessen in der Transplantation spielen CD4+-Lymphozyten eine Schlüsselrolle. Die Inhibierung ihrer Aktivierung stellt eine Möglichkeit dar, initial in den Abstoßungsprozess einzugreifen. Dieses kann erreicht werden durch den Einsatz einer konventionellen, lebenslangen Immunsuppression, die jedoch fast immer zu gravierenden Nebenwirkungen führt und außerdem die chronische Transplantatabstoßung nicht verhindert. Ziel der modernen gentherapeutischen Forschung ist es, mit einer Kurzzeittherapie die lebenslange Akzeptanz eines fremden Organs ohne langanhaltende Schädigung der generellen Immunantwort zu erreichen. Ein mögliches Modell in der Gentherapie ist die Expression therapeutischer Gene im Transplantat mittels adenoviralem Gentransfer. Die Nachteile liegen bei der zeitlich begrenzten (transienten) Expression des Transgens und bei der ausschließlich auf das Transplantat begrenzten Expression. Ein anderer Ansatz zur Inhibierung der CD4+-Lymphozyten bietet der stabile retrovirale Gentransfer direkt in Zellen des Immunsystems (T-Zellen, DCs). Eine alloantigen-spezifische ex vivo Prägung der tansgenen Zellen führt außerdem zu einem allo-spezifischen Homing-Verhalten der Zellen in das Transplantat und die sekundären lymphatischen Organe in vivo. In der vorliegenden Arbeit ist das Potential von alloantigen-spezifischen und für vIL-10 transgenen T-Lymphozyten, immunmodulatorisch und immuninhibitorisch auf die Immunantwort bei der allogenen Transplantation einzuwirken, untersucht worden.

Dazu wurde als erstes mit Hilfe einer retroviralen Verpackungszelllinie ein Retrovirus, das das vIL-10 Gen exprimiert, generiert. Das hergestellte vIL-10 Molekül wurde hinsichtlich seiner biologischen Aktivität getestet. Es konnte gezeigt werden, dass vIL-10 haltige Zellkulturüberstände die LPS induzierte TNF-a Freisetzung in PBMC, vergleichbar mit rekombinantem IL-10, inhibieren (Abb.8). Der virale Titer der Verpackungszelllinie liegt bei 3-5 x 106 cfu/ml (Tab.4). Die retrovirale Transduktion der naiven T-Lymphozyten erfolgte mittels Ko-Kultivierung der Verpackungszelllinie bei gleichzeitiger allogener Stimulation der T-Zellen. Die Transduktionseffizienz nach der Ko-Kultivierung liegt bei ca. 10-20% der T-Lymphozyten. Über mehrere Restimulations- und Selektionsschritte wurde eine alloantigen-spezifische und für vIL-10 transgene T-Zelllinie generiert. Es konnte gezeigt werden, dass die TvIL-10-Lymphozyten sowohl die Proliferation als auch die IFN-g Produktion von naiven T-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Stimulation in vitro signifikantinhibieren (Abb.


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12,14). Der adoptive Transfer dieser allo-spezifischen TvIL-10-Lymphozyten führte jedoch in den bisherigen Untersuchungen, allein und in einer Kombinationstherapie mit Cyclosporin A (suboptimale Dosis), zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit im Herz-Transplantationsmodell der Ratte (Tab.7,8).

6.1 T-Lymphozyten als Zielzellen für die Genexpression in das Transplantat

Das Problem vieler Arbeiten zum Gentransfer ist immer noch die optimale Applikation des therapeutischen Moleküls. So führt die systemische Gabe eines Zytokins selten zu einem lokales Milieu, welches der physiologischen Situation entspricht. Außerdem haben Zytokine im Serum eine sehr kurze Halbwertszeit, so dass das therapeutische Protein ständig nachgeliefert werden müsste, um den gewünschten Serumspiegel zu erreichen. Die systemische Gabe von Zytokinen kann zudem zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. In vorangegangenen Studien wurde bereits das enorme Potential von T-Zellen als Transportvehikel für therapeutische Moleküle dargestellt. Dieses erfolgte am Beispiel des Reportergens EGFP. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden:

  1. Die alloantigen-spezifische Aktivierung retroviral transduzierter T-Zellen führt in vitro und in vivo zu einer gesteigerten Transgenexpression, die durch die Kombination einer gesteigerten Zahl transduzierter Lymphozyten und die verstärkte Expression in der einzelnen Zelle hervorgerufen wird (Hammer et al, 2000).
  2. Die Migration der alloantigen-spezifischen Zellen nach adoptiven Transfer erfolgt spezifisch (unabhängig vom Wirkungsmechanismus) in das allogene Transplantat. Außerdem rezirkulieren die transgenen Zellen durch die sekundären lymphatischen Organe, die Orte, an denen unter anderen die T-Zellaktivierung über APCs stattfindet (Hammer et al, 2002).

Des weiteren sind T-Lymphozyten unproblematisch zu isolieren und kultivieren und weisen eine lange natürliche Lebensdauer auf. Auf Grund dieser Tatsachen und Ergebnisse sind T-Lymphozyten außergewöhnlich gut als Transportvehikel für therapeutische Moleküle geeignet.

Neben der Anwendung von T-Zellen sind auch dendritische Zellen sehr gut für einen gentherapeutischen Ansatz geeignet, da sie ebenfalls ausschlaggebend an der Initiation und


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Regulation der Immunantwort beteiligt sind. Neuere Untersuchungen haben Erkenntnisse zur Entwicklung, Reifung, Aktivierung und Funktion von DCs beigetragen. Es existieren unterschiedliche Subtypen dieser Zellen, die in Abhängigkeit ihrer Zytokinexpression und Oberflächenmoleküle polarisierend zu einer Th1 oder Th2 Immunantwort führen und die Entstehung regulatorischer T-Zellen induzieren können. Viele Untersuchungen weisen daraufhin, dass DCs eine große Rolle bei der Entwicklung einer zentralen als auch peripheren Toleranz spielen. Aus diesen Gründen stellt die genetische Manipulation, z.B. durch die Überexpression anti-inflammatorischer Moleküle (IL-10, TGF-b) eine weitere Möglichkeit dar, immunmodulatorische auf die allogene Immunantwort einzuwirken. Es konnte gezeigt werden, dass der retrovirale Gentransfer von vIL-10 in dendritische Vorläuferzellen zu der Entstehung von potentiell toleranten APCs führt (Takayama et al, 1999).

6.2 Generierung vIL-10 produzierender T-Zellen

Regulatorische T-Zellen spielen bei der Induktion und Erhaltung einer Toleranz eine wichtige Rolle. Eine in vitro Generierung dieser T-Zellen wäre daher von enormen Interesse. Diese gestaltet sich aber, abgesehen von einigen Berichten über IL-10 generierte regulatorische T-Zellen, als sehr schwierig (Groux et al, 1997). Es ist bisher auch nicht gelungen, in vivo generierte, regulatorische Zellen längere Zeit in Kultur zu halten oder gar zu vermehren. Es schien daher ein sinnvoller Ansatz zu sein, regulatorische T-Zellen durch gezielte Überexpression von therapeutischen Molekülen in vitro zu generieren und auf ihr regulatorisches Potential zu untersuchen.

Zur Herstellung einer alloantigen-spezifischen und für das anti-inflammatorische Molekül vIL-10 transgenen T-Zelllinie wurde ein retrovirales Transduktionssystem verwendet. Die Transduktionseffizienz nach Ko-Kultivierung der MLC mit der Verpackungszelllinie über drei Tage liegt bei nur durchschnittlich 10-20%, so dass anschließende Restimulationen unter gleichzeitiger Antibiotikaselektion notwendig sind. Die Selektion ist möglich durch das auf dem retroviralen Plasmid integrierte Neomycin-Gen. Die Restimulationen ermöglichen die Herstellung einer nahezu 100%igen Population von alloantigen-spezifischen und für vIL-10 transgenen T-Zellen. Nachteilig ist der große Zeitaufwand, der benötigt wird, um eine ausreichend große Population der TvIL-10-Lymphozyten für die in vivo Applikationen zu generieren. Des weiteren kann bei der Umsetzung der T-Lymphozyten nach Ko-Kultivierung mit der Verpackungszelllinie eine Kontamination der T-Zellen mit der adhärenten


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virusproduzierenden Zelllinie auftreten. Da diese ebenfalls über das Resistenzgen verfügt, ist eine Abtrennung über Antibiotikaselektion nicht möglich. Die Ko-Kultivierung selbst ist notwendig, da die viralen Titer der retroviralen Verpackungszelllinien relativ gering sind (im Vergleich zu adenoviralen Titern). Viele Untersuchungen deuten daraufhin, dass die Transduktionseffizienz in eine Zielzelle unter anderen im direkten Zusammenhang mit der Titerhöhe steht. Um so höher der Titer, um so größer ist die Effizienz. Die in unserem System verwendeten Titer lagen zwischen 3x106- 3x107 cfu/ml (Tab.4). Im Vergleich dazu liegen die adenoviralen Titer bei über 1x1010 pfu/ml, nach Aufkonzentrierung des Virus. Eine Anreicherung der Retroviren mittels Ultrazentrifugation ist auf Grund der instabilen Virushülle nicht möglich. Die einzige Möglichkeit bisher, indirekt einen höheren Titer zu erreichen ist die Kokultivierung über einen längeren Zeitraum von drei Tagen, wie in unseren System angewendet. Weiter scheinen Zell-Zell-Kontakte ebenfalls eine Rolle bei der Virusaufnahme zu spielen. In den letzten Jahren wurden Methoden entwickelt, die mit Hilfe von Filtern verschiedener Größe eine schonende Aufkonzentrierung der Retroviren mittels Zentrifugation erlauben. Erste Ergebnisse sind sehr vielversprechend hinsichtlich der Titererhöhung bei gleichzeitigem geringen Virusverlust. Ziel der Weiterentwicklung der retroviralen Transduktionssysteme liegt darin, einen Virusstock mit einem sehr hohen Titer zu generieren, wodurch eine Ko-Kultivierung vermieden werden kann. Weitere Arbeiten zum Gentransfer mit Virusüberstand im Hinblick auf eine Humananwendung sind geplant.

6.3 Einfluss von vIL-10 auf die transduzierte Zelllinie

Die retroviral transduzierten T-Zelllinien (TvIL-10-Lymphozyten, TEGFP-Lymphozyten, TMOCK-Lymphozyten) wurden nach ihrer Generierung ausführlich charakterisiert. Sowohl auf Protein-Ebene, mRNA-Ebene und mittels FACS-Analyse wurde eine hohe IFN-g Expression und auf Proteinebene keine IL-4 Expression detektiert (Tab.5,6). Dieses entspricht dem Phänotyp von Th1-Zellen. Aber auch in regulatorischen Zellen konnte eine IFN-g Expression nachgewiesen werden. TvIL-10-Lymphozyten zeigen keine signifikanten Unterschiede auf Protein und mRNA-Ebene im Vergleich zu TEGFP-Lymphozyten und TMOCK-Lymphozyten. Zum einen deutet dieses daraufhin, dass durch die retrovirale Transduktion keine einschneidenden Veränderungen in den T-Zellen hervorgerufen wurden, welches ein wichtiges Kriterium bei der Verwendung viraler Transduktionssysteme ist. Andererseits wurde der Th1- Phänotyp, der schon in TEGFP-Lymphozyten beschrieben wurde, nicht durch die Überexpression von vIL-10


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verändert (Hammer et al, 2002). IL-10 spielt eine große Rolle bei der Regulation der Entwicklung einer Th1- und Th2-Immunantwort. Der exakte Regulationsmechanismus wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Vor kurzen konnte gezeigt werden, dass der immunsuppressive Effekt von vIL-10 im direkten Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Th2-Zytokinen, z.B. IL-4 und IL-10 steht (Qin et al, 2001). Andererseits führt der lokale Gentransfer von IL-10 nicht zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit, und in einem syngenen Tumor-Modell sogar zur Tumorabstoßung (Qin et al, 1996; Suzuki et al, 1995). In vielen Modellen konnte jedoch gezeigt werden, dass eine Toleranzinduktion in Korrelation mit einer erhöhten Sekretion von Th2-Zytokinen steht (Takeuchi et al, 1992; Sayegh et al, 1995). Da auch vIL-10 bei den anti-inflammatorischen Zytokinen eingeordnet wird und IL-10 auch schon im Zusammenhang mit regulatorischen T-Zellen diskutiert wird, liegt der Schluss nahe, dass die Gegenwart von vIL-10 schon bei der ersten allogenen Stimulation, und die anschließende Überexpression von vIL-10 in den T-Zellen selbst, zu einer Veränderung des Phänotyps der Zellen führen würde. Eine Veränderung des Phänotyps der generierten TvIL-10-Lymphozyten von Th1 in Richtung Th2 konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die IFN-g Expression auf Protein-Ebene lag zwar geringfügig unter der von den TMOCK-Lymphozyten und TEGFP-Lymphozyten, aber dennoch wurden Konzentrationen zwischen 1-5 ng/ml IFN-g erreicht. Anti-apoptotische Gene, wie Bcl-2 oder Bag1 wurden von allen Zelllinien auf mRNA-Ebene sehr viel stärker als der apoptotische Marker FasL oder INOS exprimiert. Auch der Aktivierungsmarker CD25 (a-Kette des IL-2 Rezeptors) konnte aktivierungsabhängig auf allen T-Zelllinien nachgewiesen werden. Trotz des Th1 Phänotyps der transgenen T-Zelllinie ist nicht auszuschließen, dass Subpopulationen in der Zelllinie enthalten sind, die zusätzlich zu der vIL-10 Überexpression regulativ wirken können. Somit besteht die Möglichkeit, dass die TvIL-10-Lymphozyten über zwei verschiedene Wirkungsmechanismen in den Rejektionsprozess eingreifen können. Zum einen über die Sekretion des antiinflammatorischen und immunmodulatorischen Moleküls vIL-10, zum anderen über regulativ wirkende T-Zell-Subpopulationen der T-Zelllinie.

6.4 Wirkung und Wirkungsmechanismen der TvIL-10-Lymphozyten in vitro

Die Funktionsanalysen der TvIL-10-Lymphozyten in vitro zeigen deutlich das immunmodulatorische Potenzial der für vIL-10 transgenen T-Zelllinie. Die Proliferation und die IFN-g Produktion von naiven T-Zellen konnte, bei gleichzeitiger allogener Stimulation,


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signifikant inhibiert werden (Abb.12,14). In der gemischten Lymphozyten-Kultur (MLC) kann die Aktivierung der naiven „responder“ T-Zellen über zwei Wege vermittelt werden. Bei der direkten Antigenpräsentation werden die Alloantigene von den Stimulator-APCs direkt präsentiert. Bei der indirekten Antigenpräsentation werden die Spenderantigene zunächst von den „responder“ APCs phagozytiert und anschließend über MHC II den eigenen T-Lymphozyten präsentiert. Beide Aktivierungswege können gleichzeitig ablaufen, wobei die direkte Aktivierung schneller greift als die indirekte und somit den vorherrschenden Mechanismus der Antigenpräsentation in einer MLC wiederspiegelt. Das Modell der MLC ist eine stark vereinfachte Darstellung einer Situation, wie sie bei der allogenen Transplantation in vivo vorliegt. Auch hier scheinen die Spender-APCs eine wichtige Rolle bei der Entscheidung zwischen Toleranz und Rejektion zu spielen (Sekine et al, 1997; Josien et al, 1998). Der Wirkungsmechanismus von vIL-10, der zur Inhibierung der Proliferation und auch IFN-g Produktion der naiven T-Zellen führt, kann ebenso über verschiedene Ebenen vermittelt werden. Zum einen durch die Inhibierung der „responder“-APCs und zum anderen durch die Inhibierung der direkten Antigenpräsentation mittels Spender-APCs. Interessanterweise führt die Kokultivierung von EGFP transgenen T-Lymphozyten zu einer Verstärkung der Proliferation und auch IFN-g Produktion in den naiven T-Zellen (Abb.12). Die Ursache hierfür ist nicht klar, es könnte jedoch sein, dass die Alloreaktivität der TEGFP-Lymphozyten und die damit verbundene hohe IFN-g und auch IL-2 Produktion zu einer schnelleren Aktivierung der naiven T-Zellen führt als im allogenen Kontrollansatz ohne transgene Zellen. Die Aktivierung erfolgt wahrscheinlich über die direkte Antigenpräsentation durch die Spender APCs und wird zusätzlich unterstützt durch die sofortige Sekretion von IL-2 durch die TEGFP-Lymphozyten. Die TvIL-10-Lymphozyten konnten trotz des Th1 Phänotyps und der hohen IFN-g Produktion inhibitorisch wirken (Abb.12,13,14). Dieser Effekt wird am wahrscheinlichsten über die Inhibierung von kostimulatorischen Molekülen auf „responder“ und Spender APCs vermittelt (Bejarano et al, 1992). Eine direkte inhibitorische Wirkung von vIL-10 auf den B7 Rezeptor CD28 oder CTLA-4 von T-Zellen wurde ebenfalls beschrieben (Schonrich et al, 1998). Andere Gruppen beschreiben ähnliche Effekte von IL-10. So führt die Aktivierung von T-Zellen in Gegenwart von IL-10 zur Anergie der Zellen, die weder durch IL-2, noch durch Stimulation von anti-CD3 und anti-CD28 revertierbar ist (Groux et al, 1996). Weiter wird die über IL-10 vermittelte Anergie assoziiert mit der Induktion von regulatorischen T-Zell-Populationen. Diese produzieren hohe Konzentrationen an IL-10 und supprimieren effektiv die


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antigen-spezifische Immunantwort in vitro und in vivo (Asseman et al, 1999). Mit Hilfe der TvIL-10-Lymphozyten konnte das erste Mal in vitro gezeigt werden, dass nach retroviraler Transduktion von naiven T-Zellen mit dem anti-inflammatorischen Molekül vIL-10, diese wirkungsvoll einen inhibitorischen Einfluss auf die allogenen T-Zell-Aktivierung vorweisen.

6.5  Wirkung der TvIL-10-Lymphozyten in vivo

6.5.1 Adoptiver Transfer im Herztransplantationsmodell

Aufgrund der im Kapitel 6.5. beschriebenen Resultate und der Ergebnisse der in vitro Studien mit den TvIL-10-Lymphozyten sind wir von der Hypothese ausgegangen, dass eine lokale alloantigen-spezifische Sekretion des anti-inflammatorischen Moleküls vIL-10 über die retroviral modifizierten T-Lymphozyten erfolgt. Als Transplantationsmodell wurde die Übertragung des Herzens von DA-Ratten auf Lewis-Ratten gewählt, also eine donorspezifische Transplantation in gleicher Stammkombination wie bei der Generierung der transgenen alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten. Die beiden Rattenstämme weisen einen kompletten Mismatch in den Genloci MHC I und MHC II auf. Die durchschnittliche Transplantatüberlebenszeit in diesem starken Abstoßungsmodell liegt zwischen Tag 6-8. Der adoptive Transfer von 1,5 x 107 transgenen Zellen erfolgte sofort im Anschluss an die Transplantation in die Penisvene des Tieres. Es konnte keine Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit nach adoptivem Transfer von 1,5 x 107 TvIL-10-Lymphozyten nachgewiesen werden (Tab.7). Die Herzen wurden zwischen Tag 6-7 abgestoßen. Die Überexpression des anti-inflammatorischen Moleküls könnte es zu einem veränderten Migrationsverhalten der transgenen Zellen führen. Um dieses zu untersuchen, wurden sowohl TMOCK-Lymphozyten als auch TvIL-10-Lymphozyten vor dem adoptivem Transfer mit dem Fluoreszenzfarbstoff PKH 26 markiert. Am Tag 4 nach der Transplantation wurden die Organe entnommen und mit Hilfe von Gewebeschnitten die Anzahl der PKH 26 markierten Zellen bestimmt. Es konnte ein alloantigen-spezifisches Migrationverhalten der TvIL-10-Lymphozyten nachgewiesen werden (Abb.15,16). Die Ergebnisse sind hinsichtlich der Allospezifität vergleichbar mit den Migrationsstudien der TEGFP-Lymphozyten. Im Vergleich der TMOCK-Lymphozyten mit den TvIL-10-Lymphozyten wird deutlich, dass die Gesamtanzahl der zu detektierenden markierten TvIL-10-Lymphozyten reduziert ist. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die Zellen vermehrt apoptotisch sind. Die mRNA-Untersuchungen der apoptotischen Marker FasL und INOS sind zwar nicht erhöht, es besteht jedoch die


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Möglichkeit, dass die hohe IFN-g Produktion der TvIL-10-Lymphozyten zur Aktivierung des Immunsystems führt, welches den Tod der Zellen zur Folge hat. Ebenso besteht die Möglichkeit, dass die TvIL-10-Lymphozyten auf dem Weg in das Transplantat „versickern“, was erklären würde, dass lediglich 2/3 der ursprünglich applizierten TvIL-10-Lymphozyten im Vergleich zu den TMOCK-Lymphozyten im Gewebe wiederzufinden sind (Abb.16). Unklar ist bislang, wie hoch die vIL-10 Konzentrationen in vivo im Transplantat und den sekundären lymphatischen Organen sind. Dieses ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Viele Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-10 und vIL-10 dosis-abhängig wirken. Die systemische Applikation von IL-10 und eine lokale hohe Konzentration führt in einigen Transplantationsmodellen zu einer akzelerierten Abstoßung (Qian et al, 1996; Li et al, 1997). Der retrovirale Gentransfer von vIL-10 im Herztransplantationsmodell hingegen zeigt eine vielversprechende Überlebenszeitverlängerung des Transplantates (Qin et al, 1996; Zuo et al, 2001). Ebenso wurde beschrieben, dass hohe Konzentrationen von IL-10 assoziiert sind mit der Ausbildung einer Toleranz gegen allogene Stammzellen des Knochenmarks (Bacchetta et al, 1994). Diese Ergebnisse deuten klar daraufhin, dass die Wirkung von IL-10 und auch vIL-10 dosisabhängig ist (Blazar et al, 1998). Eine exakte Regulierung der Expressionshöhe ist jedoch nach retroviralen Gentransfer nicht möglich. Es besteht auch die Möglichkeit, dass die Expression des therapeutischen Gens zu hoch ist und dadurch ein gegenteiliger Effekt erzielt wird. Aus diesem Grund wurde eine geringer dosierte Applikation der TvIL-10-Lymphozyten (3 x 106 T-Zellen) getestet, die jedoch ebenfalls zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führte (Tab.8).

6.5.2 Kombinationstherapie: Cy A und TvIL-10-Lymphozyten

Das gewählte Transplantationsmodell DA auf Lewis ist, wie schon erwähnt, ein sehr starkes Abstoßungsmodell. Deshalb haben wir zur Unterstützung der TvIL-10-Lymphozyten eine Kombinationstherapie mit Cyclosporin A gewählt. Cyclosporin A wirkt als Calcineurininhibitor und wird bei humanen Transplantationen als wirkungsvolles Immunsuppressivum eingesetzt, so dass es zu keiner akuten Abstoßungsreaktion kommt. Die Applikation einer geringen, suboptimalen Dosis Cy A („low dose“ 0,5mg/kg/Tag entspricht ca. 200ng im Serum) führt in diesem Modell nicht zur Verhinderung der Rejektion, inhibiert aber das Immunsystem dahingehend, dass möglicherweise regulatorische T-Zellen entstehen können, bzw. die TvIL-10-Lymphozyten ihr immunmodulatorischen Potenzial entfalten können. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Gabe von einer mittelhohen, nicht-


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therapeutisch wirksamen Cy A Konzentration (1,5mg/kg/Tag) zur Toleranzinduktion in einigen Transplantationsmodellen führt (pers. Mitteilung H.-D. Volk). Es ist vorstellbar, dass die geringe Cy A Konzentration die allogene Immunantwort stark genug inhibiert, dass die Transplantatabstoßung zunächst verhindert wird, aber gleichzeitig das Immunsystem noch ausreichend aktiviert ist, um die Generierung regulatorisch wirkender T-Zellen zuzulassen. Die Applikation von Cyclosporin A führt über die Inhibierung von NFkB zu einer verminderten Zytokinsynthese (IL-2, IFN-g), was wiederum eine Inhibierung der allogenen Immunantwort zur Folge hat. Wir sind von der Hypothese ausgegangen, dass die Applikation von Cy A folgendes bewirkt:

1) Hemmung der Proliferation der Rezipienten T-Zellen.

2) Hemmung der IFN-g Synthese in den Rezipienten und vIL-10 transgenen Zellen.

Des weiteren wird das therapeutische Transgen vIL-10 über den retroviralen LTR-Promoter transkribiert, von dem zwar bekannt ist, dass Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren NFAT, NFkB und AP-1 vorhanden sind, welcher jedoch auch große Unterschiede im Vergleich zu humanen Promotern aufweißt (Hammer et al, 2000). Dadurch könnte die über den LTR-Promoter vermittelte vIL-10 Transkription nur geringfügig von Cy A inhibiert werden. Zunächst wurde diese Hypothese in vitro untersucht. TvIL-10-Lymphozyten wurden restimuliert in der Gegenwart von verschiedenen Cy A-Konzentrationen. Anschließend wurden die Zellkulturüberstände am Tag 1 bis 5 auf ihre IFN-g und vIL-10 Konzentrationen im ELISA getestet. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass die IFN-g Sekretion bei einer Konzentration von 200ng/ml Cy A 20-30fach inhibiert wurde (Abb.18B). vIL-10 dagegen wurde nur um das 4-5 fache inhibiert (Abb.18A). Die Expressionshöhe des Transgens und die T-Zell-Aktivierung stehen im direkten Zusammenhang. Folglich hat die Applikation von Cy A indirekt auch einen Einfluss auf die Expressionshöhe des Transgens der TvIL-10-Lymphozyten. Während die IFN-g Expression jedoch fast vollständig inhibiert wird, kann vIL-10 noch in einer therapeutisch relevanten Dosis sekretiert werden, so dass diese Kombinationstherapie in vivo zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit - vermittelt über die transgenen T-Lymphozyten - führen könnte. Die Transplantationen wurden wie schon beschrieben durchgeführt. Mit der Cy A Therapie wurde einen Tag vor der Transplantation mit einer subcutanen Injektion von 0,5mg/kg/Tag begonnen. Der adoptive Transfer von 15 x106 oder 3 x106 TvIL-10-Lymphozyten erfolgte im sofortigen Anschluss an die Transplantation. Auch die


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Kombinationstherapie führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit. Die Abstoßung der allogenen Transplantate erfolgte am Tag 7 (Tab.8).

Das Ausbleiben einer immuninhibitorischen oder immunmodulatorischen Wirkung der TvIL-10-Lymphozyten im allogenen Transplantationsmodell kann unterschiedliche Ursachen haben:

6.5.3 Problematik von Dosis und Wirkung von vIL-10.

Nach den bisherigen Erkenntnissen ist nicht bekannt, wie viel bioaktives vIL-10 von den transgenen T-Lymphozyten nach dem adoptiven Transfer in vivo exprimiert wird. Auf Grund der vorangegangenen Studien mit EGFP als Reportergen können wir davon ausgehen, dass die Sekretion spezifisch im Allotransplantat und den sekundären lymphatischen Organen erfolgt. EGFP wird in der Zelle akkumuliert, so dass keine direkten Vergleiche mit der Sekretion eines therapeutischen Moleküls gezogen werden können. Es besteht die Möglichkeit, dass die sekretierte Menge an vIL-10 zu gering oder zu hoch ist. Auch die Expression des IL-10-Rezeptors auf den verschiedenen Zellen des Gewebes und der Immunzellen ist im direkten Zusammenhang mit der Wirkung von vIL-10 auf die Regulation der allogenen Immunantwort zu sehen (Ding et al, 2001). Weitere Experimente müssen folgen, um zu untersuchen in welcher Höhe vIL-10 nach dem adoptiven Transfer im allogenen Transplantat, den sekundären lymphatischen Organen und anderen Geweben exprimiert wird. Ebenso Untersuchungen zur Expression des IL-10-Rezeptors. Diese Ergebnisse würden wichtige Informationen zur Aufklärung von Dosis und Wirkung des anti-inflammatorischen Moleküls vIL-10 in der Regulation der allogenen Immunantwort liefern.

6.5.4 Zeitliche Applikation und Wirkungsmechanismus von vIL-10.

Ein weiteres essentielles Problem beim adoptiven Transfer ist der Zeitpunkt der Zellgabe. In unserem System wurden die therapeutischen Zellen zeitgleich mit der Transplantation i.v. appliziert. Es ist bislang wenig darüber bekannt, wie schnell die Migration der Zellen in das Transplantat, die regionalen Lymphknoten und die Milz erfolgt. Auch die durch die alloreaktive Aktivierung verstärkte Transgenaktivierung wird eine gewisse Zeitspanne benötigen, in der die Initiation der allogenen Immunantwort bereits stattgefunden haben könnte. Die Generierung von alloreaktiven Effektorzellen findet vorwiegend im Transplantat und den regionalen Lymphknoten statt. Eine Schlüsselrolle spielen dabei die Dendritischen Zellen, die ebenso wie vIL-10 und IL-10 im Zusammenhang bei der Entstehung von regulatorischen T-Zellen diskutiert werden (Jonuleit et al, 2001). Dendritische Zellen kommen


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in zwei Aktivierungsstufen vor. Unreife Vorläufer DCs (Monozyten) wandern, durch Entzündung, Pathogene oder Zytokine angeregt, in das Gewebe ein (Roncarolo et al, 2001). Die Reifung der DCs erfolgt im Zusammenhang mit der Beladung der DCs mit Peptiden und ihrer darauffolgenden Wanderung zu den regionalen Lymphknoten. Hier findet die Aktivierung von naiven Lymphozyten über reife DCs statt (Lanzavecchia and Sallusto, 2001). Es ist bislang jedoch weder bekannt, wann und wo regulatorische T-Zellen entstehen, noch ob unterschiedliche Subtypen der regulatorischen Zellen die Th1 und Th2 Immunantwort regulieren. Der Wirkungsmechanismus von vIL-10 und IL-10 kann auf verschiedenen Ebenen vermittelt werden. Zum einen ist vorstellbar, dass vIL-10 die Generierung von IL-10 produzierenden T-Zellen über APCs induziert, zum anderen könnte vIL-10 auch direkt auf die T-Zellen wirken. Da eine inhibitorische Wirkung auf DCs und Makrophagen bereits in verschiedenen Modellen nachgewiesen werden konnte und IL-10 behandelte DCs Toleranz induzieren, ist der Wirkungsmechanismus über DCs sehr wahrscheinlich (Steinbrink et al, 1997, 2002). Es besteht die Möglichkeit, dass der Zeitpunkt des adoptiven Transfers der transgenen T-Lymphozyten nicht optimal für die Entwicklung einer regulativen, immunsuppressiven Immunantwort ist. Es konnte bereits im Maus-Transplantations-Modell gezeigt werden, dass eine Vorbehandlung mit IL-10 mit anschließender allogener Herztransplantation zur einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führt (Li et al, 1999). Da der Wirkungsmechanismus von vIL-10 und auch IL-10 wahrscheinlich hauptsächlich über die Inhibierung der DCs erfolgt, könnte es sinnvoll sein, die transgenen T-Lymphozyten bereits vor der allogenen Transplantation adoptiv zu applizieren. So könnte bereits vor dem ersten Antigenkontakt zwischen Alloantigen und DC eine Milieu geschaffen werden, welches die allogene Immunantwort effektiv inhibiert. Ein wiederholter adoptiver Transfer könnte diesen Effekt zusätzlich unterstützen. Diese Untersuchungen werden derzeit durchgeführt.

6.5.5 Th1 Phänotyp der TvIL-10-Lymphozyten.

Der stark ausgeprägte Th1 Phänotyp der TvIL-10-Lymphozyten stellt eine weitere zentrale Problematik in diesem Modell dar. Der adoptive Transfer von 15 x106 alloreaktiven TEGFP-Lymphozyten führt zwar nicht zu einer akzelerierten Abstoßung, dennoch ist nicht auszuschließen, dass der Th1 Phänotyp zu einer Inhibierung der immunmodulatorischen Effekte von vIL-10 führt (Hammer et al, 2002). In zahlreichen Modellen konnte bereits gezeigt werden, dass die akute Rejektion einhergeht mit der Expression von Th1 Zytokinen


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(IL-2, IFN-g). In Modellen, die zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führen, sind dagegen Th2 Zytokine (IL-4) zu detektieren (Heidecke et al, 1996). Es ist nicht auszuschließen, dass der Th1 Phänotyp der transgenen T-Lymphozyten einen negativen Einfluss auf die regulatorischen, immunsuppressiven Eigenschaften der Zellen selbst ausübt. Eine Alternative ist die Herstellung alloantigen-spezifischen und transgenen T-Zelllinie, die einen Th2 Phänotyp aufweist. Dieses könnte möglich sein, durch die Gegenwart von anti-IL-12 mAk und IL-4 schon während der ersten MLC. Der limitierende Faktor ist zur Zeit, dass es noch keinen monoklonalen Ak gegen IL-12 im Rattensystem gibt. Dass die Anwesenheit von anti-IL-12 und IL-4 zur Generierung von Th2 T-Zellen führt konnte bereits im Maus-System gezeigt werden.

6.5.6 Alloreaktivität und Zytotoxizität der TvIL-10-Lymphozyten.

CD4+ allospezifische Effektor-T-Zellen mit einem Th1 Phänotyp sind die Hauptinitiatoren der akuten Rejektion. Da die in vitro generierten transgenen T-Lymphozyten den gleichen Phänotyp aufweisen und ebenfalls allospezifisch sind, könnten die genmodifizierten Zellen selbst eine Rejektion auslösen. Es konnte gezeigt werden, dass die in vitro gewonnenen alloantigen-spezifischen Lymphozyten nur bei Applikation in einer sehr großen Zellzahl (50 x 106 Zellen) ein Transplantat in einer subletal bestrahlten Ratte abstoßen konnten (Hammer et al, 2001). Die Applikation von geringeren Zellzahlen, wie in unseren Modell verwendet, führen jedoch nicht zu einer akzelerierten Rejektion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Toleranzinduktion, vermittelt über den nicht-depletierenden anti-CD4 Antikörper, nicht durch den adoptiven Transfer von 15 x106 alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten verhindert wurde (Dr. Lehmann, pers. Mitteilung). Des weiteren sind Studien zur Zytotoxizität der transgenen Zellen erforderlich, um herauszufinden, ob die transgenen Effektor T-Zellen eventuell das allogene Gewebe vermittelt über einen zytotoxischen Effekt zerstören.

6.6 Gentherapie und Biosicherheit

Der molekularbiologische Aufbau der Retroviren zeichnet sich unter anderem durch ihre Fähigkeit aus in die DNA des Wirtsgenom zu integrieren. Die Integration erfolgt über bestimmte repetitive Elemente, den „long terminal repeats“ (LTR) der Retroviren. Diese Sequenzbereiche besitzen außerdem Promoter-Eigenschaften, so dass die heute verwendeten retroviralen Expressionsvektoren oftmals minimiert sind auf die Bereiche: 5’LTR, Verpackungssignal, Transgen, Poly A Signal, Resistenzgen und 3’LTR (Walther and Stein,


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2000). Die Integration des Virus und auch des viralen Expressionsvektors erfolgt zufällig, so dass die Möglichkeit eines DNA-Defektes und somit eine onkogene Transformation der Wirtszelle nicht ausgeschlossen werden kann (Haviernik et al, 2002). Durch die Transduktion der T-Lymphozyten in vitro ist jedoch die Möglichkeit vorhanden, diese vor dem adoptiven Transfer hinsichtlich ihrer onkogenen Entartung zu untersuchen, so dass dieses Risiko kalkulierbarer, jedoch nicht völlig auszuschließen ist. Das System der Verpackungszelllinie ist so aufgebaut, dass die retroviralen Proteine zur Bildung der Hülle, Strukturmatrix und Enzyme des Retrovirus (gag, env, pol) stabil aber ohne Verpackungssignal in das Genom der Zelllinie eingebaut sind. Auf dem retroviralen Vektor hingegen sind diese Gene deletiert, das Verpackungssignal ist aber vorhanden. Nach der Transfektion des Vektors in die Zelle kann eine infektiöses Virus gebildet werden, das replikationsdefekt ist, dadurch dass die Gene gag, pol und env nicht mitverpackt werden. Theoretisch besteht die Möglichkeit der homologen Rekombination zwischen den getrennt lokalisierten Genabschnitten gag, env und pol mit dem retroviralen Plasmid und damit die Möglichkeit der Generierung neuer replikationsfähiger Viren. Durch Analysen des Zellkulturüberstandes der transduzierten Zellen auf das Vorhandensein teilungsfähiger Viren kann das Risiko der Übertragung replikationskompetenter Viren minimiert werden. Ein weiterer Punkt der Biosicherheit betrifft die Aktivierung eventuell vorhandener endogener Viren durch den retroviralen Vektor. Molekulare und zelluläre Mechanismen sind jedoch noch wenig bekannt, so dass dieser Aspekt meiner Meinung nach den sensibelsten Punkt bei der Verwendung von viralen Expressionssystemen in der Gentherapie beinhaltet. Eine in vivo Applikation im Menschen ist deshalb sehr gründlich und gewissenhaft zu diskutieren. An dieser Stelle ist ausdrücklich darauf hinzuweisen, dass bei dem verwendeten Modell nicht der virale Transduktionsweg im Vordergrund steht, sondern die Ausnutzung der alloantigen-spezifischen Migrations- und Aktivierungsmechanismen der genmodifizierten Zellen. Die Entwicklung neuer nicht-viraler Methoden, bzw. der Einsatz von weiterentwickelten sehr sicheren viralen Systemen zur Generierung transgener Lymphozyten, wird die Biosicherheit erheblich erhöhen.


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24.10.2003