3 ZUSAMMENFASSUNG

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Das Pseudotetrasaccharid Acarbose hat als Inhibitor gegenüber Hydrolasen α-1,4-glykosidischer Bindungen medizinische Bedeutung bei der Therapie des Diabetes mellitus Typ II erlangt. Das Acarbose-Biosynthese-Gencluster (acb) des grampositiven Produzenten Actinoplanes sp. wurde identifiziert und Genprodukte z. T. charakterisiert. Das abgeleitete Modell zum AcarboseMetabolismus beschreibt einen extra- und intrazellulären Acarbosekreislauf, bei dem das Pseudotetrasaccharid analog den Eisen-Siderophoren als Carbophor fungiert. Dabei wird das Molekül im Zytoplasma synthetisiert, in das umgebende Medium abgegeben und durch das Zusammenwirken zweier extrazellulärer Enzyme nach Stärkehydrolyse mit einer unterschiedlichen Anzahl an Glukosemonomeren beladen. Nach dem vermuteten Re-Import über ein Bindeprotein-abhängiges ABC-Transportsystem stünde dem Organismus dann ein Gewinn an Glukosemolekülen zur Verfügung. Neben diesem Vorteil gegenüber Nahrungskonkurrenten im Habitat fungiert Acarbose ebenso als Hemmer der artfremden extrazellulären α-Amylasen. Über die Acarbose-vermittelte Ausbeute an Kohlenstoff- und Energiequelle hinaus sollte Actinoplanes sp. im Stärke-reichen Habitat auch über eine Kapazität zur Aufnahme von Maltose und Maltodextrinen verfügen.

Im ersten Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die ökologische Funktion des Pseudotetrasaccharids verifiziert und ausgeweitet. Untersuchungen zum Einfluss auf den Maltodextrin-Stoffwechsel von E. coli haben gezeigt, dass Acarbose gleichsam Maltose effektiv durch das Maltose-Importsystem MalEFGK2 als Substrat erkannt und in die Zellen importiert wird. Demgegenüber sind die maltolytischen Enzyme im Zytoplasma nicht in der Lage, diese Substanz als C-Quelle zu nutzen. Die intrazelluläre Akkumulation von Acarbose führt zum Absterben der Zellen.

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Da eine alleinige Hemmwirkung des Pseudozuckers auf Exoenzyme der Nahrungskonkurrenten bisher keine befriedigende Erklärung für einen effizienten Wettbewerb um Kohlenstoffquellen lieferte, kann nunmehr von einem ausgedehnteren und ökonomisch sinnvolleren Konkurrenzverhalten von Actinoplanes sp. gesprochen werden. Von den im Verlauf der Aktivität der extrazellulären α-Amylase des Acarboseproduzenten selbst bereitgestellten Maltosacchariden aus Stärke profitieren artfremde Mikroorganismen nicht, da neben den Exoenzymen auch die Maltodextrin-Aufnahmesysteme in ihrer Funktion gehemmt sind.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine für Actinoplanes sp. geforderte Kapazität zur Aufnahme von Maltose und Maltodextrinen in vivo gefunden und in Transportexperimenten mit radioaktiv markierten Zuckern charakterisiert. Festgestellt werden konnte, dass die Transportaktivität wahrscheinlich über zwei Bindeprotein-abhängige ABC-Importer mit multiplem Substratspektrum realisiert wird. Während die Substratspezifitäten überlappend sind, ist nur eines der beiden Systeme durch Acarbose inhibierbar. Aus dem Kulturüberstand konnte nach Anzucht der Zellen mit verschiedenen Kohlenstoffquellen ein potentielles, Acarbose-insensitives Maltodextrin-Bindeprotein isoliert werden.

Das innerhalb des Acarbose-Biosynthese-Genclusters kodierte Bindeprotein-abhängige ABCImportsystem AcbHFG wurde zur Ermittlung der Funktion im Acarbose-Metabolismus heterolog in E. coli und S. lividans synthetisiert und z. T. erfolgreich gereinigt. Ein im acb-Cluster fehlendes Gen für ein den Transportkomplex möglicherweise vervollständigendes ABC-Protein wurde in DNA-DNA-Hybridisierungsexperimenten mit dem Gen des MsiK-Proteins aus S. lividans detektiert und kloniert. Ko-Elutionsexperimente weisen auf die Ausbildung eines AcbFG-MsiKKomplexes hin. In Substrat-Bindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte für das AcbH-Protein eine Interaktion mit Acarbose und längerkettigen Derivaten, nicht jedoch mit Maltose/Maltodextrinen beobachtet werden. Dieser Befund unterstützt die Hypothese zur Beteiligung des Komplexes am Re-Import des beladenen Carbophors.


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22.09.2006