Bruhn, Claudia: Untersuchungen zum genetischen Polymorphismus der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase T1-1 und Arylamin-N-Acetyltransferase 1

136

Kapitel 4. Experimenteller Teil

4.1 Gewinnung des Untersuchungsmaterials

Für die vorliegenden Untersuchungen standen die Blutproben von insgesamt 314 gesunden, freiwilligen Probanden im Alter zwischen 19 und 48 Jahren zur Verfügung. 284 Individuen waren männlich, 30 weiblich. Ihre schriftliche Einverständniserklärung lag vor. Alle Probanden wurden hinsichtlich NAT1, 300 zufällig ausgewählte Individuen (270 männliche, 30 weibliche) hinsichtlich GSTT1 genotypisiert. Zur Phänotypisierung hinsichtlich GSTT1-1 wurden von den 300 genotypisierten Individuen 140 (136 männlich, 4 weiblich) zufällig ausgewählt. Zur Phänotypisierung hinsichtlich NAT1 erfolgte eine gezielte Auswahl von 105 ausschließlich männlichen Probanden. Es handelt sich dabei einerseits um solche mit den selteneren NAT1-Genotypen und andererseits um eine repräsentative Zahl von Individuen mit dem NAT1*4/*4- bzw. NAT1*4/*10-Genotyp. Die Entnahme des Blutes erfolgte nach Venenpunktion in Röhrchen mit EDTA-beschichteten Polystyrolkügelchen (Monovetten®). Die Proben wurden bei -80°C gelagert.

4.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Die Monovetten® zur Blutentnahme stammen von der Firma Sarstedt. Alle anderen Verbrauchsmaterialien wie PCR-Gefäße, Einmal-Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße verschiedener Volumina u.a. wurden von den Firmen Eppendorf, Biozym und Falcon bezogen. Die verwendeten Geräte sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.


137

Gerät

Hersteller

Thermocycler GeneAmp PCR System 9600 und 9700

Perkin Elmer/Applied Systems

Flachbett-Elektrophoresekammern und Elektrophorese-Spannungsgeräte

Pharmacia, Biorad, Hoefer

diverse Gefriertruhen

Foron, GFL Burgwedel

diverse Waagen

Sartorius

diverse Pipetten

Eppendorf

pH-Messgerät

WTW, Weilheim

Dosierspritze

Hamilton

Thermomixer 5437

Eppendorf

Minishaker MS1

IKA Jahnke & Kunkel

Ultraschallbad Sonorex RK 1000

Bandelin electronics, Berlin

Temperierbad TS 2

IKA Jahnke & Kunkel

Ultraschallstab Sonoplus UW 70

Bandelin electronics, Berlin

Kühlzentrifuge Hermle ZK 380

Hermle, Gosheim

Micro-Zentrifuge 5415 C

Eppendorf

UV-VIS-Spektrofotometer UV 2101 PC

Shimadzu

HPLC-Anlage: Lichrograph 6200 A Gradienten-Pumpe, L-4500 Diodenarray-Detektor, Autosampler AS 2000 A

Merck/Hitachi

HPLC-Säule RP 18, 250 x 4,6 mm, 5 µm Hypersil, RP-18-Vorsäulen

Shandon


138

4.3 Chemikalien

Bezeichnung

Reinheitsgrad

Hersteller

dNTPs

 

MBI Fermentas

DNA-Polymerase AmpliTaq

 

Perkin Elmer, Amersham

diverse PCR-Oligonukleotid-Startmoleküle (Primer)

Gelfiltration

TIB MOLBIOL

diverse DNA-Marker

 

MBI Fermentas

Agarose

 

Gibco BRL

Restriktionsendonukleasen

 

New England Biolabs, MBI Fermentas

Glutathion, reduzierte Form, freie Säure

99%

Sigma

Formaldehydlösung

37%

Ferak, Berlin

Dichlormethan

99,9%

Sigma

Acetylaceton, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Kaliumhydrogencarbonat, Natriumchlorid, Natriumacetat, Essigsäure, EDTA, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, SDS, TRIS, Ficoll-400, Magnesiumchlorid, Salzsäure, NaOH, Citronensäure

zur Analyse

Merck, Sigma, Pharmacia

Phenol-Lösung (gebrauchsfertiges Phenol-Chloroform-Wasser-Gemisch)

gradient grade

Perkin Elmer

Ethanol, 2-Propanol, Chloroform, Isoamylalkohol

gradient grade

Merck

Proteinase K

 

Boehringer Mannheim

Ethidiumbromid

95%

Sigma

Bromphenolblau, Na-salz

 

Sigma

Hämoglobin-Testkit „Merckotest

 

Merck

Methanol, Acetonitril

HPLC grade

Merck

Triethanolamin, freie Base

99 %

Sigma

o-Nitrophenol

 

Sigma

2,4-Dinitrophenylhydrazin

 

Sigma

p-Aminobenzoesäure, freie Säure

99,9%

Sigma

p-Acetamidobenzoesäure, p-Acetamidophenol

99 %

Sigma

D,L-Dithiothreitol

99 %

Sigma

Acetyl Coenzym A, Na-salz

95%

Sigma

Carnitin-O-Acetyltransferase

 

Sigma

Acetyl-D,L-Carnitin

99%

Sigma


139

4.4 Methoden

4.4.1 Genotypisierung hinsichtlich GSTT1

Leukozyten-Isolation

Erythrozyten-Lysis-Puffer (10 x):

61,5 g

NH4Cl (Endkonzentration 1,15 M)

10 g

KHCO3 (0,1 M)

2 ml

0,5 M EDTA (1 mM)

Aqua bidest. ad 1000 ml

TEN-Puffer (10 x):

2,4 g

TRIS/HCl pH 7,5 (0,2 M)

400 µl

EDTA (0,02 M)

17,5 g

NaCl (0,3 M)

Aqua bidest. ad 1000 ml

Vier Volumenteile 1x Lysis-Puffer wurden mit einem Volumenteil EDTA-Blut in sterilen Reaktionsgefäßen gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (2 000 g, 4°C, 30 min) wurde der Überstand entfernt, das Pellet in 1,5 ml 1 x TEN-Puffer gelöst und bei -20°C bis zur DNA-Extraktion aufbewahrt.

DNA-Extraktion

TE-Puffer:

121 mg

TRIS-HCl (10 mM)

200 µl

0,5 M EDTA, pH 8,0 (1 mM)

Aqua bidest. ad 100 ml

Die aufgetaute Zellsuspension wurde mit 100 µl 20%iger SDS-Lösung und 100 µl Proteinase K-Lösung (2 mg Proteinase K in 100 µl 1 x TEN-Puffer gelöst) versetzt und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (40 min-1) inkubiert. Im ersten Extraktionsschritt wurde ein Volumenteil dieser Lösung mit einem Volumenteil Phenol-Lösung in geeigneten Reaktionsgefäßen gemischt und 3 h bei 30 min-1 überkopf geschüttelt. Nach Zentrifugation (5 min, 4 000 g) und dabei erfolgter


140

Phasentrennung wurde die obere, DNA-haltige Phase in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, 1:1 mit Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (49:1, v/v) versetzt und 1 h bei 30 min-1 überkopf geschüttelt. Nach Phasen-
trennung durch Zentrifugation (5 min, 4 000 g) wurde die obere, DNA-haltige Phase in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. 100 µl einer 3 M Natriumacetat-Lösung (40,8 g Natriumacetat in 100 ml Aqua bidest. gelöst und mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt) und das dreifache Volumen 96%iger Ethanol wurden zugegeben und gut vermischt. Die DNA wurde dann durch Zentrifugation (10 min, 4000 g) gefällt und der flüssige Überstand entfernt. Ein zweiter Fällungsschritt mit 3 ml 70%igem Ethanol und Zentrifugation wie oben schloß sich an. Nach dem Entfernen des Überstandes wurde das DNA-Pellet getrocknet, in 600 µl TE-Puffer gelöst und bei 5°C über Nacht unter leichtem Schwenken inkubiert. Danach wurde die DNA-Lösung bei 4°C aufbewahrt.

Als Kriterium für die Reinheit der isolierten DNA diente der Quotient aus der Absorption bei 260 nm und der Absorption bei 280 nm (Optimum 1,8 - 2,0). Die Quantifizierung der DNA erfolgte spektrofotometrisch durch Messung der Absorption bei 260 nm. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz:

A260 = epsilon · c · d

A260 = Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm

epsilon = Extinktionskoeffizient 1/50 (µl/ng) für doppelsträngige DNA

d = Schichtdicke 1 cm

ergibt sich

cDNA (ng/µl) = A260 · 50 ng/µl

Der DNA-Gehalt lag bei Extraktion nach diesem Verfahren bei 150 - 400 ng/µl.


141

Polymerase-Kettenreaktion

Reaktionsansatz (25 µl):

1 µl

genomische DNA

2,5 µl

10 x PCR-Puffer

1,5 µl

MgCl2 (25 mM)

0,625 µl

GT1-F1-Primer Theta-f (10 µmol/ml)

0,625 µl

GT1-R2-Primer Theta-r (10 µmol/ml)

0,3 µl

Primer BNF3

0,3 µl

Primer BNF5

2,5 µl

dNTPs (2 mM)

16,45 µl

Aqua bidest.

0,2 µl

AmpliTaq

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, 35x (30 s 94°C - 30 s 66°C - 1 min 72°C),
7 min 72°C, 4°C.

Tab. 42: Sequenzen und Positionen der zur Identifizierung des GSTT1-Gens verwendeten Primer.

Primer

Primer-Position (nt)

Ausrichtung

Primer-Sequenz

GT1

469 - 491

„vorwärts“

5’ - TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC - 3’

GT2

723 - 704

„rückwärts“

5’ - TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA - 3’

BNF3

(-40) - (-21)

„vorwärts“

5’ - GCC ACA GGA GCT TCT GAC AC - 3’

BNF5

130 - 111

„rückwärts“

5’ - GGC ACA ACA GGT AGT AGG CG - 3’

Agarose-Gelektrophorese

10 x TBE-Puffer:

109 g

TRIS (900 mM)

55 g

Borsäure (900 mM)

40 ml

0,5 M EDTA pH 8,0 (20 mM)

Mit 1 M HCl wurde auf einen pH von 8,0 eingestellt und mit Aqua bidest auf 1 l aufgefüllt. Ein 1 x TBE-Puffer wurde durch 1:10-Verdünnung dieser Lösung mit Aqua bidest erhalten.

Ethidiumbromid-Lösung: 100 mg Ethidiumbromid wurden in 100 ml Aqua bidest. gelöst; 10 µl dieser Stammlösung wurden mit 1 x TBE-Puffer auf 100 ml aufgefüllt.


142

2,5% Agarose-Gel: Zu 2,5 g Agarose wurden 100 ml 1 x TBE-Puffer gegeben und die Mischung in der Mikrowelle zweimal aufgekocht. Durch Rühren wurde die Lösung auf ca. 50°C abgekühlt und mit 10 µl Ethidiumbromid-Lösung pro 100 ml versetzt. Das flüssige Gel wurde in den mit Klebestreifen abgedichtete Elektrophoreseschlitten gefüllt. Nach Einsetzen der Elektrophoresekämme zur Ausbildung der Probentaschen wurde das Gel zunächst 10 min bei Raumtemperatur, dann 15 min bei 4°C abgekühlt.

Probenlaufpuffer:

15 g

Ficoll-400

0,25 g

Bromphenolblau

Mit Aqua bidest. auf 100 ml auffüllen und unter Rühren lösen.

Elektrophoresebedingungen: 90 min Laufzeit,120 V.


143

4.4.2 Genotypisierung hinsichtlich NAT1

Primer

Tab. 43: Sequenzen und Positionen der zur Identifizierung der NAT1-Mutationen verwendeten Primer.


Primer

Primer-Position
(nt)

DNA-Abschnitts-länge (bp)


Primer-Sequenz


Spezifität

N1-IR

-7 - -39

409

5'-CTA AgC AAg GAA AAC AAA ACG AAA GCA AAT AAT

MaeII-site (3‘) -344
SspI-site (3‘)
-40

N1-IIR

1125 - 1096

435

5'-TTC CAA GAT AAC CAC AGG CCA TCT TTA GAA

BbsI-site (3') 1095

N1-1F

-415 - -394

-

5'-GAA ATT GAG TGG GTC AGG TAC C

NAT1-gene (5')

N1-4F

344 - 364

247

5’ - AtG GCA GGA ACT ACA TTG TCG

 

N1-5F

691 - 710

-

5'-GTT CAC TGT TtG GTG GGC TT

BbsI-site (5') 1095

N1-5R

1125 - 1106

1540

5'-TTC CAA GAT AAC CAC AGG CC

NAT1-gene (3')

 

 

 

 

 

N1-6F

-16 - -4

-

5’-TCC TTG CTT AGG GGA TCA TG

NAT1-gene (5‘)

N1-6R

861 - 840

878

5’-AAA TCT ATC ACC ATG TTT GGG C

NAT1-gene (3‘)

N1-6R

1108 - 1088

418

5'- GCC ATC TTT AAA ATA CAT TTA

1088T (3‘)

N1-7R

1108 - 1088

418

5'- GCC ATC TTT AAA ATA CAT TTT

1088A (3‘)

N1-8R

556 - 590

247

5’ - CGA GGC TTA AGA GTA AAG GAG TAG ATG TCT

 


144

Restriktionsenzyme

Tab. 44: Restriktionsendonukleasen zur Erkennung der NAT1-Mutationen.

Mutation

Präamplifikation


DNA-Abschnitt
Primer

Restriktions-endo-nuklease

Erken-nungs-sequenz

Schnitt-positionen
(nt)
Wildtyp
Mutation

entstandene DNA-Fragmente
(bp)
Wildtyp
Mutation

C-344T

409 bp
N1-1F/N1-IR

MaeII

A‘CG_T

-345

71 338

keine

409

A-40T

409 bp
N1-1F/N1-IR

SspI

AAT‘ATT

keine

409

-40

376 33

C190T

878 bp
N1-6F/N1-6R

Tsp590I

‘AATT_

26 52 410
520 597 732

358 139 129
110 73 43 26

26 52 186 410 520 597 732

224 139 134 129 110 73 43 26

G445A

878 bp
N1-6F/N1-6R

BbsI

GAA
GAC(N)2

438 551

455 310 113

551

568 310

G459A

1540 bp
N1-1F/ N1-5R

BslI

CCnn_nnn‘nnGG

-10 132 456 686 687 847

406 324 278 230 160 141 1

-10 132
686 687 847

554 406 278
160 141 1

C559T

247 bp
N1-4F/N1-8R

DdeI

C‘TnA_G

431

159 88

431 558

127 88 32

G560A

247 bp
N1-4F/N1-8R

Alw26I

GTCTCn‘nnnn_

554

211 36

 

247

T640G

1540 bp
N1-1F/N1-5R

AlwNI

CAG_nnn‘CTG

402

817 723

402 643

817 482 241

A752T

878 bp
N1-6F/N1-6R

BgIII

A‘GATC_T

750

767 111

-

878

A1095C

435 bp
N1-5F/N1-IIR

BbsI

GAAGACnn‘nnnn_

-

435

1086

396 39


145

Identifizierung der Allele NAT1*3, NAT1*4, NAT1*10 und NAT1*11

Amplifikation eines 1540 bp-DNA-Abschnittes. Zunächst wurde ein NAT1-spezifischer 1540 bp-DNA-Abschnitt, der die 3’- und 5’-Regionen des Exons enthält, mittels PCR amplifiziert.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl

genomische DNA

5 µl

10x Taq-Puffer

5 µl

2 mM dNTPs

1 µl

10 µM 5'-Primer N1-1F

1 µl

10 µM 3'-Primer N1-5R

33 µl

Aqua bidest.

0,2 µl

AmpliTaq

4,8 µl

25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 1 min 62°C, 2 min 72°C), 7 min 72°C, 35 Zyklen

Elektrophoresebedingungen:

1,2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer, Marker VI.

Mutation G459A. Zur Identifizierung dieser Mutation wurde der präamplifizierte DNA-Abschnitt mit dem Restriktionsenzym BslI inkubiert („verdaut“).

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,75 µl

BslI

2,5 µl

NEBuffer 2

9,5 µl

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 55°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).


146

Mutation T640G. Zur Identifizierung dieser Mutation wurde der präamplifizierte DNA-Abschnitt mit dem Restriktionsenzym AlwNI verdaut.

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,5 µl

AlwNI

2,5 µl

NEBuffer 4

9,5 µl

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2 % Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Das verbliebene Amplifikat wurde durch Zugabe von 162 µl Aqua bidest. ca. 1:10 auf ein Endvolumen von ca. 180 µl verdünnt.

Amplifikation eines 409 bp-DNA-Abschnitts. In dieser Verdünnung wurde ein 409 bp-Abschnitt amplifiziert, mit dem die Mutationen A-40T und C-344T identifiziert werden konnten. Bezüglich A-40T wurde ein mismatch-Primer (N1-IR) verwendet, der im Falle der Mutation zur Entstehung einer SspI-Schnittstelle führte.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl

1:10 verdünnte, präamplifizierte DNA

5 µl

10x Taq-Puffer

5 µl

2 mM dNTPs

1 µl

10 µM 5'-Primer N1-1F

1 µl

10 µM 3'-Primer N1-IR

33 µl

Aqua bidest.

0,2 µl

AmpliTaq

4,8 µl

25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, (0.5 min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C), 7 min 72°C, 14 Zyklen

Elektrophoresebedingungen:

2 % Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker V).


147

Mutation C-344T. Der 409 bp-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym MaeII verdaut.

Ansatz:

125 µl

präamplifizierte DNA

0,5 µl

MaeII

12,5 µl

Puffer

Inkubation über Nacht bei 50°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2 % Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 5 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation A-40T. Der 409 bp-DNA-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym SspI verdaut.

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,5 µl

SspI

2,5 µl

NEBuffer SspI

9,5 µl

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

3% Nusieve® 3:1 Agarose, 80 V, 120 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation T1088A . Diese Mutation wurde mittels allelspezifischer PCR nach Amplifikation eines 418 bp-DNA-Abschnitts identifiziert.


148

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl

1:10 verdünnte, präamplifizierte DNA

2,5 µl

10x Taq-Puffer

2,5 µl

2 mM dNTPs

0,5 µl

10 µM 5'-Primer N1-5F

0,5 µl

10 µM 3'-Primer N1-6R bzw. N1-7R

16,5 µl

Aqua bidest.

0,1 µl

AmpliTaq

2,4 µl

25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C (0.5 min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C), 7 min 72°C, 14 Zyklen.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation C1095A. Diese Mutation wurde nach Amplifikation eines 435 bp-DNA-Abschnitts und anschließendem Verdau mit BbsI identifiziert.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl

1:10 verdünnte, präamplifizierte DNA

2,5 µl

10x Taq-Puffer

2,5 µl

2 mM dNTPs

0,5 µl

10 µM 5'-Primer N1-5F

0,5 µl

10 µM 3'-Primer N1-IIR

16,5 µl

Aqua bidest.

0,1 µl

AmpliTaq

2,4 µl

25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C (0.5 min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C), 7 min 72°C, 14 Zyklen.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker V).


149

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,5 µl

BbsI

2,5 µl

NEBuffer 2

9,5 µl

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

3% Nusieve® 3:1 Agarose, 80 V, 120 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation G445A. Der zur Identifizierung dieser in NAT1*11 enthaltenen Mutation amplifizierte 878 bp-Abschnitt wurde außerdem für die Mutationen in den NAT1-Allelen NAT1*17 und NAT1*22 verwendet. Zur Identifizierung von G445A erfolgte anschließend der Verdau des 878 bp-Abschnitts mit dem Restriktionsenzym BbsI.

PCR-Reaktionsbedingungen:

1 µl

genomische DNA

5 µl

10x Taq-Puffer

5 µl

2 mM dNTPs

1 µl

10 µM 5'-Primer N1-6F

1 µl

10 µM 3'-Primer N1-6R

33 µl

Aqua bidest.

0,2 µl

AmpliTaq

4,8 µl

25 mM MgCl2

Temperaturzyklus: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 30 s 60°C, 60 s 72°C), 7 min 72°C, 35 Zyklen.

Elektrophoresebedingungen:

1,2% Agarose, 120 V, 20 min, Auftragung von 7 µl Amplifikat und 3 µl Probenpuffer (Marker VI).


150

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,5 µl

BbsI

2,5 µl

NEBuffer 2

9,5 µl

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Identifizierung der Allele NAT1*14 und NAT1*15

Zur Identifizierung der in diesen Allelen enthaltenen Mutationen wurde ein 247 bp-DNA-Abschnitt unter Verwendung der Primer N1-4F und N1-8R amplifiziert.

PCR-Reaktionsbedingungen:

6,0 µl

25 mM MgCl2

5 µl

2 mM dNTPs

je 1 µl

10 µM 5’-Primer N1-4F und N1-8R

5 µl

10x Taq-Puffer

0,2 µl

AmpliTaq

1 µl

genomische DNA

31,8 µl

Aqua bidest.

Temperaturprofil: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 1 min 63°C, 30 s 72°C), 7 min 72°C, 35 Zyklen.

Mutation C559T. Der 247 bp-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym Ddel verdaut.

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,75 µl

DdeI

DdeI

2,5 µl

NEBuffer 3

9,5 µl

Aqua bidest.


151

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Mutation G560A. Der 247 bp-Abschnitt wurde mit dem Restriktionsenzym Alw26I verdaut.

Ansatz:

12,5 µl

präamplifizierte DNA

0,75 µl

Alw26I

0,25 µl

Rinderserumalbumin

2,5 µl

Puffer Y

9,0 µl

Aqua bidest.

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

Identifizierung der Allele NAT1*17 und NAT1*22

Mutation C190T. Zur Identifizierung dieser Mutation wurde der präamplifizierte
878 bp-DNA-Abschnitt mit Tsp509I verdaut.

Ansatz:

12.5 µl

präamplifizierte DNA

0.5 µl

Tsp509I

Tsp509I

2.5 µl

NEBuffer 1

9.5 µl

Aqua bidest.

2 h bei 65°C im Brutschrank inkubieren.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).


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Mutation A752T. Zur Identifizierung dieser Mutation wurde der präamplifizierte
878 bp-Abschnitt mit BglII verdaut.

Ansatz:

12.5 µl

präamplifizierte DNA

0.5 µl

BglII

2.5 µl

NEBuffer 3

9.5 µl

Aqua bidest.

Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Elektrophoresebedingungen:

2% Agarose, 80 V, 60 min, Auftragung von 25 µl Verdau und 10 µl Probenpuffer (Marker V).

4.4.3 Phänotypisierung hinsichtlich GSTT1-1

Puffer und Lösungen

Inkubationsansätze

Zur Phänotypisierung der Probanden wurde individuelles Hämolysat mit drei Konzentrationen des spezifischen Substrates Dichlormethan inkubiert. Die 1 ml-Reaktionsansätze enthielten folgende Komponenten:

125 µl Hämolysat

333 µl GSH-Lösung (12 mM)

2, 4 bzw. 8 µl Dichlormethan (Endkonzentrationen 31, 62 und 124 mM)

TRIS-HCl-Puffer, 20 mM, pH 7,4, zu einem Gesamtvolumen von 1 ml ergänzt

In einem 2 ml-Eppendorf®-Gefäß wurden Hämolysat, Puffer und GSH-Lösung gemischt und 5 min bei 37°C in einem Eppendorf®-Thermomixer vorinkubiert. Anschließend wurde die Schüttelfrequenz (700/min) eingestellt und das Substrat mittels einer Hamilton®-Spritze zugegeben. Sofort nach Substratzugabe wurde der Inhalt des jeweiligen Reaktionsgefäßes mit 5 s gründlich gemischt. Für jeden Probanden wurden neun substrathaltige (drei pro Konzentration) und zwei substratfreie Ansätze (Puffer anstelle Substrat) hergestellt. Nach Ablauf der Inkubationszeit (90 min bei 37°C) erfolgte der Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 333 µl 20%iger Trichloressigsäure (m/V) und eine Zentrifugation der Proben (10 min, 15 000g). 1 ml des jeweiligen Überstandes wurde weiterverarbeitet (siehe unten).


154

Kalibrierung

Zur Erstellung der individuellen Kalibrierfunktion jedes Probanden wurden folgende Ansätze verwendet:

125 µl Hämolysat

333 µl GSH-Lösung (12 mM)

Volumen wässrige Formaldehydlösung, so dass Endkonzentrationen von 200, 400 und 600 µM Formaldehyd im Ansatz vorlagen

TRIS-HCl-Puffer, 20 mM, pH 7,4, zu einem Gesamtvolumen von 1 ml ergänzt.

Die Kalibrierproben wurden sofort nach der Herstellung mit 333 µl 20%iger Trichloressigsäure (m/V) versetzt, zentrifugiert und vermessen. Für jede individuelle Kalibriergerade wurden neun formaldehydhaltige Proben (drei je Konzentration) und zwei Leermatrixproben (Puffer anstelle Formaldehydlösung) hergestellt.

Bestimmung des Formaldehyds

Bestimmung nach Nash. Je 1 ml des nach Proteinfällung und Zentrifugation gewonnenen Überstandes wurde in ein verschließbares Reagenzglas überführt und mit 1 ml frisch zubereitetem Nash-Reagenz versetzt. Nach einer 30-minütigen Temperierung bei 60°C (Wasserbad) wurden die Proben sofort abgekühlt (Eisbad) und nach 15 min bei 415 nm gegen den Leerwert der Kalibrierfunktion gemessen.

Bestimmung mittels HPLC. In einem 2 ml-Eppendorf®-Gefäß wurden 0,5 ml des Überstandes mit 0,5 ml frisch zubereiteter 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Lösung
(100 µM) gemischt und 45 min bei 37°C im Eppendorf®-Thermomixer inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden dazu 0,5 ml des internen Standards o-Nitrophenol (400 µM) gegeben.


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HPLC-Bedingungen:

Methodenoptimierung und -validierung

Außer bei der Optimierung der Inkubationszeit wurden für alle Untersuchungen zur Methodenetablierung und -validierung 1 ml-Reaktionsansätze verwendet. Von den oben beschriebenen Ansätzen abweichende Zusammensetzungen sind in den jeweiligen Teilkapiteln bzw. Abbildungs- und Tabellenlegenden angegeben.

Optimierung der Inkubationszeit. Verschließbare 15 ml-Reagenzgläser enthielten folgende Inkubationsansätze:

3,0 ml

Hämolysat

1,5 ml

GSH (12 mM)

76,8 µl

Dichlormethan (100 mM/Ansatz)

TRIS-HCl-Puffer (20 mM, pH 7,4) auf 12 ml ergänzt

Vor der Substratzugabe wurden die Ansätze 5 min bei 37°C im Wasserbad vorinkubiert. Nach der Substratzugabe und gründlichem Mischen wurde bei konstanter Temperatur zu folgenden Zeiten je 1 ml entnommen: 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180 min. Parallel dazu wurden Kontrollansätze mit hitzeinaktiviertem Hämolysat (60 min bei 100°C behandelt) mitgeführt.


156

4.4.4 Phänotypisierung hinsichtlich NAT1

Puffer und Lösungen

Inkubationsansätze

Zur Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich NAT1 wurde individuelles Hämolysat mit vier Konzentrationen des spezifischen Substrates
p-Aminobenzoesäure (PABA) inkubiert. In ein 2 ml-Eppendorf®-Gefäß wurden in der angegebenen Reihenfolge pipettiert und gemischt:

375 µl

0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 7,5

25 µl

Hämolysat

200 µl

Acetyl-CoA-regenerierendes System

200 µl

Acetyl-CoA (450 µM)

Der Ansatz wurde genau 5 min bei 37°C im Eppendorf®-Thermomixer vorinkubiert. Dann wurden 200 µl der auf 37°C vortemperierten Substratlösung in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben, so dass Endkonzentrationen von 10, 20, 50 und 100 µM PABA im Ansatz vorlagen. Es wurde 5 s gründlich gemischt und 10 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Pro Substratkonzentration erfolgte eine Doppelbestimmung, zusätzlich wurden je Proband eine substratfreie Leerprobe (200 µl Aqua bidest. anstelle Substrat) und je Analysentag zwei Enzymkontrollproben mit 100 µM PABA mitgeführt. Nach der Inkubation wurden die Proben mit 333 µl 15%iger Perchlorsäure versetzt, gründlich gemischt und
10 min bei 15 000g zentrifugiert.

Kalibrierung

Für die Ansätze wurden 25 µl Hämolysat, 575 µl Pufferlösung und 200 µl des Acetyl-CoA-regenerierenden System gemischt. Nach Zusatz von 333 µl 15 %iger Perchlorsäure (V/V) und gründlichem Mischen wurden je 100 µl PABA- und NAcPABA-Lösung zugefügt, so dass die Endkonzentrationen im Ansatz für PABA 10, 25 und 50 µM und für NAcPABA 5, 10 und 20 µM betrugen. Die Ansätze wurden 10 min bei 15 000g zentrifugiert.


158

Bestimmung der PABA- und NAcPABA-Konzentrationen

Nach der Zentrifugation wurden 900 µl des Überstandes mit 100 µl 500 µM
p-Acetamidophenol-Lösung gemischt.

HPLC-Bedingungen:

Methodenoptimierung und -validierung

Für alle Untersuchungen zur Methodenetablierung und -validierung wurden 1 ml-Reaktionsansätze verwendet. Von den oben beschriebenen Ansätzen abweichende Zusammensetzungen sind in den jeweiligen Teilkapiteln bzw. Abbildungs- und Tabellenlegenden angegeben.

Prüfung auf nichtenzymatische Zersetzung von NAcPABA. NAcPABA-Konzentrationen: 8, 10, 20 µM/Ansatz, Doppelbestimmung, 1 Leerwert (Aqua bidest. anstelle NAcPABA)

Ansatz:

In ein Eppendorfgefäß werden in der angegebenen Reihenfolge pipettiert:

375 µl

0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 7,5

25 µl

Hämolysat

200 µl

Acetyl-CoA-regenerierendes System

200 µl

Acetyl-CoA (450 µM)

Nach gründlichem Mischen wurden 333 µl 15%ige Perchlorsäure zugesetzt. Nach


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Zugabe von 200 µl der auf 37°C vortemperierten Produktlösung wurde 5 s gemischt und 10 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert.

Prüfung auf enzymatische Zersetzung von NAcPABA. Es wurde der gleiche Ansatz wie bei der Prüfung auf nichtenzymatische Zersetzung verwendet. Der Ansatz wurde 5 min bei 37°C im Eppendorf-Thermomixer vorinkubiert. Dann wurden 200 µl der auf 37°C vortemperierten NAcPABA-Lösung zugegeben, so dass im Ansatz Konzentrationen von 2, 4, 8, 10 und 20 µM vorhanden waren. Nach 5 s Mischen wurde 10 min bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Abbruch der Reaktion und Weiterbehandlung erfolgten wie bei regulären Inkubationsansätzen.

Bestimmung des Hämoglobingehalts

Die Bestimmung des Hämoglobingehalts von Blutproben wurde unter Verwendung des Hämoglobin-Testkits Merckotest® von Merck durchgeführt. Sie beruht auf der Oxidation des Hämoglobin zu Hämiglobin durch Kaliumhexacyanoferrat-III-Lösung. Hämiglobin wird anschließend mit Kaliumcyanid-Lösung zu einem stabilen, bei 540 nm fotometrisch messbaren Komplex umgesetzt. Zur Kalibrierung wurden die im Testkit enthaltenen Hämiglobincyanid-Standardlösungen verwendet.


160

4.5 Datenverarbeitungsprogramme und statistische Testmethoden

Die Anpassung von Kurvenfunktionen an experimentell ermittelte Daten (lineare Regression, nichtlinearisiertes Kurvenfitting) erfolgte mit dem Programm Microcal Origin Version 4.1 von Microcal Software Inc. Northhampton, USA.

Chemische Formeln wurden mit dem Programm C-Design®, Version 2.2, FoBaSoft GmbH, Deutschland, gezeichnet.

Für alle statistischen Testmethoden sowie die Schätzung von Mittelwerten, Medianen und Vertrauensbereichen wurde das Computerprogramm SYSTAT, Version 6.0.1, SPSS Inc. USA, verwendet.

÷2-Test, Zweiseitiger exakter Fisher-Test. Diese Tests wurden zur Erkennung der Signifikanz mit p < 0,05 bei unterschiedlichen Häufigkeiten verwendet. Der zweiseitige exakte Fisher-Test ist speziell für sehr kleine Stichprobenumfänge geeignet. Im Einzelnen wurde getestet auf:

Mann-Whitney-U-Test. Der Mann-Whitney-U-Test ist ein nichtparametrisches Verfahren und damit geeignet für Stichproben mit nicht normalverteilten Beobachtungswerten. Er ist anwendbar bei kleinen Stichproben und unterschiedlichem Stichprobenumfang. Es wurde auf Signifikanz der Unterschiede in den Vmax- sowie Km-Werten der Individuen jeweils zweier NAT1-Genotypen geprüft. P < 0,10 führte zur Ablehnung der Nullhypothese.

Test nach Kolmogoroff-Smirnoff. Die Km-Werte der GSTT1-1-aktiven Probanden sowie die Einzelwerte der Kalibrierkonzentrationen von PABA und NAcPABA wurden dem Kolmogoroff-Smirnoff-Testverfahren „one sample“


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unterzogen. Dabei wurde aus den experimentell ermittelten Daten eine empirische Verteilungsfunktion aufgestellt und mit der Verteilungsfunktion einer geschätzten Standardnormalverteilung verglichen. P > 0,05 führte zur Annahme der Null-hypothese.

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