Retroviral modifizierte, alloantigen-spezifische und vIL-10 transgene T-Lymphozyten als therapeutischer Ansatz im akuten Abstoßungsmodell

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
doctorum rerum naturalium(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Christine Brandt

geboren am 28.03.1969 in Einbeck

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. H.-D. Volk
2. Prof. Dr. R. Lucius
3. Prof. Dr. W. Uckert

Tag der mündlichen Prüfung: 11. Juli 2003

Inhaltsverzeichnis

• 1  Zusammenfassung
• 2  Einleitung
  • 2.1 Transplantation und Rejektion
  • 2.2 Immunsuppressiva
  • 2.3 Die spezifische Immunantwort in der Transplantation
    • 2.3.1 T-Zell Aktivierung und Kostimulatorische Moleküle
    • 2.3.2 Effektormechanismen der T-Lymphozyten
    • 2.3.3 Th1 versus Th2
    • 2.3.4 Direkte und indirekte Antigenerkennung
    • 2.3.5 Migration von T-Lymphozyten
  • 2.4 Toleranz
  • 2.5 Gentherapeutische Ansätze in der Transplantation
    • 2.5.1 Virale Expressionssysteme in der Gentherapie
    • 2.5.2 Verpackungszelllinien für Retroviren
    • 2.5.3 T-Zellen als Vektoren in der Gentherapie
  • 2.6  Virales Interleukin-10 als immunmodulatorisches Molekül
• 3  Aufgaben- und Zielstellung
• 4  Material und Methoden
  • 4.1 Material
    • 4.1.1 Allgemeine technische Geräte
    • 4.1.2 Geräte und Material für die Zellkultur
    • 4.1.3 Geräte und Material für die Molekularbiologie und Biochemie
    • 4.1.4 Chemikalien
    • 4.1.5  Versuchssysteme (Kits)
    • 4.1.6 Enzyme
    • 4.1.7 Antikörper und Membranfarbstoffe
    • 4.1.8 Anästhetika
    • 4.1.9 Zelllinien
    • 4.1.10 Rattenstämme
    • 4.1.11 Bakterienstämme
    • 4.1.12  Expressionsvektoren
    • 4.1.13 Puffer und Medien
  • 4.2  Methoden
    • 4.2.1 Klonierung von vIL-10 in den retroviralen Expressionsvektor pLXSN
      • .1 Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Agarosegelelekrophorese
      • .2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen mit Glasmilch
      • .3 Ligation von vIL-10 in den retroviralen pLXSN-Vektor
      • .4 Kulturmedien und Agarplatten für Bakterien
      • .5 Transformation von E. coli
      • .6 Konservieren von Bakterienkolonien
      • .7  DNA-Präparation
    • 4.2.2 Herstellung der virusproduzierende Verpackungszelllinie GP+E vIL-10
      • .1 Kalzium-Phosphat Transfektion
      • .2 Tunikamycinbehandlung und Infektion
      • .3 Limited Dilution und Titerbestimmung
    • 4.2.3  Generierung der vIL-10 transgenen, allospezifischen T-Zelllinie (TvIL-10-Lymphozyten)
      • .1 Präparation des lymphatischen Gewebes
      • .2 Gewinnung des autologen Serums
      • .3 Aufarbeitung der lymphatischen Gewebe
      • .4  Retrovirale Transduktion der Lymphozyten in der gemischten Lymphozytenkultur (MLC, mixed lymphocyte reaction)
      • .5 Restimulationen der TvIL-10 -Lymphozyten
      • .6 Aufreinigung der TvIL-10-Lymphozyten
      • .7 Herstellung allospezifischer TEGFP-Lymphozyten und TMOCK-Lymphozyten
      • .8 Biologischer Aktivitätstest für vIL-10
    • 4.2.4  Zytokinexpressionsuntersuchungen auf mRNA- und Protein-Ebene in der MLC
      • .1 Zellkulturansatz
      • .2 Proteinbestimmung
      • .3 mRNA-Analytik mittels Real-Time TaqMan PCR
        • RNA-Isolation
        • cDNA-Synthese
        • TaqManTM PCR
        • Relative Quantifizierung
    • 4.2.5  Proliferations-Test in der MLC
    • 4.2.6  Intrazelluläre IFN-g Färbung in der MLC
    • 4.2.7  Durchflußzytometrische Analysen der TvIL-10-Lymphozyten
    • 4.2.8 Einfluß von Cyclosporin A auf die Zytokinproduktion
    • 4.2.9 Heterotrope Herztransplantation und adoptiver T-Zelltransfer
    • 4.2.10  PKH 26 Markierung der TvIL-10-Lymphozyten
    • 4.2.11 Histologische Auswertung der PKH 26 markierten TvIL-10-Lymphozyten
    • 4.2.12 Cyclosporin A Behandlung im Transplantationsmodell
• 5  Ergebnisse
  • 5.1 Generierung des retroviralen pLXSN vIL-10 Vektors
  • 5.2 Generierung der retroviralen Verpackungszelllinie GP+E vIL-10
  • 5.3  Bioaktivitätstest für vIL-10
  • 5.4  Generierung der retroviral modifizierten, alloantigen spezifischen T-Zelllinie (TvIL-10-Lymphozyten)
  • 5.5 Charakterisierung der TvIL-10-Lymphozyten
  • 5.6 Funktionstests der TvIL-10-Lymphozyten in vitro
    • 5.6.1 Einfluss der TvIL-10-Lymphozyten auf die Proliferation naiver T-Zellen
    • 5.6.2  Einfluss der TvIL-10-Lymphozyten auf die IFN-g Produktion naiver T-Zellen
  • 5.7  Migrations- und Funktionsanalysen der TvIL-10-Lymphozyten nach adoptivem Transfer im allogenen Herz-Transplantationsmodell
    • 5.7.1 Untersuchung zur Gewebeverteilung der ex vivo generierten T-Lymphozyten in den Organen
    • 5.7.2 Transplantatüberlebenszeiten nach adoptivem T-Zell Transfer
    • 5.7.3 Auswirkung von Cyclosporin A auf die vIL-10 und IFN-g Expression der transgenen Zellen in vitro.
    • 5.7.4  Kombinationstherapie von Cyclosporin A und adoptivem Transfer von TvIL-10-Lymphozyten in vivo.
• 6  Diskussion
  • 6.1 T-Lymphozyten als Zielzellen für die Genexpression in das Transplantat
  • 6.2 Generierung vIL-10 produzierender T-Zellen
  • 6.3 Einfluss von vIL-10 auf die transduzierte Zelllinie
  • 6.4 Wirkung und Wirkungsmechanismen der TvIL-10-Lymphozyten in vitro
  • 6.5  Wirkung der TvIL-10-Lymphozyten in vivo
    • 6.5.1 Adoptiver Transfer im Herztransplantationsmodell
    • 6.5.2 Kombinationstherapie: Cy A und TvIL-10-Lymphozyten
    • 6.5.3 Problematik von Dosis und Wirkung von vIL-10.
    • 6.5.4 Zeitliche Applikation und Wirkungsmechanismus von vIL-10.
    • 6.5.5 Th1 Phänotyp der TvIL-10-Lymphozyten.
    • 6.5.6 Alloreaktivität und Zytotoxizität der TvIL-10-Lymphozyten.
  • 6.6 Gentherapie und Biosicherheit
• 7  Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Publikationen und Kongressteilnahmen
• Lebenslauf
• Danksagung
• Selbstständigkeitserklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Virale Expressionssysteme
• Tabelle 2: Proliferations-Test, Versuchsaufbau.
• Tabelle 3: Intrazelluläre IFN-g Färbung, Versuchsaufbau.
• Tabelle 4: Virale Titer der Verpackungszelllinien. 5 x 105 Zellen/5ml wurden für 48 h kultiviert. Der viraler Titer des Zellkulturüberstandes der GP+E Verpackungszelllinien mit vIL-10 oder EGFP als Transgen ist dargestellt (n = 5).
• Tabelle 5: Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse auf mRNA- und Protein-Ebene (+ = sehr geringe Expression; + + = geringe Expression, + + + = hohe Expression, + + + + = sehr hohe Expression; = nicht vorhanden; n.g. = nicht gemessen).
• Tabelle 6: Oberflächenmarker und Zytokinprofil der T vIL-10 -Lymphozyten. 1x106 TvIL-10-Lymphozyten wurden mit direkt markierten monoklonalen Ak gegen TCR, CD4, CD8, CD25, L-Selektin und IFN-g angefärbt und mittels FACS analysiert. Zellkulturüberstände der Zellen wurden im ELISA auf IFN-g und IL-4 untersucht (n = 3).
• Tabelle 7: Transplantatüberlebenszeiten nach adoptivem Transfer von T MOCK -Lymphozyten und T vIL-10 -Lymphozyten. Heterotope Herztransplantation mit sofortiger Applikation von 15x 106 TMOCK-Lymphozyten oder TvIL-10-Lymphozyten in 500µl PBS in die Penisvene der Ratten. Die Kontrolle des Herzschlages erfolgte zwei Mal am Tag. Das Transplantat wurde bei Ausbleiben des Herzschlages als abgestoßen gewertet.
• Tabelle 8: Transplantatüberlebenszeiten bei der Kombinationstherapie von Cy A mit TvIL-10-Lymphozyten. Beginnend am Tag –1 wurden die Empfänger Tiere mit 0,5mg/kg/Tag Cyclosporin A behandelt. Am Tag 0 wurde die heterotope Herztransplantation mit anschließendem adoptivem Transfer von 3x106 bzw. 15x106 TvIL-10-Lymphozyten in die Penisvene durchgeführt. Die Kontrolle des Herzschlages erfolgte zwei Mal am Tag. Das Transplantat wurde bei Ausbleiben des Herzschlages als abgestoßen gewertet.

Bilder

• Abbildung 1: Th1 und Th2 Immunantwort verändert nach Liew, Nature Rev Immunol. 2002 (THP = Vorläufer T-Helferzelle, TH0 = aktivierte, nicht polarisierte T-Helferzelle).
• Abbildung 2: Herstellung rekombinanter replikationsdefekter Retroviren. Transfektion des retroviralen Vektors (LTR: „long terminal repeat“, Integrationsstelle des retroviralen Plasmides in die DNA der Zielzelle mit intrinsischer Promoteraktivität; MCS: „multiple- cloning-site“; SV40: Polyadenylierungssignal; Amp, Neo: Resistenzgen) mit dem zu übertragenden Gen in die Verpackungszelllinie. Diese exprimiert die retroviralen Strukturgene konstitutiv, so dass von dem retroviralen Vektor Transkripte hergestellt werden, die sowohl translatiert als auch als genomische RNA mit Hilfe der viralen Strukturproteine zu neuen Virionen verpackt werden (gag, env, pol: retrovirale Proteine zur Bildung der Hülle, Strukturmatrix und Enzyme des Retrovirus).
• Abbildung 3: Migration EGFP transgener und alloantigen-spezifischer T-Zellen nach adoptiven Transfer im Nierentransplantationsmodell (Hammer et al, 2002, J. Am. Soc. Nephrol.).
• Abbildung 4: pLXSN vIL-10 Vektor
• Abbildung 5: DNA-Sequenz vIL-10 (kodierender Bereich)
• Abbildung 6: Generierung des Vektors pLXSN vIL-10. Restriktionsverdau des retroviralen Vektors pLXSN-vIL-10 mit EcoR I und BamH I und anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente im 1,5%igen Agarosegel (M = 1kb Marker, V = pLXSN-vIL-10 nach Restriktionsverdau).
• Abbildung 7: vIL-10 Expression der Verpackungszelllinien-Klone. 3 x 106 Zellen/T75 Kulturflasche wurden für 48 h inkubiert. Die vIL-10 Expression von drei ausgewählten Klonen ist dargestellt. Zum Nachweis dafür, dass die Verpackungszelllinie nicht nur das Transgen vIL-10 im hohen Ausmaß exprimiert, sondern auch ein infektiöses Virus bildet, wurde im Anschluss an den vIL-10 ELISA eine Titerbestimmung durchgeführt. Die Expressionshöhe des Transgens im Zellkulturüberstand korreliert mit der Höhe des Virus-Titers (pers. Mitteilung A. Flügel, MPI für Neurobiologie, Abt. Neuroimmunologie, München), d.h. eine hohe vIL-10 Expression bedeutet auch einen hohen Titer. Der virale Titer (cfu/ml) des Verpackungszelllinien-Klons 8 betrug 3-5x106 cfu/ml (Tab.4). Mit diesem Klon wurden alle weiteren Experimente durchgeführt.
• Abbildung 8: Inhibierung der LPS induzierten TNF- Produktion durch vIL-10. PBMCs wurden 4h mit LPS (500pg/ml) und verschiedenen Konzentrationen von vIL-10, rek. hu IL-10 und einem neutralisierenden anti vIL-10 Antikörper (Ak) inkubiert. Dargestellt ist ein repräsentativer Versuch (n=3).
• Abbildung 9: vIL-10 Produktion der T vIL-10 -Lymphozyten. 5x105 TvIL-10-Lymphozyten bzw. TMOCK-Lymphozyten wurden in 200µl TCM-Medium für 24h inkubiert. Die Zellkulturüberstände wurden mittels ELISA analysiert (n=5).
• Abbildung 10: Zytokinexpressionsmuster auf mRNA-Ebene von T vIL-10 -Lymphozyten, T EGFP -Lymphozyten und T MOCK-Lymphozyten. 3-4fach restimulierte TvIL-10-Lymphozyten, TEGFP-Lymphozyten und TMOCK-Lymphozyten wurden in einer Konzentration von 1 x105 Zellen mit je 3 x105 bestrahlten LE und DA Thymozyten im 96-well Flachboden restimuliert. Am Tag 1-5 wurden die Zellen geerntet. Nach der RNA-Isolation und cDNA-Synthese wurden die Proben mittels TaqMan PCR analysiert. A) rat IFN-g; B) rat CD25; C) rat IL-2; D) rat IL-10; E) rat Bag-1; F) rat bcl-2, G) rat FasL, H) rat INOS, I) vIL-10. Als „house-keeping“ Gen wurde CD3 verwendet. Dargestellt ist die relative Expressionshöhe der Moleküle als dimensionsloses Ergebnis bezogen auf CD3.
• Abbildung 11: Proteinexpressionsmuster von T vIL-10 -Lymphozyten, T EGFP -Lymphozyten und T MOCK -Lymphozyten. 3-4fach restimulierte TvIL-10-Lymphozyten, TEGFP-Lymphozyten und TMOCK-Lymphozyten wurden in einer Konzentration von 1 x105 Zellen mit je 3 x105 bestrahlten LE und DA Thymozyten im 96-well Flachboden restimuliert. Am Tag 1-5 wurden die Zellenkulturüberstände abgenommen und im ELISA gemessen. A) rat IFN-g; B) rat IL-10; C) rat IL-2, D) vIL-10. Ein repräsentatives Ergebnis ist dargestellt (n = 3).
• Abbildung 12: Inhibierung der Proliferation von naiven T-Lymphozyten durch TvIL-10-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Stimulation. Die naiven LE-Lymphozyten wurden vor dem Versuch mit dem Membranfarbstoff SNARF markiert. 3,5x105 LE-Lymphozyten wurden durch bestrahlte DA-Lymphozyten (3,5x105) allogen stimuliert, bei gleichzeitiger Inkubation mit 5% TvIL-10-Lymphozyten oder TEGFP-Lymphozyten. Nach 3 (A) bzw. 4 Tagen (B) erfolgte die Auswertung am FACS-Gerät an Hand der Fluoreszenzstärke der mit SNARF markierten Lymphozyten. Die Daten sind als Verhältnis der mittleren SNARF Fluoreszenz-Intensität bezogen auf die allogene Kontrolle dargestellt. Syn = syngene Stimulation mit bestrahlten LE-Lymphozyten; allo = allogene Stimulation mit bestrahlten DA-Lymphozyten. Die Standardabweichung zeigen die Variationen innerhalb von 5 Experimenten (n =5). Signifikanz: allo/vIL-10 p<0,05 Mann-Whitney-Test; allo/EGFP p<0,01 T-Test; vIL-10/EGFP p<0,01 T-Test.
• Abbildung 13: Intrazelluläre IFN-g Expression naiver T-Lymphozyten nach Kokultur mit TvIL-10-Lymphozyten oder TEGFP-Lymphozyten bei gleichzeitiger allogener Stimulation. Die naiven LE T-Lymphozyten wurden vor der Kokultur mit CFDA-SE markiert, außer für den Ansatz mit TEGFP-Lymphozyten (EGFP strahlt selbst im Kanal 1). Kokulturansatz: A) syn: 3,5x105 LE, 3,5x105 LE (irr); B) allo: 3,5x105 LE, 3,5x105 DA (irr); C) vIL-10: allo, 5% TvIL-10-Lymphozyten; D) EGFP: allo, 5% TEGFP-Lymphozyten. Nach 4 Tagen Inkubation erfolgte die intrazelluläre IFN-g Färbung nach vorheriger Stimulation mit PMA/Ionomyzin in Gegenwart des Sekretionsblockers BrefeldinA. Die Daten sind im Dot-Blot CFDA-SE gegen IFN-g PE dargestellt. Ein repräsentatives Experiment ist dargestellt (n=5).
• Abbildung 14: Intrazelluläre IFN- Expression naiver T-Lymphozyten nach Kokultur mit T vIL-10 -Lymphozyten. Die Daten sind als Verhältnis der mittleren IFN-g Fluoreszenz-Intensität zwischen allogener Kontrolle und Versuchsansatz dargestellt. A) Anzahl der IFN-g positiven Zellen; B) Mittlere Fluoreszenz Intensität (MFI) der IFN-g positiven Zellen. Syn = Stimulation mit bestrahlten LE-Lymphozyten; allo = Stimulation mit bestrahlten DA-Lymphozyten; vIL-10 = allo + 5%TvIL-10-Lymphozyten. Die Standardabweichung zeigen die Variationen innerhalb 5 Wiederholungen (n =5). Signifikanz: A) allo/vIL-10 p<0,05 Mann-Whitney-Test; B) allo/vIL-10 p<0,05 Mann-Whitney-Test.
• Abbildung 15: Verteilung der PKH 26 markierten alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten nach adoptivem Transfer in den Organen. 15 x 106 PKH 26 markierte Zellen wurden am Tag 1 nach der Transplantation i. v. appliziert. Tag 4 nach der Tx wurden die Organe entnommen und 5µm Kryostatschnitte angefertigt. Am Lasermikroskop wurden 5 Schnitte mit 250 Gesichtsfeldern ausgezählt (Gesichtsfeld: 0,159mm2). Die Anzahl der PKH 26 markierten Zellen wurde in Zellen/mm2 berechnet. A) syngene und allogene Transplantationen mit adoptivem Transfer von TMOCK-Lymphozyten; B) syngene und allogene Transplantationen mit adoptivem Transfer von TvIL-10-Lymphozyten. (n =3).
• Abbildung 16: Verteilung der PKH 26 markierten alloantigen-spezifischen T MOCK -Lymphozyten mit T vIL-10 -Lymphozyten. 15 x 106 PKH 26 markierte Zellen wurden am Tag 1 nach der Transplantation i. v. appliziert. Tag 4 nach der Tx wurden die Organe entnommen und 5µm Kryostatschnitte angefertigt. Am Lasermikroskop wurden 5 Sektionen mit 250 Gesichtsfeldern ausgezählt (Gesichtsfeld: 0,159mm2). Die Anzahl der PKH 26 markierter Zellen wurde in Zellen/mm2 berechnet (n = 3).
• Abbildung 17: Detektion der PKH 26 markierten alloantigen-spezifischen T-Lymphozyten nach adoptivem Transfer im Ratten-Herz-Transplantationsmodell. 15 x 106 PKH 26 markierte Zellen wurden am Tag 1 nach der Transplantation i. v. appliziert. Tag 4 nach der Tx wurden die Organe entnommen, 5µm Kryostatschnitte angefertigt und mikroskopisch ausgewertet. In den Abbildungen A-D sind repräsentative Gewebe-Schnitte der transplantierten Organe dargestellt. A) syngene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TMOCK-Lymphozyten; B) allogene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TMOCK-Lymphozyten; C) syngene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TvIL-10-Lymphozyten; D) allogene Transplantation und adoptiver Transfer von 15 x 106 TvIL-10-Lymphozyten.
• Abbildung 18: Dosis-Wirkungskurve von Cyclosporin A auf die vIL-10 und IFN- Expression von T vIL-10 -Lymphozyten in vitro. 1x105 TvIL-10-Lymphozyten wurden mit je 3x105 bestrahlten LE und DA Thymozyten unter Anwesenheit von 500ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml, 10ng/ml und 0ng/ml Cyclosporin A restimuliert. Tag 1-5 wurden die Zellkulturüberstände auf die vIL-10 (A) und IFN-g Expression (B) analysiert. Die Expressionshöhe der Zytokine ist als Ratio versus allogener, nicht mit Cy A behandelter Kontrolle, dargestellt (n = 5).