Bruhn, Claudia: Untersuchungen zum genetischen Polymorphismus der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase T1-1 und Arylamin-N-Acetyltransferase 1
Untersuchungen zum genetischen Polymorphismus
der humanen Biotransformationsenzyme
Glutathion-S-Transferase T1-1
und
Arylamin-N-Acetyltransferase 1
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)


im Fach Pharmazie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Pharmazeutin Claudia Bruhn ,
geboren am 9. März 1966 in Freiberg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
Prof. Dr. rer. nat. H.-H. Borchert
Prof. Dr. med. J. Brockmöller
Prof. Dr. rer. nat. M. Melzig

eingereicht: 11. Oktober 2000

Tag der mündlichen Prüfung: 12. März 2001

Zusammenfassung

Die genetischen Polymorphismen der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase Theta 1 (GSTT1-1) und Arylamin-N-Acetyltransferase 1 (NAT1) wurden zu Beginn der neunziger Jahre entdeckt. Es besteht derzeit ein großes Interesse an Untersuchungen zur Häufigkeit der Allele, zu deren phänotypischen Konsequenzen und pharmakologisch-toxikologischer Relevanz.

Für die Untersuchungen in dieser Arbeit standen die Blutproben von 314 gesunden, deutschen Probanden mit bekanntem GSTT1- und/oder NAT1-Genotyp zur Verfügung. Es wurden Methoden etabliert und validiert, um im Hämolysat die Reaktionsgeschwindigkeiten bei der Umsetzung des GSTT1-1-spezifischen Substrats Dichlormethan sowie des NAT1-spezifischen Substrats p-Aminobenzoesäure mit vertretbarem Laboraufwand zu bestimmen.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine vollständige Übereinstimmung zwischen der homozygoten GSTT1-Gendeletion und dem defizienten Phänotyp bei 19,3% der Individuen gefunden. Bei 80,7% der Probanden war durch Genotypisierung mindestens ein GSTT1*A-Allel identifiziert worden. Mit Hilfe der Phänotypisierung konnten in dieser Gruppe zwei Phänotypen, der intermediäre und der hoch aktive Phänotyp, voneinander abgegrenzt werden. Damit bestand der Vorteil der Phänotypisierung darin, eine trimodale Verteilung der GSTT1-1-Aktivität nachweisen zu können. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig in einer größeren deutschen Population gezeigt.

Weiterhin wurden in dieser Arbeit untersucht, ob zwei Phosphonsäurediester des Glutathions, die sich als kompetitive bzw. nicht-kompetitive Hemmstoffe anderer GST-Isoenzyme erwiesen hatten, sowie der Arzneistoff Tactin, ein Medikament zur Behandlung des Mobus Alzheimer eine Hemmwirkung auf die GSTT1-1-vermittelte Umsetzung von Dichlormethan besitzen.

Gegenwärtig sind 24 verschiedene NAT1-Allele bekannt, wobei einige davon sehr selten auftreten. In der hier verwendeten deutschen Population waren sechs NAT1-Allele identifiziert worden. In den Blutproben der 105 Probanden wurde die funktionelle Konsequenz dieser Allele bestimmt. In vorliegender Arbeit wurde erstmalig für einen homozygoten Träger des NAT1*15-Allels das Fehlen jeglicher Enzymaktivität nachgewiesen.

Bezüglich der Häufigkeit der GSTT1-Gendefizienz sowie des NAT1*11-Allels wurden in vorliegender Arbeit zwischen europäischen, d.h. einander ethnisch nahestehenden Bevölkerungsgruppen statistisch signifikante Unterschiede gefunden.

Schlagwörter:
GSTT1-1, NAT1, genetischer Polymorphismus, Genotyp-Phänotyp-Beziehungen

Abstract

The genetic polymorphisms of the glutathione S-transferase theta 1-1 (GSTT1-1) and the arylamine N-acetyltransferase 1 (NAT1) were found in the beginning of the 90's.

There is a great interest in genotype-phenotype relations in individuals and in pharmacological and toxicological consequences of the polymorphisms.

In this work, hemolysate of 314 healthy German volunteers was used for several genotyping and phenotyping methods.

A concordance between the homozygous GSTT1 gene deletion and the enzyme deficiency in 27 of 140 individuals (19,3%)was found. In 80,7% of the volunteers a discrimination between intermediate and rapid metabolizers was possible in a German population for the first time.

In addition it was proved, if the ex-vivo metabolism of dichloromethane, catalyzed by GSTT1-1, is inhibited by phosphono-analoga of glutathione or tacrine, a drug for treatment of Alzheimers' disease.

The NAT1 polymorphism is characterized by several point mutations and deletions or insertions of oligonucleotides. 24 NAT1 alleles are known so far. In this work, the functional consequences of various NAT1 allele combinations in the genotypes of 105 individuals were determinated.

There were found interethnic differences in the frequency of the NAT1*11 allele and the frequency of the homozygous gene deletion between the German and other Caucasien populations.

Keywords:
GSTT1-1, NAT1, genetic polymorphism, genotype-phenotype relation


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] [150] [151] [152] [153] [154] [155] [156] [157] [158] [159] [160] [161] [162] [163] [164] [165] [166] [167] [168] [169] [170] [171] [172] [173] [174] [175] [176] [177] [178] [179] [180] [181] [182] [183] [184] [185] [186] [187] [188] [189] [190] [191] [192] [193] [194] [196] [197]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zum genetischen Polymorphismus der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase T1-1 und Arylamin-N-Acetyltransferase 1
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
1 Einleitung und Problemstellung
2 Literaturübersicht
2.1Glutathion-S-Transferasen
2.1.1Allgemeine Struktur und Nomenklatur der Glutathion-S-Transferasen
2.1.2Reaktionen und Substrate der Glutathion-S-Transferasen
2.1.3Inhibitoren der Glutathion-S-Transferasen mit Bedeutung für die Modulation der Zytostatikaresistenz
2.1.4Erkenntnisstand zu Glutathion-S-Transferasen der Klasse Theta
2.2Arylamin-N-Acetyltransferasen
2.2.1Allgemeine Struktur und Nomenklatur der Arylamin-N-Acetyltransferasen
2.2.2Reaktionen und Substrate der Arylamin-N-Acetyltransferasen
2.2.3Erkenntnisstand zur Arylamin-N-Acetyltransferase 1
3 Untersuchungen, Ergebnisse und Diskussion
3.1Glutathion-S-Transferase Theta 1-1
3.1.1Genotypisierung der Probanden
3.1.2Phänotypisierung der Probanden
3.1.3Vergleich und Diskussion der Ergebnisse der Geno- und Phänotypisierung der Probanden hinsichtlich der Glutathion-S-Transferase T1-1
3.1.4Ergebnisse und Diskussion der Untersuchungen mit potentiellen Inhibitoren und Substraten der Glutathion-S-Transferase T1-1
3.2Arylamin-N-Acetyltransferase 1
3.2.1Genotypisierung der Probanden
3.2.2Phänotypisierung der Probanden
3.2.3Vergleich und Diskussion der Ergebnisse der Geno- und Phäno-typisierung der Probanden hinsichtlich der Arylamin-N-Acetyltransferase 1
3.2.4Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
4 Experimenteller Teil
4.1Gewinnung des Untersuchungsmaterials
4.2Geräte und Verbrauchsmaterialien
4.3Chemikalien
4.4Methoden
4.4.1Genotypisierung hinsichtlich GSTT1
4.4.2Genotypisierung hinsichtlich NAT1
4.4.3Phänotypisierung hinsichtlich GSTT1-1
4.4.4Phänotypisierung hinsichtlich NAT1
4.5Datenverarbeitungsprogramme und statistische Testmethoden
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Kooperationen
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Nomenklatur und Einteilung der humanen Glutathion-S-Transferasen (nach Mannervik
et al., 1992).
Tab. 2: Ausgewählte Substrate der humanen GST-Isoenzyme der Klassen Alpha, Mu und Pi.
Tab. 3: Mittlere Reaktionsgeschwindigkeiten der Umsetzung spezifischer Substrate der GSTT1-1; Untersuchungsobjekt: humane Erythrozyten.
Tab. 4: Geno- und Phänotypisierungsstudien zur Häufigkeit der GSTT1-Gendeletion bzw.
GSTT1-1-Enzymdefizienz in verschiedenen ethnischen Gruppen.
Tab. 5: Überblick über Studien zum möglichen Einfluss des GSTM1-1- bzw. GSTT1-1-Poly-morphismus auf die Hepatotoxizität von Tacrin.
Tab. 6: Übersicht zum Erkenntnisstand zur Mutagenität von GSTT1-1-Substraten und zum Einfluss des genetischen Polymorphismus des Enzyms; Quellenangaben im Text.
Tab. 7: Ausgewählte Substrate der humanen Arylamin-N-Acetyltransferasen NAT1 und NAT2.
Tab. 8: Mittlere Reaktionsgeschwindigkeiten der Umsetzung spezifischer NAT1-Substrate.
Tab. 9: Verhältnis von PABA, PABA-Glu, NAcPABA, NAcPABA-Glu, PAHA und NAcPAHA im
24-h-Urin nach einmaliger Applikation von 800 mg PABA, Gesamtwiederfindung 98% (nach Chan et al., 1988).
Tab. 10: Humane NAT1-Allele ().
Tab. 11: Erkenntnisstand zur interethnischen Verbreitung der NAT1-Allele.
Tab. 12: Erkenntnisstand zur funktionellen Relevanz von NAT1-Allelen.
Tab. 13: Ergebnisse der GSTT1-Genotypisierung von 300 Probanden.
Tab. 14: Häufigkeit des GSTT1*0/0-Genotyps bei männlichen (m) und weiblichen (f) Probanden in vier ethnischen Gruppen (Deutsche: eigene Daten; Schweden: Warholm et al., 1995; Chinesen, Malaysier und Inder: Lee et al., 1995).
Tab. 15: Reaktionsgeschwindigkeit der Formaldehydbildung bei verschiedenen Verfahren der Probenvorbereitung (1 ml-Ansatz, Dichlormethan: 100 mM, GSH: 4 mM/Ansatz, n = 2).
Tab. 16: Mittlerer Substratverbrauch im Inkubationszeitraum (90 min,125 µl Hämolysat, 4 mM GSH); verwendet wurden jeweils die Mittelwerte von Substrat- und Produktmenge (n = 3).
Tab. 17: WFR des Formaldehyds in der Probenmatrix. Herstellung der Ansätze wie unter Kalibrierung (Kapitel 4.4.3 ) angegeben. Die WFR ist der Mittelwert aus n = 3 bzw. 6.
Tab. 18: Kontrolle der seriellen Präzision und der Richtigkeit der Formaldehydbestimmung nach Nash (n = 6 je Konzentration und Tag).
Tab. 19: Zeitabhängige Präzision der Nash-Methode. Bestimmung der Formaldehydbildung in Ansätzen mit 125 µl Hämolysat, GSH 4 mM/Ansatz, Formaldehydlösung und Puffer ad 1 ml an 29 Messtagen.
Tab. 20: Prozentuale Abweichung der Qualitätskontrollproben der Formaldehydbestimmung nach Nash vom Sollwert
Tab. 21: Zuordnung der hinsichtlich GSTT1-1 phänotypisierten Probanden (n = 140) zu den drei Phänotypen.
Tab. 22: Genotyp- und Phänotyp-Häufigkeiten der GSTT1-1-Studie im Vergleich mit Hardy-Weinberg's Theorem.
Tab. 23: PCR-Produkte der drei GSTT1-Genotypen bei der Methode nach Sprenger et al. (2000).
Tab. 24: Mutationen der mittels Genotypisierung in der Population von 314 Probanden identifizierten NAT1-Allele.
Tab. 25: Häufigkeiten der NAT1-Allele in einer unselektierten Population von 314 gesunden deutschen Probanden.
Tab. 26: Häufigkeiten der NAT1-Genotypen in einer unselektierten Population von 314 gesunden deutschen Probanden.
Tab. 27: Vergleich der Häufigkeiten der heterozygoten Träger von NAT1-Allelen mit dem Erwartungswert, berechnet mit der mathematischen Gleichung der Hardy-Weinberg-Regel.
Tab. 28: Häufigkeiten ausgewählter NAT1-Allele in europäischen Bevölkerungsgruppen.
Tab. 29: Reaktionsgeschwindigkeit der Acetylierung von PABA bei verschiedenen Verfahren der Probenvorbereitung (1 ml-Ansatz, 50 µl Hämolysat, PABA: 100 µM, n = 2).
Tab. 30: Substratverbrauch bei den zur Phänotypisierung der Probanden verwendeten PABA-Konzentrationen bei 25 µl und 50 µl Hämolysat desselben Probanden (Ansatzvolumen 1 ml, Inkubationszeit 10 min, n = 2).
Tab. 31: Konzentration von PABA und NAcPABA in % der Konzentration der Ausgangslösung nach Lagerung bei -80°C (n = 2).
Tab. 32: Stabilität der Analyten während der Verweildauer im automatischen Probengeber der HPLC-Anlage bei Raumtemperatur; wässrige PABA- und NAcPABA-Lösungen der angegebenen Konzentrationen, n = 2.
Tab. 33: Wiederfindungsrate von PABA und NAcPABA in der Probenmatrix. Herstellung der Ansätze wie unter Kalibrierung (Kapitel 4.4.4 ) angegeben. Die WFR ist der Mittelwert aus n = 6.
Tab. 34: Kontrolle der seriellen Präzision und der Richtigkeit der HPLC-Bestimmung von PABA
(n = 6 je Konzentration und Tag).
Tab. 35: Kontrolle der seriellen Präzision und der Richtigkeit der HPLC-Bestimmung von NAcPABA (n = 6 je Konzentration und Tag).
Tab. 36: Zeitabhängige Präzision der HPLC-Bestimmung von NAcPABA. Ansätze mit 25 µl Hämolysat, 375 µl Puffer, 200 µl Acetyl-CoA-regenerierendem System und 200 µl NAcPABA-Lösung zum Erreichen der angegebenen Endkonzentrationen.
Tab. 37: Prozentuale Abweichung der Qualitätskontrollproben der HPLC-Bestimmung von NAcPABA vom Sollwert.
Tab. 38: Mediane und Spannweiten (Range) der Vmax- und Km-Werte der untersuchten Probanden in Bezug zu ihrem Genotyp.
Tab. 39: Statistischer Vergleich der Vmax-Werte (bezogen auf mg Hämoglobin) der NAT1-Genotypen (Mann-Whitney-U-Test).
Tab. 40: Postulierte Phänotypen aller Individuen dieser Studie (n = 314). Klassifizierung auf Grundlage der Phänotypisierung der Probanden, wobei nur ausgewählte Individuen der angegebenen Genotypen untersucht worden waren. NAT1*4/*15 in Klammern, da kein Proband dieses Genotyps phänotypisiert wurde.
Tab. 41: Genotypen und Phänotypen der 48 Probanden, die im Rahmen dieser Arbeit hinsichtlich NAT1 und GSTT1-1 phänotypisiert wurden.
Tab. 42: Sequenzen und Positionen der zur Identifizierung des GSTT1-Gens verwendeten Primer.
Tab. 43: Sequenzen und Positionen der zur Identifizierung der NAT1-Mutationen verwendeten Primer.
Tab. 44: Restriktionsendonukleasen zur Erkennung der NAT1-Mutationen.

Abbildungsverzeichnis

Schema 1: Entgiftung und metabolische Aktivierung bei der GST-vermittelten Konjugation elektrophiler Substrate mit GSH.
Schema 2: Metabolische Aktivierung von Dibromethan durch Bildung eines Episulfonium-Ions über den GSTT1-1-Weg und Bindung an die DNA in N7-Position des Guanins (nach Hengstler et al., 1998).
Schema 3: Biotransformation von Dichlormethan (modifiziert nach Andersen et al., 1987).
Schema 4: NAT-katalysierte N-Acetylierung eines Amins.
Schema 5: Entgiftung und metabolische Aktivierung von Arylaminen (modifiziert nach Hein et al., 1993 und Grant et al., 1997). DAC: Deacetylierung; OAT: NAT-katalysierte O-Acetylierung; NOAT: NAT-katalysierter intramolekularer N,O-Acetyltransfer.
Schema 6: Formeln von PABA, NAcPABA, PAHA und NAcPAHA.
Schema 7: Mutationen im NAT1-Gen (nach Lo-Guidice et al., 2000). 5‘, 3‘UTR: untranslated region, Bereiche außerhalb der proteinkodierenden Region des Gens.
Abb. 1: Elektrophoresemuster nach Analyse der Amplifikate der GSTT1-PCR (von links nach rechts). Spur 1: DNA-Größenstandard. Spuren 2 und 3: Amplifikate von zwei Trägern des GSTT1*A-Allels. Spur 4: keine Auswertung, da das Amplifikat des internen Standards nicht detektiert werden konnte. Spur 5: Amplifikat eines Probanden mit GSTT1-Gendeletion.
Schema 8: Prinzip der Formaldehydbestimmung nach Nash (Hantzsch-Reaktion).
Schema 9: Umsetzung von Formaldehyd mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin bei Anwendung der HPLC-Methode.
Abb. 2: Bildung von 2,4-Dinitrophenylhydrazon bei 25°C (-?-) und 37°C (-¦-). Analyse zweier Gemische aus je 10,0 ml verdünnter Formaldehydlösung (100 µM) und 10,0 ml 2,4-Dinitrophenyl-hydrazinlösung (100 µM) durch Inkubation bei 25°C bzw. 37°C. Entnahme von 1 ml und HPLC-analyse in den entsprechenden Zeitintervallen (n = 1).
Abb. 3: HPLC-Analyse des Gemisches aus 2,4-Dinitrophenylhydrazin (RT: 5,76 min), internem Standard o-Nitrophenol (RT: 6,89 min) und 2,4-Dinitrophenylhydrazon (RT: 10,79 min).
Abb. 4: Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Formaldehydbildung vom eingesetzten Hämolysatvolumen (62 mM Dichlormethan und 4 mM GSH in einem Ansatzvolumen
von 1 ml, n = 3, ± R).
Abb. 5: Zeitabhängigkeit der spezifischen Formaldehydbildung (nmol/µl Hämolysat) im unbehandeltem (-full-square-) und hitzeinaktivierten (-full-square-) Hämolysat (1 ml-Ansätze mit 125 µl Hämolysat, 100 mM Dichlormethan und 4 mM GSH/Ansatz, n = 2; n = 1 bei hitzeinaktivierten Proben).
Abb. 6: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit (v) von der Substratkonzentration (s) für die durch GSTT1-1 katalysierte Bildung von Formaldehyd aus Dichlormethan.
Abb. 7: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Glutathion-Konzentration bei einer Substratkonzentration von 124 mM, 90 min Inkubationszeit, 125 µl Hämolysat (n = 2).
Abb. 8: Kalibrierfunktion für die Formaldehydbestimmung nach Nash (n = 9 je Konzentration).
Abb. 9: Relative Abweichung der aus der Gleichung der Kalibrierfunktion berechneten Konzentrationen der Kalibrierproben (n = 9 je Konzentration) vom Sollwert. ............ 15%-Akzeptanz-grenze
Abb. 10a - c, siehe auch folgende Seite: Qualitätsregelkarten zur Kontrolle von zeitabhängiger Präzision und Richtigkeit der Formaldehydbestimmung bei drei Konzentrationen: (a) 200 µM; (b) 400 µM; (c) 600 µM;( __ Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit: Sollwert ± 20%; ........... Warngrenze: Sollwert ± zweifache Standardabweichung, berechnet aus den Einzelproben; ---------- Kontrollgrenze: Sollwert ± dreifache Standardabweichung).
Abb. 11: Häufigkeitsverteilung der Reaktionsgeschwindigkeiten im Hämolysat von 140 Probanden bei der GSTT1-1-katalysierten Umsetzung von Dichlormethan (Substratkonzentration: 124 mM).
Abb. 12: Formaldehydbildung in Ansätzen mit 124 mM Substrat (-¢-) und Leerwerte in substratfreien Ansätzen (-£-) mit Hämolysat eines GSTT1-1-defizienten Probanden (jeweils n = 1).
Abb. 13: Darstellung der reziproken Reaktionsgeschwindigkeit 1/v eines GSTT1-1-aktiven Probanden in Abhängigkeit von der reziproken Substratkonzentration 1/s nach Lineweaver-Burk (ungewichtete lineare Regression der Einzelwerte, n = 3).
Abb. 14: Häufigkeitsverteilung der Km-Werte der GSTT1-1-aktiven Probanden der Studie
(n = 113).
Abb. 15: Häufigkeitsverteilung der Vmax-Werte der GSTT1-1-aktiven Probanden (n = 113).
Abb. 16: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit im Hämolysat eines Probanden von der Konzentration an potentiellem Inhibitor; (a) Substanz 3, (b) Substanz 4 (1 ml-Ansatz mit 125 µl Hämolysat, 4 mM GSH und 124 mM Dichlormethan, n = 3 je Konzentration, <b> </b> ± R).
Abb. 17: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Tacrin-Konzentration bei einer Dichlormethan-Konzentration von 124 mM (n = 2 bzw.3)
Abb. 18: Doppelt reziproke Darstellung der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration in Gegenwart verschiedener Tacrin-Konzentrationen (5 = n = 8 je Konzen-tration)
Schema 10: Möglicher Mechanismus für die Bioaktivierung von Tacrin durch CYP1A2 und die Entgiftung reaktiver Metaboliten durch GST (modifiziert nach Madden et al., 1995).
Abb. 19: HPLC-Analyse eines Gemisches aus internem Standard p-Acetamidophenol
(RT: 4,35 min), PABA (RT: 5,45 min) und NAcPABA (RT: 6,97 min).
Abb. 20: Abhängigkeit der Acetylierungsgeschwindigkeit von PABA vom eingesetzten Hämolysatvolumen (50 µM PABA, Ansatzvolumen 1 ml, n = 3, ± R).
Abb. 21: Zeitabhängigkeit der Acetylierung von PABA (50 µl Hämolysat, 100 µM PABA, Ansatzvolumen 1 ml, n = 4, ± R).
Abb. 22: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit (v) von der Substratkonzentration (s) für die durch NAT1 katalysierte Acetylierung von PABA (50 µl Hämolysat in einem Ansatzvolumen von
1 ml, Inkubationszeit 10 min, n = 4).
Abb. 24: Relative Abweichung der aus der Gleichung der Kalibrierfunktion berechneten Konzentrationen der PABA-Kalibrierproben vom Sollwert (......... Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit).
Abb. 23: Kalibrierfunktion für die HPLC-Bestimmung von PABA unter Verwendung des internen Standards p-Acetamidophenol (n = 6 je Konzentration).
Abb. 25: Kalibrierfunktion für die HPLC-Bestimmung von NAcPABA unter Verwendung des internen Standards p-Acetamidophenol (n = 6 je Konzentration).
Abb. 26: Relative Abweichung der aus der Gleichung der Kalibrierfunktion berechneten Konzentrationen der NAcPABA-Kalibrierproben vom Sollwert (......... Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit).
Abb. 27a-c: Qualitätsregelkarten zur Kontrolle von zeitabhängiger Präzision und Richtigkeit der Bestimmung von NAcPABA bei drei Konzentrationen: (a) 5 µM; (b) 10 µM; (c) 20 µM; ( __ Akzeptanzgrenze für die Richtigkeit: Sollwert ± 20%; ....... Warngrenze: Sollwert ± zweifache Standardabweichung, berechnet aus den Einzelproben; ------ Kontrollgrenze: Sollwert ± dreifache Standardabweichung).
Abb. 28: Häufigkeitsverteilung der NAT1-katalysierten Reaktionsgeschwindigkeit bei der N-Acetylierung von PABA (Substratkonzentration 100 µM, n = 104).
Abb. 29: Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit bei der N-Acetylierung von PABA in Abhängigkeit von der Substratkonzentration im Hämolysat eines Probanden.
Abb. 30: Vmax-Werte der hinsichtlich NAT1 phänotypisierten Probanden (n = 105).

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Fri Jun 8 12:39:32 2001