136

Kapitel 4. Experimenteller Teil

4.1 Gewinnung des Untersuchungsmaterials

Für die vorliegenden Untersuchungen standen die Blutproben von insgesamt 314 gesunden, freiwilligen Probanden im Alter zwischen 19 und 48 Jahren zur Verfügung. 284 Individuen waren männlich, 30 weiblich. Ihre schriftliche Einverständniserklärung lag vor. Alle Probanden wurden hinsichtlich NAT1, 300 zufällig ausgewählte Individuen (270 männliche, 30 weibliche) hinsichtlich GSTT1 genotypisiert. Zur Phänotypisierung hinsichtlich GSTT1-1 wurden von den 300 genotypisierten Individuen 140 (136 männlich, 4 weiblich) zufällig ausgewählt. Zur Phänotypisierung hinsichtlich NAT1 erfolgte eine gezielte Auswahl von 105 ausschließlich männlichen Probanden. Es handelt sich dabei einerseits um solche mit den selteneren NAT1-Genotypen und andererseits um eine repräsentative Zahl von Individuen mit dem NAT1*4/*4- bzw. NAT1*4/*10-Genotyp. Die Entnahme des Blutes erfolgte nach Venenpunktion in Röhrchen mit EDTA-beschichteten Polystyrolkügelchen (Monovetten^®). Die Proben wurden bei -80°C gelagert.

4.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Die Monovetten^® zur Blutentnahme stammen von der Firma Sarstedt. Alle anderen Verbrauchsmaterialien wie PCR-Gefäße, Einmal-Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße verschiedener Volumina u.a. wurden von den Firmen Eppendorf, Biozym und Falcon bezogen. Die verwendeten Geräte sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

137

Gerät	Hersteller
Thermocycler GeneAmp PCR System 9600 und 9700	Perkin Elmer/Applied Systems
Flachbett-Elektrophoresekammern und Elektrophorese-Spannungsgeräte	Pharmacia, Biorad, Hoefer
diverse Gefriertruhen	Foron, GFL Burgwedel
diverse Waagen	Sartorius
diverse Pipetten	Eppendorf
pH-Messgerät	WTW, Weilheim
Dosierspritze	Hamilton
Thermomixer 5437	Eppendorf
Minishaker MS1	IKA Jahnke & Kunkel
Ultraschallbad Sonorex RK 1000	Bandelin electronics, Berlin
Temperierbad TS 2	IKA Jahnke & Kunkel
Ultraschallstab Sonoplus UW 70	Bandelin electronics, Berlin
Kühlzentrifuge Hermle ZK 380	Hermle, Gosheim
Micro-Zentrifuge 5415 C	Eppendorf
UV-VIS-Spektrofotometer UV 2101 PC	Shimadzu
HPLC-Anlage: Lichrograph 6200 A Gradienten-Pumpe, L-4500 Diodenarray-Detektor, Autosampler AS 2000 A	Merck/Hitachi
HPLC-Säule RP 18, 250 x 4,6 mm, 5 µm Hypersil™, RP-18-Vorsäulen	Shandon

138

4.3 Chemikalien

Bezeichnung	Reinheitsgrad	Hersteller
dNTPs		MBI Fermentas
DNA-Polymerase AmpliTaq™		Perkin Elmer, Amersham
diverse PCR-Oligonukleotid-Startmoleküle (Primer)	Gelfiltration	TIB MOLBIOL
diverse DNA-Marker		MBI Fermentas
Agarose		Gibco BRL
Restriktionsendonukleasen		New England Biolabs, MBI Fermentas
Glutathion, reduzierte Form, freie Säure	99%	Sigma
Formaldehydlösung	37%	Ferak, Berlin
Dichlormethan	99,9%	Sigma
Acetylaceton, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Kaliumhydrogencarbonat, Natriumchlorid, Natriumacetat, Essigsäure, EDTA, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, SDS, TRIS, Ficoll-400, Magnesiumchlorid, Salzsäure, NaOH, Citronensäure	zur Analyse	Merck, Sigma, Pharmacia
Phenol-Lösung (gebrauchsfertiges Phenol-Chloroform-Wasser-Gemisch)	gradient grade	Perkin Elmer
Ethanol, 2-Propanol, Chloroform, Isoamylalkohol	gradient grade	Merck
Proteinase K		Boehringer Mannheim
Ethidiumbromid	95%	Sigma
Bromphenolblau, Na-salz		Sigma
Hämoglobin-Testkit „Merckotest“		Merck
Methanol, Acetonitril	HPLC grade	Merck
Triethanolamin, freie Base	99 %	Sigma
o-Nitrophenol		Sigma
2,4-Dinitrophenylhydrazin		Sigma
p-Aminobenzoesäure, freie Säure	99,9%	Sigma
p-Acetamidobenzoesäure, p-Acetamidophenol	99 %	Sigma
D,L-Dithiothreitol	99 %	Sigma
Acetyl Coenzym A, Na-salz	95%	Sigma
Carnitin-O-Acetyltransferase		Sigma
Acetyl-D,L-Carnitin	99%	Sigma

139

4.4 Methoden

4.4.1 Genotypisierung hinsichtlich GSTT1

Leukozyten-Isolation

Erythrozyten-Lysis-Puffer (10 x):

61,5 g	NH4Cl (Endkonzentration 1,15 M)
10 g	KHCO3 (0,1 M)
2 ml	0,5 M EDTA (1 mM)

Aqua bidest. ad 1000 ml

TEN-Puffer (10 x):

2,4 g	TRIS/HCl pH 7,5 (0,2 M)
400 µl	EDTA (0,02 M)
17,5 g	NaCl (0,3 M)

Aqua bidest. ad 1000 ml

Vier Volumenteile 1x Lysis-Puffer wurden mit einem Volumenteil EDTA-Blut in sterilen Reaktionsgefäßen gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (2 000 g, 4°C, 30 min) wurde der Überstand entfernt, das Pellet in 1,5 ml 1 x TEN-Puffer gelöst und bei -20°C bis zur DNA-Extraktion aufbewahrt.

DNA-Extraktion

TE-Puffer:

121 mg	TRIS-HCl (10 mM)
200 µl	0,5 M EDTA, pH 8,0 (1 mM)

Aqua bidest. ad 100 ml

Die aufgetaute Zellsuspension wurde mit 100 µl 20%iger SDS-Lösung und 100 µl Proteinase K-Lösung (2 mg Proteinase K in 100 µl 1 x TEN-Puffer gelöst) versetzt und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (40 min-1) inkubiert. Im ersten Extraktionsschritt wurde ein Volumenteil dieser Lösung mit einem Volumenteil Phenol-Lösung in geeigneten Reaktionsgefäßen gemischt und 3 h bei 30 min-1 überkopf geschüttelt. Nach Zentrifugation (5 min, 4 000 g) und dabei erfolgter

140

Als Kriterium für die Reinheit der isolierten DNA diente der Quotient aus der Absorption bei 260 nm und der Absorption bei 280 nm (Optimum 1,8 - 2,0). Die Quantifizierung der DNA erfolgte spektrofotometrisch durch Messung der Absorption bei 260 nm. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz:

A₂₆₀ = · c · d

A₂₆₀ = Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm

= Extinktionskoeffizient 1/50 (µl/ng) für doppelsträngige DNA

d = Schichtdicke 1 cm

ergibt sich

c_DNA (ng/µl) = A₂₆₀ · 50 ng/µl

Der DNA-Gehalt lag bei Extraktion nach diesem Verfahren bei 150 - 400 ng/µl.

141

Polymerase-Kettenreaktion

Reaktionsansatz (25 µl):

1 µl	genomische DNA
2,5 µl	10 x PCR-Puffer
1,5 µl	MgCl2 (25 mM)
0,625 µl	GT1-F1-Primer Theta-f (10 µmol/ml)
0,625 µl	GT1-R2-Primer Theta-r (10 µmol/ml)
0,3 µl	Primer BNF3
0,3 µl	Primer BNF5
2,5 µl	dNTPs (2 mM)
16,45 µl	Aqua bidest.
0,2 µl	AmpliTaq™

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, 35x (30 s 94°C - 30 s 66°C - 1 min 72°C),
7 min 72°C, 4°C.

Tab. 42: Sequenzen und Positionen der zur Identifizierung des GSTT1-Gens verwendeten Primer.

Primer	Primer-Position (nt)	Ausrichtung	Primer-Sequenz
GT1	469 - 491	„vorwärts“	5’ - TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC - 3’
GT2	723 - 704	„rückwärts“	5’ - TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA - 3’
BNF3	(-40) - (-21)	„vorwärts“	5’ - GCC ACA GGA GCT TCT GAC AC - 3’
BNF5	130 - 111	„rückwärts“	5’ - GGC ACA ACA GGT AGT AGG CG - 3’

Agarose-Gelektrophorese

10 x TBE-Puffer:

109 g	TRIS (900 mM)
55 g	Borsäure (900 mM)
40 ml	0,5 M EDTA pH 8,0 (20 mM)

Mit 1 M HCl wurde auf einen pH von 8,0 eingestellt und mit Aqua bidest auf 1 l aufgefüllt. Ein 1 x TBE-Puffer wurde durch 1:10-Verdünnung dieser Lösung mit Aqua bidest erhalten.

Ethidiumbromid-Lösung: 100 mg Ethidiumbromid wurden in 100 ml Aqua bidest. gelöst; 10 µl dieser Stammlösung wurden mit 1 x TBE-Puffer auf 100 ml aufgefüllt.

142

Probenlaufpuffer:

15 g	Ficoll-400
0,25 g	Bromphenolblau

Mit Aqua bidest. auf 100 ml auffüllen und unter Rühren lösen.

Elektrophoresebedingungen: 90 min Laufzeit,120 V.

143

4.4.2 Genotypisierung hinsichtlich NAT1

Primer

Tab. 43: Sequenzen und Positionen der zur Identifizierung der NAT1-Mutationen verwendeten Primer.

Primer	Primer-Position (nt)	DNA-Abschnitts-länge (bp)	Primer-Sequenz	Spezifität
N1-IR	-7 - -39	409	5'-CTA AgC AAg GAA AAC AAA ACG AAA GCA AAT AAT	MaeII-site (3‘) -344 SspI-site (3‘) -40
N1-IIR	1125 - 1096	435	5'-TTC CAA GAT AAC CAC AGG CCA TCT TTA GAA	BbsI-site (3') 1095
N1-1F	-415 - -394	-	5'-GAA ATT GAG TGG GTC AGG TAC C	NAT1-gene (5')
N1-4F	344 - 364	247	5’ - AtG GCA GGA ACT ACA TTG TCG
N1-5F	691 - 710	-	5'-GTT CAC TGT TtG GTG GGC TT	BbsI-site (5') 1095
N1-5R	1125 - 1106	1540	5'-TTC CAA GAT AAC CAC AGG CC	NAT1-gene (3')
N1-6F	-16 - -4	-	5’-TCC TTG CTT AGG GGA TCA TG	NAT1-gene (5‘)
N1-6R	861 - 840	878	5’-AAA TCT ATC ACC ATG TTT GGG C	NAT1-gene (3‘)
N1-6R	1108 - 1088	418	5'- GCC ATC TTT AAA ATA CAT TTA	1088T (3‘)
N1-7R	1108 - 1088	418	5'- GCC ATC TTT AAA ATA CAT TTT	1088A (3‘)
N1-8R	556 - 590	247	5’ - CGA GGC TTA AGA GTA AAG GAG TAG ATG TCT

144

Restriktionsenzyme

Tab. 44: Restriktionsendonukleasen zur Erkennung der NAT1-Mutationen.

Mutation	Präamplifikation DNA-Abschnitt Primer	Restriktions-endo-nuklease	Erken-nungs-sequenz	Schnitt-positionen (nt) Wildtyp Mutation	entstandene DNA-Fragmente (bp) Wildtyp Mutation
C-344T	409 bp N1-1F/N1-IR	MaeII	A‘CG_T	-345	71 338
				keine	409
A-40T	409 bp N1-1F/N1-IR	SspI	AAT‘ATT	keine	409
				-40	376 33
C190T	878 bp N1-6F/N1-6R	Tsp590I	‘AATT_	26 52 410 520 597 732	358 139 129 110 73 43 26
				26 52 186 410 520 597 732	224 139 134 129 110 73 43 26
G445A	878 bp N1-6F/N1-6R	BbsI	GAA GAC(N)2	438 551	455 310 113
				551	568 310
G459A	1540 bp N1-1F/ N1-5R	BslI	CCnn_nnn‘nnGG	-10 132 456 686 687 847	406 324 278 230 160 141 1
				-10 132 686 687 847	554 406 278 160 141 1
C559T	247 bp N1-4F/N1-8R	DdeI	C‘TnA_G	431	159 88
				431 558	127 88 32
G560A	247 bp N1-4F/N1-8R	Alw26I	GTCTCn‘nnnn_	554	211 36
					247
T640G	1540 bp N1-1F/N1-5R	AlwNI	CAG_nnn‘CTG	402	817 723
				402 643	817 482 241
A752T	878 bp N1-6F/N1-6R	BgIII	A‘GATC_T	750	767 111
				-	878
A1095C	435 bp N1-5F/N1-IIR	BbsI	GAAGACnn‘nnnn_	-	435
				1086	396 39

145

Identifizierung der Allele NAT1*3, NAT1*4, NAT1*10 und NAT1*11

Amplifikation eines 1540 bp-DNA-Abschnittes. Zunächst wurde ein NAT1-spezifischer 1540 bp-DNA-Abschnitt, der die 3’- und 5’-Regionen des Exons enthält, mittels PCR amplifiziert.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl	genomische DNA
5 µl	10x Taq-Puffer
5 µl	2 mM dNTPs
1 µl	10 µM 5'-Primer N1-1F
1 µl	10 µM 3'-Primer N1-5R
33 µl	Aqua bidest.
0,2 µl	AmpliTaq™
4,8 µl	25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 1 min 62°C, 2 min 72°C), 7 min 72°C, 35 Zyklen

Elektrophoresebedingungen:

1,2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer, Marker VI.

Mutation G459A. Zur Identifizierung dieser Mutation wurde der präamplifizierte DNA-Abschnitt mit dem Restriktionsenzym BslI inkubiert („verdaut“).

Ansatz:

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,75 µl	BslI
2,5 µl	NEBuffer 2
9,5 µl	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 55°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

146

Ansatz:

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,5 µl	AlwNI
2,5 µl	NEBuffer 4
9,5 µl	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2 % Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Das verbliebene Amplifikat wurde durch Zugabe von 162 µl Aqua bidest. ca. 1:10 auf ein Endvolumen von ca. 180 µl verdünnt.

Amplifikation eines 409 bp-DNA-Abschnitts. In dieser Verdünnung wurde ein 409 bp-Abschnitt amplifiziert, mit dem die Mutationen A-40T und C-344T identifiziert werden konnten. Bezüglich A-40T wurde ein mismatch-Primer (N1-IR) verwendet, der im Falle der Mutation zur Entstehung einer SspI-Schnittstelle führte.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl	1:10 verdünnte, präamplifizierte DNA
5 µl	10x Taq-Puffer
5 µl	2 mM dNTPs
1 µl	10 µM 5'-Primer N1-1F
1 µl	10 µM 3'-Primer N1-IR
33 µl	Aqua bidest.
0,2 µl	AmpliTaq™
4,8 µl	25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, (0.5 min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C), 7 min 72°C, 14 Zyklen

Elektrophoresebedingungen:

2 % Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker V).

147

Ansatz:

125 µl	präamplifizierte DNA
0,5 µl	MaeII
12,5 µl	Puffer

Inkubation über Nacht bei 50°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2 % Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 5 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation A-40T. Der 409 bp-DNA-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym SspI verdaut.

Ansatz:

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,5 µl	SspI
2,5 µl	NEBuffer SspI
9,5 µl	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

3% Nusieve^® 3:1 Agarose, 80 V, 120 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation T1088A . Diese Mutation wurde mittels allelspezifischer PCR nach Amplifikation eines 418 bp-DNA-Abschnitts identifiziert.

148

1 µl	1:10 verdünnte, präamplifizierte DNA
2,5 µl	10x Taq-Puffer
2,5 µl	2 mM dNTPs
0,5 µl	10 µM 5'-Primer N1-5F
0,5 µl	10 µM 3'-Primer N1-6R bzw. N1-7R
16,5 µl	Aqua bidest.
0,1 µl	AmpliTaq™
2,4 µl	25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C (0.5 min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C), 7 min 72°C, 14 Zyklen.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation C1095A. Diese Mutation wurde nach Amplifikation eines 435 bp-DNA-Abschnitts und anschließendem Verdau mit BbsI identifiziert.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl	1:10 verdünnte, präamplifizierte DNA
2,5 µl	10x Taq-Puffer
2,5 µl	2 mM dNTPs
0,5 µl	10 µM 5'-Primer N1-5F
0,5 µl	10 µM 3'-Primer N1-IIR
16,5 µl	Aqua bidest.
0,1 µl	AmpliTaq™
2,4 µl	25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C (0.5 min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C), 7 min 72°C, 14 Zyklen.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker V).

149

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,5 µl	BbsI
2,5 µl	NEBuffer 2
9,5 µl	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

3% Nusieve^® 3:1 Agarose, 80 V, 120 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation G445A. Der zur Identifizierung dieser in NAT1*11 enthaltenen Mutation amplifizierte 878 bp-Abschnitt wurde außerdem für die Mutationen in den NAT1-Allelen NAT1*17 und NAT1*22 verwendet. Zur Identifizierung von G⁴⁴⁵A erfolgte anschließend der Verdau des 878 bp-Abschnitts mit dem Restriktionsenzym BbsI.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl	genomische DNA
5 µl	10x Taq-Puffer
5 µl	2 mM dNTPs
1 µl	10 µM 5'-Primer N1-6F
1 µl	10 µM 3'-Primer N1-6R
33 µl	Aqua bidest.
0,2 µl	AmpliTaq™
4,8 µl	25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 30 s 60°C, 60 s 72°C), 7 min 72°C, 35 Zyklen.

Elektrophoresebedingungen:

1,2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker VI).

150

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,5 µl	BbsI
2,5 µl	NEBuffer 2
9,5 µl	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Identifizierung der Allele NAT1*14 und NAT1*15

Zur Identifizierung der in diesen Allelen enthaltenen Mutationen wurde ein 247 bp-DNA-Abschnitt unter Verwendung der Primer N1-4F und N1-8R amplifiziert.

PCR-Reaktionsbedingungen:

6,0 µl	25 mM MgCl2
5 µl	2 mM dNTPs
je 1 µl	10 µM 5’-Primer N1-4F und N1-8R
5 µl	10x Taq-Puffer
0,2 µl	AmpliTaq™
1 µl	genomische DNA
31,8 µl	Aqua bidest.

Temperaturprofil: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 1 min 63°C, 30 s 72°C), 7 min 72°C, 35 Zyklen.

Mutation C559T. Der 247 bp-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym Ddel verdaut.

Ansatz:

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,75 µl DdeI	DdeI
2,5 µl	NEBuffer 3
9,5 µl	Aqua bidest.

151

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation G₅₆₀A. Der 247 bp-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym Alw26I verdaut.

Ansatz:

12,5 µl	präamplifizierte DNA
0,75 µl	Alw26I
0,25 µl	Rinderserumalbumin
2,5 µl	Puffer Y
9,0 µl Aqua bidest.	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Identifizierung der Allele NAT1*17 und NAT1*22

Mutation C190T. Zur Identifizierung dieser Mutation wurde der präamplifizierte
878 bp-DNA-Abschnitt mit Tsp509I verdaut.

Ansatz:

12.5 µl	präamplifizierte DNA
0.5 µl Tsp509I	Tsp509I
2.5 µl	NEBuffer 1
9.5 µl	Aqua bidest.

2 h bei 65°C im Brutschrank inkubieren.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

152

Ansatz:

12.5 µl	präamplifizierte DNA
0.5 µl	BglII
2.5 µl	NEBuffer 3
9.5 µl	Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

4.4.3 Phänotypisierung hinsichtlich GSTT1-1

Puffer und Lösungen

• TRIS-HCl-Puffer, 20 mM, pH 7,4: Zunächst wurde eine 0,2 M TRIS-Lösung hergestellt, indem 24,23 g TRIS mit Aqua bidest. auf 1 l aufgefüllt wurden. Zu 25 ml dieser Lösung wurden 42 ml 0,1 N HCl-Lösung gegeben und mit Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt. Diese Lösung wurde mit Aqua bidest. auf 250 ml aufgefüllt und der pH-Wert kontrolliert.
• Glutathion-Lösung, 12 mM: 36,9 mg GSH wurden in 10 ml TRIS-HCl-Puffer (20 mM, pH 7,4) gelöst.
• Trichloressigsäure-Lösung (20% m/V): 20 g Trichloressigsäure wurden in 100 ml Aqua bidest. gelöst.
• Formaldehyd-Lösung: 0,2000 - 0,4000 g der kommerziell erhältlichen Stammlösung (deklarierter Gehalt 37%, iodometrisch bestimmter Gehalt 40,5%) wurde in einen 100 ml-Maßkolben eingewogen und mit Aqua bidest. aufgefüllt. Diese Lösung wurde unter Verwendung eines 10 ml-Maßkolbens 1:10 (V/V) verdünnt. In 1 ml dieser Lösung waren je nach Einwaage zwischen 2,025 und 4,050 µmol Formaldehyd enthalten.

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  153

• Nash-Reagenz: 100 g einer 0,4%igen wässrigen Acetylacetonlösung wurden 30 g Ammoniumacetat und 600 µl Eisessig zugesetzt.
• Eluent Methanol:Wasser 55:45 (V/V): 55 ml Methanol und 45 ml Aqua bidest. wurden gemischt und 15 min im Ultraschallbad entgast.
• Interner Standard o-Nitrophenol (400 µM): 5,6 mg o-Nitrophenol wurden in 100 ml Eluent gelöst.
• 2,4-Dinitrophenylhydrazin (100 µM): 2,0 mg 2,4-Dinitrophenylhydrazin wurden in 100 ml Eluent gelöst.
• 2,4-Dinitrophenylhydrazon (100 µM) als Vergleichssubstanz: 2,1 mg 2,4-Dinitrophenylhydrazon wurden in 100,00 ml Eluent gelöst.

Inkubationsansätze

Zur Phänotypisierung der Probanden wurde individuelles Hämolysat mit drei Konzentrationen des spezifischen Substrates Dichlormethan inkubiert. Die 1 ml-Reaktionsansätze enthielten folgende Komponenten:

125 µl Hämolysat

333 µl GSH-Lösung (12 mM)

2, 4 bzw. 8 µl Dichlormethan (Endkonzentrationen 31, 62 und 124 mM)

TRIS-HCl-Puffer, 20 mM, pH 7,4, zu einem Gesamtvolumen von 1 ml ergänzt

In einem 2 ml-Eppendorf^®-Gefäß wurden Hämolysat, Puffer und GSH-Lösung gemischt und 5 min bei 37°C in einem Eppendorf^®-Thermomixer vorinkubiert. Anschließend wurde die Schüttelfrequenz (700/min) eingestellt und das Substrat mittels einer Hamilton^®-Spritze zugegeben. Sofort nach Substratzugabe wurde der Inhalt des jeweiligen Reaktionsgefäßes mit 5 s gründlich gemischt. Für jeden Probanden wurden neun substrathaltige (drei pro Konzentration) und zwei substratfreie Ansätze (Puffer anstelle Substrat) hergestellt. Nach Ablauf der Inkubationszeit (90 min bei 37°C) erfolgte der Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 333 µl 20%iger Trichloressigsäure (m/V) und eine Zentrifugation der Proben (10 min, 15 000g). 1 ml des jeweiligen Überstandes wurde weiterverarbeitet (siehe unten).

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Kalibrierung

Zur Erstellung der individuellen Kalibrierfunktion jedes Probanden wurden folgende Ansätze verwendet:

125 µl Hämolysat

333 µl GSH-Lösung (12 mM)

Volumen wässrige Formaldehydlösung, so dass Endkonzentrationen von 200, 400 und 600 µM Formaldehyd im Ansatz vorlagen

TRIS-HCl-Puffer, 20 mM, pH 7,4, zu einem Gesamtvolumen von 1 ml ergänzt.

Die Kalibrierproben wurden sofort nach der Herstellung mit 333 µl 20%iger Trichloressigsäure (m/V) versetzt, zentrifugiert und vermessen. Für jede individuelle Kalibriergerade wurden neun formaldehydhaltige Proben (drei je Konzentration) und zwei Leermatrixproben (Puffer anstelle Formaldehydlösung) hergestellt.

Bestimmung des Formaldehyds

Die Bestimmung des Formaldehyds erfolgte kolorimetrisch mit der Methode nach Nash (1963) bzw. mittels HPLC durch Detektion des bei der Reaktion von Formaldehyd mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin entstehenden 2,4-Dinitro-phenylhydrazon nach Grömping und Cammann (1989).

Bestimmung nach Nash. Je 1 ml des nach Proteinfällung und Zentrifugation gewonnenen Überstandes wurde in ein verschließbares Reagenzglas überführt und mit 1 ml frisch zubereitetem Nash-Reagenz versetzt. Nach einer 30-minütigen Temperierung bei 60°C (Wasserbad) wurden die Proben sofort abgekühlt (Eisbad) und nach 15 min bei 415 nm gegen den Leerwert der Kalibrierfunktion gemessen.

Bestimmung mittels HPLC. In einem 2 ml-Eppendorf^®-Gefäß wurden 0,5 ml des Überstandes mit 0,5 ml frisch zubereiteter 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Lösung
(100 µM) gemischt und 45 min bei 37°C im Eppendorf^®-Thermomixer inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden dazu 0,5 ml des internen Standards o-Nitrophenol (400 µM) gegeben.

155

• Injektionsvolumen 50 µl (Autosampler)
• Isokratische Elution mit Methanol-Wasser-Gemisch (55:45, V/V), 1 ml/min
• Detektionswellenlänge: 350 nm

Methodenoptimierung und -validierung

Außer bei der Optimierung der Inkubationszeit wurden für alle Untersuchungen zur Methodenetablierung und -validierung 1 ml-Reaktionsansätze verwendet. Von den oben beschriebenen Ansätzen abweichende Zusammensetzungen sind in den jeweiligen Teilkapiteln bzw. Abbildungs- und Tabellenlegenden angegeben.

Optimierung der Inkubationszeit. Verschließbare 15 ml-Reagenzgläser enthielten folgende Inkubationsansätze:

3,0 ml	Hämolysat
1,5 ml	GSH (12 mM)
76,8 µl	Dichlormethan (100 mM/Ansatz)

TRIS-HCl-Puffer (20 mM, pH 7,4) auf 12 ml ergänzt

Vor der Substratzugabe wurden die Ansätze 5 min bei 37°C im Wasserbad vorinkubiert. Nach der Substratzugabe und gründlichem Mischen wurde bei konstanter Temperatur zu folgenden Zeiten je 1 ml entnommen: 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180 min. Parallel dazu wurden Kontrollansätze mit hitzeinaktiviertem Hämolysat (60 min bei 100°C behandelt) mitgeführt.

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4.4.4 Phänotypisierung hinsichtlich NAT1

Puffer und Lösungen

• 0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 7,5: Für 1 l Puffer weurden 320 ml 0,2 N HCl und 500 ml 0,2 M Triethanolamin-Lösung ( 29,8 g Triethanolamin/l) mit Aqua dest. auf 1 l aufgefüllt und der pH-Wert überprüft. Darin wurden 693,5 mg Dithiothreitol (? 4,5 mM) und 1,675 g Na-EDTA (? 4,5 mM) gelöst.
• Acetyl-CoA-regenerierendes System: besteht aus o.g. Triethanolamin-Puffer, 20 mM D,L-Acetylcarnitin und 2 U/ml Carnitin-O-Acetyltransferase; 48 mg D,L-Acetylcarnitin und 20 U Carnitin-O-Acetyltransferase (µl entsprechend der vorliegenden Aktivität) wurden auf 10 ml Puffer aufgefüllt.
• Acetyl-CoA: Für eine 450 µM Lösung wurden 3,6 mg in 10 ml Aqua bidest. gelöst.
• Substratlösung: Eine 5 mM Stammlösung (79,6 mg PABA/100 ml Aqua bidest.) wurde 1:100, 1:50, 1:20 und 1:10 verdünnt; im Ansatz ergaben sich Konzentrationen von 10, 20, 50, und 100 µM.
• Perchlorsäure-Lösung (15%): Zu 79 ml Aqua bidest. wurden 21 ml einer kommerziell erhältlichen 70%igen Perchlorsäure-Lösung gegeben.
• Vergleichssubstanz NAcPABA: Für eine 250 µM Stammlösung wurden 4,5 mg NAcPABA in 100 ml Aqua bidest. gelöst.
• interner Standard: 7,6 mg p-Acetamidophenol werden in 100,00 ml Aqua bidest. gelöst (500 µM).
• 0,1 M Citratpuffer, pH 3,5: Zunächst wurden eine 0,1 M Citronensäure-Lösung (21,0 g Citronensäure auf 1 l Reinst-Aqua bidest.) und eine 0,1 M Natriumcitratlösung (21 g Citronensäure und 200 ml 1 N NaOH mit Reinst-Aqua bidest. auf 1 l auffüllen) hergestellt. Für 1 l Puffer wurden 550 ml der Citronensäure-Lösung mit 450 ml der Natriumcitratlösung gemischt, filtriert und der pH-Wert kontrolliert.

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• Eluent: 850 ml des 0,1 M Citratpuffers wurden mit 150 ml Acetonitril (V/V) gemischt und 15 min im Ultraschallbad entgast.

Inkubationsansätze

Zur Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich NAT1 wurde individuelles Hämolysat mit vier Konzentrationen des spezifischen Substrates
p-Aminobenzoesäure (PABA) inkubiert. In ein 2 ml-Eppendorf^®-Gefäß wurden in der angegebenen Reihenfolge pipettiert und gemischt:

375 µl	0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 7,5
25 µl	Hämolysat
200 µl	Acetyl-CoA-regenerierendes System
200 µl	Acetyl-CoA (450 µM)

Der Ansatz wurde genau 5 min bei 37°C im Eppendorf^®-Thermomixer vorinkubiert. Dann wurden 200 µl der auf 37°C vortemperierten Substratlösung in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben, so dass Endkonzentrationen von 10, 20, 50 und 100 µM PABA im Ansatz vorlagen. Es wurde 5 s gründlich gemischt und 10 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Pro Substratkonzentration erfolgte eine Doppelbestimmung, zusätzlich wurden je Proband eine substratfreie Leerprobe (200 µl Aqua bidest. anstelle Substrat) und je Analysentag zwei Enzymkontrollproben mit 100 µM PABA mitgeführt. Nach der Inkubation wurden die Proben mit 333 µl 15%iger Perchlorsäure versetzt, gründlich gemischt und
10 min bei 15 000g zentrifugiert.

Kalibrierung

Für die Ansätze wurden 25 µl Hämolysat, 575 µl Pufferlösung und 200 µl des Acetyl-CoA-regenerierenden System gemischt. Nach Zusatz von 333 µl 15 %iger Perchlorsäure (V/V) und gründlichem Mischen wurden je 100 µl PABA- und NAcPABA-Lösung zugefügt, so dass die Endkonzentrationen im Ansatz für PABA 10, 25 und 50 µM und für NAcPABA 5, 10 und 20 µM betrugen. Die Ansätze wurden 10 min bei 15 000g zentrifugiert.

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Bestimmung der PABA- und NAcPABA-Konzentrationen

Nach der Zentrifugation wurden 900 µl des Überstandes mit 100 µl 500 µM
p-Acetamidophenol-Lösung gemischt.

HPLC-Bedingungen:

• Injektionsvolumen 50 µl (Autosampler)
• Isokratische Elution mit 15% Acetonitril V/V in 0,1 M Citratpuffer pH 3,5,
  1 ml/min;
• Detektionswellenlänge 270 nm

  Zur Auswertung wurden die Peakhöhen (h) von PABA, NAPABA und dem internen Standard verwendet. Es wurden jeweils die Quotienten hPABA/h(int. St.) und hNAcPABA/h(int. St.) gebildet. Mittels linearer Regression wurden aus den Daten der Kalibrierproben jeweils für PABA und NAcPABA Kalibrierfunktionen erstellt.

Methodenoptimierung und -validierung

Für alle Untersuchungen zur Methodenetablierung und -validierung wurden 1 ml-Reaktionsansätze verwendet. Von den oben beschriebenen Ansätzen abweichende Zusammensetzungen sind in den jeweiligen Teilkapiteln bzw. Abbildungs- und Tabellenlegenden angegeben.

Prüfung auf nichtenzymatische Zersetzung von NAcPABA. NAcPABA-Konzentrationen: 8, 10, 20 µM/Ansatz, Doppelbestimmung, 1 Leerwert (Aqua bidest. anstelle NAcPABA)

Ansatz:

In ein Eppendorfgefäß werden in der angegebenen Reihenfolge pipettiert:

375 µl	0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 7,5
25 µl	Hämolysat
200 µl	Acetyl-CoA-regenerierendes System
200 µl	Acetyl-CoA (450 µM)

Nach gründlichem Mischen wurden 333 µl 15%ige Perchlorsäure zugesetzt. Nach

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Prüfung auf enzymatische Zersetzung von NAcPABA. Es wurde der gleiche Ansatz wie bei der Prüfung auf nichtenzymatische Zersetzung verwendet. Der Ansatz wurde 5 min bei 37°C im Eppendorf-Thermomixer vorinkubiert. Dann wurden 200 µl der auf 37°C vortemperierten NAcPABA-Lösung zugegeben, so dass im Ansatz Konzentrationen von 2, 4, 8, 10 und 20 µM vorhanden waren. Nach 5 s Mischen wurde 10 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Abbruch der Reaktion und Weiterbehandlung erfolgten wie bei regulären Inkubationsansätzen.

Bestimmung des Hämoglobingehalts

Die Bestimmung des Hämoglobingehalts von Blutproben wurde unter Verwendung des Hämoglobin-Testkits Merckotest^® von Merck durchgeführt. Sie beruht auf der Oxidation des Hämoglobin zu Hämiglobin durch Kaliumhexacyanoferrat-III-Lösung. Hämiglobin wird anschließend mit Kaliumcyanid-Lösung zu einem stabilen, bei 540 nm fotometrisch messbaren Komplex umgesetzt. Zur Kalibrierung wurden die im Testkit enthaltenen Hämiglobincyanid-Standardlösungen verwendet.

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4.5 Datenverarbeitungsprogramme und statistische Testmethoden

Die Anpassung von Kurvenfunktionen an experimentell ermittelte Daten (lineare Regression, nichtlinearisiertes Kurvenfitting) erfolgte mit dem Programm Microcal^™ Origin^™ Version 4.1 von Microcal Software Inc. Northhampton, USA.

Chemische Formeln wurden mit dem Programm C-Design^®, Version 2.2, FoBaSoft GmbH, Deutschland, gezeichnet.

Für alle statistischen Testmethoden sowie die Schätzung von Mittelwerten, Medianen und Vertrauensbereichen wurde das Computerprogramm SYSTAT^™, Version 6.0.1, SPSS Inc. USA, verwendet.

÷2-Test, Zweiseitiger exakter Fisher-Test. Diese Tests wurden zur Erkennung der Signifikanz mit p < 0,05 bei unterschiedlichen Häufigkeiten verwendet. Der zweiseitige exakte Fisher-Test ist speziell für sehr kleine Stichprobenumfänge geeignet. Im Einzelnen wurde getestet auf:

• · Signifikanz der Unterschiede in den Häufigkeiten des GSTT*0/0-Genotyps und verschiedener NAT1-Allele in ethnischen Gruppen,
• · signifikante geschlechtsspezifische Unterschiede in der Häufigkeit des GSTT1*0/0-Genotyps,
• · signifikante Unterschiede zwischen der nach der Hardy-Weinberg-Regel erwarteten Häufigkeit von GSTT1- und NAT1-Allelen und den durch Genotypisierung bzw. Phänotypisierung ermittelten Häufigkeiten.

Mann-Whitney-U-Test. Der Mann-Whitney-U-Test ist ein nichtparametrisches Verfahren und damit geeignet für Stichproben mit nicht normalverteilten Beobachtungswerten. Er ist anwendbar bei kleinen Stichproben und unterschiedlichem Stichprobenumfang. Es wurde auf Signifikanz der Unterschiede in den Vmax- sowie K_m-Werten der Individuen jeweils zweier NAT1-Genotypen geprüft. P < 0,10 führte zur Ablehnung der Nullhypothese.

Test nach Kolmogoroff-Smirnoff. Die K_m-Werte der GSTT1-1-aktiven Probanden sowie die Einzelwerte der Kalibrierkonzentrationen von PABA und NAcPABA wurden dem Kolmogoroff-Smirnoff-Testverfahren „one sample“

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