Braumann, Chris : Der Einfluss der intraperitonealen und intravenösen Applikation von Taurolidin und der Kombination von Taurolidin/Heparin in der laparoskopischen und konventionellen Chirurgie auf das intra- und extraperitoneale Tumorwachstum bei Ratten.

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Kapitel 3. Methodik

3.1 Die Tierhaltung und die Tierpflege

Alle Tiere (210 BD IX-Ratten, Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden 14 Tage vor dem geplanten Eingriff in einem eigens für Kleintiere vorgesehenen und klimatisiertem Raum (Temperatur 22-24 ºC, Luftfeuchtigkeit 50-60%) untergebracht. Damit wurde eine Gewöhnung der Tiere untereinander sowie an ihre neue Umgebung gewährleistet. Am Operationstag wurden nur die Tiere nüchtern belassen, welche unmittelbar operiert wurden. Postoperativ wurden die Tiere für drei Stunden engmaschig überwacht. Die Tiere konnten Wasser und Futterpellett (Standardfutter) nach belieben zu sich nehmen. Bei den Blutabnahmen erfolgten Gewichtsbestimmungen, die das regelrechte Wachstum der Tiere ermittelten. Nach 28 Tagen wurden die Tiere durch Pentobarbital getötet und durch einen Untersucher obduziert. Die Lagerung der Kadaver erfolgte bis zur sachgerechten Abholung der Tierkörperverwertung bei -21°C.

3.2 Die Zelllinie

Die verwendeten syngenetischen Zellen (DHD/K12/TRb) (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, United Kingdom) wurden in Dulbeccos MEM (Biochrom, Deutschland) und HAMs F10-Medium (Biochrom, Deutschland) 1:1 mit 10%igem fetalem Rinderserum (Dibco BRL, Deutschland), 2 mmol/l Glutamin (Biochrom, Deutschland) und Penicillin-Streptomycin 1000 IU/ml (Gibco, Deutschland) kultiviert. Zur Herstellung der gewünschten Tumorzellkonzentration erfolgte eine fünfminütige Passagierung (Trypsinierung) bei 37°C. Nach der anschließenden Neutralisation des Trypsins durch Zugabe von 5 ml Vollmedium wurde die Zellsuspension für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert und die Zellpellets in 10 ml Vollmedium resuspendiert. Die Zellzählung wurde in der Neubauer-Zählkammer (0.1 µl) nach der Trypan-Blau-Methode durchgeführt. Dabei wurde die Zellsuspension sowie das Trypan-Blau in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, und unter dem Mikroskop ausgezählt. Gleichzeitig waren Einschätzungen der Rate an avitalen Zellen möglich. Entsprechend der Zellzahl erfolgte die Verdünnung der Suspension mit Fertigmedium ohne fetalem Rinderserum und die Abfüllung von jeweils 1 ml in Eppendorfgefäße. Die Gefäße verblieben im Inkubator und wurden vor der Applikation geschwenkt, um abgesunkene Tumorzellen erneut in Suspension zu bringen.


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3.3 Das Studiendesign

14 Tage

0 Min.

30 Min.

 

28 Tage

Nach Narkoseeintritt wurden die Tiere am Bauch und am Rücken rasiert und steril abgewaschen. In Bauchlage erfolgte standardisiert die subkutane Injektion der Tumorzellsuspension (104, DHD/K12/TRb Zellen) am Rücken der Tiere. Dann wurden die Tiere auf den Rücken gelagert und nach erneuter Desinfektion die Bauchdecke entsprechend der Randomisierung eröffnet. Zunächst erfolgte die intraperitoneale Applikation der Tumorzellsuspension (104, DHD/K12/TRb Zellen). Am offenen Abdomen wurden die Tumorzellen über das Peritoneum verteilt, wohingegen bei der Laparoskopie die Tumorzellen mit einer Injektionsnadel durch die Bauchdecke appliziert und im Abdomen verteilt wurden.

Am Ende der Operation wurde 1 ml Ringerlösung in das Abdomen der Kontrolltiere instilliert. Bei den Therapiegruppen erfolgte die Behandlung des Abdomens mit Taurolidin oder der Kombination aus Taurolidin und Heparin durch die intraperitoneale Instillation. Die intravenöse Injektion der Substanzen erfolgte über die linke Vena femoralis nach deren Präparation. Zusätzlich wurden die intraperitoneale und die intravenöse Applikation kombiniert.

Die Operationszeiten begannen mit dem Hautschnitt, beziehungsweise der ersten Inzision für die Trokare und betrugen in allen Gruppen 30 Minuten bis zum Beginn der Hautnaht.

3.4 Taurolidin und Heparin zur Verhinderung von Tumormetastasen in der Laparoskopie mit Kohlendioxid

Die Insufflation von Kohlendioxid erfolgte über 30 Minuten mit einem Druck von 8 mmHg. Am Ende der Operation wurden in die Bauchöhle, entsprechend der Randomisierung, Ringerlösung, Taurolidin oder Heparin instilliert. Die intravenösen Applikationen wurden mit einer Injektionsnadel durchgeführt (n=15):

Gruppe 1:

intraperitoneale Applikation von 1 ml isotoner Ringerlösung

Gruppe 2:

1 ml 0,5% Taurolidin intraperitoneal (ip)


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Gruppe 3:

1 ml 0,5% Taurolidin intravenös (iv)

Gruppe 4:

1 ml 0,5% Taurolidin simultan intraperitoneal und intravenös (ipiv)

Gruppe 5:

1 ml 0,5% Taurolidin/10 IE Heparin ip

Gruppe 6:

1 ml 0,5% Taurolidin/10 IE Heparin iv

Gruppe 7:

1 ml 0,5% Taurolidin/10 IE Heparin simultan ipiv

In den Gruppen 1-7 wurden neben der Inzision für die Insufflationskanüle im Mittelbauch (Ø 3 mm) zwei weitere Trokare (Ø 3 mm) in den rechten und linken Unterbauch platziert. Am Operationsende erfolgten die Verschlüsse der Inzisionen zweischichtig: Einzelknopfnaht der Bauchwandmuskulatur mit Vicryl 4/0 sowie Einzelknopfnaht der Haut mit Prolene 4/0.

3.5 Taurolidin und Heparin zur Verhinderung von Tumormetastasen in der offenen Chirurgie

Die Länge der medianen Laparotomie betrug bei allen konventionell operierten Tieren 4 cm. Um realitätsnahe Bedingungen zu schaffen, erfolgte in der Hälfte der Operationszeit (15 Minuten) eine Eventeration des Darmes für 5 Minuten. Am Ende der Operation erfolgten die intraperitonealen oder intravenösen Applikationen der Substanzen entsprechend der randomisierten Gruppen:

Gruppe 8:

intraperitoneale Injektion von 1 ml isotoner Ringerlösung

Gruppe 9:

1 ml 0,5% Taurolidin intraperitoneal (ip)

Gruppe 10:

1 ml 0,5% Taurolidin intravenös (iv)

Gruppe 11:

1 ml 0,5% Taurolidin simultan intraperitoneal und intravenös (ipiv)

Gruppe 12:

1 ml 0,5% Taurolidin/10 IE Heparin ip

Gruppe 13:

1 ml 0,5% Taurolidin/10 IE Heparin iv

Gruppe 14:

1 ml 0,5% Taurolidin/10 IE Heparin simultan ipiv

Der Wundverschluß der medianen Laparotomie erfolgte zweischichtig: Einzelknopfnaht der Bauchwandmuskulatur mit Vicryl 4/0 sowie Einzelknopfnaht der Haut mit Prolene 4/0.

3.6 Das Differentialblutbild unter der Therapie

Um einen Einfluß von Taurolidin und der Kombination von Taurolidin und Heparin nach intraperitonealer Resorption oder nach intravenöser Injektion auf die Leukozyten zu


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analysieren, erfolgten 5 peripher-venöse Blutentnahmen: 7 Tage präoperativ, 2 Stunden, 2 Tage, 7 Tage sowie 28 Tage postoperativ. Vor der Blutentnahme wurden die Tiere durch inhaliertes Äther narkotisiert. Das Blut wurde mittels einer Glaskapillare aus dem retrobulbären Plexus entnommen und in Eppendorfgefäßen gesammelt. Zur Bestimmung des Differentialblutbildes wurde für jedes Tier bei allen Blutentnahmen Ausstriche angefertigt und ausgezählt. Der Blutaustrich erfolgte auf einem fettfreien Objektträger. Dann wurden die Präparate nach „Pappenheim“ gefärbt: 2 Minuten Färbebad in konzentrierter May-Grünwald-Lösung, 2 Minuten in verdünnter, gepufferter May-Grünwald-Färbung (1:2) und abschließend 10 Minuten in Giemsa-Lösung. Im Differentialblut wurden Lymphozyten, Monozyten, Eosinophyle und Erythroblasten (je/100 Zellen) bestimmt.

Die Bestimmung der peripheren Leukozytenzahlen erfolgte nach erythrozytärer Lyse mit dreiprozentiger Essigsäure aus dem vorher gemischten Vollblut in der Neubauer Zählkammer. Die Errechnung der Zellzahlen/µl erfolgte bei bekannten Volumen der Zählkammer (0.1 µl). Danach wurde das Vollblut 10 Minuten bei 4 ºC zentrifugiert (10.000 rpm) und der Überstand (ca. 270 µl) in drei Eppendorfgefäße aliquotiert. Die Aliquots wurden bei -80ºC gelagert.

3.7 Die Bestimmung des intraperitonealen und subkutanen Tumorgewichtes

Die Obduktion der Tiere erfolgte 28 Tage nach operativer Intervention. Die Tiere wurden unter einer Äthernarkose mit einer Überdosis Pentobarbital getötet. Für die Inspektion des gesamten Bauchraumes wurde ein Kreuzschnitt (paramediane und quere Laparotomie) angelegt. Durch die Schnittführung konnte eine Inspektion der ehemaligen Inzisionen gewährleistet werden und eine genaue Ermittlung der Inzidenzen von Inzisionsmetastasen erfolgen. Die Lokalisation sowie der Anzahl aller Tumorknötchen wurde bestimmt und auf standardisierten Bögen dokumentiert. Nach sorgfältiger Präparation wurden alle Tumorknötchen des Abdomens gesammelt und deren Gewicht bestimmt. Das Gewicht und die Inzidenz der Tumorknoten an den ehemaligen Inzisionen wurde parallel erfaßt. Bei der Auswertung der Metastasen an den Inzisionen wurde nur die Inzidenz und nicht das Tumorgewicht bewertet. Nachdem das Abdomen untersucht wurde, erfolgte am Rücken der Tiere das Aufsuchen der tastbaren, subkutanen Tumoren. Caudal erfolgte eine quere Inzision, so dass eine vollständige Präparation der Tumoren möglich war. Die Gewichtsbestimmung der Tumoren der einzelnen Kompartimente (abdominal, subkutan und an den Inzisionen) erfolgte mit einer Präzisionswaage (BP 610) der Firma Sartorius (Sartorius AG, Göttingen, Deutschland). Die intraperitonealen Tumoren sowie die


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Trokarmetastasen wurden in Formaldehyd eingebettet und histologisch gesichert. Die subkutanen Tumoren, wurden für die pathologische Aufarbeitung kryokonserviert (-80ºC).

3.8 Die Dokumentation der Daten und die statistische Auswertung

Jedes Tier wurde bei der ersten Untersuchung (präoperative Blutentnahme 7 Tage vor dem geplanten Eingriff) durch eine kleine Lochstanze am Ohr markiert und erhielt einen Dokumentationsbogen. In das Protokoll wurden der Code für das entsprechende Tier, das Aufnahmedatum, das perioperative Gewicht zu den Blutentnahmezeitpunkten, das OP-Datum, die Lokalisation der Tumoren sowie deren Gewicht detailliert erfaßt. Bei kontinuierlichen Daten erfolgte ein Normalitätstest nach Shapiro und Francia. Bei normalverteilten Parametern wurden die Mittelwertvergleiche zwischen den Versuchsgruppen als Einfaktorielle Multivarianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Beim Vorliegen von vergleichbaren Varianzen in den Versuchsgruppen erfolgte die Post-Hoc-Korrektur nach dem Bonferroni-Modell. Lagen hingegen zwischen den Gruppen ungleiche Varianzen vor, wurde als Post-Hoc-Korrektur das Dunnett´s T3-Modell gewählt. Bei nicht normalverteilten Parametern erfolgten die Mittelwertvergleiche zwischen den Gruppen mittels Kruskal-Wallis-Test. Die folgenden Einzelvergleiche wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test mit Bonferroni Korrektur zur Vermeidung der alpha-Fehlerkumulierung durchgeführt. Kategorielle Daten wurden mit dem Fisher´s exact Test verglichen. Das Signifikanzniveau wurde mit p#0.05 festgelegt. Die Berechnungen wurden mit dem Statistikprogramm SPSS 9.0 for Windows durchgeführt. Die Daten im Text wurden als Median und 95% Konfidenzintervall des Mittelwertes angegeben. Die Grafiken wurden mittels box-whisker-plots dargestellt. Er gibt neben dem Median, die untere und die obere Quartile (box) sowie 1.5 Quartildifferenzen (whisker) an. Ausreißer werden nicht dargestellt.


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Wed Oct 16 17:04:23 2002