Bridg, Hannia: Micropropagation and Determination of the in vitro Stability of Annona cherimola Mill. and Annona muricata L.
Micropropagation and Determination of the in vitro Stability of
Annona cherimola Mill. and Annona muricata L.
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum agriculturarum
(Dr. rer. agr.)

eingereicht an der
Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl. Biol. Hannia Bridg,
25.01.64 Santafe de Bogota, Kolumbien

Präsident der
Humboldt Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der
Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
Prof. Dr. Dr. h.c. E. Lindemann

Gutachter:
Dr. habil. G. Ebert
Prof. Dr. F. Lenz
Prof. Dr. F. Pohlheim

Tag der mündlichen Prüfung 24.03.2000

Zusammenfassung

A. cherimola und A. muricata sind als Halblaubbäume in den tropischen Hochländern Südamerikas und besonders auf den Karibischen Inseln endemisch. Beide besitzen ein großes Potential als Handelsfrüchte aufgrund ihrer wohlschmeckenden Früchte und ihrer Eigenschaften als Heilpflanzen.

Die Forschung über diese Obstarten wurde in Kolumbien, Peru, Ekuador, Venezuela und in der Dominikanischen Republik vernachlässigt. Deshalb sollte die wissenschaftliche Bearbeitung, das Sammeln, die Konservierung und eine neue Bewertung der natürlichen Genotypen von A. cherimola und A. muricata in jedem Land eine Vorrangstellung erhalten. Die Etablierung von Plantagen mit selektierten Genotypen und die Erzeugung hoher Qualität ist eines der fundamentalen weltweiten Ziele in der Züchtung dieser Arten.

Wenn ein selektierter Genotyp von A. cherimola und A. muricata über Samen vermehrt wird, entsteht eine hohe Variationsbreite von Pflanzen. Bei konventioneller Stecklingsvermehrung dagegen ist der gleiche Genotyp zu erwarten, aber die dichogame protogyne Blüte bringt eine Kreuzung hervor. Deshalb war es bisher unmöglich, einen selektierten Genotyp in den Regionen Spaniens, Australien, Asiens, Kaliforniens und Chiles, in denen er eingeführt wurde, durch die Anwendung konventioneller Vermehrungsmethoden auf natürliche Weise zu erhalten.

Die gegenwärtige Studie zielt darauf, die botanischen und Pflanzenkulturaspekte der A. cherimola und A. muricata zu untersuchen und ein in vitro Vermehrungsprotokoll zu entwickeln, um die Produktion klonierter Genotypen zu sichern.

Selektierte Bäume aus Kolumbien und Chile wurden in vitro durch direkte Sproßknospenentwicklung einer vier Jahre alten Pflanze vermehrt. Die chemischen, hormonellen und physikalischen Faktoren der Wachstumsvermehrung vor und während der in vitro Phasen wurden untersucht. Da A. cherimola und A. muricata in ihrem natürlichen Lebensraum mit Mikroorganismen kontaminiert sind, mußten Antibiotika und Fungizide zugesetzt werden. Um die Bildung von Phenolen zu verhindern, wurde mit mit Zusätzen von Zitronensäure, Ascorbinsäure und Polyvinypirrolydon im Medium gearbeitet. Mit dieser Behandlung entstanden in einer Nitsch und Nitsch-Kultur, die 8,87 µM Benzylaminopurin und 2,46 µM Indol-3-Butiricsäure enthielt, aus einem halbverholzten Explantat mit zwei Knospen innerhalb von zwanzig Tagen vier neue Triebe pro Knospe.

Die Auswirkungen der Hormone Benzylaminopurin, Kinetin, Zeatin und Thidiazuron auf die Vermehrung der Triebe wurden miteinander verglichen. Bei A. cherimola wurden durch eine Anreicherung der Nitsch und Nitsch-Kultur mit Zeatin und Kinetin die besten Ergebnisse erzielt. Das Explantat der A. muricata zeigte keine Triebe, verlängerte aber im durch Benzylaminopurin angereicherten Medium ihren Sproß.

Während der in vitro Vermehrung verloren beide Arten ihre Vitalität und zeigten Chlorose-Erscheinungen. Daraufhin wurden die Ionenkonzentrationen von Bor, Kalzium und Stickstoff in der Nitsch und Nitsch-Lösung untersucht, und es wurde festgestellt, daß nicht Bor und Kalzium, sondern der fehlende Stickstoff für die Chlorose verantwortlich war. Die Anreicherung der Lösung mit 20,6 mM NH4 und 39,4 mM NO3 behob dieses Problem und verbesserte die Qualität der Sprosse.

Indol-3-Butiricsäure bewirkte ein Wurzelwachstums unter in vitro- und ex vitro-Bedingungen. In beiden Fällen mußten die Sprosse vorher in ein Kulturmedium mit 20% Saccharose ohne Hormone gebracht werden. Die Wurzelausbildung unter in vitro Bedingungen gelang am besten in einer ¼ Nitsch und Nitsch-Lösung, wenn sie mit nur 1% Saccharose angereichert wurde. Unter ex vitro Bedingungen war das Wurzelwachstum in einem Quarzsandsubstrat bei 90% Feuchtigkeit optimal.

Durch Vergleich des DNS-Bandenmusters bei Verwendung von RAPD-Marker wurde die genetische Stabilität der in vitro vermehrten Triebe von A. cherimola und A. muricata von vier kolumbianischen und zwei chilenischen Klonen analysiert. 29 Primer wurden überprüft. Fünf von ihnen ergaben ein reproduzierbares linienspezifisches Bandenmuster. Für die A. cherimola wurden drei Primer identifiziert, die bei verschiedenen Klonen unterschiedliche Muster ergaben, während sich beim Vergleich von Mutterpflanze und Regenerat in allen Tests monomorphe Muster zeigten.

Diese Arbeit stellt zum erstenmal eine in vitro Vermehrung von Klonen von A. cherimola und A. muricata vor, die durch RAPD getestet wurde. Die genetische Stabilität in vitro vermehrter Arten wurde gezeigt, so daß die Ergebnisse dieser Arbeit die Züchtung dieser Pflanzen unter Erhaltung der natürlichen genetischen Charakteristik ermöglichen.

Schlagwörter:
Microvermehrung , RAPD, Annona spp., tropischer Obstbau

Abstract

A. cherimola and A. muricata are semideciduous native trees from the tropical highlands of South America and tropical areas of the Caribbean Islands. Both have developed a commercial promise in the fruit trade market, because of their edible fruits and phytochemical products.

The knowledge of these fruit trees has been scattered thus, exploration, collection, conservation and evaluation of A. cherimola and A. muricata natural genotypes is a priority in Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela and El Salvador, countries where they are believed to be part of the native Flora. Furthermore, the promotion of technical plantations with healthy and high quality trees are the principal worldwide aims for these species.

If a selected genotype of A. cherimola and A. muricata is propagated by seeds a high genotype variation is expected, when conventional vegetative propagation methods are applied, the dichogamous protogyneous flower behaviour promotes an intervarietal crossing. Therefore the conservation of selected ecotypes by the application of conventional propagation methods has been until now impossible, in those regions where they have been introduced because of their qualities such as Spain, Australia, Asia, California and Chile.

The aim of the present study was to review the botanical and cultural aspects of A. cherimola and A. muricata and develop a reproducible micropropagation protocol preserving the genetic stability of the selections or promote true-to-types genotypes in order to open an alternative for this plant species.

Preformed axillary bud sprouting excised from the side branches of four year old plants have been developed with a yield of 4 new shoots per bud in 20 days. The position of the buds on the branches had an effect on the bud break and establishment of cultures under in vitro conditions, therefore semiwoody cuttings with three buds were the most suitable explants for multiple shoot proliferation when cultured on a Nitsch and Nitsch (1969) medium containing 8.87 µM of benzylaminopurine and 2.46 µM of indole-butiric acid.

The effect of Benomyl, Rifampicin and some antioxidants like Polyvinylpirrolydone, ascorbic acid and citric acid are discussed. There were no significant differences during the establishment of A. cherimola and A. muricata in terms of in vitro requirements, time and yield of bud new shoots formation.

To improve shoot proliferation and multiplication the effect of benzylaminopurine, kinetin, zeatin and thidiazuron were compared. The NN-69 media supplemented with 2.32 µM kinetin and 1.36 µM zeatin was the proliferant for A. cherimola. A. muricata, it showed no shoot proliferantion but elongated well in 1.44 µM Gibberellic acid. Both species improved the formation of eight new shoots in 60 days of culture with one subculture after 30 days.

A. cherimola and A. muricata multiplied shoots lost their quality and started to be chlorotic in relation to the number of subcultures on the same multiplication media. The variation of ammonium nitrate, potassium nitrate and ammonium carbonate supplied as salts on the Nitsch and Nitsch (1969) media were evaluated as well as the supplementation of casein hydrolisate and coconut water. The supplementation of 20.6 mM NH4- and 39.4 mM NO3- improved the promotion of quality and green shoots available for rooting.

The indole-3-butiric acid 4.90 µM promotes rhizogenesis under in vitro and ex vitro conditions in both cases a previous precondition of the shoots was required. To improve in vitro rooting the concentration of Nitsch and Nitsch (1969) macro-salts should be reduced to ¼ with a supplementation of 1 % of sucrose and 3% gelrite. The ex vitro rooting is succesfully in quartz-sand substract without plant growth regulators and 90% of relative humidity.

Pattern band comparison by Random Amplified Polymorphic DNA markers was applied to determine the genetic stability of micropropagated shoots of A. cherimola and A. muricata 4 Colombian and 2 Chile selections. 29 primers were screened, of them 5 primes gave clear reproducible bands. No variation in RAPD banding patterns among the tested shoots. These results verify the genetic stability of the in vitro regenerants and tested the true-to-type propagation.

Keywords:
Micropropagation , RAPD, Annona spp., Tropical Fruits


Pages: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93 ] [94] [95] [96] [97] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [IX] [X] [XI] [XII] [XIII] [XIV] [XV] [XVI] [XVII] [XVIII] [XIX] [XX] [XXI] [XXII] [XXIII] [XXIV] [XXV] [XXVI] [XXVII] [XXVIII] [XXIX] [XXX] [XXXI] [XXXII]

Table of Contents

Front pageMicropropagation and Determination of the in vitro Stability of Annona cherimola Mill. and Annona muricata L.
1 Botanical and Cultural Aspects
Introduction
1.1Annona spp.
1.2Annona cherimola Mill., Gard. Dict. ed. 8 No. 5 (1768)
1.2.1Origin and Distribution
1.2.2Description
1.2.3Bloom, Harvest and Storage
1.2.4Cultivars
1.2.5Cultural Aspects
1.2.6Pests and Diseases
1.2.7Propagation
1.2.8Properties
1.2.9Nutritional Value
1.3Annona muricata L. Sp. Pl. 536, 1753
1.3.1Origin and Distribution
1.3.2Description
1.3.3Bloom, Harvest and Storage
1.3.4Cultivars
1.3.5Cultural Aspects
1.3.6Pest and Diseases
1.3.7Propagation
1.3.8Properties
1.3.9Nutritional Value
2 Aims in Annona spp.
2.1Aims
2.2Needs for in vitro Culture in Annona spp.
2.2.1Genetic Diversity
2.2.2Increment of Natural Types
2.2.3Long Juvenile Periods
2.2.4Tree Improvement
2.3Biotechnology Applications on Annona spp.
2.3.1Micropropagation
2.3.2Genetic Variation
2.3.3Chromosome Number
3 Micropropagation and Genetic Stability
3.1Micropropagation
3.1.1Application
3.1.2Limitation
3.2Somaclonal Variation
3.2.1Factors
3.2.2Phenotypic changes
3.2.3Genetic changes
3.2.4Screening
3.3Random Amplified Polymorphic DNA
4 Purpose of this Work
4.1Objectives
5 Materials and Methods
5.1Micropropagation
5.1.1Plant Material
5.1.2Explant Selection and Isolation
5.1.3Phenolics
5.1.4Disinfection
5.1.5Effect of Antibiotics
5.1.6Mineral Basal Composition
5.1.7Rooting
5.1.8Hardening
5.1.9Physical Factors
5.1.10Statistical Analysis
5.2Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
5.2.1Plant Material
5.2.2DNA Extraction
5.2.3DNA Amplification
5.2.4DNA Separation
5.2.5DNA Separation
5.2.6RAPD Analysis
5.3Karyotype Observations on Annona spp.
6 Results
Micropropagation
6.1Plant Material
6.2Initiation of Culture
6.2.1Explant
6.2.2Disinfection
6.2.3Disinfectant Solutions
6.2.4Antibiotics
6.2.5Hypersensitivity Reactions
6.2.6Darkness Precondition in the Greenhouse
6.2.7Antioxidant Substances
6.2.8Culture Media
6.2.9Plant Growth Regulators
6.2.10Shoot Induction
6.2.11Effect of Closures
6.3Multiplication
6.3.1Effect of Cytokinins
6.3.2Zeatin
6.3.3Kinetin
6.3.4Benzyl amino-purine
6.3.5Kinetin and Zeatin
6.3.6Thidiazuron
6.3.7Gibberellic acid
6.3.8Shoot Quality
6.3.9Chlorosis
6.3.10Subcultures
6.4Rooting
6.4.1 In vitro
6.4.2Ex vitro
6.5Hardening
7 Results
Random Amplified DNA Polymorphic (RAPD)
7.1DNA Amplification
7.2Pattern Band Comparison
8 Results
Karyotype observations
9 Discussion
10 Summary
11 Zusammenfassung
12 Resúmen
Bibliography References
Acknowledgements

Table of Tables

Table 1. List of the most well-known species of the Annona genus and their popular assigned names in several languages
Table 2. A. cherimola cultivar characterization by fruit appearance
Table 3. The most promising cultivars of A. cherimoya around the world in 1999
Table 4. Acceptable leaf mineral concentration in Custard apple
Table 5. Ecophysiological optimal requirements of A. cherimola
Table 6. Graft compatibilities between the Annona species
Table 7. Food components in 100g of A. cherimola edible portion
Table 8. Seasonal production of A. muricata in several countries
Table 9. Classification of soursop cultivars in Central America
Table 10. Ecophysiological requirements of A. muricata
Table 11. Reported A. muricata pathogens in Colombia plantations
Table 12. Food components in 100g of edible portion of A. muricata
Table 13. In vitro approaches on Annona spp.
Table 14. Reported chromosome number in A. cherimola and A. muricata
Table 15. Micropropagation steps
Table 16. Source of A. cherimola and A.muricata experimental material
Table 17. Mineral media basal formulation
Table 18. Polymerase chain reaction mix
Table 19. DNA amplification steps applied on Annona spp.
Table 20. Effect of gibberelic acid and cold temperature shock on seed germination of Annona cherimola cv. Felpa and cv. Bronceada
Table 21. Effect of Benomyl 0.03% on A. cherimola and A. muricata in the
greenhouse to control in vitro fungi contamination
Table 23. Effect of darkness precondition on A. cherimola and A. muricata
plants in the greenhouse
Table 24. Effect of some antioxidants on A. muricata explants
-after two weeks of culture-
Table 25. Effect of the culture medium and supplements on A. cherimola and A. muricata semiwoody cuttings -response after 4 weeks of culture-
Table 26. Effect of BAP and IBA on shoot bud organogenesis of A. cherimola and A. muricata semiwoody cuttings -response after four weeks of culture-
Table 27. Effect of some supplements on the phenolization and contamination of
Annona muricata (T1) semiwoody cuttings (5-9cm) with pre-formed buds to promote the in vitro establishment - after four weeks of culture-
Table 28. Effect of different nitrogen sources during the shoot multiplication
of A. cherimola on Nitsch and Nitsch (1969) basic medium *
Table 29. Evaluation of some auxins to improve the rhizogenesis on
A. cherimola and A. muricata
Table 30. Evaluation of in vitro rhizogenesis of A. cherimola and A. muricata selections - shoots conditioned one month in a hormone free media-
Table 31. Effect of Rhizopon on ex vitro root formation of
A. cherimola and A. muricata selections
Table 32. Comparison of the ex vitro and in vitro root organogenesis
Of A. cherimola and A. muricata
Table 33. Arbitrary Primers used to screen A. cherimola and A. muricata by RAPD
(0) : no pattern, no repetition (1) : pattern and successful repetition
Table 34. Primers used in RAPD analysis and number of scoreable bands in in vitro clonal regenerants and mother plant of A. cherimola and A. muricata

Table of Figures

Figure 1. World distribution of Annona cherimola
Figure 2. Aspect of Annona cherimola tree, flower, fruit and plantation
Figure 3. Dichogamous protogynous flowering behaviour on A. cherimola Mill.
Figure 4. Classification of some Cherimoya fruits by the surface appearance (Tijero,1992)
Figure 5. Some commercial products made with A. cherimola
Figure 6. World distribution of Annona muricata
Figure 7. Aspect of Annona muricata tree, flower and fruit and plantation
Figure 8. Some commercial products made with A. muricata
Figure 9. A. cherimola and A. muricata Colombian plants
adapted to greenhouse conditions in Berlin
Figure 10. First in vitro responses of various explants of A. cherimola and A. muricata
-after one week of culture-
Figure 11. In vitro response of A. cherimola and A. muricata semiwoody shoots (5-9 cm) to different disinfectant solutions
- after two weeks of culture-
Figure 12. Various stages during the in vitro establishment of A. cherimola
Figure 13. Various stages during the in vitro establishment of A. muricata
Figure 14. Effect of magenta caps and parafilm during the establishment of
A. cherimola and A. muricata in test-tubes
Figure 15. Season effect on bud sprouting of A. cherimola and A. muricata selections
Figure 16. Zeatin effect on A. cherimola and A.muricata shoot formation
Figure 17. Kinetin effect on A. cherimola and A.muricata shoot formation
Figure 18. Benzyl-amino-purine effect on A. cherimola and A.muricata shoot formation
Figure 19. Effect of Kinetin combined with Zeatin on A.cherimola shoot proliferation
Figure 20. Effect of thidiazuron on A. cherimola and A.muricata shoot formation
Figure 21. Effect of gibberellic acid on A. cherimola and A. muricata shoot elongation
Figure 22. Several in vitro responses of A. cherimola and A. muricata during the multiplication stage - after four weeks of culture-
Figure 23. Effect of nitrogen concentration in [µM] on in vitro chlorosis of A. cherimola and A. muricata
Figure 24. Effect of subculture number on the proliferation of
A. cherimola and A. muricata selections - after three four weeks of subculture
Figure 25. Morphogenic events related with the the root organogenesis of cherimola and A. muricata under in vitro and ex vitro conditions
Figure 26. DNA extracted from A. cherimola and A.muricata
Figure 27. Amplification of genomic DNA primers Q-12, C-11, C-5 primers from regenerants and mother plants of A. cherimola
Figure 28. Amplification of genomic DNA primers Q-12, C-11, C-5 primers from regenerants and mother plants of A. muricata
Figure 29. Amplification of genomic DNA primers Q-4, Opa-18, Opa-16 primers from regenerants and mother plants of A. cherimola
Figure 30. Amplification of genomic DNA primers Q-4, Opa-18, Opa-16 primers from regenerants and mother plants of A. muricata
Figure 31. Chromosomes of A. cherimola and A. muricata in vitro regenerants

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Thu May 3 19:54:52 2001