Bruhn, Claudia: Untersuchungen zum genetischen Polymorphismus der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase T1-1 und Arylamin-N-Acetyltransferase 1

47

Kapitel 3. Untersuchungen, Ergebnisse und Diskussion

3.1 Glutathion-S-Transferase Theta 1-1

3.1.1 Genotypisierung der Probanden

Allgemeines

Die Genotypisierung der Probanden erfolgte in Anlehnung an eine von Pemble
et. al. (1992) entwickelte Methode. Im folgenden soll ein Überblick über die Prinzipien der durchgeführten Arbeitsschritte zur DNA-Extraktion, zur Amplifizierung des DNA-Abschnittes mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und zu dessen Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese gegeben werden. Die genaue Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Reaktionsansätze ist in Kapitel 4.4.1 beschrieben.

DNA-Extraktion

Zunächst erfolgte eine Isolierung der Leukozyten aus den Blutproben der Probanden. Das Blut wurde dazu mit Erythrozyten-Lysis-Puffer versetzt, nach einer 30minütigen Inkubationszeit (auf Eis) zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Sediment erneut in Erythrozyten-Lysis-Puffer aufgenommen. Nach Wiederholung der Prozedur wurde das resuspendierte Sediment bis zur DNA-Extraktion bei -20°C eingefroren. Zur DNA-Extraktion wurde die aufgetaute Zellsuspension zunächst mit Proteinase K über Nacht verdaut. Dann folgten ein Extraktionsschritt mit Phenol zur Entfernung der Proteine sowie ein Extraktionsschritt mit Chloroform-Isoamylalkohol zur Entfernung von Lipiden und Phenolresten. Nach der Zentrifugation wurde die wässrige Phase mit Natriumacetat und dem dreifachen Volumen 96%igen Alkohols versetzt. Die DNA wurde durch Zentrifugation sedimentiert, gewaschen und in Puffer aufbewahrt. Die auf diese Weise gewonnene DNA der Probanden wurde für deren Genotypisierung hinsichtlich GSTT1 und/oder NAT1 verwendet.


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Polymerase-Kettenreaktion

Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion beruht auf der Synthese von DNA-Amplifikaten durch thermostabile DNA-Polymerasen an einer einsträngigen DNA-Matrize unter Verwendung von speziellen Oligonukleotid-Startmolekülen (Primern). Die Primer werden so ausgewählt, dass sie dem 5’- bzw. dem 3’-terminalen Ende des zu vermehrenden DNA-Abschnittes entsprechen. In einem geeigneten Reaktionspuffer wurde eine kleine Menge DNA-Matrize (10 - 1000 ng) mit DNA-Polymerase, Desoxyribonukleotid-5’-triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) sowie den Primern GT1 und GT2 (siehe 4.4.1 ) inkubiert. Es wurde ein spezifischer 459 bp-DNA-Abschnitt des Gens amplifiziert. Ein mit Hilfe der Primer BNF3 und BNF5 coamplifizierter Abschnitt des ß-Interferon-Gens diente als interner Standard zur Detektion falsch negativer Ergebnisse.

Die Reaktionszyklen der Polymerase-Kettenreaktion bestehen aus drei Teilschritten. Im Teilschritt Denaturierung werden die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix bei 92 - 95°C getrennt. Im Teilschritt Primeranlagerung (Annaeling) lagern sich die Primer nach Abkühlung auf die Anlagerungstemperatur (40 - 72°C) komplementär an die jeweiligen Zielsequenzen der Matrizen-DNA an. Im Teilschritt Kettenverlängerung (Elongation) wird mit Hilfe der Taq™-Polymerase, einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus, bei der optimalen Reaktionstemperatur von 72°C ein neuer DNA-Doppelstrang synthetisiert. Wegen der Hitzestabilität der DNA-Polymerase kann sich der nächste Reaktionszyklus ohne Zugabe von frischer DNA-Polymerase oder Zwischenreinigungsschritte anschließen. Dies ermöglicht die Automatisierung der PCR unter Verwendung eines programmierbaren Thermostaten (Thermocycler), so dass mehrere PCR-Zyklen (20 - 35) in ca. zwei bis vier Stunden durchgeführt werden können.

Bei der PCR mit den Primern GT1 und GT2 entstand ein Amplifikat mit einer Länge von 459 bp, wenn mindestens ein GSTT1*A-Allel vorlag. Demnach konnten der homozygote GSTT1*A/A-Genotyp sowie der heterozygote GSTT1*A/0-Genotyp durch den Nachweis des 459 bp-Amplifikats von dem homozygoten GSTT1*0/0-Genotyp durch dessen Fehlen differenziert werden.


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Agarose-Gelelektrophorese

Zur Auftrennung von PCR-Produkten werden häufig Agarosegele verwendet. Die Wanderung der DNA-Abschnitte im elektrischen Feld beruht auf den negativen Ladungen ihrer Phosphatgruppen im verwendeten Puffer (pH = 8). Agarose ist ein lineares Polymer aus alternierenden D-Galactose- und 3,6-Anhydro-L-galactoseresten. Durch Ausbildung einer Netzstruktur entsteht ein Molekularsieb, welches die Wanderung größerer DNA-Abschnitte stärker behindert als die kleinerer. Die zu verwendende Agarosekonzentration (1,5 - 4%) richtet sich nach der Größe der aufzutrennenden Amplifikate.

Das 459 bp- und das 170 bp-Amplifikat der GSTT1-PCR wurden in einem 3%igem NuSieve® 3:1-Gel 90 min bei 120 V aufgetrennt. Zur Längenbestimmung wurde eine kommerziell erhältliche 100 bp-DNA-Standard-Leiter mitgeführt. Der im Elektrophoresegel enthaltene Farbstoff Ethidiumbromid bindet an die doppelsträngige DNA durch Interkalation. Unter UV-Licht (310 nm) sind die Amplifikate als fluoreszierende Banden sichtbar. Die Ergebnisse der GSTT1-Gelelektrophorese wurden mit einer Polaroidkamera dokumentiert. Abb. 1 zeigt ein Elektrophoresegel, das nach Analyse der Blutproben von vier Probanden erhalten wurde.

Genotypisierung der Probanden: Ergebnisse und Diskussion

Wie in Tab. 13 dargestellt, konnten bei 243 der 300 genotypisierten Probanden nach PCR und Agarose-Gelelektrophorese sowohl ein 459 bp- als auch ein
170 bp-Amplifikat nachgewiesen werden. Diese Probanden sind Träger des homozygoten GSTT1*A/A- bzw. des heterozygoten GSTT1*A/0-Genotyps. Bei
57 Probanden war kein 459 bp-DNA-Abschnitt detektierbar, wobei der Nachweis des 170 bp-DNA-Abschnitts den fehlerfreien Verlauf der PCR und der Gelelektrophorese bestätigte. Diesen Probanden konnte somit der GSTT1*0/0-Genotyp zugeordnet werden. Die Häufigkeit dieses Genotyps lag in der untersuchten Population bei 19%.


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Abb. 1: Elektrophoresemuster nach Analyse der Amplifikate der GSTT1-PCR (von links nach rechts). Spur 1: DNA-Größenstandard. Spuren 2 und 3: Amplifikate von zwei Trägern des GSTT1*A-Allels. Spur 4: keine Auswertung, da das Amplifikat des internen Standards nicht detektiert werden konnte. Spur 5: Amplifikat eines Probanden mit GSTT1-Gendeletion.

Tab. 13: Ergebnisse der GSTT1-Genotypisierung von 300 Probanden.

Zahl der Probanden

Amplifikate

Genotyp

243 (81%)

170 bp, 459 bp

GSTT1*A/0- bzw. GSTT1*A/A

57 (19%)

170 bp

GSTT1*0/0

Das Probandenkollektiv setzte sich aus 270 männlichen und nur 30 weiblichen Individuen zusammen und spiegelt damit hinsichtlich des zahlenmäßigen Verhältnisses der Geschlechter nicht die Zusammensetzung der Bevölkerung wider. Dies ist durch die Tatsache begründet, dass sich als Spender der Blutproben vorwiegend männliche Studenten zur Verfügung gestellt hatten. Bei


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den bisher vorliegenden epidemiologischen Studien zu GSTT1-1 waren die Geschlechter der Probanden häufig nicht dokumentiert bzw. es überwog wie in vorliegenden Untersuchungen ebenfalls der Anteil der männlichen Personen (Warholm et al., 1994, Lee et al., 1995). Es stellt sich die Frage, ob der GSTT1*0/0-Genotyp bei männlichen und weiblichen Individuen unterschiedlich häufig auftritt. Unter Verwendung von zwei Testverfahren (÷2-Test und zweiseitiger exakter Fisher-Test) wurden bei der in dieser Arbeit untersuchten sowie vier weiteren aus der Literatur entnommenen Populationen keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit des GSTT1*0/0-Genotyps bei männlichen und weiblichen Probanden festgestellt (siehe Tab. 14 ). Daher kann die Tatsache, dass das Probandenkollektiv hinsichtlich des zahlenmäßigen Verhältnisses der Geschlechter nicht die Bevölkerung repräsentiert, unberücksichtigt bleiben.

Tab. 14: Häufigkeit des GSTT1*0/0-Genotyps bei männlichen (m) und weiblichen (f) Probanden in vier ethnischen Gruppen (Deutsche: eigene Daten; Schweden: Warholm et al., 1995; Chinesen, Malaysier und Inder: Lee et al., 1995).

 

Deutsche

Schweden

Malaysier

Chinesen

Inder

Gesamtpopulation (n)

300

270

167

187

152

Zusammensetzung der
Population m;f (n)

270;30

181;89

93;74

136;51

97;55

Zahl der GSTT1*0/0-Individuen m;f (n)

53;4

19;7

36;28

82;27

17;8

Häufigkeit des GSTT1*0/0-Genotyps
- insgesamt (%):


19


10


38


58


16

- geschlechtsbezogen (%): m;f

20;13

10;8

39;38

60;53

14;16

3.1.2 Phänotypisierung der Probanden

Allgemeines

Von den 300 genotypisierten Probanden waren nach dem Zufallsprinzip 140 für die Phänotypisierungs-Studie ausgewählt worden. Der Genotyp dieser Individuen wurde erst nach Abschluss der Untersuchungen bekanntgegeben. Das Ziel bestand darin, mit Hilfe einer rationellen, zuverlässigen Methode im Hämolysat der Probanden die Geschwindigkeiten des Substratumsatzes bei verschiedenen


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Konzentrationen zu bestimmen und miteinander zu vergleichen und aus den Daten der GSTT1-1-aktiven Individuen die enzymkinetischen Parameter Km und Vmax näherungsweise zu berechnen. Vor den eigentlichen Probenmessungen wurden mit dem Hämolysat einiger Probanden das von Hallier et al. (1994) beschriebene Verfahren zur Bestimmung der GSTT1-1-Aktivität auf die konkreten Bedingungen der vorliegenden Studie angepasst. Diese Anpassung umfasste im Rahmen der Methodenetablierung und Validierung die Optimierung der Probenvorbereitung, der Enzymmenge, der Inkubationszeit und der Substrat- und Cosubstratkonzentration, sowie die Prüfungen auf Stabilität und Wiederfindungsrate des Analyten, Präzision, Richtigkeit und Spezifität der verwendeten Methode und verschiedene Untersuchungen zur Kalibrierfunktion. Darüber hinaus erfolgte während der Phänotypisierungs-Studie eine Qualitätssicherung durch Kontrolle der zeitabhängigen Präzision und Richtigkeit der Formaldehydbestimmung sowie der Stabilität des Enzyms unter Lagerungsbedingungen mit Hilfe eines selbst gewonnen Kontrollmaterials. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind im folgenden dargestellt. Die genaue Zusammensetzung der Reaktionsansätze und verwendeten Lösungen ist in Kapitel 4.4.3 beschrieben.

Bestimmung von Formaldehyd

Für die Phänotypisierung wurde Dichlormethan als spezifisches Substrat der GSTT1-1 verwendet. Es zeichnet sich durch seine im Vergleich zu gasförmigen Haloalkanen gute Handhabbarkeit aus und wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen (Hallier et al., 1994) erfolgreich angewendet. Das über den GSTT1-1-abhängigen Stoffwechselweg gebildete Reaktionsprodukt Formaldehyd lässt sich durch die kolorimetrische Methode nach Nash (1953) oder mit einem HPLC-Verfahren in Anlehnung an Grömping und Camman (1989) bestimmen.

Methode nach Nash. Bei der kolorimetrischen Bestimmung nach Nash (1953). reagiert Formaldehyd in Gegenwart überschüssigen Ammoniumsalzes zum Kondensationsprodukt 3,5-Diacetyl-1,4-dihydrotoluidin ( Schema 8 ), das bei
415 nm fotometrisch vermessen werden kann.


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Schema 8: Prinzip der Formaldehydbestimmung nach Nash (Hantzsch-Reaktion).

HPLC-Methode. Die Bestimmung des Formaldehyds mit Hilfe der HPLC-Methode nach Grömping und Camman (1989) erfolgte nach dessen Umsetzung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin zum 2,4-Dinitrophenylhydrazon ( Schema 9 ).

Schema 9: Umsetzung von Formaldehyd mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin bei Anwendung der HPLC-Methode.

Die Bildung des Produkts kann erwartungsgemäß durch Temperaturerhöhung beschleunigt werden. Ein Vergleich der Reaktionsabläufe bei 25°C und 37°C ergab, dass bei einer Temperatur von 37°C schon nach 30 min keine weitere Zunahme der 2,4-Dinitrophenylhydrazon-Bildung erfolgte (siehe Abb. 2 ). Deshalb wurde für die Probandenserie die höhere Temperatur und ein Zeitraum von 30 min für die Detektionsreaktion gewählt. Als interner Standard diente o-Nitrophenol. Es war eine gute Auftrennung der Peaks von 2,4-Dinitrophenylhydrazin,
2,4-Dinitrophenylhydrazon und o-Nitrophenol möglich ( Abb. 3 ). Die HPLC-Methode wurde wegen des höheren Zeitbedarfs im Vergleich zur Nash-Methode nicht direkt zur Phänotypisierung der Probanden, jedoch zur Klärung von Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen der Geno- und Phänotypisierung verwendet (siehe Kapitel 3.1.3 ).


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Abb. 2: Bildung von 2,4-Dinitrophenylhydrazon bei 25°C (-?-) und 37°C (-¦-). Analyse zweier Gemische aus je 10,0 ml verdünnter Formaldehydlösung (100 µM) und 10,0 ml 2,4-Dinitrophenyl-hydrazinlösung (100 µM) durch Inkubation bei 25°C bzw. 37°C. Entnahme von 1 ml und HPLC-analyse in den entsprechenden Zeitintervallen (n = 1).

Abb. 3: HPLC-Analyse des Gemisches aus 2,4-Dinitrophenylhydrazin (RT: 5,76 min), internem Standard o-Nitrophenol (RT: 6,89 min) und 2,4-Dinitrophenylhydrazon (RT: 10,79 min).


55

Inkubationsbedingungen

Die Inkubationstemperatur lag bei 37°C. Nach einer fünfminütigen Temperierungsphase des Ansatzes wurde die Reaktion durch Zugabe des Substrates gestartet. Der Abbruch der enzymatischen Reaktion erfolgte nach
90 min durch Zugabe von 20%iger Trichloressigsäure (m/V).

Während Hallier et al. (1994) bei ihren GSTT1-1-Bestimmungen 1,8 ml Hämolysat in einem Gesamtvolumen von 7,8 ml Inkubationsansatz einsetzten, wurden bei den vorliegenden Untersuchungen im Interesse einer optimalen Verwendung der verfügbaren Probenmengen und einer kostengünstigen Durchführung der Phänotypisierung Ansatzvolumina von 1 ml verwendet.

Optimierung der Probenvorbereitung

In der Studie von Hallier et al. (1994) waren die Blutproben der Probanden unmittelbar nach der Entnahme zentrifugiert und das Blutplasma verworfen worden. Nach einem Waschschritt erfolgte die Lysis der Erythrozyten durch Zusatz von gleichen Volumenteilen destillierten Wassers. Für die vorliegenden Untersuchungen kamen Blutproben zur Anwendung, die nach der Entnahme
bei - 80°C eingefroren worden waren. Da es bei der Probenvorbereitung einerseits auf vollständige Lysis der Erythrozyten und andererseits auf einen möglichst geringen Funktionsverlust des Enzyms durch Proteindenaturation ankommt, wurden verschiedene Verfahren mit weiteren Einfrier- und Auftauzyklen bzw. unter Einbeziehung des Zellaufschlusses durch Ultraschallbehandlung überprüft. Zwei Einfrier- und Auftauzyklen umfassten dabei jeweils das vollständige Auftauen der eingefrorenen Proben innerhalb von 60 min bei Raumtemperatur (25°C) sowie erneutes Einfrieren (60 min bei -80°C) und anschließendes Auftauen (60 min bei Raumtemperatur). Die Ergebnisse in Tab. 15 zeigen bereits bei zwei Einfrier- und Auftauzyklen ein Optimum, zusätzliche Behandlungen bieten keinen Vorteil.


56

Tab. 15: Reaktionsgeschwindigkeit der Formaldehydbildung bei verschiedenen Verfahren der Probenvorbereitung (1 ml-Ansatz, Dichlormethan: 100 mM, GSH: 4 mM/Ansatz, n = 2).

Verfahren der Probenvorbereitung

Reaktionsgeschwindigkeit (pmol Formaldehyd/min·µl)

zwei Einfrier- und Auftauzyklen

20,3
20,3

vier Einfrier- und Auftauzyklen

18,2
19,2

sechs Einfrier- und Auftauzyklen

19,6
19,5

zwei Einfrier- und Auftauzyklen + 30 s Ultraschall (60 W/cm2)

18,7
16,0

zwei Einfrier- und Auftauzyklen + 60 s Ultraschall (60 W/cm2)

18,8
20,2

Optimierung der Enzymmenge

Da bei Enzymaktivitätsbestimmungen für eine vorgegebene Substratkonzentration im Messzeitraum eine proportionale Beziehung zwischen Enzymmenge und gebildeter Produktmenge bestehen muss, wurde die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom Hämolysatvolumen überprüft. Unter den gegebenen Bedingungen konnte bis 350 µl Hämolysat eine lineare Beziehung zwischen eingesetztem Hämolysatvolumen und der Geschwindigkeit der Formaldehydbildung festgestellt werden (vgl. Abb. 4 ). Bei Verwendung von 500 µl Hämolysat ließ sich die Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr steigern, da im Verhältnis zur Enzymmenge offensichtlich ein Mangel an Substrat bestand. In den weiteren Untersuchungen enthielten die 1 ml-Inkubationsansätze jeweils 125 µl Hämolysat.


57

Abb. 4: Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Formaldehydbildung vom eingesetzten Hämolysatvolumen (62 mM Dichlormethan und 4 mM GSH in einem Ansatzvolumen
von 1 ml, n = 3, ± R).

Optimierung der Inkubationszeit

Die Messung der Zeitabhängigkeit der Formaldehydbildung ergab einen linearen Verlauf ( Abb. 5 ), das heißt, bis zu einer Inkubationszeit von 180 min war die Reaktionsgeschwindigkeit unter den gegebenen Bedingungen konstant. Damit scheint die Gefahr der Denaturierung des Enzyms, auf die verschiedene Autoren (Liese et al., 1988, Richterich und Colombo, 1978) bei Inkubationszeiten über
60 min verweisen, unter diesen Bedingungen nicht gegeben. Zur Gewährleistung einer ausreichenden Produktbildung bei einem vertretbaren Zeitaufwand wurde im folgenden eine Inkubationszeit von 90 min gewählt.


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Abb. 5: Zeitabhängigkeit der spezifischen Formaldehydbildung (nmol/µl Hämolysat) im unbehandeltem (-full-square-) und hitzeinaktivierten (-full-square-) Hämolysat (1 ml-Ansätze mit 125 µl Hämolysat, 100 mM Dichlormethan und 4 mM GSH/Ansatz, n = 2; n = 1 bei hitzeinaktivierten Proben).

Optimierung der Substratkonzentration

Es war das Ziel der vorliegenden Untersuchungen, neben der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeiten der GSTT1-1-vermittelten Umsetzung bei verschiedenen Substratkonzentrationen für jeden Probanden die enzymkinetischen Parameter Km und Vmax zu berechnen. Durch Vor-untersuchungen wurde zunächst der Substratkonzentrationsbereich eingegrenzt. In Abb. 6 ist beispielhaft die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration im Bereich bis 250 mM Dichlormethan dargestellt. Die Daten lassen sich annähernd durch eine hyperbolische Funktion beschreiben, so dass angenommen werden kann, dass die enzymatische Umsetzung einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt (Michaelis und Menten, 1913).


59

Abb. 6: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit (v) von der Substratkonzentration (s) für die durch GSTT1-1 katalysierte Bildung von Formaldehyd aus Dichlormethan.

Die Voraussetzung für eine konstante Reaktionsgeschwindigkeit ist ein Substratüberschuß im Messzeitraum. Es wird empfohlen, dass während der Inkubationszeit nicht mehr als 20% des Substrats verbraucht werden (Richterich und Colombo, 1978). Da sich bei vorliegenden Untersuchungen aus 1 µmol Substrat 1 µmol Produkt bildete, kann aus der Produktmenge der Substrat-verbrauch im Messzeitraum berechnet werden. Unter der Voraussetzung der Stabilität des Substrats ist der Verbrauch innerhalb des Messzeitraums sehr gering (siehe Tab. 16 ). Damit kann bei den untersuchten Substratkonzentrationen über die Inkubationszeit von 90 min von einer annähernd konstanten Reaktions-geschwindigkeit ausgegangen werden, so dass dieser Konzentrationsbereich für die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeiten als geeignet anzusehen ist. Für die Untersuchungen der Probandenproben wurde die Messung bei drei Substratkonzentrationen (31, 62 und 124 mM Dichlormethan) durchgeführt und die


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Ergebnisse zur Phänotypisierung und zur näherungsweisen Bestimmung von Km und Vmax verwendet.

Tab. 16: Mittlerer Substratverbrauch im Inkubationszeitraum (90 min,125 µl Hämolysat, 4 mM GSH); verwendet wurden jeweils die Mittelwerte von Substrat- und Produktmenge (n = 3).

Stoffmenge (µmol) Substrat
im Ansatz

Stoffmenge (nmol) Produkt
im Ansatz

Substrat-verbrauch (%)

31

171

0,55

62

248

0,40

93

281

0,30

124

327

0,26

186

436

0,23

250

484

0,19

Optimierung der Cosubstrat-Konzentration

In bisherigen Phänotypisierungsstudien mit Dichlormethan als Substrat wurden Konzentrationen des Cosubstrats Glutathion von 4 mM (Hallier et al., 1994, Pemble et al., 1994), 5 mM (Mainwaring et al., 1996) bzw. 10 mM (Hallier
et al., 1993 Ahmed and Anders, 1978) im Ansatz verwendet. Zur Ermittlung der optimalen Glutathion-Konzentration für diese Studie wurden 1 ml-Ansätze mit Glutathion-Konzentrationen im Bereich 0,5 - 10 mM GSH/Ansatz hergestellt. Es zeigte sich, dass unter diesen Bedingungen die Reaktionsgeschwindigkeit nicht linear mit steigender GSH-Konzentration zunimmt, sondern im Bereich 4 - 5 mM/Ansatz ein Optimum besitzt. Die in Abb. 7 dargestellte Funktion mit der Gleichung y = 16,2x - 2,5x2 + 0,1x3 + 10,3 wurde durch polynomische Regression dritten Grades an die Einzelwerte angepasst. Das Maximum der Kurve liegt bei einer Glutathion-Konzentration von 4,4 mM/Ansatz. Für die Untersuchungen wurde eine GSH-Konzentration von 4 mM/Ansatz verwendet.


61

Abb. 7: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Glutathion-Konzentration bei einer Substratkonzentration von 124 mM, 90 min Inkubationszeit, 125 µl Hämolysat (n = 2).

Stabilität und Wiederfindungsrate des Formaldehyds

Stabilität. Als Akzeptanzkriterium für die Stabilität eines Analyten wird ein 90%iger Vertrauensbereich der Analysenergebnisse im Bereich von 90-110% der Ausgangskonzentration empfohlen (Shah et al., 1992). Zur Überprüfung der Stabilität des Formaldehyds wurden 12 ml einer verdünnten, wässrigen Formaldehydlösung (3 mM) bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min wurde je 1 ml der Lösung entnommen und mit der Methode nach Nash analysiert. Der mittlere Formaldehydgehalt aller Lösungen lag bei 102,75% der Ausgangskonzentration (90% VB 102,3 - 103,2%). Demnach ist o.g. Bedingung erfüllt und die Stabilität des Formaldehyds unter Inkubations-bedingungen als ausreichend zu betrachten. Die Stabilität der kommerziell erworbenen Formaldehyd-Stammlösung (deklarierter Gehalt 37%) wurde über den


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Messzeitraum hinweg dreimal jeweils in Zehnfachbestimmung iodometrisch bestimmt (Poethke und Kupferschmid, 1979). Bei dieser Methode wird Formaldehyd in alkalischer Lösung durch Iod quantitativ zu Ameisensäure oxidiert. Diese Oxidation wird durch das aus Iod und Alkalilauge gebildete Hypoiodit bewirkt. Nach dem Ansäuern entsteht aus nicht verbrauchtem Hypoiodit und Iodat wieder Iod, das nach dem Ansäuern mit Thiosulfat unter Verwendung von Stärke-Indikator zurücktitriert wird. Der Mittelwert der drei Bestimmungen im Messzeitraum (40,5%) wurde für die Erstellung der individuellen Kalibrierfunktionen zugrunde gelegt.

Wiederfindungsrate des Formaldehyds. Die Bestimmung der Wiederfindungs-rate (WFR) eines Analyten kann Informationen über eventuelle Verluste, z. B. durch Extraktion oder Derivatisierung, oder über dessen Instabilität in der Probenmatrix liefern. Sie berechnet sich nach der Formel: WFR(%) = (Signal bei Bestimmung im Inkubationsansatz/ Signal bei Bestimmung in Pufferlösung)·100%.

Eine WFR unter 100% ist akzeptabel, wenn sie bei allen Konzentrationen konstant ist und mit ausreichender Präzision bestimmt werden kann (Hartmann, 1994).
Tab. 17 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Wiederfindungsrate bei ausge-wählten, über den Kalibrierbereich (vgl. Abb. 8 ) verteilten Proben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wiederfindungsrate relativ konstant ist. Die Präzision der Bestimmung der Wiederfindungsrate, ausgedrückt durch die relative Standardabweichung (srel), liegt unter 15% und ist damit als ausreichend zu betrachten (siehe auch folgenden Abschnitt Präzisionskontrollen).

Tab. 17: WFR des Formaldehyds in der Probenmatrix. Herstellung der Ansätze wie unter Kalibrierung (Kapitel 4.4.3 ) angegeben. Die WFR ist der Mittelwert aus n = 3 bzw. 6.

Formaldehyd-Konzentration (µM)

100

200

300

400

500

WFR (%)

73,6

70,4

74,5

74,9

76,9

srel (%)

1,6

4,7

2,1

2,9

0,7

Präzisionskontrollen

Die Präzision wird durch das Auftreten zufälliger Fehler beeinflusst. Die relative Standardabweichung (srel) ist ein Maß für die Impräzision. Kromidas et al. (1995)


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empfehlen eine Kontrolle der Messpräzision (Präzision des Analysengerätes) vor der Kontrolle der Methodenpräzision. Srel sollte dabei 1% möglichst nicht übersteigen. Neben internen Präzisionskontrollen (Kontrolle der Präzision bei Durchführung der Methode durch denselben Bearbeiter an einem Gerät) sind externe Präzisionskontrollen notwendig, falls die Methode von verschiedenen Bearbeitern und/oder an verschiedenen Messgeräten durchgeführt wird („Ringversuche“, Shah et al., 1992).

Messpräzision. Die Präzision des verwendeten Fotometers wurde zu Beginn aller Untersuchungen durch zehnmaliges Vermessen einer verdünnten Formaldehyd-lösung (100 µM) bestimmt. Srel lag hier bei 1,36%; die Messpräzision wurde noch als ausreichend bewertet.

Methodenpräzision. Bei der Methodenpräzision unterscheidet man zwischen der Präzision innerhalb einer Serie von Messungen (serielle Präzision, intra-assay variation) und der Präzision für die Messungen identischer Proben an verschiedenen Tagen durch denselben Bearbeiter (zeitabhängige Präzision, inter-assay variation). Als Akzeptanzkriterium für die Präzision einer Methode gilt eine relative Standardabweichung von maximal 15% (Shah et al., 1992).

Die serielle Präzision der Formaldehydbestimmung nach Nash wurde an drei Tagen bei drei verschiedenen Konzentrationen (n = 6 je Konzentration und Tag) ermittelt. Der Sollwert als bestmögliche Näherung an den wahren (richtigen) Wert wurde dabei durch iodometrische Bestimmung des Formaldehydgehaltes der verwendeten Stammlösung (40,5%, siehe oben) und drei unabhängige Einwaagen der Formaldehydlösung sichergestellt. Aus den in Tab. 18 dargestellten Ergebnissen wird deutlich, dass in keiner der untersuchten Serien das Akzeptanzkriterium überschritten wird. Damit ist die serielle Präzision der Methode als ausreichend zu betrachten. Die Bestimmung der zeitabhängigen Präzision der Methode nach Nash wird im Abschnitt Qualitätssicherung während der Probenmessungen beschrieben. Zusätzlich ist dort die zeitabhängige Präzision der Bestimmung der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit in einem selbst hergestellten Kontrollmaterial dargestellt.


64

Kontrolle der Richtigkeit der Formaldehydbestimmung

Die Kontrolle der Richtigkeit einer Methode erfolgt anhand des systematischen Fehlers. Definitionsgemäß ist die Unrichtigkeit die Abweichung des Analysen-ergebnisses vom Sollwert. Als Akzeptanzkriterium gilt, dass die mittlere relative Abweichung der Analysenergebnisse einer Mehrfachbestimmung (n = 5) vom Sollwert maximal ± 15% betragen darf (Shah et al., 1992). Während bei der Sollwertkonzentration von 50 µM Formaldehyd lediglich am ersten Tag die Akzeptanzgrenze überschritten wurde, erfüllen alle anderen Kontrollen das Richtigkeitskriterium (siehe Tab. 18 ).

Tab. 18: Kontrolle der seriellen Präzision und der Richtigkeit der Formaldehydbestimmung nach Nash (n = 6 je Konzentration und Tag).

Sollwert
(µM Formaldehyd)


Tag

der Bestimmungen
(µM Formaldehyd)


s


Serielle Präzision
(s
rel in %)

Mittlere relative Abweichung vom Sollwert (%)

 

1

58,3

4,1

7,0

16,7

50,0

2

45,3

3,2

7,1

-9,3

 

3

47,1

1,4

3,0

-5,8

 

1

154,6

4,2

2,7

3,1

150,0

2

151,5

0,6

0,4

1,0

 

3

153,0

2,4

1,6

2,0

 

1

312,2

3,3

1,1

4,1

300,0

2

306,6

4,4

1,4

2,2

 

3

312,3

2,9

0,9

4,1

Spezifität der Formaldehydbestimmung

Eine Methode arbeitet spezifisch, wenn sie die zu bestimmende Komponente ohne Verfälschung durch andere in der Probe vorhandene Komponenten erfasst (Kromidas et al., 1995). Obwohl die Nash-Methode als relativ spezifisch für Formaldehyd gilt, muss davon ausgegangen werden, dass unter den gegebenen Bedingungen auch für wasserlösliche Bestandteile der Probenmatrix, die im Überstand nach Abzentrifugieren der gefällten Proteine (siehe Kapitel 4.4.3 ) vorhanden sind, eine Absorption bei 415 nm messbar ist. Hallier et al. (1994)


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konnten in substratfreien Proben bei 415 nm eine Absorption messen, die sie als „Formaldehyd-background“ bezeichneten. Bei vorliegenden Untersuchungen wurden in substratfreien Ansätzen (Puffer anstelle Dichlormethan) individuell variierende „Leerwerte“ nach 90 min Inkubation festgestellt. Daher wurde in der Phänotypisierungs-Studie der Leerwert jedes Probanden von den Messwerten der regulären Inkubationsansätze subtrahiert.

Untersuchungen zur Kalibrierfunktion

Erstellung der Kalibrierfunktion. Die Kalibrierfunktion beschreibt den mathema-tischen Zusammenhang zwischen der Konzentration der Kalibrierproben und dem Analysensignal. Zur Erstellung der Kalibrierfunktion soll dieselbe Matrix verwendet werden wie für die zu analysierenden Proben. Nach Vorversuchen wurde für die Kalibrierfunktion der praktisch relevante Konzentrationsbereich von 50 - 400 µM Formaldehyd ausgewählt. Es wurden für die Konzentrationen 50, 100, 150, 300 und 400 µM Formaldehyd in substratfreien Ansätzen mit 125 µl Hämolysat, 333 µl GSH-Lösung (4 mM/Ansatz) und TRIS-HCl-Puffer ad 1 ml jeweils neun Bestimmungen durchgeführt. Damit war die Empfehlung, wonach das Produkt aus der Anzahl der Kalibrierproben und der Wiederholbestimmungen pro Kalibrierprobe mindestens 24 betragen sollte, berücksichtigt (McDowall et al., 1995). Die Herstellung der Ansätze ist in Kapitel 4.4.3 beschrieben. Abb. 8 zeigt die grafische Darstellung der Kalibrierfunktion.

Linearität. Zur Berechnung der Geradengleichung der Kalibrierfunktion kann die ungewichtete lineare Regressionsanalyse nur dann verwendet werden, wenn eine Linearität der Abhängigkeit von Konzentration und Signal der Kalibrierproben besteht sowie Homogenität der Varianzen (Homoskedastizität) über den Kalibrierbereich nachgewiesen wurde oder angenommen werden kann. Zur Beurteilung der Linearität können die grafische Darstellung, der Korrelationskoeffizient und die relative Abweichung der an Hand der Kalibrierfunktion berechneten Konzentrationen vom Sollwert herangezogen werden. Die grafische Darstellung in Abb. 8 lässt den Schluss zu, dass eine lineare Abhängigkeit des Analysensignals von der Konzentration des Analyten besteht. Die relative Abweichung der Konzentration einer Kalibrierprobe vom


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entsprechenden Sollwert sollte unter 15% liegen (Shah et al., 1992). Diese Bedingung ist im gewählten Kalibrierbereich erfüllt ( Abb. 9 ). Der Korrelations-koeffizient sollte mindestens 0,95 betragen. Von einigen Autoren wird er als ungeeignet zur Beurteilung der linearen Abhängigkeit des Signals von der Konzentration angesehen (Shah et al., 1992). Der Korrelationskoeffizient der vorliegenden Kalibrierfunktion (r = 0,9987) wird als ausreichend betrachtet. Das Problem der Ungleichheit der Varianzen (Heteroskedastizität) tritt eher bei Kalibrierbereichen über mehrere Zehnerpotenzen auf (Shah et al., 1992). Aufgrund des geringen Umfanges des hier verwendeten Kalibrierbereichs kann von einer Homogenität der Varianzen ausgegangen werden. Die Geradengleichung der Kalibrierfunktion wurde deshalb durch ungewichtete lineare Regression ermittelt.

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Abb. 8: Kalibrierfunktion für die Formaldehydbestimmung nach Nash (n = 9 je Konzentration).

Abb. 9: Relative Abweichung der aus der Gleichung der Kalibrierfunktion berechneten Konzentrationen der Kalibrierproben (n = 9 je Konzentration) vom Sollwert. ............ 15%-Akzeptanz-grenze


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Bestimmungs- und Nachweisgrenze. Die Bestimmungsgrenze stellt diejenige Konzentration dar, bis zu der zuverlässige Analysenergebnisse gewonnen werden können. Sie wird definiert als die Konzentration des Analyten, welche ein Signal mit einer Impräzision (srel) von maximal 20% und einer relativen Abweichung vom Sollwert zwischen 80 und 120% liefert (Shah et al., 1992). Zur Ermittlung der Bestimmungsgrenze der Methode nach Nash wurden Ansätze mit Formaldehyd-Konzentrationen von 5, 10, 20, 25, 50, 100, 150 und 200 µM ( jeweils n = 6) analysiert. Bei einer Formaldehyd-Konzentration von 50 µM wurde o.g. Kriterium erfüllt (srel: 16,2%, rel. Abweichung vom Sollwert: 11,0%). Die Bestimmungsgrenze für Formaldehyd liegt demnach unter den gegebenen Bedingungen bei 50 µM (4,4 pmol/min·µl Hämolysat). Diese Konzentration wurde als niedrigste Kalibrier-konzentration verwendet. Zur Ermittlung der Bestimmungsgrenze für Formaldehyd bei der HPLC-Methode wurden Proben in Analogie zur Nash-Methode hergestellt und analysiert. Bei allen Formaldehyd-Konzentrationen unter 50 nmol/ml waren keine Peaks zur Retentionszeit von 2,4-Dinitrophenylhydrazon nachweisbar. Die relative Standardabweichung als Maß für die Präzision lag bei 50 µM Formaldehyd bei 15,4% und bei 100 µM bei 15,0%. Die Bestimmungsgrenzen der beiden Methoden sind somit identisch.

Unter der Nachweisgrenze wird das Analysensignal verstanden, das noch vom Leerwert unterschieden werden kann. Sie liegt in der Regel bei der Hälfte bis zu einem Drittel der Bestimmungsgrenze. Als Nachweisgrenze für Formaldehyd bei der Bestimmung nach Nash wurde diejenige Konzentration definiert, die dem Signal des Leerwertes plus dreifacher Standardabweichung entsprach (Long and Winefordner, 1983). Es wurden aus jeweils 125 µl Hämolysat, 333 µl GSH-Lösung (4 mM/Ansatz) und Pufferlösung ad 1 ml zehn Leerwerte hergestellt und mit der Methode nach Nash analysiert. Zum Mittelwert der Signale wurde das Dreifache der Standardabweichung addiert und die Summe mit Hilfe der mitgeführten Kalibrierfunktion in die Formaldehyd-Konzentration umgerechnet. Es ergab sich eine Nachweisgrenze von 21 µM Formaldehyd (1,9 pmol/min·µl Hämolysat).


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Qualitätssicherung während der Probenmessungen

Zeitabhängige Präzision. Bei Anwendung einer validierten Methode muss gesichert werden können, dass sie nach den während der Validierung erarbeiteten Spezifikationen arbeitet. Zu diesem Zweck wird empfohlen, in jeder Analysenserie neben den Kalibrierproben und den zu bestimmenden Proben unbekannter Konzentration auch eine Anzahl von Proben bekannter Konzentration, sogenannte Qualitätskontrollproben, mitzuführen (Shah et al., 1992). Bei vorliegenden Untersuchungen wurden zur Qualitätssicherung während der Probenmessungen an jedem Messtag aus substratfreien Ansätzen drei Qualitätskontrollproben mit Formaldehyd-Konzentrationen von 200, 400 und 600 µM mitgeführt. Aus den Ergebnissen der Messungen ließ sich die zeitabhängige Präzision der Methode nach Nash bestimmen (siehe Tab. 19 ). Die relative Standardabweichung als Maß für die Schwankungen der Analysenergebnisse liegt jeweils unter 5%. Damit ist die zeitabhängige Präzision der Methode nach Nash als ausreichend zu bewerten.

Tab. 19: Zeitabhängige Präzision der Nash-Methode. Bestimmung der Formaldehydbildung in Ansätzen mit 125 µl Hämolysat, GSH 4 mM/Ansatz, Formaldehydlösung und Puffer ad 1 ml an 29 Messtagen.

 

Formaldehyd-Konzentration (µM)

200

400

600

(n = 29)

198,5

396,2

597,0

s

8,1

12,7

16,3

srel (%)

4,1

3,2

2,7

Durch das Mitführen von Enzymkontrollproben sollte überprüft werden, ob während der Lagerung der Proben Veränderungen der Enzymaktivität aufgetreten sind. Es wurde Hämolysat eines hoch aktiven Probanden (durch vorherige Genotypisierung und Phänotypisierung gesichert) in 500 µl-Portionen aufgeteilt und bei -80°C aufbewahrt. Die Inkubation der Enzymkontrollproben erfolgte mit 4 µl Dichlormethan (n = 2). Die relative Standardabweichung als Maß für die zeitabhängige Präzision der Messungen der Enzymkontrollproben lag bei 8,4%
( ± s = 30,9 ± 2,6 pmol/min·µl) und damit unter der Akzeptanzgrenze von 15%.


70

Damit ist sichergestellt, dass keine problematischen Veränderungen der Enzymaktivität durch die Lagerung der Proben aufgetreten sind.

Qualitätsregelkarten. Die Ergebnisse der Messungen der Qualitätskontrollproben können in Qualitätsregelkarten eingetragen werden, um systematische Fehler leichter zu erkennen. Sie enthalten den Sollwert der Analyten-Konzentration mit den Akzeptanzgrenzen für die Richtigkeit sowie Warn- und Kontrollgrenzen. Als Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit sind allgemein ± 20% akzeptiert. Die obere und untere Warngenze berechnen sich aus dem Sollwert ± dem Doppelten der Standardabweichung der Einzelproben, die Kontrollgrenzen aus dem Sollwert
± dem Dreifachen der Standardabweichung. Die Ergebnisse einer Analysenserie sind zu verwerfen, wenn alle zugehörigen Qualitätskontrollproben die Kontrollgrenzen über- bzw. unterschreiten. Außerdem werden noch folgende Ereignisse als Außer-Kontroll-Situationen gewertet:

In Abb. 10 a - c sind die Regelkarten mit den Messungen der Qualitätskontroll-proben während der Phänotypisierungs-Studie dargestellt. Alle Proben lagen innerhalb des geforderten Akzeptanzbereiches für die Richtigkeit von ± 20% des Sollwertes, größtenteils sogar unter 5% (siehe Tab. 20 ). Die Kontrollgrenzen wurden nur an einem Messtag im oberen Konzentrationsbereich geringfügig überschritten. Die beiden anderen Qualitätskontrollproben dieser Serie lagen jedoch innerhalb der Grenzen, so dass die Ergebnisse dieses Messtages nicht verworfen werden mussten. Weitere Außer-Kontroll-Situation (siehe oben) wurden nicht registriert. Es kann davon ausgegangen werden kann, dass während der gesamten Messungen keine unzulässig hohen systematischen Fehler bei der Anwendung der Nash-Methode aufgetreten sind.


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Abb. 10a - c, siehe auch folgende Seite: Qualitätsregelkarten zur Kontrolle von zeitabhängiger Präzision und Richtigkeit der Formaldehydbestimmung bei drei Konzentrationen: (a) 200 µM; (b) 400 µM; (c) 600 µM;( __ Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit: Sollwert ± 20%; ........... Warngrenze: Sollwert ± zweifache Standardabweichung, berechnet aus den Einzelproben; ---------- Kontrollgrenze: Sollwert ± dreifache Standardabweichung).


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Tab. 20: Prozentuale Abweichung der Qualitätskontrollproben der Formaldehydbestimmung nach Nash vom Sollwert

Konzentration
(µM Formaldehyd)

Anzahl der Qualitätsproben (n = 29)

Abweichung < ± 5%

Abweichung < ± 10%

200

24 (83%)

28 (97%)

400

24 (83%)

29 (100%)

600

27 (93%)

29 (100%)

Phänotypisierung der Probanden: Ergebnisse und Diskussion

Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit. Nach Abschluss der Optimierung und Validierung erfolgte die Phänotypisierung der Probanden in Inkubationsansätzen mit 125 µl Hämolysat, 333 µl GSH (4 mM/Ansatz), Substrat-konzentrationen von 31, 62 und 124 mM Dichlormethan und TRIS-HCl-Puffer,
20 mM, pH 7,5 ad 1 ml. Für jeden Probanden wurde eine Dreifachbestimmung je Substratkonzentration sowie eine Doppelbestimmung der substratfreien Leeransätze („Leerwerte“) durchgeführt. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde in pmol Formaldehyd pro Minute pro µl Hämolysat berechnet. Abb. 11 zeigt die


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Häufigkeitsverteilung der Reaktionsgeschwindigkeiten der 140 Probanden bei einer Substratkonzentration von 124 mM Dichlormethan sowie den Probit-Plot. Anhand der grafischen Darstellung sind drei Phänotypen voneinander abgrenzbar: eine Gruppe von Individuen, in deren Hämolysat eine Reaktionsgeschwindigkeit nicht messbar war bzw. im Bereich der Nachweisgrenze lag; eine weitere Gruppe mit intermediärer sowie eine dritte Gruppe mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit.

Abb. 11: Häufigkeitsverteilung der Reaktionsgeschwindigkeiten im Hämolysat von 140 Probanden bei der GSTT1-1-katalysierten Umsetzung von Dichlormethan (Substratkonzentration: 124 mM).

Probanden mit einer Reaktionsgeschwindigkeit unterhalb 3 pmol Formaldehyd/min·µl Hämolysat bei 124 mM Dichlormethan wurden als funktionell


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inaktiv (defizient) betrachtet. Abb. 12 zeigt beispielhaft die Formaldehydbildung in Ansätzen mit Hämolysat eines defizienten Probanden im Vergleich zum Leerwert des gleichen Hämolysats im Inkubationszeitraum. Die Häufigkeit der Enzymdefizienz betrug in der untersuchten Population 19,3% (n = 27).

Abb. 12: Formaldehydbildung in Ansätzen mit 124 mM Substrat (-¢-) und Leerwerte in substratfreien Ansätzen (-£-) mit Hämolysat eines GSTT1-1-defizienten Probanden (jeweils n = 1).

Bei den GSTT1-1-aktiven Probanden (n = 113) war im Hämolysat von 63 Individuen (45,0%) eine intermediäre Reaktionsgeschwindigkeit messbar. Sie lag bei dieser Substratkonzentration im Bereich 3 - 22 pmol/min·µl Hämolysat.
50 Probanden (35,7%) besaßen eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit im Bereich
23 - 70 pmol/min·µl Hämolysat. Vergleicht man die Mediane der Reaktionsgeschwindigkeiten der beiden aktiven Phänotypen, so lag die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit aller Individuen mit dem hoch aktiven Phänotyp beim 2,4fachen der Reaktionsgeschwindigkeit der Individuen mit dem intermediären Phänotyp (Median 30,7 bzw. 12,6 pmol/min·µl Hämolysat). Auffällig ist die sehr hohe Reaktionsgeschwindigkeit im Hämolysat zweier Probanden ( Abb. 11 ), die mit


75

66 bzw. 70 pmol/min·µl Hämolysat mehr als das Doppelte der mittleren Reaktionsgeschwindigkeit der hoch aktiven Individuen betrug. Eine mögliche Erklärung dafür ist das Vorliegen einer Genduplikation, wie sie bereits bei einem anderen GST-Isoenzym, GSTM1, nachgewiesen werden konnte (McLellan et al., 1997). Bei den Messungen mit 31 und 62 mM Dichlormethan war eine übereinstimmende Zuordnung der Probanden zu den drei Phänotypen möglich (siehe Tab. 21 ).

Tab. 21: Zuordnung der hinsichtlich GSTT1-1 phänotypisierten Probanden (n = 140) zu den drei Phänotypen.

Substrat-
konzentration
(mM Dichlormethan)


Phänotyp

Reaktions-geschwindigkeit (pmol/min·µl)

Zahl der Individuen und Häufigkeit des Phänotyps (%)

 

defizient

< 2

27 (19,3)

31

intermediär aktiv

2 - 8

63 (45,0)

 

hoch aktiv

8 - 29

50 (35,7)

 

defizient

< 2

26 (18,6)

62

intermediär aktiv

2 - 17

64 (45,7)

 

hoch aktiv

15 - 52

50 (35,7)

 

defizient

< 3

27 (19,3)

124

intermediär aktiv

3 - 22

63 (45,0)

 

hoch aktiv

23 - 70

50 (35,7)

Die Formaldehydbildung bei der 31 mM-Substratkonzentration war jedoch teilweise sehr gering; bei 13 Probanden lag sie unterhalb der Bestimmungsgrenze. Für drei dieser Probanden trifft das auch auf die 62 mM-Substratkonzentration zu. Aus dieser Tatsache kann geschlussfolgert werden, dass eine Messung der Reaktionsgeschwindigkeiten im Hämolysat der GSTT1-1-aktiven Probanden bei höheren Substratkonzentrationen, beispielsweise 62, 124 und 248 mM Dichlormethan, günstiger gewesen wäre, da dann die entstehende Formaldehydmenge bei o.g. Individuen nicht im Bereich der Bestimmungsgrenze gelegen hätte. Höhere Substratkonzentrationen als 124 mM waren deshalb nicht in Betracht gezogen worden, weil Hallier et al. (1994) bei Dichlormethan-


76

Konzentrationen über 120 mM einen Abfall der Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet hatten, der auf eine Substrathemmung zurückzuführen sein könnte.

Da bisher nur wenige Phänotypisierungsstudien hinsichtlich GSTT1-1, insbesondere mit dem Substrat Dichlormethan, durchgeführt wurden, sind kaum Vergleiche mit den Ergebnissen anderer Autoren möglich. Pemble et al. (1994) bestimmten im Hämolysat von vier Probanden die GSTT1-1-katalysierte Formaldehydbildung aus Dichlormethan. Sie lag im Bereich 15 - 18 pmol/min·mg Hb (keine Angabe der Dichlormethan-Konzentration). Hallier et al. (1994) bestimmten die Reaktionsgeschwindigkeit der Formaldehydbildung im Hämolysat von sieben Individuen. Sie lag bei 48 mM Dichlormethan im Bereich von 4 - 18 pmol/min·mg Hb. In einer Studie von Warholm et al. (1994), bei der erstmalig drei Phänotypen voneinander abgegrenzt worden waren, wurde mit dem Substrat Methylchlorid eine Enzymdefizienz bei 11,1% der Probanden, eine intermediäre Umsetzungsgeschwindigkeit bei 46,1% und eine hohe bei 42,8% der Individuen
bestimmt (n = 208). Die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit aller Individuen mit dem hoch aktiven Phänotyp lag etwa beim Doppelten der Reaktionsgeschwindigkeit der Individuen mit dem intermediären Phänotyp, wie es auch in vorliegenden Untersuchungen annähernd der Fall war.

Bestimmung der enzymkinetischen Parameter. Für eine korrekte Bestimmung von Vmax und Km müssen eine Reihe von Bedingungen erfüllt sein. Es wird empfohlen, mindestens 10 Substratkonzentrationen über den in Vorversuchen ermittelten Konzentrationsbereich zu verteilen. Es werden Intervalle von 0,2·Km, 0,5·Km, Km, 2·Km und 5·Km oder Km/4, Km/3, Km/2, Km, 2·Km, 4·Km und 8·Km vorgeschlagen. Als günstigster Bereich zur genauen Ermittlung von Km wird der Bereich zwischen 20%iger bis 80%iger Sättigung des Enzyms betrachtet (Suelter, 1990). Bei vorliegender Studie waren Voruntersuchungen zur Ermittlung des optimalen Substrat-Konzentrationsbereichs jedes einzelnen Probanden aus zeitlichen Gründen nicht möglich und auch nicht beabsichtigt. Deshalb konnten nur die Reaktionsgeschwindigkeiten bei den drei zur Phänotypisierung der Probanden verwendeten Substratkonzentrationen zur näherungsweisen Berechnung der enzymkinetischen Parameter herangezogen werden.


77

Als Modelle zur Analyse der gewonnen Messdaten existieren neben der hyperbolischen Funktion eine Reihe von linearisierten Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung, deren grafische Darstellung optisch die Richtigkeit des enzymkinetischen Mechanismus überprüfbar macht. Die am häufigsten verwendeten Darstellungen sind der Lineweaver-Burk-Plot, der Hanes-Plot und der Eadie-Hofstee-Plot. Welches dieser Modelle am besten zur Berechnung von Km und Vmax aus den experimentell ermittelten Daten geeignet ist, sollte jedoch nicht subjektiv bestimmt werden. Für eine objektive Betrachtung wird eine Residuenanalyse vorgeschlagen (Mannervik, 1982). Die Ausgleichsgeraden bei den linearisierten Darstellungen sollten durch gewichtete lineare Regression ermittelt werden. Je nach Art der verwendeten Wichtungsfaktoren ist es dadurch einerseits möglich, die unterschiedliche Varianz der Messwerte zu berücksichtigen. Andererseits kann die Verzerrung der Messfehler, die nach dem Fehlerfortpflanzungsgesetz durch die Bildung der Reziproken von Substratkonzentration (s) und/oder Reaktionsgeschwindigkeit (v) entsteht, korrigiert werden (Lasch, 1987).

Bei den vorliegenden Untersuchungen war durch den geringen Umfang der für jeden Probanden vorliegenden Messdaten eine statistische Auswertung nicht möglich. Km und Vmax konnten nur näherungsweise bestimmt werden. Nach Lineweaver und Burk (1934) wurden das Reziproke der Reaktionsgeschwindigkeit (1/v) gegen das Reziproke der entsprechenden Substratkonzentration (1/s) aufgetragen ( Abb. 13 ). Aus der Gleichung der nach ungewichteter linearer Regression erhaltenen Geraden der Form 1/v = 1/Vmax + Km/Vmax · 1/S wurden Km und Vmax berechnet. Die Gerade mit dem Anstieg Km/Vmax schneidet die Abszisse bei -1/Km und die Ordinate bei 1/Vmax.


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Abb. 13: Darstellung der reziproken Reaktionsgeschwindigkeit 1/v eines GSTT1-1-aktiven Probanden in Abhängigkeit von der reziproken Substratkonzentration 1/s nach Lineweaver-Burk (ungewichtete lineare Regression der Einzelwerte, n = 3).

Die Variabilität der enzymkinetischen Parameter innerhalb der untersuchten Population sind in Abb. 14 und Abb. 15 dargestellt. Die Km-Werte der GSTT1-1-aktiven Individuen lagen im Bereich zwischen 33 und 468 mmol/l.
Bei Verwendung des Tests nach Kolmogoroff-Smirnoff (siehe Kapitel 4.5 ) konnte kein signifikanter Unterschied zur Normalverteilung festgestellt werden (p > 0,05).

Wegen der Normalverteilung der Km-Werte sind Mutationen, die Veränderungen der Aminosäurestruktur des aktiven Zentrums des Enzyms und damit eine veränderte Affinität zum Substrat zur Folge haben, relativ unwahrscheinlich. Punktmutationen, wie sie beispielsweise bei GSTM1 vorhanden sind (Widersten
et al., 1991) und damit bisher unbekannte GSTT1-Allelvarianten können jedoch nicht ausgeschlossen werden


79

Abb. 14: Häufigkeitsverteilung der Km-Werte der GSTT1-1-aktiven Probanden der Studie
(n = 113).

Die Vmax-Daten der GSTT1-1-aktiven Individuen lagen im Bereich 5 - 149 pmol/min·µl Hämolysat ( Abb. 15 ). Die Ergebnisse zeigen eine bimodale Verteilung mit einem Antimode bei 54 pmol/min·µl Hämolysat. Dabei lagen die Vmax-Werte von fünf Probanden, die aufgrund der Reaktionsgeschwindigkeiten bei den drei Substratkonzentrationen zu den Individuen mit intermediärer Aktivität gerechnet worden waren, über diesem Wert. In bisherigen Phänotypisierungsstudien sind Angaben zu enzymkinetischen Parametern der Individuen einer Population selten zu finden. Hallier et al. (1994) ermittelten bei Inkubation von Hämolysat eines


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Probanden mit zehn verschiedenen Dichlormethan-Konzentrationen
(10 - 200 mM) einen Vmax-Wert von 180 pmol/min·mg Hb und einen Km-Wert von 60 mmol/l.

Abb. 15: Häufigkeitsverteilung der Vmax-Werte der GSTT1-1-aktiven Probanden (n = 113).


81

3.1.3 Vergleich und Diskussion der Ergebnisse der Geno- und Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich der Glutathion-S-Transferase T1-1

Im Hämolysat von 140 zufällig ausgewählten, gesunden deutschen Probanden mit bekanntem GSTT1-Genotyp wurde eine Phänotypisierung hinsichtlich GSTT1-1 mit dem spezifischen Substrat Dichlormethan vorgenommen. Bei 27 Individuen (19,3%) war keine bzw. eine unterhalb der Nachweisgrenze stattfindende Umsetzung des Substrats nachweisbar. Es bestand eine 100%ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Genotypisierung, wonach bei diesen Probanden eine homozygote GSTT1-Gendeletion und damit der Genotyp GSTT1*0/0 vorlag.

Bei 113 Probanden (80,7%) war mittels Genotypisierung mindestens ein GSTT1*A-Allel identifiziert worden. Mit Hilfe der Phänotypisierung konnten in dieser Gruppe zwei Phänotypen voneinander abgegrenzt werden; 45,0% der Individuen waren unter den gegebenen Bedingungen intermediär, 35,7% der Individuen hoch aktiv. Damit bestand der Vorteil der Phänotypisierung darin, eine trimodale Verteilung der GSTT1-1-Aktivität nachweisen zu können. Da die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit aller Individuen mit dem hoch aktiven Phänotyp etwas mehr als das Doppelte der Reaktionsgeschwindigkeit der Probanden mit dem intermediären Phänotyp betrug (Mediane 30,7 bzw. 12,6 pmol/min·µl Hämolysat), liegt wahrscheinlich ein Gen-Dosis-Effekt bedingt durch eine Codominanz der Allele GSTT1*0 und GSTT1*A vor. Demnach sind Probanden mit einer mittleren GSTT1-1-Aktivität heterozygot und Probanden mit einer hohen Aktivität homozygot hinsichtlich des GSTT1*A-Allels. Mit der mathematischen Gleichung der Hardy-Weinberg-Regel wurden unter Verwendung der durch Genotypisierung ermittelten Häufigkeit des GSTT*0/0-Genotyps die Häufigkeiten der beiden anderen Genotypen berechnet. Die Gleichung p2 + 2pq + q2 = 1 mit p + q = 1 diente der Berechnung der erwarteten Allelfrequenzen, wobei p hier die Frequenz des defizienten und q die des aktiven Allels darstellen sollen. Aus der durch Genotypisierung ermittelten Häufigkeit des GSTT1*0/0-Genotyps (p2 = 0,193) wurden p und q berechnet (q = 1 - p = 0,561). Die Häufigkeit der heterozygoten


82

Individuen berechnete sich entsprechend aus 2pq = 0,492. Unter Verwendung des ÷2-Tests konnte kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) zwischen der erwarteten Verteilung der Genotypen und den durch Phänotypisierung ermittelten Häufigkeiten der Phänotypen gefunden werden ( Tab. 22 ).

Tab. 22: Genotyp- und Phänotyp-Häufigkeiten der GSTT1-1-Studie im Vergleich mit Hardy-Weinberg's Theorem.


Genotyp

 

Häufigkeit des Genotyps nach Genotypisierung

Häufigkeit des Phänotyps nach Phänotypisierung

Erwartungswert nach Hardy-Weinberg

GSTT1*0/0

 

0,193

0,193

0,193

GSTT1*A/0

GSTT1*A/A

 


0,807

0,450

0,357

0,492

0,315

Aus der Anwendbarkeit der Hardy-Weinberg-Regel kann allgemein angenommen werden, dass sich die Population im Gleichgewichtszustand befindet, d.h. beispielsweise kein Selektionsdruck auf sie einwirkt (Hennig, 1995). Die in Tab. 22 dargestellten Ergebnisse unterstützen im speziellen die Hypothese, dass es sich bei den hoch aktiven Individuen um homozygote Träger des GSTT1*A-Allels und bei den intermediär aktiven um Heterozygote, d.h. Individuen mit dem Genotyp GSTT1*A/0 handelt.

Die Ergebnisse der Untersuchungen von Wiebel et al. (1999) bekräftigen die Hypothese der Codominanz der beiden GSTT1-Allele. Bei paralleler Phänotypisierung und Genotypisierung von 29 Mitgliedern einer Familie (drei Generationen) konnte mittels semiquantitativer PCR der GSTT1*A/0-Genotyp vom GSTT1*A/A-Genotyp differenziert werden. Die GSTT1-1-Enzymaktivität der Träger des GSTT1*A/A-Genotyps war doppelt so groß wie die der Träger des GSTT1*A/0-Genotyps.

Die HPLC-Methode kam bei vorliegenden Untersuchungen nur zur Klärung einer Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der Geno- und Phänotypisierung zur Anwendung. Im Hämolysat eines Probanden, bei dem mittels Genotypisierung eindeutig ein GSTT1-spezifisches Amplifikat identifiziert worden war, konnte zunächst keine Umsetzung von Dichlormethan bestimmt werden. Bei wiederholter


83

Phänotypisierung, die zusätzlich zur Nash-Methode unter Verwendung der HPLC-Methode durchgeführt wurde, wurde schließlich in Übereinstimmung mit dem Genotyp eine enzymatische Formaldehydbildung nachgewiesen. Der zunächst veranschlagte höhere Zeitbedarf für die HPLC-Methode dürfte bei entsprechender Automatisierung der Analyse durch Verwendung eines automatischen Probengebers nicht die entscheidende Rolle spielen. Dagegen müsste vor Verwendung der HPLC-Methode zur Phänotypisierung eines größeren Probandenkollektivs geprüft werden, ob das Produkt 2,4-Dinitrophenylhydrazon über einen längeren Messzeitraum, je nach Kapazität des Probengebers bis zu 12 Stunden, stabil ist.

Die Grenzen der hier verwendeten Methode zur Genotypisierung der Probanden liegen darin, dass lediglich das Vorhandensein von mindestens einem GSTT1*A- Allel nachgewiesen werden konnte. Eine Differenzierung zwischen heterozygoten und homozygoten Trägern war zunächst nicht möglich. Von Sprenger et al. (2000) wurde kürzlich eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, die GSTT1-Gendeletion detaillierter zu charakterisieren. Durch PCR-mapping stellten die Autoren fest, dass das GSTT1-Gen von zwei 18kb-Regionen (mit HA3 und HA5 bezeichnet) mit hoher Homologie ihrer Nukleotidsequenzen (90%) begrenzt ist. Im Falle der GSTT1-Deletion entsteht durch Fusion dieser beiden Genabschnitte ein neuer Abschnitt H0, der sich von HA3 und HA5 nur in wenigen Nukleotiden unterscheidet. Diese neuen Erkenntnisse ermöglichten die Entwicklung einer PCR-Methode, bei der die Gendeletion nicht durch die Abwesenheit eines PCR-Produkts wie bei der herkömmlichen Methode, sondern durch den Nachweis eines 1460 bp-Amplifikats diagnostiziert wird. Ein 466 bp-Amplifikat zeigt das Vorhandensein eines GSTT1*A-Allels an. Damit konnten erstmalig die heterozygoten Träger von GSTT1*A durch Nachweis zweier PCR-Produkte identifiziert werden (vgl. Tab. 23 ).

Tab. 23: PCR-Produkte der drei GSTT1-Genotypen bei der Methode nach Sprenger et al. (2000).

Genotyp

GSTT1*0/0

GSTT1*A/0

GSTT1*A/A

PCR-Produkte (bp)

1460

466, 1460

466


84

Von den im Rahmen der vorliegenden Studie phänotypisierten Probanden wurden 130 mit dieser neuentwickelten Methode erneut genotypisiert. Die Korrelation zwischen dem GSTT1*0/0-Genotyp und dem enzymdefizienten Phänotyp wurde bestätigt. Zusätzlich konnte bis auf wenige Ausnahmen (keine Übereinstimmung bei neun Individuen) bei den Probanden mit intermediärer Reaktions-geschwindigkeit der GSTT1*A/0-Genotyp und bei Probanden mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit bei der Umsetzung von Dichlormethan der GSTT1*A/A-Genotyp diagnostiziert werden. Damit wird die Hypothese der Codominanz der beiden GSTT1-Allele erneut bestätigt.

Zusätzlich zu einem Gen-Dosis-Effekt muss auch der Einfluss von Faktoren in Betracht gezogen werden, die induzierend oder hemmend auf die Enzymaktivität wirken können. Die Problematik der Induktion und Hemmung von GSTT1-1 bietet noch vielfältige Forschungsmöglichkeiten. Eine Induzierbarkeit des humanen Isoenzyms ist denkbar, da ein solcher Effekt bei den verwandten Klasse-Theta-Enzymen der Ratte (rGSTT1-1, rGSTT2-2) bereits nachgewiesen werden konnte. Die rGSTT1-1 im Rattenmagen konnte beispielsweise durch Cumarin und Alpha-Tocopherol, das Enzym der Rattenleber u.a. durch Cumarin und Phenobarbital sowie das Enzym des Rattendickdarms durch nichtsteroidale Antirheumatika wie beispielsweise Indometacin, Piroxicam und Acetylsalicylsäure induziert werden (van Lieshout et al., 1998a, 1998b, Sherratt et al., 1998). Mit der kombinierten Anwendung der Genotypisierungs-Methode von Sprenger et al. (2000) und einer Phänotypisierungs-Methode könnte in zukünftigen epidemiologischen Studien die Bedeutung von GSTT1-1 als Risikofaktor für verschiedene Erkrankungen besser eingeschätzt werden.

Hinsichtlich der GSTT1-Gendeletion bestehen nach bisherigen Erkenntnissen große interethnische Unterschiede (vgl. Tab. 4 ). In den asiatischen Bevölkerungsgruppen ist der GSTT*0/0-Genotyp stark verbreitet, die Häufigkeit seines Auftretens lag in den bisherigen Studien zwischen 58 und 64%. In den europäischen Bevölkerungsgruppen tritt nach den bisher vorliegenden Daten die GSTT1-Gendeletion viel seltener auf. Allerdings erscheint es möglich, dass auch zwischen einander ethnisch nahestehenden Bevölkerungsgruppen signifikante


85

Unterschiede bestehen. Bei Anwendung des ÷2 -Tests unterscheidet sich die Defizienz von 11,1% (95% VB 6,6 - 16,8%), die in einer Population von 208 schwedischen Individuen durch Phänotypisierung festgestellt wurde, signifikant
(p = 0,032) von der in vorliegender Arbeit mittels Phänotypisierung ermittelten Häufigkeit von 19,3% (95% VB 12,1 - 27,7%). Beim Vergleich der eigenen Daten mit der in einer deutschen Population von 40 Individuen bestimmten Defizienz-Häufigkeit von 15% (95% VB 4,3 - 31,4%, Kempkes et al., 1996) konnte dagegen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Es sind weitere Studien in verschiedenen anderen europäischen Bevölkerungsgruppen notwendig, um diesbezüglich zu sicheren Aussagen kommen zu können. Es wird jedoch deutlich, dass bei epidemiologischen Studien die genaue Kenntnis der ethnischen Herkunft der Individuen von großer Bedeutung ist.


86

3.1.4 Ergebnisse und Diskussion der Untersuchungen mit potentiellen Inhibitoren und Substraten der Glutathion-S-Transferase T1-1

Phosphonsäurediester des Glutathions

In Untersuchungen von Kunze (1996, siehe auch Kapitel 2.1.3 ) wurde das Cosubstrat Glutathion als Leitstruktur zur Entwicklung von GST-Inhibitoren, die als Modulatoren der Zytostatikaresistenz dienen könnten, verwendet. Neben anderen erwiesen sich dabei die Verbindungen (S)-ã-Glutamyl-(2RS)-2-amino-(di-iso-propoxy-phosphinyl)-acetyl-glycin (3) und (S)-ã-Glutamyl-(2RS)-2-amino-(di-n-butoxy-phosphinyl)-acetyl-glycin (4), in denen die SH-Funktion von GSH durch Phosphonsäurediester substituiert ist, als potentielle Inhibitoren verschiedener, aus Schweinegeweben isolierter GST-Isoenzyme.

(3)

(4)

Der Di-iso-propyl-phosphonsäureester (3) und der Di-n-butyl-phosphonsäureester (4) zeigten bei GSTs der Klasse Alpha eine kompetitive Hemmung gegenüber Glutathion, wobei 4 stärker wirksam war als 3. Bei den GSTs der Klassen Mu und Pi wurde dagegen für beide Substanzen ein gemischter nicht-kompetitiver Hemmtyp nachgewiesen. Für die aus humaner Plazenta isolierte GSTP1-1


87

wurden IC50-Werte von 64 µM für 3 bzw. 21 µM für 4 bestimmt (Kunze, 1996).

Bei vorliegenden Untersuchungen sollte überprüft werden, ob diese beiden Substanzen auch auf die GSTT1-1 der humanen Erythrozyten inhibitorisch wirken. Das Ziel bestand zunächst darin, durch Variation der Inhibitorkonzentrationen im Bereich 10 µM - 1 mM die IC50 zu ermitteln. Abb. 16 zeigt für beide Substanzen die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration an potentiellem Inhibitor. Eine erwartete Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit im Vergleich zu den Ansätzen ohne potentiellen Inhibitor konnte nicht beobachtet werden. Wegen der begrenzten Verfügbarkeit der Substanzen im Untersuchungszeitraum wurden keine weiteren Untersuchungen durchgeführt.

In weiterführenden Studien wäre der nächste Schritt die Variation der GSH-Konzentration. Bei den hier dargestellten Versuchsergebnissen war eine GSH-Konzentration von 4 mM gewählt worden, wie sie auch als Optimum für die Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich GSTT1-1 verwendet worden war. In Untersuchungen von Kunze (1996) wurde eine kompetitive Hemmung der GSTs der Klasse Alpha im Bereich 0,125 - 4 mM GSH festgestellt. Für die Hemmwirkung auf GST-Isoenzyme der Klassen Mu und Pi waren jedoch niedrigere GSH-Konzentrationen (0,125 - 1 mM) relevant.

Sollte auch bei diesen Untersuchungen kein Hemmeffekt der o.g. Substanzen nachweisbar sein, wäre eine Isoenzymspezifität der potentiellen Inhibitoren denkbar. Diese könnte z. B. mit der von anderen GSTs abweichenden Struktur des aktiven Zentrums erklärbar sein. Während bei Isoenzymen der Klassen Alpha ein Arginin-Rest (Arg15) und bei GSTs der Klassen Mu und Pi ein Tyrosin-Rest der G-site bei der Aktivierung des Glutathions eine wichtige Rolle spielt, wird im Falle der GST Theta die Funktion der GSH-Aktivierung wahrscheinlich von einem Serin-Rest der GSH-Bindungsstelle übernommen (Tan et al., 1995, Wilce et al., 1996). Die Substanzen 3 und 4 könnten bezüglich ihrer Anlagerung an die G-site sterisch behindert sein (Kunze, persönliche Mitteilung).


88

Abb. 16: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit im Hämolysat eines Probanden von der Konzentration an potentiellem Inhibitor; (a) Substanz 3, (b) Substanz 4 (1 ml-Ansatz mit 125 µl Hämolysat, 4 mM GSH und 124 mM Dichlormethan, n = 3 je Konzentration, <b> </b> ± R).


89

Tacrin

Neuere epidemiologische Daten (ausführlich dargestellt in Kapitel 2.1.4 ) lassen eine Schutzfunktion von GSTT1-1 bei der Behandlung von Alzheimer-Patienten mit dem Arzneistoff Tacrin (9-Amino-1,2,3,4-tetrahydroacridin, Cognex®) in dem Sinne vermuten, dass reaktive Tacrin-Metaboliten entgiftet bzw. ihre Bildung behindert werden kann. Tacrin selbst ist aufgrund seiner Struktur wahrscheinlich kein GSTT1-1-Substrat. Um diese Hypothese zu sichern, sollte ein möglicher Einfluss von Tacrin auf die Umsetzung von Dichlormethan durch GSTT1-1 getestet werden.

Bei einer Dosierung von 80 - 200 mg Tacrin pro Tag über zwei Wochen werden ein bis zwei Stunden nach Applikation maximale Plasmakonzentrationen von
0,09 - 0,26 µM erreicht (Wagstaff and McPavish, 1994). Bei vorliegenden Untersuchungen wurden zunächst Inkubationsansätze wie bei der Phänotypisierung der Probanden mit 124 mM Dichlormethan und Tacrin-Puffer-Lösungen im mikromolaren Bereich hergestellt. Es waren jedoch keine Hemmeffekte auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Dichlormethan-Umsetzung nachweisbar. Der Einfluss verschiedener Tacrin-Konzentrationen im millimolaren Bereich (0 - 160 mM Tacrin) bei einer Substratkonzentration von 124 mM ist in Abb. 17 dargestellt. Zur Bestimmung der IC50 als derjenigen Konzentration des Hemmstoffes, die die Enzymaktivität unter Standardbedingungen um 50% senkt, wurde Hämolysat eines Probanden mit Tacrin-Puffer-Lösungen in den Konzentrationen 7,5, 15, 30 und 75 mM Tacrin versetzt. Nach Substratzugabe erfolgt die Inkubation unter denselben Bedingungen wie bei der Phänotypisierung der GSTT1-1 mit den Substratkonzentrationen 31, 62 und 124 mM Dichlormethan. Nach Berechnung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeiten (Vmax) der ungehemmten und der gehemmten Reaktionen ergab sich eine IC50 von 12 mM Tacrin.


90

Abb. 17: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Tacrin-Konzentration bei einer Dichlormethan-Konzentration von 124 mM (n = 2 bzw.3)

Abb. 18 zeigt die doppelt reziproke Darstellung der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration in Gegenwart unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen. Bei zwei Tacrin-Konzentrationen (7,5 und 30 mM) verläuft die durch lineare Regression an die Mittelwerte der Messungen angepasste Gerade parallel zur Geraden der ungehemmten Reaktion, das heißt, sowohl Km als auch Vmax sind im Vergleich zur ungehemmten Reaktion verändert. Dies lässt auf eine unkompetitive Hemmung des Enzyms im untersuchten Bereich schließen, die auf einer Wechselwirkung des Inhibitors mit dem Enzym-Substrat-Komplex beruht. (Schellenberger, 1989).


91

Abb. 18: Doppelt reziproke Darstellung der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration in Gegenwart verschiedener Tacrin-Konzentrationen (5 = n = 8 je Konzen-tration)

Die bisherigen Untersuchungen stützen die Hypothese, dass Tacrin wahrscheinlich kein Substrat der GSTT1-1 ist. In weiterführenden Studien müßte der Einfluss der Metaboliten des Tacrin auf die GSTT1-1-vermittelte Umsetzung von Dichlormethan in analoger Weise untersucht werde. Bisher sind die Metaboliten 1-OH-, 2-OH-, 3-OH-, 4-OH- und 7-OH-Tacrin beim Menschen identifiziert worden (Madden et al., 1995, Pool et al., 1997). Im Zeitraum der hier dargestellten Untersuchungen waren Tacrin-Metaboliten nicht kommerziell erhältlich.

Falls Tacrin-Metaboliten von GSTT1-1 verstoffwechselt werden können, wäre dies eine mögliche Erklärung für die stärkere hepatotoxische Wirkung von Tacrin auf Alzheimer-Patienten mit dem GSTT1*0/0-Genotyp (Bequemont et al., 1997). Diese Patienten wären nicht in der Lage wären, die durch das Cytochrom P450-System entstandenen reaktiven Metaboliten zu entgiften. Madden et al. (1995) zeigten in vitro mit Humanlebermikrosomen, dass die Bildung protein-reaktiver


92

Chinonmethid-Metaboliten von Tacrin und 7-OH-Tacrin in Gegenwart von 500 µM GSH signifikant verringert war. Aus Schema 10 wird deutlich, dass die Bildung des Thioether-Addukts auch durch Glutathion-S-Transferasen katalysiert werden könnte. Ob dabei eine Beteiligung von GSTT1-1 in Frage kommt, bleibt in weiteren Untersuchungen, wie oben beschrieben, zu klären.

Schema 10: Möglicher Mechanismus für die Bioaktivierung von Tacrin durch CYP1A2 und die Entgiftung reaktiver Metaboliten durch GST (modifiziert nach Madden et al., 1995).


93

3.2 Arylamin-N-Acetyltransferase 1

3.2.1 Genotypisierung der Probanden

Allgemeines

Bei der Genotypisierung der 314 Probanden wurde auf das Vorhandensein der Allele NAT1*3, NAT1*4, NAT1*10, NAT1*11, NAT1*14, NAT1*15, NAT1*17 und NAT1*22 geprüft.

DNA-Extraktion

Die Extraktion der genomischen DNA wurde wie im Kapitel 3.1.1 beschrieben durchgeführt.

RFLP-PCR

Die bisher bekannten NAT1-Allele sind überwiegend durch das Auftreten von Punktmutationen charakterisiert. Diese dienen als Erkennungsstelle für Restriktionsendonukleasen und werden daher als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (restrictions fragment length polymorphisms, RFLPs) bezeichnet. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme bakterieller Herkunft mit der Eigenschaft, DNA-Abschnitte sequenzspezifisch hydrolysieren zu können.

Mit den in Kapitel 4.4.2 angegebenen Primern wurden zunächst NAT1-spezifische DNA-Abschnitte amplifiziert. Außer bei der Mutation T1088A, deren Identifizierung mittels allelspezifischer PCR erfolgte, wurden mit Hilfe der in Kapitel 4.4.2 aufgeführten Restriktionsenzyme diese DNA-Abschnitte hydrolysiert, so dass mutationsspezifische Fragmente entstanden. Beispielsweise führte die Inkubation eines 435 bp-DNA-Abschnittes mit dem Restriktionsenzym BbsI bei Vorliegen der Mutation A1095C zu zwei Fragmenten mit 39 bp und 396 bp, während im Falle des Wildtyp-Allels der DNA-Abschnitt erhalten blieb.

Agarose-Gelelektrophorese

Die DNA-Amplifikate und -Fragmente wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese mit Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Die genaue


94

Zusammensetzung der Ansätze sowie die Reaktionsbedingungen sind Kapitel 4.4.2 zu entnehmen.

Genotypisierung der Probanden: Ergebnisse und Diskussion

Identifizierung der Allele. In dem untersuchten Probandenkollektiv wurde auf das Vorhandensein der NAT1-Allele NAT1*3, NAT1*4, NAT1*10, NAT1*11, NAT1*14, NAT1*15, NAT1*17 und NAT1*22 getestet. Die Allele NAT1*17 und NAT1*22 traten nicht auf. Tab. 24 zeigt im Überblick die nach derzeitigem Erkenntnisstand in den identifizierten Allelen enthaltenen Mutationen (siehe auch Tab. 10 und Schema 7 ). Die Häufigkeiten der identifizierten Allele und entsprechenden Genotypen der Individuen sind in Tab. 25 und Tab. 26 dargestellt.

Tab. 24: Mutationen der mittels Genotypisierung in der Population von 314 Probanden identifizierten NAT1-Allele.


NAT1-Allel

Nukleotide

-344

-40

445

459

559

560

640

1088

1095

NAT1*4

C

A

G

G

C

G

T

T

C

NAT1*3

C

A

G

G

C

G

T

T

A

NAT1*10

C

A

G

G

C

G

T

A

A

NAT1*11

T

T

A

A

C

G

G

9 bp-Del. 1077-85

A

NAT1*14A

C

A

G

G

C

A

T

A

A

NAT1*15

C

A

G

G

T

G

T

T

C

Tab. 25: Häufigkeiten der NAT1-Allele in einer unselektierten Population von 314 gesunden deutschen Probanden.

NAT1-Allel

n

Häufigkeit (%)

95% Vertrauensbereich

NAT1*3

19

3,03

1,47 - 5,25

NAT1*4

445

70,86

65,73 - 75,45

NAT1*10

126

20,06

15,95 - 24,52

NAT1*11

21

3,34

1,69 - 5,65

NAT1*14A

14

2,23

0,93 - 4,22

NAT1*15

3

0,48

0,02 - 1,71


95

Tab. 26: Häufigkeiten der NAT1-Genotypen in einer unselektierten Population von 314 gesunden deutschen Probanden.

NAT1-Genotyp

n

Häufigkeit (%)

95% Vertrauensbereich

NAT1*3/*3

3

0,95

0,02 - 3,65

NAT1*4/*3

10

3,19

0,92 - 7,01

NAT1*10/*3

3

0,95

0,02 - 3,65

NAT1*4/*4

163

51,91

43,39 - 59,90

NAT1*4/*10

87

27,70

20,54 - 35,34

NAT1*10/*10

13

4,14

1,48 - 8,31

NAT1*4/*11

12

3,82

1,29 - 7,88

NAT1*10/*11

5

1,59

0,19 - 4,68

NAT1*11/*11

2

0,64

0 - 3,10

NAT1*4/*14A

9

2,87

0,75 - 6,56

NAT1*10/*14A

5

1,59

0,19 - 4,68

NAT1*4/*15

1

0,32

0 - 2,49

NAT1*15/*15

1

0,32

0 - 2,49

Mit Hilfe der mathematischen Gleichung der Hardy-Weinberg-Regel wurde analog zu Kapitel 3.1.3 aus der durch Genotypisierung ermittelten Häufigkeit jedes NAT1-Allels (p) und der Summe aller übrigen Allele (q) der Erwartungswert 2pq für die heterozygoten Träger des jeweiligen Allels berechnet (siehe Tab. 27 ). Mit statistischen Testverfahren (÷2-Test, zweiseitiger exakter Fisher-Test) wurde überprüft, ob signifikante Unterschiede zwischen den durch Genotypisierung ermittelten Häufigkeiten der heterozygoten Träger des jeweiligen Allels und dem mit Hilfe der Hardy-Weinberg-Regel berechneten Erwartungswert bestehen. Für das NAT1*15-Allel wurde ein solcher statistisch signifikanter Unterschied gefunden (p < 0,01), für alle übrigen Allele bestand eine Übereinstimmung beider Werte. Damit ist anzunehmen, dass sich die untersuchte Population annähernd im genetischen Gleichgewichtszustand befindet.


96

Tab. 27: Vergleich der Häufigkeiten der heterozygoten Träger von NAT1-Allelen mit dem Erwartungswert, berechnet mit der mathematischen Gleichung der Hardy-Weinberg-Regel.


NAT1
-Allel

Allelhäufigkeit nach Geno-typisierung (p)

Summe aller übrigen Allele der Population (q)

Häufigkeit der heterozygotenTräger des Allels nach Genotypisierung
(aus Tab. 26 )

Erwartungswert der heterozygoten Träger des Allels nach Hardy-Weinberg (2·p·q)

NAT1*3

0,0303

0,9697

0,0414

0,0588

NAT1*4

0,7086

0,2914

0,3950

0,4130

NAT1*10

0,2006

0,7994

0,3183

0,3207

NAT1*11

0,0334

0,9666

0,0541

0,0646

NAT1*14A

0,0223

0,9777

0,0446

0,0436

NAT1*15

0,0048

0,9952

0,0032

0,0010

Ethnische Unterschiede. Aus der in Tab. 11 dargestellten interethnischen Verteilung der NAT1-Allele wurden die europäischen Bevölkerungsgruppen ausgewählt und den eigenen Ergebnissen gegenübergestellt ( Tab. 28 ). Wegen des geringen Stichprobenumfangs war die englische Population von Payton and Sim (1998) nicht einbezogen.

Tab. 28: Häufigkeiten ausgewählter NAT1-Allele in europäischen Bevölkerungsgruppen.

Population
(Zahl der Individuen)

NAT1-Allelhäufigkeit in der Population (%)


Literatur

*3

*4

*10

*11

*14A

*14B

*15

*17

*22

*24

 

Dänen (471)

n.b.

73,9

24,7

1,4

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

Okkels et al., 1997

Franzosen (322)

2,0

74,4

20,5

1,4

1,7

0

0

n.b.

n.b.

n.b.

Bouchardy et al., 1998

Engländer (112)

2,7

77,7

16,1

4,5

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

Bell et al., 1995a

Deutsche (314)

3,0

70,9

20,1

3,3

2,2

0

0,5

0

0

n.b.

eigene Datena

a Bruhn et al. (1999)

Mit dem ÷2-Test und dem zweiseitigen exakten Fisher-Test wurde auf signifikante Unterschiede der Allelhäufigkeiten getestet. Zwischen den Häufigkeiten im Auftreten der Allele NAT1*4, *3 und *10 bestand bei Dänen, Franzosen, Engländern und Deutschen kein signifikanter Unterschied. Das NAT1*11 Allel trat


97

bei den deutschen Individuen signifikant häufiger auf als bei Franzosen (p = 0,026) und Dänen (p = 0,012). Zwischen deutschen und englischen Probanden war hinsichtlich der Häufigkeit dieses Allels kein signifikanter Unterschied feststellbar.

Im internationalen Vergleich zeigten erste Studien größere Unterschiede in der Verteilung der NAT1-Allele bei europäischen und amerikanischen Populationen einerseits und asiatischen Bevölkerungsgruppen andererseits. Innerhalb Europas konnte unter Verwendung der eigenen Ergebnisse lediglich ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit des NAT1*11-Alleles festgestellt werden; weitere Unterschiede sind jedoch nicht ausgeschlossen. Es wird damit erneut die Bedeutung der Kenntnis der ethnischen Herkunft der Probanden in epidemiologischen Studien unterstrichen.

3.2.2 Phänotypisierung der Probanden

Allgemeines

Von den 314 genotypisierten Probanden wurden für die Phänotypisierungs-Studie 105 Individuen so ausgewählt., dass einerseits die unter Europäern am häufigsten auftretenden Allele NAT1*4 und NAT1*10 in repräsentativem Umfang enthalten waren. Andererseits wurden möglichst viele Probanden mit den selteneren Allelen (NAT1*3, NAT1*11, NAT1*14A und NAT1*15) in die Studie einbezogen. Das Ziel der Untersuchungen bestand darin, mit einer zuverlässigen Methode im Hämolysat der Probanden die Geschwindigkeiten des Substratumsatzes zu bestimmen, miteinander zu vergleichen sowie für jedes Individuum die enzymkinetischen Parameter Km und Vmax näherungsweise zu berechnen. Das von Grant et al. (1991) beschriebene Verfahren zur Bestimmung der NAT1-Aktivität wurde auf die konkreten Bedingungen der vorliegenden Studie angepasst. Dabei wurden im Rahmen der Methodenetablierung und -validierung eine Optimierung der Probenvorbereitung, der Enzymmenge, der Inkubationszeit und der Substrat- und Cosubstratkonzentration, die Prüfungen auf Stabilität und Wiederfindungsrate der Analyten, Präzision, Richtigkeit und Spezifität der verwendeten Methode, sowie verschiedene Untersuchungen zu den Kalibrierfunktionen durchgeführt.


98

Darüber hinaus erfolgte während der Phänotypisierungs-Studie eine Qualitätssicherung durch Kontrolle der zeitabhängigen Präzision und Richtigkeit der Bestimmung der Analyten sowie der Stabilität des Enzyms unter Lagerungsbedingungen mit Hilfe eines selbst gewonnen Kontrollmaterials. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind im folgenden dargestellt. Die genaue Zusammensetzung der Reaktionsansätze und verwendeten Lösungen ist in Kapitel 4.4.3 beschrieben.

Bestimmung von PABA und NAcPABA

Zur Bestimmung von PABA und NAcPABA wurde ein HPLC-Verfahren in Anlehnung an die von Lindsay et al. (1988) beschriebenen Bedingungen etabliert. Anstelle des dort verwendeten internen Standards p-Hydroxybenzoesäure, der sich bei vorliegenden Untersuchungen nicht ausreichend von den Analyten trennen ließ, wurde p-Acetamidophenol verwendet. Die gute Auftrennung der Peaks von internem Standard (RT: 4,35 min), PABA (RT: 5,45 min) und NAcPABA (RT: 6,97 min) ist aus Abb. 19 erkennbar. Die Quantifizierung erfolgte unter Bezug auf die Kalibrierfunktionen des jeweiligen Versuchstages mittels Quotientenbildung aus den Peakhöhen von PABA und internem Standard bzw. NAcPABA und internem Standard.

Abb. 19: HPLC-Analyse eines Gemisches aus internem Standard p-Acetamidophenol
(RT: 4,35 min), PABA (RT: 5,45 min) und NAcPABA (RT: 6,97 min).


99

Inkubationsbedingungen

Die Inkubation der Blutproben erfolgte bei einer Temperatur von 37°C. Nach einer fünfminütigen Temperierung des Ansatzes erfolgte der Start der enzymatischen Reaktion durch Zugabe der Substratlösung. Nach 10 min wurde die enzymatische Reakion durch Zugabe von 15%iger Perchlorsäure (V/V) gestoppt. Die Zusammensetzung des Inkubationsansatzes wurde in Anlehnung an Grant et al. (1991) an die Bedingungen der vorliegenden Studie angepasst.

Optimierung der Probenvorbereitung

Bei Untersuchungen von Lindsay et al. (1988) war der Umsatz von PABA in Gesamtblut signifikant höher als in gewaschenen roten Blutzellen. Dies ist begründet durch das Vorkommen von NAT1 sowohl in Erythrozyten als auch in Leukozyten, wobei die Aktivität in Erythrozyten ca. 99% der Gesamtaktivität in Blutzellen beträgt (Risch et al., 1996). In den für die vorliegenden Untersuchungen verwendeten Gesamtblutproben war demnach die NAT1 aller Blutzellen enthalten. Zur Sicherung einer vollständigen Lysis der Erythrozyten wurden analog zu den Untersuchungen bei GSTT1-1 (siehe 0 ) verschiedene Verfahren der Probenvorbereitung geprüft. Aus Tab. 29 wird deutlich, dass drastischere Aufschlussmethoden tendenziell zu einer verringerten Enzymaktivität führen.

Tab. 29: Reaktionsgeschwindigkeit der Acetylierung von PABA bei verschiedenen Verfahren der Probenvorbereitung (1 ml-Ansatz, 50 µl Hämolysat, PABA: 100 µM, n = 2).

Verfahren der Probenvorbereitung

Reaktionsgeschwindigkeit (pmol NAcPABA/min·µl)

ein Einfrier- und Auftauzyklus

5,1
5,5

zwei Einfrier- und Auftauzyklen

3,8
4,5

vier Einfrier- und Auftauzyklen

3,9
4,2

ein Einfrier- und Auftauzyklus + 3 x 5 s Ultraschall (60 W/cm2)

4,5
5,2

ein Einfrier- und Auftauzyklus + 6 x 5 s Ultraschall (60 W/cm2)

4,9
4,1


100

Aus diesem Grund wurde einmaliges Auftauen der bei -80°C gelagerten Proben (ein Einfrier- und Auftauzyklus) als ausreichend für die vollständige Lysis der Erythrozyten betrachtet.

Optimierung der Enzymmenge

Es wurde die Abhängigkeit der Bildung des Produkts NAcPABA von der Enzymmenge (in µl Hämolysat) untersucht. In Abb. 20 ist eine lineare Abhängigkeit zwischen der Enzymmenge und der Reaktionsgeschwindigkeit bis 75 µl Hämolysat erkennbar. Bei höheren Enzymmengen besteht offensichtlich ein Mangel an Substrat. Für die Phänotypisierung der Probanden wurden 25 µl Hämolysat verwendet, da bei dieser Enzymmenge der Substratverbrauch bei den eingesetzten PABA-Konzentrationen unter 20% lag (siehe Tab. 30 ).

Abb. 20: Abhängigkeit der Acetylierungsgeschwindigkeit von PABA vom eingesetzten Hämolysatvolumen (50 µM PABA, Ansatzvolumen 1 ml, n = 3, ± R).


101

Optimierung der Inkubationszeit

Die NAT1-katalysierte Acetylierung von PABA war über einen Zeitraum von
20 min annähernd linear ( Abb. 21 ). Andere Autoren berichten über eine Instabilität von NAT1 bei Inkubationszeiten >10 min und 37°C (Grant et al., 1991, Hein et al., 1993). In einer Studie von Goodfellow et al. (2000) dagegen lag der Zeitraum, in dem 50% der ursprünglichen Aktivität eines in E. coli exprimierten humanen
NAT1 4-Proteins in vivo erhalten blieb, bei t1/2 = 4,7 h (37°C). Für die Phänotypi-sierung der Probanden wurde eine Inkubationszeit von 10 min verwendet.

Abb. 21: Zeitabhängigkeit der Acetylierung von PABA (50 µl Hämolysat, 100 µM PABA, Ansatzvolumen 1 ml, n = 4, ± R).

Optimierung der Substratkonzentration

Durch Voruntersuchungen mit dem Hämolysat einiger Probanden wurde zunächst der für die Messungen geeignete Substratkonzentrationsbereich eingegrenzt.
#LINKCONTENT#Abb. 22#/LINKCONTENT# zeigt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration im Bereich bis 100 µM PABA. Die Daten lassen sich annähernd durch eine hyperbolische Funktion beschreiben, so dass angenommen werden kann, dass die enzymatische Umsetzung einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt. Für die Probandenserie wurden die Substratkonzentrationen 10, 20, 50 und 100 µM PABA verwendet. Bei diesen Konzentrationen war PABA gut


102

wasserlöslich, so dass zur Vermeidung von Proteindenaturation auf den Zusatz von DMSO wie bei den Untersuchungen von Grant et al. (1991) verzichtet wurde.

Abb. 22: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit (v) von der Substratkonzentration (s) für die durch NAT1 katalysierte Acetylierung von PABA (50 µl Hämolysat in einem Ansatzvolumen von
1 ml, Inkubationszeit 10 min, n = 4).

Mit der HPLC-Methode ist eine Ermittlung des Substratverbrauchs während der enzymatischen Reaktion möglich. Ein Hämolysatvolumen von 25 µl erwies sich im Rahmen der Methodenetablierung als geeignet zur Gewährleistung eines Substratverbrauchs unter 20% (siehe Tab. 30 ).


103

Tab. 30: Substratverbrauch bei den zur Phänotypisierung der Probanden verwendeten PABA-Konzentrationen bei 25 µl und 50 µl Hämolysat desselben Probanden (Ansatzvolumen 1 ml, Inkubationszeit 10 min, n = 2).

 

50 µl Hämolysat

25 µl Hämolysat

eingesetzte Stoffmenge PABA (nmol) im Ansatz

Stoffmenge PABA (nmol) im Ansatz nach Inkubation


Substrat-verbrauch (%)

Stoffmenge PABA (nmol) im Ansatz nach Inkubation


Substrat-verbrauch (%)

10

6,1
6,0

39,0
40,0

8,0
8,3

20,0
17,0

20

13,6
13,6

32,0
32,0

17,5
17,4

12,5
13,0

50

39,7
38,0

20,6
24,0

45,9
47,2

8,2
5,6

100

93,9
95,6

6,1
4,4

97,9
95,3

2,1
4,7

Optimierung der Cosubstratkonzentration

Von großer Bedeutung ist die Konzentration des Cosubstrats Acetyl-Coenzym A. Sie sollte einerseits ausreichend hoch sein, um eine zeitlich konstante Reaktionsgeschwindigkeit der Acetylierung zu gewährleisten. Andererseits wurde eine Produkthemmung bei Anwesenheit hoher Coenzym-A-Konzentrationen beobachtet (Andres et al., 1985). Die Lösung dieses Problems bietet die Verwendung eines Acetyl-CoA-regenerierenden Systems. Bei vorliegenden Untersuchungen wurden in Anlehnung an die Methode von Grant et al. (1991)
200 µl Acetyl-CoA (450 µM) sowie das gleiche Volumen dieses Systems, bestehend aus Acetylcarnitin und Carnitin-O-Acetyltransferase, in Triethanolamin-Puffer (siehe 4.4.4 ) verwendet. Durch die geringe Konzentration von 90 µM Acetyl-CoA im Ansatz wurde einerseits o.g. Produkthemmung erschwert, andererseits war durch die Reaktion

eine ständige Regenerierung des verbrauchten Acetyl-CoA gewährleistet.


104

Stabilität und Wiederfindungsrate von PABA und NAcPABA

Stabilität unter Lagerungsbedingungen. Zur Phänotypisierung der Probanden wurden zwecks Rationalisierung des Arbeitsablaufs wässrige Lösungen der verwendeten Substratkonzentrationen sowie der Kalibrierproben einmalig hergestellt, portioniert und bei -80°C vorrätig gehalten. Die Stabilität dieser Lösungen wurde überprüft, indem nach einer, sechs und acht Wochen Lagerung die Konzentrationen bestimmt und mit der Konzentration der Ausgangslösung verglichen wurden. Nach Shah et al. (1992) ist die Stabilität eines Analyten dann gewährleistet, wenn die Konzentration nach entsprechender Lagerungszeit
80 - 120% der Ausgangskonzentration beträgt. Wie Tab. 31 zeigt, ist diese Anforderung erfüllt.

Tab. 31: Konzentration von PABA und NAcPABA in % der Konzentration der Ausgangslösung nach Lagerung bei -80°C (n = 2).

 


Konz. (µM)

Gehalt in % des Ausgangswertes nach

1 Woche

6 Wochen

8 Wochen

PABA

20

104,6
106,0

101,6
103,5

114,5
116,6

 

50

101,6
103,0

100,5
101,6

106,9
109,8

 

100

97,9
106,6

97,1
101,4

107,5
-

NAcPABA

5

108,2
107,4

94,8
94,0

112,1
112,8

 

10

104,9
104,3

98,0
97,7

109,9
110,3

 

20

103,5
104,9

100,4
99,8

107,9
107,1

Stabilität unter Inkubationsbedingungen. Es wurde geprüft, ob während der Inkubationszeit (10 min) eine Zersetzung von NAcPABA auf nichtenzymatischen oder enzymatischem Wege stattfindet. Zur Prüfung auf nichtenzymatische Zersetzung wurde in Ansätzen mit dem Hämolysat zweier Probanden (genaue Zusammensetzung siehe Kapitel 4.4.4 ) zunächst mit Perchlorsäure das Enzym denaturiert. Anschließend erfolgt die Zugabe von NAcPABA-Lösungen in den Konzentrationen, die der aus Vorversuchen bekannten Produktbildung dieser


105

Probanden entsprachen. Unter diesen Bedingungen konnte keine Bildung von PABA nachgewiesen werden. Zur Prüfung auf Bildung von PABA durch die Aktivität von Deacetylasen (enzymatische Zersetzung von NAcPABA) wurden mit dem Hämolysat eines Probanden Ansätze mit 2, 4 und 8 µM NAcPABA (Bereich der Produktbildung, in Vorversuchen ermittelt) sowie zusätzlich 10 und 20 µM NAcPABA hergestellt. Es war lediglich in den 20 µM-Ansätzen eine PABA-Bildung nachweisbar, die einer Zersetzung von ca. 5% der eingesetzten NAcPABA-Konzentration entspricht. Daher wurde angenommen, dass die Aktivität von Deacetylasen in dem hier relevanten Konzentrationsbereich keine Bedeutung hat.

Stabilität während der Analyse. Es wurde außerdem überprüft, ob die Lösungen der Analyten während der Verweildauer im automatischen Probengeber bei Raumtemperatur (25°C) stabil waren. Diese Verweildauer konnte je nach Bestückung bis zu 450 min betragen (Aufnahmevermögen 50 Proben, Analysendauer 8 min, siehe Abb. 19 , Pause zwischen zwei Injektionen ca. 1 min). Es wurden wässrige PABA- bzw. NAcPABA-Lösungen verschiedener Konzentrationen nach der angegebenen Verweildauer im automatischen Probengeber analysiert und die prozentuale Abweichung der Konzentration vom Ausgangswert ermittelt (siehe Tab. 32 ). Auch nach längerer Verweildauer lag die prozentuale Abweichung vom Sollwert unter ± 5%, daher war die Stabilität während der Analyse gewährleistet.


106

Tab. 32: Stabilität der Analyten während der Verweildauer im automatischen Probengeber der HPLC-Anlage bei Raumtemperatur; wässrige PABA- und NAcPABA-Lösungen der angegebenen Konzentrationen, n = 2.

 

 

Gehalt in % der Ausgangskonzentration (Sollwert) nach Verweildauer von

Substanz

Sollwert (µM)

120 min

240 min

480 min

PABA

10

105,0
103,0

101,0
102,0

n.b.

100

99,9
97,2

n.b.

101,0
100,8

NAcPABA

5

96,0
96,0

99,2
97,6

n.b.

 

20

100,0
100,0

n.b.

102,8
102,8

Wiederfindungsrate. Die Ergebnisse der Bestimmung der Wiederfindungsrate bei ausgewählten Konzentrationen PABA und NAcPABA des Kalibrierbereichs sind in Tab. 33 dargestellt. Die relative Standardabweichung liegt unter 15%, damit ist die Präzision der Bestimmung der WFR als ausreichend zu bewerten.

Tab. 33: Wiederfindungsrate von PABA und NAcPABA in der Probenmatrix. Herstellung der Ansätze wie unter Kalibrierung (Kapitel 4.4.4 ) angegeben. Die WFR ist der Mittelwert aus n = 6.

 

PABA

NAcPABA

Konzentration (µM)

25

50

5

10

20

WFR (%)

93,4

96,0

99,6

106,4

105,1

srel (%)

4,9

8,0

8,1

9,7

11,7

Präzisionskontrollen

Messpräzision. Die Messpräzision der HPLC-Anlage wird bei Verwendung eines automatischen Probengebers wesentlich von der Präzision des Einspritzvorganges bestimmt. Bei zehnmaligem Vermessen einer PABA-Lösung (50 µM) lag die relative Standardabweichung der Peakhöhen des Analyten bei 0,97% und damit unter der für die Messpräzision empfohlenen Grenze von 1% (Kromidas et al., 1995).


107

Methodenpräzision. Die serielle Präzision der HPLC-Bestimmung von PABA und NAcPABA wurde an drei Tagen mit verdünnten Lösungen der Analyten in drei verschiedenen Konzentrationen (n = 6 je Konzentration und Tag) ermittelt. Der Sollwert als bestmögliche Näherung an den wahren (richtigen) Wert wurde durch drei unabhängige Einwagen der beiden Substanzen sichergestellt. Tab. 34 und Tab. 35 zeigen, dass in keiner der untersuchten Serien das Akzeptanzkriterium für die Präzision (srel = 15%, Shah et al., 1992) überschritten wird.

Kontrolle der Richtigkeit der Bestimmung von PABA und NAcPABA

Als Akzeptanzkriterium für die Richtigkeit gilt, dass die mittlere relative Abweichung der Analysenergebnisse einer Mehrfachbestimmung (n = 5) vom Sollwert maximal ± 15% betragen darf (Shah et al., 1992). Tab. 34 und Tab. 35 zeigen, dass dieses Kriterium bei allen Bestimmungen für beide Substanzen erfüllt wurde.

Tab. 34: Kontrolle der seriellen Präzision und der Richtigkeit der HPLC-Bestimmung von PABA
(n = 6 je Konzentration und Tag).


Sollwert
(µM PABA)


Tag

<b> der Bestimmungen<br>
(µM PABA)</b>


s


Serielle Präzision
(s
rel in %)

Mittlere relative Abweichung vom Sollwert (%)

 

1

10,0

0,2

2,0

0,4

10,0

2

9,8

0,04

0,4

-1,6

 

3

9,5

0,3

3,2

-4,7

 

1

49,9

0,3

0,6

-0,2

50,0

2

50,1

0,2

0,4

0,2

 

3

50,3

0,4

0,8

0,7

 

1

101,6

0,7

0,7

1,6

100,0

2

101,8

1,2

1,2

1,8

 

3

100,1

0,8

0,8

0,1


108

Tab. 35: Kontrolle der seriellen Präzision und der Richtigkeit der HPLC-Bestimmung von NAcPABA (n = 6 je Konzentration und Tag).

Sollwert
(µM NAcPABA)


Tag

<b> der Bestimmungen<br>
(µM NAcPABA)</b>


s


Serielle Präzision
(s
rel in %)

Mittlere relative Abweichung vom Sollwert (%)

 

1

4,9

0,03

0,6

-2,0

5,0

2

4,9

0,04

0,8

-3,0

 

3

4,9

0,04

0,8

-2,2

 

1

10,0

0,1

1,0

0,3

10,0

2

9,4

0,1

1,1

-5,7

 

3

10,0

0,1

1,0

0,2

 

1

50,9

0,2

0,4

1,8

50,0

2

51,3

0,2

0,4

2,6

 

3

50,0

0,6

1,2

0,02

Spezifität der Bestimmung von PABA und NAcPABA

Wie bei der Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich GSTT1-1 wurde von jedem Probanden der Leerwert in zwei substratfreien Ansätzen nach 10 min Inkubation bestimmt und das Mittel von den Messwerten der regulären Inkubationsansätze subtrahiert.

Bei der HPLC-Analyse der Proben trat zwischen dem PABA- und dem NAcPABA-Peak ein dritter Peak bei einer Retentionszeit von 5,9 min auf (siehe Abb. 19 ). Sein Erscheinen ist vom Substrat unabhängig, da er auch in den substratfreien Ansätzen detektiert werden konnte. Da er sich stets klar von den übrigen relevanten Peaks abtrennen ließ, stellte er keine Interferenz dar.

Untersuchungen zur Kalibrierfunktion

Erstellung der Kalibrierfunktion. Nach Vorversuchen wurde zur Bestimmung der Kalibrierfunktion für PABA der Bereich 10-100 µM und für NAcPABA der Bereich
5 - 50 µM ausgewählt, da in diesem Bereich die meisten Signale der Probanden-proben zu erwarten waren. Es wurden für die PABA-Konzentrationen 10, 20, 25, 50 und 100 µM sowie für die NAcPABA-Konzentrationen 5, 7,5, 10, 20 und 50 jeweils 6 Bestimmungen durchgeführt. Damit war die Empfehlung, wonach das


109

Produkt aus der Anzahl der Kalibrierproben und der Wiederholbestimmungen pro Kalibrierprobe n = 24 betragen sollte, berücksichtigt (McDowall et al., 1995). Die Herstellung der Ansätze ist in Kapitel 4.4.4 beschrieben. Abb. 23 und Abb. 25 zeigen die grafischen Darstellungen der Kalibrierfunktionen für PABA und NAcPABA.

Linearität. Zur Beurteilung der Linearität der Abhängigkeit des Analysensignals von der Konzentration wurden die grafischen Darstellungen, die relativen Abweichungen der Konzentrationen vom richtigen Wert (Sollwert) sowie die Korrelationskoeffzienten herangezogen. Zusätzlich wurde auf Normalverteilung der Einzelwerte der Kalibrierkonzentrationen geprüft. Die grafischen Darstellungen lassen den Schluss zu, dass jeweils eine lineare Abhängigkeit des Analysensignals von der Konzentration des Analyten besteht. Die Akzeptanzgrenze für die relative Abweichung der Konzentrationen der Kalibrierproben vom richtigen Wert liegt bei 15%. Falls diese Bedingung nicht erfüllt werden kann, müssen jedoch mindestens vier von sechs Kalibrierproben je Konzentration innerhalb der Akzeptanzgrenze liegen (Shah et al., 1992). Diese Anforderung ist für die Kalibrierproben von PABA und NAcPABA erfüllt (siehe
Abb. 24 und Abb. 26 ). Die Korrelationskoeffizienten für die Kalibrierfunktion von PABA (r = 0,995) und für die von NAcPABA (r = 0,976) werden als ausreichend betrachtet. Mit dem Test nach Kolmogoroff-Smirnoff (siehe Kapitel 4.5 ) wurde festgestellt, dass sowohl bei PABA als auch bei NAcPABA die Einzelwerte der Kalibrierkonzentrationen nicht signifikant von der Normalverteilung abweichen. Da anhand der vorgenommenen Untersuchungen von einer Linearität der Kalibrierfunktionen ausgegangen werden konnte, wurden die Geradengleichungen jeweils durch ungewichtete lineare Regression bestimmt.


110

Abb. 23: Kalibrierfunktion für die HPLC-Bestimmung von PABA unter Verwendung des internen Standards p-Acetamidophenol (n = 6 je Konzentration).


111

Abb. 25: Kalibrierfunktion für die HPLC-Bestimmung von NAcPABA unter Verwendung des internen Standards p-Acetamidophenol (n = 6 je Konzentration).

Abb. 26: Relative Abweichung der aus der Gleichung der Kalibrierfunktion berechneten Konzentrationen der NAcPABA-Kalibrierproben vom Sollwert (......... Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit).


112

Bestimmungs- und Nachweisgrenze. Zur Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurden aus Hämolysat, das der üblichen Probenvorbereitung unterworfen worden war, Proben mit PABA-Konzentrationen von 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 und 10 µM und NAcPABA-Konzentrationen von 0,3, 0,5, 1, 2, 3, 4 und 7,5 µM (n = 6) hergestellt. Die Bestimmungsgrenze als diejenige Konzentration des Analyten, welche eine Signal mit einer Impräzision (srel) von maximal 20% und einer relativen Abweichung vom Sollwert zwischen 80 und 120% liefert, liegt für PABA bei einer Konzentration von 10 µM (srel: 12,2%, mittlere relative Abweichung vom
Sollwert: -2,8%), das entspricht 40 pmol /min·µl Hämolysat. Diese Konzentration wurde auch bei der Phänotypisierung als kleinste Kalibrierkonzentration verwendet. Für NAcPABA waren erst ab 1 µM auswertbare Peaks zu erkennen. Bei dieser Konzentration lagen sowohl srel als auch die relative Abweichung vom Sollwert unter 20% (11,8% bzw. 19,6%). Die Bestimmungsgrenze für NAcPABA liegt demnach unter den gegebenen Bedingungen der Probenvorbereitung und Analytik bei 1 µM, das entspricht 4 pmol/min·µl Hämolysat. Als niedrigste Konzentration für die Kalibrierung wurden 5 µM gewählt.

Als Nachweisgrenzen von PABA und NAcPABA wurden die Konzentrationen definiert, die dem dreifachen Rauschsignal der Basislinie des Eluenten entsprachen (Buick et al., 1990). Mit Hilfe der mitgeführten Kalibrierfunktionen wurde das Dreifache dieses Rauschens in die entsprechenden PABA- und NAcPABA-Konzentrationen umgerechnet. Dabei wurde für PABA eine Nachweisgrenze von 1,4 µM und für NAcPABA eine Nachweisgrenze von 0,6 µM ermittelt. Für PABA ergab erst eine Konzentration von 2 µM ein auswertbares Signal, die Nachweisgrenze lag daher bei 8 pmol/min·µl Hämolysat. Für NAcPABA waren unterhalb einer Konzentration von 1 µM keine auswertbaren Peaks vorhanden. Für diesen Analyten liegt daher die Nachweisgrenze wie die Bestimmungsgrenze bei 4 pmol/min·µl Hämolysat.

Qualitätssicherung während der Probenmessungen

Zeitabhängige Präzision. Zur Qualitätssicherung während der Probenmessungen wurden an jedem Messtag drei Qualitätskontrollproben mit NAcPABA-Konzentrationen von 5, 10 und 20 µM mitgeführt. Aus den Ergebnissen


113

der Messungen wurde die zeitabhängige Präzision der HPLC-Bestimmung von NAcPABA ermittelt. Tab. 36 zeigt, dass die Akzeptanzgrenze von srel = 15% nicht überschritten wurde. Damit ist die zeitabhängige Präzision der HPLC-Bestimmung von NAcPABA ausreichend.

Tab. 36: Zeitabhängige Präzision der HPLC-Bestimmung von NAcPABA. Ansätze mit 25 µl Hämolysat, 375 µl Puffer, 200 µl Acetyl-CoA-regenerierendem System und 200 µl NAcPABA-Lösung zum Erreichen der angegebenen Endkonzentrationen.

 

NAcPABA-Konzentration (µM)

5

10

20

(n = 23)

4,9

9,9

20,0

s

0,5

0,6

0,5

srel (%)

10,2

6,1

2,5

Durch das Mitführen von Enzymkontrollproben an jedem Messtag (n = 23, Doppelbestimmung) wurde überprüft, ob während der Lagerung der Proben Veränderungen der Enzymaktivität aufgetreten sind. Dazu wurde Hämolysat eines Probanden mit dem Genotyp NAT1*4/*10- (durch vorherige Genotypisierung und Phänotypisierung gesichert) in 100 µl-Portionen aufgeteilt und bei -80°C aufbewahrt. Die Inkubation erfolgte im 1 ml-Ansatz mit 25 µl Hämolysat und 100 µM PABA. Die relative Standardabweichung als Maß für die zeitabhängige Präzision der Messung der Enzymkontrollproben lag bei 13,4% ( ± s = 18,6 ± 2,5 pmol/min·µl) und damit unter der Akzeptanzgrenze von 15%. Damit ist sichergestellt, dass im Messzeitraum keine problematischen Veränderungen der Enzymaktivität durch die Lagerung der Proben aufgetreten sind.

Qualitätsregelkarten. In Abb. 27 a-c sind die Qualitätsregelkarten mit den während der Phänotypisierungs-Studie durchgeführten Messungen dargestellt. Die Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit (Sollwert ± 20%) wurde an einem Tag bei der 5 µM-Konzentration überschritten. Da aber die beiden anderen Qualitätskontrollproben dieses Messtages die geforderte Richtigkeit aufwiesen, musste die Analysenserie nicht verworfen werden. Tab. 37 stellt dar, wieviele der Qualitätskontrollproben im jeweiligen Konzentrationsbereich innerhalb der


114

Grenzen von ± 5 , ± 10% bzw. 20% des richtigen Wertes liegen. Ereignisse wie z. B. das Auftreten von sieben aufeinanderfolgenden Werten mit aufsteigender oder abfallender Tendenz können ebenfalls als Außer-Kontroll-Situation gewertet werden und zum Verwerfen einer Analysenserie führen. In vorliegender Serie trat jedoch keines dieser Ereignisse ein, so dass davon ausgegangen werden kann, dass während der gesamten Messungen keine unzulässig hohen systematischen Fehler bei Anwendung der HPLC-Methode aufgetreten sind. Die aus der Präzision der Methode berechneten Kontrollgrenzen (richtiger Wert ± Dreifaches der Standardabweichung des Verfahrens) wurden nur an einem Messtag im oberen Konzentrationsbereich geringfügig überschritten ( Abb. 27 a). Die beiden anderen Qualitätskontrollproben dieser Serie lagen jedoch innerhalb der Grenzen, so dass die Ergebnisse dieses Messtages nicht verworfen werden mussten.


115

Abb. 27a-c: Qualitätsregelkarten zur Kontrolle von zeitabhängiger Präzision und Richtigkeit der Bestimmung von NAcPABA bei drei Konzentrationen: (a) 5 µM; (b) 10 µM; (c) 20 µM; ( __ Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit: Sollwert ± 20%; ....... Warngrenze: Sollwert ± zweifache Standardabweichung, berechnet aus den Einzelproben; ------ Kontrollgrenze: Sollwert ± dreifache Standardabweichung).


116

Tab. 37: Prozentuale Abweichung der Qualitätskontrollproben der HPLC-Bestimmung von NAcPABA vom Sollwert.

 

Anzahl der Qualitätsproben (n = 23)

Konzentration (µM NAcPABA)

Abweichung < ± 5%

Abweichung < ± 10%

Abweichung < ± 20%

5

15 (65,2%)

17 (73,9%)

22 (95,7%)

10

18 (78,3%)

19 (82,6%)

23 (100%)

20

21 (91,3%)

23 (100%)

-

Intraindividuelle versus interindividuelle Variabilität

In Untersuchungen von Ward et al. (1992) war die NAT1-Aktivität der Probanden (intraindividuelle Variabilität) über einen Zeitraum von zwei Jahren konstant. Zur Prüfung der intraindividuellen Variabilität in dieser Arbeit wurde innerhalb von vier Monaten die Reaktionsgeschwindigkeit im Hämolysat eines Probanden (Genotyp: NAT1*4/*10) jeweils mit 10, 20, 50 und 100 µM PABA bestimmt sowie Vmax ermittelt. Die intraindividuelle Variabilität lag bei srel = 11,9% ( = 21,9 pmol/min·µl, n = 7) für 100 µM PABA sowie srel = 11,7% ( = 28,2 pmol/min·µl) für Vmax. Damit wurde das Ergebnis o.g. Autoren bestätigt. Im Vergleich dazu lag die Variabilität der Reaktionsgeschwindigkeiten aller untersuchten Individuen mit dem Genotyp NAT1*4/*10 bei 21,6% ( = 26,1 pmol/min·µl). Es wird davon ausge-gangen, dass die intraindividuelle Variabilität der NAT1-Aktivität der Probanden der vorliegenden Studie keinen maßgeblichen Einfluss auf die interindividuellen Schwankungen der Enzymaktivität aller Probanden desselben Genotyps hat.

Phänotypisierung der Probanden: Ergebnisse und Diskussion

Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit. An die Optimierung und Validierung schloss sich die Phänotypisierung der Probanden an, wobei Inkubationsansätze mit 25 µl Hämolysat, 375 µl 0,1 M Triethanolamin-Puffer (pH 7,5 mit 4,5 mM DTT und 4,5 mM EDTA), 200 µl des Acetyl-CoA-regenerierenden Systems (siehe Kapitel 4.4.4 ) und 200 µl Substratlösung mit 10, 20, 50 und 100 µM PABA (Endkonzentrationen im Ansatz) verwendet wurden. Für jeden Probanden wurde pro Substratkonzentration eine Doppelbestimmung sowie die


117

Bestimmung zweier substratfreier Leeransätze („Leerwerte“) durchgeführt. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde in pmol NAcPABA pro min pro µl Hämolysat sowie in pmol NAcPABA pro min pro mg Hämoglobin ermittelt. Die interindividuellen Schwankungen im Hämoglobingehalt der Blutproben waren gering; srel des Hb-Gehaltes der 104 NAT1-aktiven Probanden lag bei 7,4%. Zusätzlich wurden in den Reaktionsansätzen die PABA-Konzentrationen bestimmt. Dies diente der Kontrolle des Substratverbrauchs, der möglichst unter 20% liegen sollte (Richterich und Colombo, 1978).

Abb. 28 zeigt die Verteilung der Reaktionsgeschwindigkeiten aller Individuen bei einer Substratkonzentration von 100 µM PABA. Es ist eine bimodale Verteilung der Reaktionsgeschwindigkeiten zu erkennen. Bei einen Antimode von 90 pmol/
min·mg Hb zeigten 16% der Probanden eine geringe Umsetzungsgeschwindigkeit von PABA. In einer vergleichenden Genotyp-Phänotyp-Studie von Butcher et al. (1998) mit Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen 5 und 20 nmol NAcPABA/
min·mg Protein bei einer Substratkonzentration von 440 µM PABA war bei etwa 8% aller Probanden (n = 85) die Reaktionsgeschwindigkeit im Vergleich zu den übrigen Individuen signifikant geringer. Diese Probanden waren heterozygote Träger entweder des NAT1*14- oder des NAT1*17-Allels. Eine derartige klare Trennung konnte bei den hier untersuchten Individuen nicht vorgenommen werden. Die Beziehungen zwischen Genotyp und Phänotyp der Probanden in vorliegender Studie werden im folgenden Kapitel 3.2.3 diskutiert.


118

Abb. 28: Häufigkeitsverteilung der NAT1-katalysierten Reaktionsgeschwindigkeit bei der N-Acetylierung von PABA (Substratkonzentration 100 µM, n = 104).

Bestimmung der enzymkinetischen Parameter. Für jeden Probanden wurden Vmax und Km der NAT1-katalysierten Acetylierung von PABA näherungsweise ermittelt. Nach grafischer Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeiten in Abhängigkeit von den jeweiligen Substratkonzentrationen wurde unter Verwendung des Computerprogrammes Origin® (siehe Kapitel 4.5 ) nach der Methode der kleinsten Abweichungsquadrate (Levenberg-Marquard-Algorithmus) eine hyperbolische Funktion mit der allgemeinen Gleichung y = P1 · x / (P2 + x) an


119

die Einzelwerte angepasst. Wegen y = v, x = s, P1 = Vmax, P2 = Km erfolgte die Ermittlung der enzymkinetischen Parameter aus der Funktionsgleichung. Abb. 29 zeigt beispielhaft die Abhängigkeit der PABA-Acetylierungsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration im Hämolysat eines Probanden.

Abb. 29: Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit bei der N-Acetylierung von PABA in Abhängigkeit von der Substratkonzentration im Hämolysat eines Probanden.

3.2.3 Vergleich und Diskussion der Ergebnisse der Geno- und Phäno-typisierung der Probanden hinsichtlich der Arylamin-N-Acetyltransferase 1

In Tab. 38 sind die Mediane und Spannweiten der Vmax- und Km- Werte in Bezug zu den Genotypen der Individuen dargestellt. Bezüglich der Km-Werte konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Genotypen gefunden werden. Angaben zu Km-Werten finden sich in bisherigen Studien zur funktionellen Relevanz der NAT1-Allele relativ selten. In Untersuchungen von Butcher et al.


120

(1998) lag der Km-Wert für einen homozygoten Träger des Wildtyp-Allels bei
186 µM PABA, für einen Probanden mit dem Genotyp NAT1*4/*14B bei 157 µM und für einen Probanden mit dem Genotyp NAT1*4/*17 bei 198 µM. Es war kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen drei Werten vorhanden.

Tab. 38: Mediane und Spannweiten (Range) der Vmax- und Km-Werte der untersuchten Probanden in Bezug zu ihrem Genotyp.

 

 

 

 

 


Genotyp


n

Vmax
(pmol NAcPABA/
min·µl Hämolysat)

Vmax
(pmol NAcPABA/
min·mg Hb)


K
m (µmol/l)

 

 

 

 

 

NAT1*3/*3

3

30.9 (27.7 - 32.7)

210.2 (165.9 - 215.1)

20.1 (19.3 - 45.8)

NAT1*4/*3

7

25.2 (20.2 - 34.0)

170.3 (122.8 - 196.5)

18.0 (15.9 - 22.1)

NAT1*10/*3

1

26.6

177.3

17.7

NAT1*4/*4

37

24.1 (12.4 - 34.4)

158.1 (81.0 - 227.8)

20.6 (8.2 - 49.7)

NAT1*4/*10

28

27.6 (13.1 - 34.2)

175.0 (85.8 - 255.2)

22.6 (9.4 - 48.0)

NAT1*10/*10

8

25.1 (22.8 - 28.6)

178.1 (152.0 - 196.8)

21.3 (17.4 - 34.4)

NAT1*4/*11

6

16.5 (14.7 - 21.8)

126.0 (95.5 - 142.5)

20.0 (12.7 - 26.3)

NAT1*10/*11

2

15.5 (13.7 - 17.2)

97.1 (87.3 - 106.8)

32.1 (28.9 - 35.3)

NAT1*11/*11

2

19.1 (17.8 - 20.3)

122.5 (111.3 - 133.6)

12.9 (11.8 - 13.9)

NAT1*4/*14A

7

10.7 (7.0 - 15.2)

72.3 (36.3 - 104.8)

25.9 (12.5 - 49.1)

NAT1*10/*14A

3

12.1 (8.8 - 15.2)

78.6 (62.4 - 89.4)

20.8 (16.5 - 49.2)

NAT1*15/*15

1

0

0

n.b.

Bezüglich Vmax ist auch mit Blick auf Abb. 30 ein schwacher Trend zu höheren Werten bei Trägern des NAT1*3-Allels sowie ein deutlicher Trend zu niedrigeren Vmax-Werten bei Trägern der Allele NAT1*11 und NAT1*14A erkennbar. Mit dem Mann-Whitney-U-Test wurde geprüft, ob die Unterschiede in den Vmax-Werten der Individuen jeweils zweier NAT1-Genotypen (NAT1*4/*4 versus NAT1*4/*10, NAT1*4/*4 versus NAT1*10/*10 usw.) signifikant sind (siehe Tab. 39 ).


121

Abb. 30: Vmax-Werte der hinsichtlich NAT1 phänotypisierten Probanden (n = 105).

Tab. 39: Statistischer Vergleich der Vmax-Werte (bezogen auf mg Hämoglobin) der NAT1-Genotypen (Mann-Whitney-U-Test).

 

NAT1

NAT1

*3/*3

*4/*3

*4/*4

*4/*10

*10/*10

*4/*11

*10/*11

*11/*11

*4/*14

*3/*3

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*4/*3

n.s.

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*4/*4

0.08

n.s.

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*4/*10

n.s.

n.s.

n.s.

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*10/*10

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*4/*11

0.02

n.s.

0.01

<0.01

<0.01

\|--\|

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*10/*11

0.08

0.04

0.03

0.04

0.04

0.10

\|--\|

\|--\|

\|--\|

*11/*11

0.08

n.s.

0.10

0.07

<0.01

n.s.

n.s.

\|--\|

\|--\|

*4/*14

0.02

<0.01

<0.01

<0.01

<0.01

<0.01

0.08

0.04

\|--\|

*10/*14

0.05

0.02

<0.01

0.01

0.01

0.02

n.s.

n.s.

n.s.


122

Im folgenden sollen die Ergebnisse der Geno- und Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich NAT1 im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Studien diskutiert werden.

NAT1*3-Allel. In vorliegenden Untersuchungen wurden drei homozygote sowie acht heterozygote Träger des NAT1*3-Allels phänotypisiert. Die Mediane der maximalen Reaktionsgeschwindigkeiten (siehe Tab. 38 ) lagen höher als bei den homozygoten Trägern des Wildtyp-Allels. Es war ein monotoner Trend einer ansteigenden Reaktionsgeschwindigkeit von NAT1*4/*4- über NAT1*3/*4- zu NAT1*3/*3-Probanden zu verzeichnen. Zwischen den Probanden mit den Genotypen NAT1*4/*4 und NAT1*3/*3 konnte hinsichtlich Vmax ein statistisch signifikanter Unterschied (p = 0,08) gefunden werden. Außerdem wurden die Vmax-Werte aller Träger mindestens eines NAT1*3-Allels (n = 11) mit den Vmax-Werten der homozygoten Träger des Wildtyp-Allels (n = 37) verglichen (Mann-Whitney-U-Test). Es ergab sich ein Unterschied an der Grenze zur Signifikanz (p = 0,11).

Die Punktmutation C1095A im NAT1*3-Allel befindet sich sowohl außerhalb der kodierenden Region als auch des mRNA-Polyadenylierungssignals. Aus der Literatur sind keine Untersuchungen zur funktionellen Relevanz dieser Mutation bekannt. Es wird eine vergleichbare NAT1-Aktivität bei Individuen mit den Genotypen NAT1*3/*3, NAT1*3/*4 und NAT1*4*/*4 angenommen (Bouchardy et al., 1998). Ob das von NAT1*3 kodierte Enzym, wie hier in einer sehr kleinen Stichprobe gezeigt, tatsächlich eine erhöhte Acetylierungskapazität besitzt, bleibt in weiteren Untersuchungen zu klären.

NAT1*4-Allel. In vorliegender Studie besaßen 37 Probanden den NAT1*4/*4-Genotyp. Die Spannweite der Vmax-Werte der homozygoten Träger des NAT1*4-Allels ist relativ groß (siehe Tab. 38 ). Ähnliche Befunde wurden auch von anderen Autoren erhalten. In einer Studie von Payton und Sim (1998) mit 18 NAT1*4/*4-Probanden lag die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Umsetzung von PABA in Erythrozyten des aktivsten Probanden ca. beim 2,5fachen der Aktivität des am geringsten aktiven. Die Ursachen dafür müssen in weiterführende Studien geklärt werden.


123

Es könnte auch ein Zusammenhang zwischen dem Folsäuregehalt der Blutproben und der NAT1-Aktivität bestehen. Ward et al. (1995) wiesen mit in E. coli exprimierter humaner NAT1 eine kompetitive Hemmung der Umsetzung von PABA durch Folsäure nach. Der Folsäuregehalt der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Blutproben war nicht bekannt.

NAT1*10-Allel. Bei vorliegenden Untersuchungen konnte zwischen Individuen mit den Genotypen NAT1*4/*4, NAT1*4/*10 und NAT1*10/*10 kein signifikanter Unterschied in der Acetylierungsgeschwindigkeit von PABA gefunden werden ( Tab. 39 ). Im speziellen wurde kein Trend einer ansteigenden Reaktions-geschwindigkeit von NAT1*4/*4 über NAT1*4/*10 zu NAT1*10/*10 festgestellt ( Tab. 38 ).

Die Punktmutationen in der nichtkodierenden 3’-Region des NAT1*10-Allels (T1088A, C1095A) haben keinen Aminosäureaustausch im Enzym zur Folge. Dennoch wurde in einigen Studien bei Trägern mindestens eines NAT1*10-Allels eine höhere Aktivität beobachtet. Die Ursache dafür wird darin gesehen, dass durch die Mutation T1088A im Polyadenylierungssignal der mRNA (AATAAA, Nukleotide 1086-1091) eine Verschiebung desselben in Richtung des 5’-Endes der DNA stattfindet, d.h. ein neues Polyadenylierungssignal zwischen den Nukleotiden 1083-1088 entsteht. Dies könnte zur Bildung einer stabileren mRNA und zur verstärkten Synthese von NAT1 führen (Badawi et al., 1995, Fukutome et al., 1999). Diese Hypothese konnte durch Untersuchungen von de Leon et al. (2000) nicht gestützt werden. Die Autoren fanden keine Unterschiede in der Sekundärstruktur der pre-mRNA von NAT1 4 und NAT1 10 sowie keinen Unterschied im Gehalt von NAT1 4- und NAT1 10-Protein nach Expression in COS-1-Zellen.

Badawi et al. (1995) bestimmten die NAT1-Aktivität mit PABA als Substrat im Zytosol der Blasenschleimhautzellen von 26 Probanden. Sie lag im Bereich zwischen 1,0 und 8,2 nmol NAcPABA/min·mg Protein. Beim Vergleich von 17 Individuen mit dem Genotyp NAT1*4/*4 und acht Individuen mit dem Genotyp NAT1*4/*10 hatte letztere Gruppe eine signifikant höhere Acetylierungskapazität (p = 0,026). In einer Studie zur NAT1-Aktivität in Dickdarmgewebe von Bell et al.


124

(1995a) wurden ähnliche Befunde erzielt. Die Aktivität lag zwischen 1,0 und ca. 50 nmol NAcPABA/min·mg Protein und war bei den 11 NAT1*4/*10-Individuen signifikant höher als bei den acht NAT1*4/*4-Individuen. Verglichen mit den Daten in vorliegender Arbeit ist die Aussagekraft der Studien von Badawi
et al. und Bell et al. aufgrund der niedrigeren Probandenzahl geringer. Im Gegensatz zu den hier verwendeten relativ homogenen Blutproben kann die Zahl der Epithelialzellen in den Biopsien aus Blasen- und Dickdarmschleimhaut stark schwanken, so dass Unterschiede in der NAT1-Aktivität der Individuen auch durch diese Schwankungen erklärbar sind. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die Mutationen im NAT1*10 in verschiedenen Geweben unterschiedliche Konsequenzen aufgrund gewebeabhängiger Unterschiede in Transkriptionsfaktoren oder RNA-abbauenden Enzymen besitzen.

In einigen anderen Studien dagegen fand man zwischen NAT1*4/*4-, NAT1*4/*10-und NAT1*10/*10-Probanden keine signifikanten Unterschiede in der Acetylierung NAT1-spezifischer Substrate. Payton and Sim (1998) veröffentlichten eine Studie zur NAT1-Aktivität mit PABA als Substrat in Erythrozyten, in der keine signifikanten Unterschiede zwischen 18 NAT1*4/*4 und zehn NAT1*4/*10-Individuen gefunden werden konnten. Hughes et al. (1998) verglichen in einer Studie den Quotienten aus acetylierter PAS und PAS im Urin von 144 Probanden mit deren Genotyp. Der Quotient NAcPAS/PAS spiegelt dabei wahrscheinlich der Ausmaß der NAT1-Expression in der Leber wider. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen NAT1*4/*4-, NAT1*4/*10- und NAT1*10/*10-Individuen festgestellt werden.

NAT1*11-Allel. Im Hämolysat aller Träger des NAT1*11-Allels war bei vorliegenden Untersuchungen eine Tendenz zu geringeren maximalen Reaktions-geschwindigkeiten bei der Umsetzung von PABA zu beobachten. Der statistische Vergleich mit den homozygoten Trägern des Wildtyp-Allels ergab einen Unterschied an der Grenze zur Signifikanz (p = 0,10) zu den zwei homozygoten Trägern von NAT1*11 sowie signifikante Unterschiede zu den acht heterozygoten Trägern des Allels (p = 0,01, p = 0,03, siehe Tab. 39 ). Wegen der relativ geringen Zahl von Individuen mit NAT1*11-Allel wurden zusätzlich die Vmax-Werte aller Träger mindestens eines NAT1*11-Allels (n = 10) mit den Vmax-Werten der


125

homozygoten Träger des Wildtyp-Allels (n = 37) verglichen. Es ergab sich ein hochsignifikanter Unterschied (p < 0,001). Weitere statistisch signifikante Unterschiede bestehen zu Individuen mit NAT1*3- und NAT1*10-Allelen (siehe Tab. 39 ). Vergleicht man die Mediane der Vmax-Werte der Individuen mit NAT1*11-Allel mit dem des Wildtyp-Allels, ergibt sich eine Verringerung der maximalen Geschwindigkeit der N-Acetylierung von PABA (in pmol/min·mg Hb) um 22,5% für NAT1*11/*11-Individuen, um 38,6% für NAT1*10/*11- und um 20,3% für NAT1*4/*11-Individuen. Diese Ergebnisse entsprechen nicht der Erwartung, wonach die Reaktionsgeschwindigkeit für homozygote Träger des mutierten Allels am stärksten verringert sein sollte. Weitere Untersuchungen mit größeren Stichproben sind notwendig.

Das NAT1*11-Allel kodiert ein Enzym mit veränderter Aminosäuresequenz. Im Vergleich zu NAT1 4 besitzt NAT1 11 in Position 149 Isoleucin anstelle Valin (bedingt durch die Mutation G445A) und in Position 214 Alanin anstelle Serin (bedingt durch die Mutation T640G). Nach den aktuellen Nomenklatur-empfehlungen ( Tab. 10 ) wird derzeit zwischen den Allelen NAT1*11A und NAT1*11B unterschieden. Die Mutation C1095A ist bei NAT1*11B im Gegensatz zu NAT1*11A nicht vorhanden. Andere Autoren unterscheiden die beiden Allele nach dem Vorhandensein der Mutation G445A (Doll et al., 1997, Johnson and Sim, 2000). Bis zur endgültigen Klärung der Nomenklatur wurden die entsprechenden Allele der hier untersuchten Probanden einheitlich mit NAT1*11 bezeichnet.

Erste Struktur-Funktions-Untersuchungen der NAT1 lassen vermuten, dass das aktive Zentrum des Enzyms in der Region zwischen den Aminosäuren 47 und 111 liegt. Für die Region zwischen den Aminosäuren 112 und 210 konnte eine Bedeutung für die Affinität von NAT1 zum Substrat p-Aminosalicylsäure nachgewiesen werden (Dupret et al., 1994). Falls dieser Befund auch auf andere Substrate übertragbar wäre, könnten Veränderungen in der Aminosäuresequenz dieser Region, wie bei NAT1*11 vorliegend, einen Einfluss auf die Affinität zwischen Enzym und Substrat und damit den Km-Wert haben. Ein statistischer Vergleich der Km-Werte aller Individuen mit dem Genotyp NAT1*4/*4 mit den Km-Werten aller Individuen mit mindestens einem NAT1*11-Allel ergab jedoch keinen signifikanten Unterschied (Mann-Whitney-U-Test).


126

Bisherige Untersuchungen zur funktionellen Relevanz der NAT1*11-Mutationen erbrachten differenzierte Ergebnisse; Berechnungen enzymkinetischer Parameter wurden von anderen Autoren bisher nicht durchgeführt. Payton and Sim (1998) beobachteten im Erythrozytenlysat eines NAT1*4/*11-Probanden bei Verwendung von PABA als Substrat eine deutlich geringere NAT1-Aktivität verglichen mit
18 NAT1*4/*4- und zehn NAT1*4/*10-Individuen Die mittlere NAT1-katalysierte Umsetzung von PABA (7,6 nmol NAcPABA/min·µmol Hb) aller Individuen (n = 35) einer Studie von Risch et al. (1996) war etwa doppelt so groß wie die eines einzelnen Individuums mit dem NAT1*4/*11Genotyp. In vitro-Studien mit rekombinantem humanem NAT1-Protein, exprimiert in E. coli, zeigten eine geringere Aktivität des Genprodukts des NAT1*11-Alleles (914 nmol/min·U) im Vergleich mit dem Genprodukt des Wildtyp-Allels (968 nmol/min·U), allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant (Hughes et al., 1998). Im Gegensatz dazu war in einer Studie von Doll et al. (1997) die N-Acetylierung von PABA, PAS, Benzidin, 2-Aminofluoren, 4-Aminobiphenyl und ß-Naphtylamin durch ein rekombinantes humanes NAT1 11-Enzym (E. coli) durchschnittlich um das 1,6fache höher als bei dem rekombinanten NAT1 4. Die O-Acetylierung von N-Hydroxy-2-Aminofluoren und die N,O-Acetylierung von N-Hydroxy-2-Acetylaminofluoren waren in dieser Studie bei NAT1 11 im Vergleich zu NAT1 4 ebenfalls signifikant erhöht. De Leon et al. (2000) fanden keine funktionellen Unterschiede zwischen rekombinantem humanen NAT1 4 und NAT1 11 bei Verwendung von PAS als Substrat.

NAT1*14-Allel. Bezüglich der maximalen Reaktionsgeschwindigkeiten bei der
N-Acetylierung von PABA bestand bei den hier untersuchten sieben Individuen mit dem Genotyp NAT1*4/*14 und den drei Individuen mit dem Genotyp NAT1*10/*14 im Vergleich zu den NAT1*4/*4-Probanden jeweils ein hochsignifikanter Unterschied (p < 0,01). Auch zu Individuen mit den Genotypen NAT1*3/*3, -*3/*4,
-*4/*10, -*10/*10 und -*4/*11 wurden signifikante Unterschiede ermittelt (siehe Tab. 39 ). Ein Vergleich der Mediane der Vmax-Werte (in pmol/min·mg Hb) ergab eine Verringerung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit für NAT1*4/*14-Individuen um 54,3% und für NAT1*10/*14-Individuen um 50,3% im Vergleich zu homozygoten Trägern des Wildtyp-Allels.


127

Nach den derzeit gültigen Nomenklatur-Empfehlungen für NAT1-Allele ( Tab. 10 ) wird zwischen dem Allel NAT1*14B mit der Mutation G560A und dem Allel NAT1*14A mit den zusätzlichen Mutationen T1088A und C1095A unterschieden. G560A ist die Ursache für einen Aminosäureaustausch in Position 187 des Enzyms, wobei Arginin durch Glutamin ersetzt ist. Diese Veränderung liegt außerhalb des vermuteten aktiven Zentrums des Enzyms (siehe oben). Dupret et al. (1994) fanden jedoch eine Bedeutung der Region zwischen den Aminosäuren 112 und 210 für die Affinität von NAT1 zum Substrat p-Aminosalicylsäure. Wenn dieser Befund auch auf andere Substrate übertragbar wäre, könnte der Arginin-Glutamin-Austausch in NAT1 14 in Position 187 zu einer Veränderung des entsprechenden Km-Wertes führen. Beim statistischen Vergleich der Km-Werte aller Individuen dieser Studie mit einem NAT1*14-Allel mit den Km-Werten der homozygoten Träger des Wildtyp-Allels konnte jedoch kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (Mann-Whitney-U-Test).

Zur funktionellen Relevanz der Mutationen im NAT1*14-Allel liegen derzeit nur wenige Daten vor. Butcher et al. (1998) bestimmten die NAT1-Aktivität mit PABA als Substrat in Leukozyten von 85 Individuen, drei von ihnen besaßen den NAT1*4/*14-Genotyp. Deren mittlere Vmax-Werte (9,1 nmol NAcPABA/min·mg Protein) waren signifikant niedriger als die mittleren Vmax-Werte der homozygoten Träger des Wildtyp-Allels (19,7 nmol NAcPABA/min·mg Protein, n = 78). Diese Reduktion der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit bei den NAT1*4/*14-Individuen im Vergleich mit den NAT1*4/*4-Individuen beträgt 53,8% und steht damit in Übereinstimmung mit den Ergebnissen vorliegender Studie. In der Studie von Payton and Sim (1998) besaß der Proband mit dem NAT1*4/*14-Genotyp ebenfalls eine deutlich verringerte NAT1-Aktivität im Vergleich zu 18 NAT1*4/*4- und zehn NAT1*4/*10-Probanden. Bei in vitro-Studien mit rekombinantem humanem NAT1-Protein, exprimiert in E. coli, war beim Genprodukt des NAT1*14-Allels nur etwa ein Viertel der Aktivität des Genprodukts des Wildtyp-Allels messbar (Hughes et al., 1998)

NAT1*15-Allel. Im Hämolysat des homozygoten NAT1*15-Individuums war kein Substratumsatz messbar. Das völlige Fehlen der NAT1 15-Aktivität als Folge einer


128

Synthese eines verkürzten, funktionslosen Proteins konnte im Rahmen dieser Arbeit in humanem Gewebe erstmalig nachgewiesen werden.

Die Mutation C559T in der proteinkodierenden Region des NAT1*15-Allels führt zu einem Stopkodon in Position 187 und damit zur Synthese eines im C-Terminus um 103 Aminosäuren verkürzten Proteins. Obwohl damit das vermutete aktive Zentrum von NAT1 zwischen den Aminosäuren 47 - 111 erhalten bleibt, weist das verkürzte Protein keine enzymatische Aktivität auf.

Hughes et al. (1998) testeten die NAT1-Aktivität im Gesamtblut-Lysat von 20 Individuen mit PAS als Substrat. Der Vmax-Wert des Probanden mit dem NAT1*14/*15-Genotyp (0,26 nmol NAcPAS/min·ml Lysat) was 93mal geringer als die mittleren Werte der übrigen 19 Probanden, die Träger der Allele NAT1*4, NAT1*10 und NAT1*11 waren. In einem rekombinanten humanen NAT1*15-Protein (E. coli) konnte keine NAT1-Aktivität nachgewiesen werden.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Anwesenheit mindestens eines NAT1*3-Alleles bei Individuen der vorliegenden Studie mit einer leicht erhöhten Geschwindigkeit der N-Acetylierung von PABA verbunden war. Wegen der relativ geringen Zahl von Probanden sind jedoch weitere Untersuchungen zur Klärung der funktionellen Relevanz der Mutation C1095A mit größeren Stichproben und anderen Substraten notwendig. Bei vorliegenden Untersuchungen konnte zwischen homozygoten NAT1*4-Probanden und Individuen mit den Genotypen NAT1*4/*10 und NAT1*10/*10 kein signifikanter Unterschied in der Acetylierungsgeschwindigkeit von PABA gefunden werden. Die Allele NAT1*11 und NAT1*14 weisen Mutationen in der kodierenden und nichtkodierenden Region des NA1-Gens auf. Der mutationsbedingte Valin/Isoleucin-Aminosäure-Austausch in Position 149 und der Serin/Alanin-Austausch in Position 214 (NAT1 11) bewirkten eine intermediäre Verringerung von Vmax. Der Aminosäure-Austausch Arginin/Glutamin in Position 187 bedingt durch die Mutation G560A des NAT1*14-Allels führte im Hämolysat der entsprechenden Probanden zu einer starken Verringerung der Acetylierungsgeschwindigkeit verglichen mit Trägern der Allele NAT1*3, *4, *10 und *11. Das in Position 187 verkürzte Protein NAT1 15 ist inaktiv; eine N-Acetylierung von PABA war nicht messbar.


129

Auf Grundlage der Ergebnisse der Phänotypisierung wurden bei den Individuen dieser Studie vier NAT1-Phänotypen unterschieden: der hoch aktive, der intermediär aktive, der gering aktive und der defiziente Phänotyp (siehe Tab. 40 ).

Tab. 40: Postulierte Phänotypen aller Individuen dieser Studie (n = 314). Klassifizierung auf Grundlage der Phänotypisierung der Probanden, wobei nur ausgewählte Individuen der angegebenen Genotypen untersucht worden waren. NAT1*4/*15 in Klammern, da kein Proband dieses Genotyps phänotypisiert wurde.

Phänotyp

Häufigkeit (%)

Genotypen

hoch aktiv

5,1

NAT1*3/*3, NAT1*4/*3, NAT1*10/*3

intermediär aktiv

83,8

NAT1*4/*4, NAT1*4/*10, NAT1*10/*10

gering aktiv

10,8

NAT1*4/*11, NAT1*10/*11, NAT1*11/*11
NAT1*4/*14, NAT1*10/*14,
(NAT1*4/*15)

defizient

0,3

NAT1*15/*15

Individuen mit mindestens einem NAT1*3-Allel wurden aufgrund der vorliegenden Ergebnisse dem hoch aktiven Phänotyp zugeordnet, wobei berücksichtigt werden muss, dass der Stichprobenumfang gering war und im statistischen Vergleich der Vmax-Werte nur zwischen NAT1*3/*3 und NAT1*4/*4 ein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte. Es war jedoch ein monotoner Trend einer ansteigenden Acetylierungsgeschwindigkeit von NAT1*4/*4- über NAT1*3/*4- zu NAT1*3/*3-Individuen zu erkennen. Dem intermediär aktiven Phänotyp wurden Träger der Allele NAT1*4 und NAT1*10 zugeordnet. Zum gering aktiven Phänotyp wurden Individuen mit mindestens einem NAT1*11- oder NAT1*14-Allel gerechnet. Der homozygote Träger des NAT1*15-Allels war phänotypisch defizient.

Nach den bisher vorliegenden Erkenntnissen zur funktionellen Relevanz von NAT1-Allelen (vgl. Tab. 12 ) könnten weitere Genotypen den Phänotypen in
Tab. 40 zugeordnet werden. Zu einem hoch aktiven Phänotyp könnte das Vorhandensein der relativ seltenen Allele NAT1*21, NAT1*24 und NAT1*25 führen. In Untersuchungen von Lin et al. (1998) besaßen die in E. coli exprimierten entsprechenden Enzyme eine 2-3fach höhere Aktivität im Vergleich zu NAT1 4. Einen gering aktiven Phänotyp besitzen nach bisherigen Erkenntnissen


130

möglicherweise Träger der Allele NAT1*16 und NAT1*17. Obwohl die Mutationen in NAT1*16 keinen Aminosäureaustausch im Enzym zur Folge haben, führten die Veränderungen in der 3’-UTR-Region des Gens (AAA-Insertion nach dem Nukleotid 1091, C1095A) in Untersuchungen von de Leon et al. (2000) sowohl zur verringerten Acetylierungskapazität als auch zu einem um die Hälfte verringerten Proteingehalt von NAT1 16 in COS-1-Zellen. Bei NAT1*17 ist die verringerte Aktivität wahrscheinlich auf den Aminosäureaustausch (Arg64Trp) im postulierten aktiven Zentrum des Enzyms zurückzuführen. Delomenie et al. (1994) hatten gezeigt, dass diese Aminosäure essentiell für die katalytische Funktion von NAT1 ist. Im Hämolysat von vier Individuen mit dem Genotyp NAT1*4/*17 in einer Studie von Butcher et al. (1998) konnte nur eine sehr geringe Umsetzung von PABA festgestellt werden. In Untersuchungen von Lin et al. (1998) war keine Umsetzung von PAS durch das in E. coli exprimierte humane Enzym NAT1 17 messbar. Zur funktionellen Relevanz des Asparagin-Valin-Aminosäureaustauschs in Position 251 bei NAT1*22 liegen bisher kaum Erkenntnisse vor. In Untersuchungen von Lin et al. (1998) war keine Umsetzung von PAS durch das in E. coli exprimierte Enzym NAT1 22 messbar. Die Bedeutung der Mutation C97T in NAT1*19 für die Enzymfunktion wurde bisher noch nicht untersucht. Es könnte sich um ein funktionsloses Protein handeln, da es bedingt durch ein Stopkodon in Position 33 extrem verkürzt vorliegt. Das homozygote Vorliegen von NAT1*19 und NAT1*22 im Genotyp würde demnach zum defizienten Phänotyp führen.


131

3.2.4 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick

Diskussion der Methodik von Genotypisierung und Phänotypisierung

Bedingt durch die immer weiter Vervollkommnung der PCR-Technik lässt sich mittels Genotypisierung mit einer geringen Menge an Untersuchungsmaterial schnell und präzise der Genotyp eines Individuums hinsichtlich eines polymorphen Enzyms bestimmen. Bei Kenntnis der funktionellen Relevanz der Allele kann auf diese Weise die individuelle Metabolisierungsgeschwindigkeit eines Substrats abgeschätzt werden. Bei genetischen Polymorphismen arzneistoffmeta-bolisierender Enzyme könnte die Anwendung kommerziell erhältlicher Genotypisierungstests vor Beginn einer Pharmakotherapie eine individuelle Dosisanpassung ermöglichen. Ein Nachteil der Genotypisierung besteht darin, dass noch unbekannte Mutationen mit etablierten PCR-Methoden nicht erkannt werden und gegebenenfalls eine falscher Genotyp zugeordnet wird.

Wie in vorliegender Arbeit gezeigt werden konnte, erlaubt die Phänotypisierung
ex vivo bei Anwendung moderner, automatisierbarer Verfahren wie beispielsweise der HPLC mit geringem Aufwand eine Charakterisierung der tatsächlichen Enzymfunktion. Die Aktivität des Enzyms kann durch Induktion oder Hemmung gegenüber der nach Genotypisierung abgeschätzten Aktivität verändert sein. Derartige Einflüsse auf die Enzymfunktion können nur durch Phänotypisierung des Probanden oder Patienten erkannt werden. Beispielsweise war in einer Studie von Warholm et al. (1995) im Hämolysat von zwei Probanden auch nach wiederholter Analyse trotz des Vorhandenseins mindestens eines GSTT1*A-Allels keine Enzymaktivität nachweisbar. Die kombinierte Anwendung von Genotypisierung und Phänotypisierung erlaubt die höchste Sicherheit bei der Abschätzung der Metabolisierungskapazität eines Individuums hinsichtlich eines spezifischen Substrats.

Konsequenzen der genetischen Polymorphismen von GSTT1-1 und NAT1 für die Probanden dieser Studie

Verglichen mit anderen Biotransformationsenzymen wie beispielsweise CYP2D6, das an der Biotransformation einer großen Zahl von Arzneimitteln beteiligt ist, hat


132

der genetische Polymorphismus von GSTT1-1 und NAT1 für die Pharmakotherapie nach bisherigen Erkenntnissen nur eine geringe Bedeutung. Beide Enzyme sind jedoch an der Entgiftung und metabolischen Aktivierung von Karzinogenen beteiligt. Daher kann sich eine diesbezügliche Exposition bedingt zum Beispiel durch bestimmte Lebens- und Ernährungsgewohnheiten oder ein entsprechendes berufliches Umfeld auf ein Individuum in Abhängigkeit von seinem GSTT1- bzw. NAT1- Genotyp unterschiedlich auswirken.

Konsequenzen des GSTT1-1-Polymorphismus. Wie in Kapitel 2.1.4 ausführlich dargestellt, werden die pathophysiologischen und toxikologischen Konsequenzen des GSTT1-1-Polymorphismus derzeit teilweise kontrovers diskutiert. Übereinstimmung besteht jedoch in der Auffassung, dass die ohnehin als negativ bekannten Effekte des Rauchens auf den menschlichen Organismus durch eine GSTT1-Gendefizienz noch verstärkt werden könnten. Es wurde nachgewiesen, dass Ethylenoxid, ein Bestandteil des Zigarettenrauchs, SCEs und HEV erzeugt und dass deren Zahl bei enzymdefizienten Rauchern im Vergleich zu enzymdefizienten Nichtrauchern signifikant erhöht ist (Hallier et al., 1993, Schröder et al., 1995, Müller et al., 1998, Thier et al., 1999b). Überraschend sind in diesem Zusammenhang die Ergebnisse einer Studie von Li et al. (2000), wonach das KHK-Risiko für GSTT1-1-aktive Raucher erhöht war. Bei der komplexen Pathogenese der KHK spielen jedoch möglicherweise andere Einflussfaktoren eine größere Rolle. Es ist zudem nicht erwiesen, dass die Entgiftung potentieller Karzinogene aus dem Zigarettenrauch überwiegend von GSTs vermittelt wird (Strange and Fryer, 1999). Zum Risiko einer beruflich bedingten Exposition mit halogenierten Kohlenwasserstoffen wie beispielsweise Dichlormethan lassen die bisherigen Erkenntnisse keine eindeutigen Schlussfolgerungen zu.

Konsequenzen des NAT1-Polymorphismus. Neben Ethylenoxid und halogenierten Kohlenwasserstoffen enthält Zigarettenrauch verschiedene aromatische und heterozyklische Amine wie 4-Aminobiphenyl, ß-Naphtylamin, IQ und PhIP. Das Zusammenwirken von CYP1A2, PHS und NATs bei der Biotransformation dieser Substanzen kann zur Bildung von Arylnitrenium-Ionen führen, die DNA-Addukte bilden. Hein et al. (1993) konnten nachweisen, dass der


133

N,O-Acetyltransfer bei N-Hydroxy-4-acetyl-aminobiphenyl überwiegend von NAT1 katalysiert wird. Auch bestimmten Ernährungsgewohnheiten wie der häufige Verzehr von gekochtem Fleisch oder Fisch wird als ein Risikofaktor für genetische Schäden betrachtet, da aus den durch die Zubereitung gebildeten heterozyklischen Aminen wie PhIP, MelQ, MelQx, Glu-P2 und IQ ebenfalls Arylnitrenium-Ionen gebildet werden können.

In vorliegender Studie wies der homozygote Träger des NAT1*15-Allels eine Enzymdefizienz auf. Auch homozygote Träger der Allele NAT1*19 und NAT1*22 besitzen vermutlich einen defizienten Phänotyp, was in weiteren Studien zu bestätigen wäre. Die normaldosierte Verabreichung von Arzneimitteln wie PAS oder Sulfamethoxazol kann für einen NAT1-defizienten Patienten toxikologische Konsequenzen haben. Die größte Bedeutung bei der Elimination von Sulfonamiden besitzt die N-Acetylierung und anschließender Ausscheidung über die Niere. Ein weiterer Biotransformationsweg, die N-Oxidation von Sulfamethoxazol durch Cytochrom P450-Isoenzyme, führt zu N-Hydroxylaminen, die in toxische Nitroso-Metaboliten umgewandelt werden (Rieder et al., 1995). Diese Metaboliten sind wahrscheinlich für hypersensible Reaktionen wie Hautrötung, Erythembildung und Fieber während einer Sulfonamid-Therapie verantwortlich. Bei NAT1-enzymdefizienten Individuen dürften diese Symptome in äußerst verstärkter Form auftreten, da der Entgiftungsweg über die N-Acetylierung nicht vorhanden ist.

Konsequenzen verschiedener GSTT1-NAT1-Kombinationen. Im Rahmen vorliegender Arbeit wurden aus einem Gesamtkollektiv von 314 Probanden 140 Individuen hinsichtlich GSTT1-1 und 105 hinsichtlich NAT1 phänotypisiert. In
Tab. 41 findet sich eine Zusammenstellung derjenigen Probanden, bei denen beide Phänotypisierungen durchgeführt wurden. Die Kombination des enzymdefizienten GSTT1-1-Phänotyps mit dem hoch aktiven NAT1-Phänotyp in einem Individuum würde bei bestimmten Lebens- und Ernährungsgewohnheiten (Rauchen und häufiger Verzehr von gekochtem oder gegrillten Fleisch) nach bisherigen Erkenntnissen zu einem höheren Risiko für genetische Schädigungen führen.


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Falls in weiteren Untersuchungen bestätigt wird, dass Träger mindestens eines NAT1*3-Allels dem hoch aktiven Phänotyp zugeordnet werden können, besteht für den Probanden mit der Kombination NAT1*3/*4/GSTT1*0/0 ein erhöhtes Risiko. Für die in Tab. 41 ebenfalls grau unterlegten Probanden wäre unter o.g. Voraussetzungen das Risiko intermediär erhöht.

Tab. 41: Genotypen und Phänotypen der 48 Probanden, die im Rahmen dieser Arbeit hinsichtlich NAT1 und GSTT1-1 phänotypisiert wurden.

Ausblick

Die Erforschung des genetischen Polymorphismus der humanen Biotransformationsenzyme GSTT1-1 und NAT1 steht noch am Anfang; es ist zu erwarten, dass in den nächsten Jahren zahlreiche weitere NAT1-Allele identifiziert bzw. die Unklarheiten bezüglich der Struktur der bereits bekannten (z. B. NAT1*11) beseitigt werden. Es ist nicht auszuschließen, dass auch von GSTT1 weitere Allelvarianten existieren. Bisher sind Punktmutationen in den Genen von GST-Isoenzymen nur bei GSTM1 identifiziert worden (Hayes et al., 1989).

Bezüglich der phänotypischen Konsequenzen der GSTT1- und NAT1-Genotypen sind die Ergebnisse bisheriger Studien teilweise widersprüchlich. Die kombinierte Anwendung von Genotypisierung und Phänotypisierung, wie in vorliegender Arbeit realisiert, ermöglicht eine besonders sichere Aussage zur Metabolisierungs-kapazität eines Individuums hinsichtlich eines Substrats.

Ein großes Interesse besteht an der Erforschung des Einflusses der genetischen Polymorphismen von GSTT1-1 und NAT1 auf das individuelle Krebsrisiko eines Individuums. Es muss jedoch stets in Betracht gezogen werden, dass bei der


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Entgiftung bzw. metabolischen Aktivierung von potentiellen Karzinogenen zahlreiche andere Enzyme mit GSTT1-1 und NAT1 interagieren. Es wird daher empfohlen, in epidemiologischen Studien den Einfluss der Polymorphismen von Glutathion-S-Transferasen, Cytochrom P450-Isoenzymen und Arylamin-N-Acetyltransferasen auf die Empfindlichkeit eines Individuums gegenüber einer Erkrankung simultan zu erfassen (Strange and Fryer, 1999).


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Fri Jun 8 12:39:32 2001