4 EINLEITUNG

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Der Sekundärmetabolit Acarbose (Pseudomaltotetraose) ist als Inhibitor von Hydrolasen α1,4-glykosidischer Bindungen, vornehmlich Maltasen und Saccharasen, bekannt geworden. Seit 1990 wird Acarbose unter dem Namen Glucobay® als Wirkstoff zur Therapie des Diabetes mellitus Typ II eingesetzt. Das Biosynthese-Gencluster des Acarboseproduzenten Actinoplanes sp. ist identifiziert worden (STRATMANN, 1997). Man findet eine Reihe von Genen für die Biosynthese von Acarbose und für Komponenten eines ABC-Exportsystems. Daneben sind auch katabole Enzyme und ein ABC-Importsystem kodiert. Dieser für einen Sekundärstoffwechsel ungewöhnliche Befund führte zu der Vorstellung eines intra- und extrazellulären Acarbose-Kreislaufs, der einen hochentwickelten Stärke-Metabolismus darstellen könnte. Induktoren der Synthese einiger der Schlüsselenzyme des AcarboseMetabolismus sind Maltose und Maltotriose. Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren die Charakterisierung der Importkapazität von Actinoplanes sp. für Maltose, Maltotriose und Acarbose sowie die Ermittlung der Substratspezifität des ABC-Importsystems. Weiterhin wurden Untersuchungen zum Einfluss von Acarbose auf den Maltose/MaltodextrinStoffwechsel von Escherichia coliK12 durchgeführt. Zur Darstellung des Forschungsthemas werden daher im Folgenden die bisherigen Kenntnisse zum Acarbose-Metabolismus und die Funktionsweise und Charakteristika von ABC-Transportern sowie der Maltose-Metabolismus von E. coli aufgeführt.

4.1  Acarbose-Metabolismus in Actinoplanes sp.

Das grampositive Bakterium Actinoplanessp. ist Mitglied der Gattung Actinoplanes und wie die Gattung Streptomyces in die Gruppe der Actinomyceten einzuordnen. ActinoplanesStämme besiedeln verschiedenste Habitate und konnten aus einer Vielzahl unterschiedlicher Böden, marinen Habitaten sowie Binnengewässern isoliert werden. Charakteristisch ist das filamentöse Wachstum, welches zur Ausbildung von Substratmycelien führt (PARENTI & CORONELLI, 1979; JENSEN ET AL., 1991). Eine Besonderheit liegt in der Unempfindlichkeit gegenüber der N-Acetylmuramidase Lysozym, da innerhalb der Peptidoglykanstruktur NAcetylmuraminsäure durch N-Glykolylmuraminsäure substituiert ist (VOBIS, 1989). Actinomyceten zeichnen sich durch die Synthese diverser Sekundärmetabolite aus (z. B. Antibiotika wie Thiostrepton und Streptomycin; GRÄFE, 1992). Über die Suche nach antimikrobiellen Substanzen hinaus wurde seit den 60iger Jahren in verschiedenen ScreeningVerfahren das Auffinden weiterer Wirkstoffe für industrielle oder medizinische Anwendungen angetrieben. So wurde in der Kulturbrühe von Actinoplanes sp. SE50 der hitze- und säurestabile α-Glukosidase-Inhibitor Acarbose entdeckt (FROMMER ET AL., 1975; TRUSCHEIT ET AL., 1981). Verbesserte Abkömmlinge dieses Stammes werden heute industriell in Fermentationsverfahren durch die Bayer AG eingesetzt, zwei abgelegte Derivatstämme (SE50/110 und SN223/29) waren Grundlage der vorliegenden Arbeit.

Acarbose (Abbildung 4.1) ist ein Pseudotetrasaccharid, analog zu Maltotetraose, und Komponente eines komplexen Gemisches kürzerer und längerer Homologe, die in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des angebotenen Stärkehydrolysats als Kohlenstoffquelle gebildet werden (SCHMIDT ET AL., 1977). Kernstruktur ist das für die Hemmwirkung essentielle Pseudodisaccharid Acarviosin (HEIKER ET AL., 1981), bestehend aus dem Valienamin und einer Amino-Dideoxyglukose, welches α-1,4-glykosidisch mit einer Maltose verknüpft ist. Für detailliertere Informationen zur Biosynthese von Acarbose wird auf die Beschreibung in WEHMEIER & PIEPERSBERG (2004) und darin zitierte Artikel verwiesen.

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Abbildung 4.1: Struktur des Sekundärmetaboliten Acarbose. Bei dem Pseudotetrasaccharid ist ein Ringsystem keine Hexose, sondern ein ungesättigtes C1: Struktur des Sekundärmetaboliten Acarbose. Bei dem Pseudotetrasaccharid ist ein Ringsystem keine Hexose, sondern ein ungesättigtes C7-Cyclitol (Valienamin). Die glykosidische Bindung innerhalb der Acarviosineinheit wird über ein Stickstoffatom realisiert und ist durch α-Glukosidasen nicht spaltbar (HEIKER ET AL., 1981).

Neben einer Reihe von Acarbose-Derivaten, die sich in der Anzahl der am reduzierenden oder nicht reduzierende Ende des Acarviosins verknüpften Glukoseeinheiten unterscheiden, produziert Actinoplanes sp. auch Komponenten mit Variationen des terminalen Zuckerrestes (Fruktose, Mannose) und der Art der terminalen glykosidischen Bindung (-1,1-; s. auch Seite 77, Tabelle 6.2).

Das Biosynthese-Gencluster (STRATMANN, 1997; STRATMANN ET AL., 1999) enthält wahrscheinlich 25 acb-Gene (Acarbose-Biosynthese). Die Charakterisierung einiger der Genprodukte führte zu dem Modelleinesintra-undextrazellulärenAcarboseMetabolismus, in dem das Pseudotetrasaccharid analog den Eisen-Siderophoren eine Carbophor-Funktion übernimmt (Abbildung 4.2).

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Abbildung 4.2: Modell des Acarbose-Metabolismus (verändert nach STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Dargestellt ist ein aktuelles Modell, das bereits die erzielten Ergebnisse zweier im Rahmen der vorliegenden Arbeit angefertigten Diplomarbeiten (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002) berücksichtigt. Gezeigt ist der hypothetische Zyklus von Acarbose zwischen einem intra- und extrazellulären StärkeMetabolismus. AcbWXY: ABC-Exporter, AcbHFG-MsiK2: Modell des Acarbose-Metabolismus (verändert nach STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Dargestellt ist ein aktuelles Modell, das bereits die erzielten Ergebnisse zweier im Rahmen der vorliegenden Arbeit angefertigten Diplomarbeiten (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002) berücksichtigt. Gezeigt ist der hypothetische Zyklus von Acarbose zwischen einem intra- und extrazellulären StärkeMetabolismus. AcbWXY: ABC-Exporter, AcbHFG-MsiK2?: ABC-Importer, AcbQ: Amylomaltase, AcbD: Acarviosyl-Transferase, AcbZ, AcbE: α-Amylasen. (n) kennzeichnet variable Anzahlen an Glukoseresten. Die Darstellung der in diesem Schema möglichen Funktion von AcbHFG-MsiK2? als Maltose/Maltodextrin-Importer ist nicht Bestandteil des von STRATMANN (1997) und WEHMEIER & PIEPERSBERG (2004) aufgestellten Modells.

Das tatsächlich exportierte Endprodukt der Acarbose-Biosynthese ist bisher unbekannt. Während der Synthese bis zum Export, der vermutlich über das ABC-Transportsystem AcbWXY (s. auch Abschnitt 4.2.1) realisiert wird, bleibt die Position 7 des Valienamin phosphoryliert (WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Acarbose-7-Phosphat besitzt keine Enzymhemmende Wirkung, intrazellulär aktive Hydrolasen α-1,4-glykosidischer Bindungen wie z. B. die vermutete Amylomaltase AcbQ bleiben geschützt (DREPPER & PAPE, 1996). Außerhalb der Zelle katalysiert die Acarviosyl-Transferase AcbD den Transfer des dephosphorylierten (Enzym unbekannt) Acarviosins auf Maltose oder Maltooligosaccharide (HEMKER ET AL., 2001). Diese Acarviosyl-Akzeptoren werden durch die Aktivität der αAmylase AcbE aus Stärke bereitgestellt (STRATMANN, 1997). Die Besonderheit dieses Enzyms liegt darin, dass es unempfindlich gegenüber Acarbose ist. Eine zweite extrazelluläre α-Amylase AcbZ hingegen ist Acarbose-sensitiv (HEMKER, 1997) und möglicherweise ebenfalls an der Erschließung von Kohlenstoffquellen beteiligt. Acarbose und die verlängerten Derivate werden dem Modell entsprechend über ein ABC-Importsystem AcbHFG-MsiK2? (s. auch Abschnitt 4.2.2) wieder aufgenommen und innerhalb der Zelle durch die Acarbose-7-Kinase rephosphoryliert (DREPPER & PAPE, 1996). Nach einer Deglukosylierung (AcbQ?) beginnt mit dem Export des entladenen Carbophors ein neuer Acarbose-Kreislauf. Das Resultat ist ein Nettogewinn an Kohlenstoff- und Energiequelle. In diesem Modell fungiert die Acarbose nicht nur als „Glukose-Falle“. Einen weiteren Vorteil verschafft sich Actinoplanes sp. auch durch die Hemmungwirkung des Pseudozuckers gegenüber α-Amylasen der Nahrungskonkurrenten im Habitat (WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Da Maltose und Maltotriose als Induktoren der Acarbose-Biosynthese fungieren, kann darüber hinaus eine Rolle des AcbHFG-MsiK?-Komplexes als Maltose/Maltodextrin-Transporter nicht ausgeschlossen werden.

4.2 ABC-Transportsysteme

Kohlenhydrat-Katabolismus von lebenden Zellen beginnt mit der Aufnahme von Zuckermolekülen über die Zellmembranen in das Zytoplasma. Die hydrophobe Natur der Zytoplasmamembran stellt eine Permeabilitätsgrenze für den unkontrollierten Stoffein- bzw. austritt polarer Substanzen dar. Der lebenswichtige Import von Nährstoffen wird daher durch spezielle Proteine realisiert, die in die Membranen eingelagerte Transportsysteme, auch Permeasen oder Carrier genannt, ausbilden und nach zwei prinzipiellen Mechanismen wirken. Die Carrier-vermittelte Diffusion durch Porine gramnegativer Bakterien (SCHULZ, 1996; s. auch Abschnitt 4.2.3.1) erlaubt lediglich passive Transportvorgänge bis hin zu einem Konzentrationsausgleich. Hingegen ermöglichen aktive Transportmechanismen unter Energieaufwand die Akkumulation einer Substanz im Zellinneren. Je nach Art der Energiequelle spricht man von primären oder sekundären Transportsystemen. Die Protonensymporter für Maltose von Bacillus licheniformis und Laktose von Escherichia coli sind z. B. durch ein elektrochemisches Potential über der Membran (sekundäre Energieform) angetrieben (TANGNEY ET AL., 1992; BROOKER, 1990). ABC-Transporter und das Gruppentranslokationssystem PTS (Phosphotransferase-System; POSTMA ET AL., 1996) sind an die Hydrolyse primärer Energieformen wie ATP und PEP (Phosphoenolpyruvat) gekoppelt.

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ABC-Transportsysteme (ATP-binding cassette) finden sich in allen drei Organismenreichen. Sie funktionieren als Im- oder Exportsysteme und translozieren eine Substanz unter ATP-Verbrauch (HYDE ET AL., 1990; HIGGINS, 1992; SAURIN ET AL., 1999). Neben einer in Bezug auf die chemische Natur der Substanzen breit gefächerten Transportkapazität (Import von Nährstoffen wie Zucker, Aminosäuren, Peptide, Vitamine und Ionen und Export von Toxinen, Antibiotika und Virulenzfaktoren) nehmen ABC-Systeme an vielfältigen biologischen Prozessen wie Proteinsekretion, Signaltransduktion, Sporulation, Antibiotikaresistenz, bakterieller Pathogenität und Antigenpräsentation teil (HIGGINS, 1992).

Einige Vertreter der ABC-Transporter haben aufgrund medizinischer Relevanz besondere wissenschaftliche Aufmerksamkeit erlangt. So verursacht ein Defekt im humanen CFTRProtein die Erbkrankheit Mukoviszidose (COLLINS ET AL., 1992), die MDR1- und MRP1Proteine verursachen bei Überproduktion die Multiresistenz von Krebszellen (GOTTESMAN & PASTAN, 1993; GOTTESMAN & AMBUDKAT, 2001). Die Adrenoleukodystrophie und eine seltene Form des Diabetes sind weitere Krankheitsbilder mit Ursachen in defekten ABCTransportern (MOSSER ET AL., 1993; AGUILAR-BRYAN ET AL., 1995).

4.2.1  Die strukturelle Organisation von ABC-Transportern

Die große Familie der ABC-Transportsysteme zeichnet sich durch eine gemeinsame Organisationsstruktur aus (Abbildung 4.3). Von vier distinkten Domänen sind zwei in die Membran integriert und bilden die Translokationspore für ein Substrat. Zwei weitere zytoplasmatische Proteinkomponenten sind peripher an den Membrankomplex assoziiert. Sie stellen die ABC-Domänen dar und energetisieren den Transportvorgang durch ATPHydrolyse.

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Die erwähnten funktionellen Domänen der ABC-Transporter können als separate Proteine oder teilweise bis vollständig fusioniert vorliegen. Für eukaryotische Exporter ist eine einzige Polypeptidkette typisch. Während bei Eukaryoten nur Exportsysteme vorkommen, verfügen Prokaryoten auch über Importsysteme, die als Besonderheit eine zusätzliche extrazelluläre Domäne aufweisen (BOOS & LUCHT, 1996). Diese als Substrat-Bindeproteine bezeichneten Komponenten sind bei gramnegativen Bakterien frei im Periplasma lokalisiert, bei grampositiven Bakterien und vermutlich einigen Archaea jedoch über eine Lipidmodifikation des Cysteins am N-Terminus extrazellulär in der Membran fixiert (SUTCLIFFE & RUSSELL, 1995; HORLACHER ET AL., 1998). Bei anderen Archaea liegt es durch ein C- oder Nterminales, hydrophobes Transmembransegment an der Außenseite der Zytoplasmamembran gebunden vor (ELFERINK ET AL., 2001; KONINGS ET AL., 2002).

Abbildung 4.3: Struktureller Aufbau von ABC-Transportern (verändert nach SCHNEIDER, 2000). Schematisch dargestellt sind prokaryotische Bindeprotein-abhängige Importer (A bis D) sowie pro- und eukaryotische Exporter (E resp. F). Einzelne Domänen können separat (A), teilweise fusioniert (B, C, D, E) oder auf einer einzigen Polypeptidkette (F) vorliegen. Das für bakterielle Systeme typische, extrazelluläre bzw. periplasmatische Bindeprotein ist in (A und B) symbolisiert. Die Verbindungslinie zur Membran in (A) symbolisiert den Lipidanker der fixierten Bindeproteine bei grampositiven Bakterien.3: Struktureller Aufbau von ABC-Transportern (verändert nach SCHNEIDER, 2000). Schematisch dargestellt sind prokaryotische Bindeprotein-abhängige Importer (A bis D) sowie pro- und eukaryotische Exporter (E resp. F). Einzelne Domänen können separat (A), teilweise fusioniert (B, C, D, E) oder auf einer einzigen Polypeptidkette (F) vorliegen. Das für bakterielle Systeme typische, extrazelluläre bzw. periplasmatische Bindeprotein ist in (A und B) symbolisiert. Die Verbindungslinie zur Membran in (A) symbolisiert den Lipidanker der fixierten Bindeproteine bei grampositiven Bakterien.

Je nach Richtung des Transportes und Art des Substrates werden ABC-Transporter in 45 verschiedene Subfamilien eingeteilt, darunter 18 bisher beschriebene Familien von Aufnahmesystemen, von denen wiederum zwei spezifisch für den Import von Kohlenhydraten sind: Mitglieder der CUT1 (carbohydrate uptake transporter) transportieren verschiedene Di- und Oligosaccharide sowie Glycerin-Phosphat und Polyole, Substrate der CUT2 sind Monosaccharide (SAIER, 2000; DASSA & BOUIGE, 2001; SCHNEIDER, 2001).

4.2.2 Bindeprotein-abhängige ABC-Importer

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Die extrazellulären Substrat-Bindeproteine stellen die primäre Erkennungsstelle dar und sind im wesentlichen für die Substratspezifität und die hohe Affinität des Transportsystems verantwortlich (KD-Werte von 0,01 µM bis 10 µM; TAM & SAIER, 1993). Während sich die Primärstrukturen stark unterscheiden, legen Kristalle verschiedener Bindeproteine eine übereinstimmende Tertiärstruktur dar. Es handelt sich um monomere Proteine, reich an αhelikalen Strukturen, mit zwei getrennten, ähnlich gefalteten globulären Domänen, die über ein Scharnier aus β-Faltblättern miteinander verbunden sind. Zwischen den beiden Domänen erfolgt die Substratbindung, stabilisiert durch Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen (QUIOCHO & LEDVINA, 1996; QUIOCHO ET AL., 1997). Nach Komplexierung des Substrats schließt sich der Spalt und nur dieses geschlossene, substratbeladene Bindeprotein kann durch Interaktion mit den Membrankomponenten den Transportvorgang initiieren (SHARFF ET AL., 1992; OH ET AL., 1993; BOHL ET AL., 1995; SHILTON ET AL., 1996; AMES ET AL., 1996; HALL ET AL., 1997a,b,c).

Zwei membranintegraleProteine bilden als Homo- oder auch Heterodimer die Translokationspore. Die Mehrzahl dieser Transporterkomponenten besteht aus sechs transmembranen Helices, die über drei periplasmatische und zwei zytoplasmatische hydrophile Schleifen miteinander verbunden sind. Die N- und C-Termini sind in das Zytoplasma gerichtet (BOOS & LUCHT, 1996). Bei einer insgesamt nur begrenzten Sequenzübereinstimmung aufgrund der breiten Diversität an Substraten findet man dennoch ein hoch konserviertes Motiv. Der sogenannte EAA-Loop (Konsensus-Sequenz EAA-X3-GX9-I-X-LP) ist innerhalb der letzten zytoplasmatischen Schleife lokalisiert und übernimmt als Kontaktstelle zu den ABC-Domänen eine wichtige Funktion im Transportmechanismus (MOUREZ ET AL. 1997; LOCHER ET AL., 2002).

Die ABC-Domänen stellen die am stärksten konservierten Untereinheiten von ABCTransportern dar. Sie sind als Homo- oder auch Heterodimer organisiert und auf der zytoplasmatischen Seite peripher an die Membrankomponenten assoziiert. Die Ähnlichkeit dieser ATP hydrolysierenden Proteine wird dadurch reflektiert, dass einige solcher Komponenten zwischen verschiedenen Transportern funktionell austauschbar sind. So können die Proteine MalK und UgpC der Transporter für Maltose und Glycerin-3-Phosphat von E. coli einander ersetzen (HEKSTRA & TOMMASSEN, 1993), MalK von S. typhimurium ist außerdem durch das Protein LacK des Laktosetransporters von Agrobacteriumradiobacter vertretbar (WILKEN ET AL., 1996). Bei grampositiven Bakterien ist es nicht ungewöhnlich, dass ein ABC-Protein mehrere Zucker-Transporter bedient (s. auch Abschnitt 4.2.3.2; SCHLÖSSER ET AL., 1997; SCHLÖSSER, 1999).

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Die charakteristischen konservierten Bereiche in ABC-Domänen sind die Nukleotidbindemotive „Walker sites“ A und B (WALKER ET AL., 1982) sowie die sogenannte Signatursequenz (Konsensus-Sequenz LSGGQ) unmittelbar vor Walker B. Sie wird zur Identifizierung neuer Mitglieder der Familie der bakteriellen Importer herangezogen und ist vermutlich an der Signaltransduktion beteiligt (FETSCH & DAVIDSON, 2002). Für die Interaktion der ABC-Domänen mit den Membrankomponenten wird die zwischen den beiden Walker-Motiven gelegene hydrophobe, helikale Subdomäne verantwortlich gemacht (SCHNEIDER & HUNKE, 1998).

4.2.3 Maltose-Importsysteme von Prokaryoten

Bindeprotein-abhängige ABC-Transporter für Maltose und Maltodextrine von Prokaryoten sind Mitglieder der CUT1-Subfamilie (SCHNEIDER, 2001). Neben einer gemeinsamen strukturellen Organisation (entspr. (A) in Abbildung 4.3) weisen die ABC-Domänen von Transportern der CUT1-Subfamilie als Besonderheit eine C-terminale Extension von ca. 120 bis 150 Aminosäuren auf, die essentiell für die Interaktion mit regulatorischen Proteinen ist (BOOS & SHUMAN, 1998). Innerhalb dieser Verlängerung existiert ein kurzes Sequenzmotiv (Konsensus-Sequenz GI/VRPED/H) mit bisher unbekannter Funktion, welches zur Identifizierung neuer Mitglieder der CUT1-Subfamilie herangezogen wird.

4.2.3.1  Maltose-Importsysteme von gramnegativen Bakterien

Als Modellsystem für den Bindeprotein-abhängigen Maltose- und Maltodextrin-Import der gramnegativen Bakterien sollen die bisher best untersuchten ABC-Transporter MalEFGK2 von E. coli und Salmonellatyphimurium herangezogen werden (Abbildung 4.4; BOOS & SHUMAN, 1998; SCHNEIDER, 2003). Beide Transporter besitzen mehr als 90 % identische Aminosäuren, sind funktionell austauschbar und werden im Folgenden als ein System behandelt.

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Da sich die Zellhülle über drei Schichten erstreckt, beginnt die Substrataufnahme zunächst mit einer Passage durch die Äußere Membran via einer Maltoporin vermittelten erleichterten Diffusion. Das Maltoporin ist ein Homotrimer des Proteins LamB (47 kDa) und wird für die Aufnahme von Maltose und insbesondere Maltodextrinen (bis zu Maltoheptaosen) bei Konzentrationen ≤ 10 µM benötigt. Bei höheren Konzentrationen diffundieren die Oligosaccharide über die unspezifischen Porine OmpF und OmpC in das Periplasma.

Das periplasmatische BindeproteinMalE (40 kDa) stellt die Substrat-Erkennungsstelle dar und komplexiert Maltose sowie Maltodextrine mit hoher Affinität (KD ~ 1µM). Die Bindung des Liganden führt zur Ausbildung einer stabilen, geschlossenen Konformation, die sich mit der substratfreien, offenen Form im Gleichgewicht befindet. Beide Formen interagieren mit den Membranproteinen, jedoch nur das beladene, geschlossene MalE kann die ATP-Hydrolyse an den ABC-Domänen und damit die Substrattranslokation bewirken.

Die membranintegralenProteineMalF (57 kDa) und MalG (32 kDa) bestehen aus acht bzw. sechs transmembranen Segmenten. Aminosäureaustausche an verschiedenen Stellen, z. B. G338R zusammen mit N505I in den Transmembransegmenten 5 und 8 von MalF (malF500) weisen auf eine Beteiligung der Membranproteine an der Substraterkennung hin. Die erwähnten Mutationen führen zu einem Bindeprotein-unabhängigen Phänotyp, da resultierende Konformationsänderungen zu einer konstitutiven ATP-Hydrolyse führen, die Initiation durch den Substrat-MalE-Komplex nicht notwendig ist.

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Das ABC-ProteinMalK (40 kDa) ist als Homodimer aktiv und peripher an MalF und MalG assoziiert. MalK ist leicht überproduzier- und isolierbar. Während eine ATP-Hydrolyse im rekonstituierten Komplex MalFGK2 von der Anwesenheit des substratbeladenen Bindeproteins MalE abhängig ist, besitzt das lösliche Protein MalK eine spontane ATPase-Aktivität (KM ~ 0,1 mM).

Abbildung 4.4: SchematischeDarstellungder Maltose-Importsysteme von Prokaryoten (verändert nach SCHNEIDER, 2003). Neben den aufgeführten Maltooligosacchariden stellen auch höhere Homologe mit bis zu sieben Glukoseeinheiten Substrate dar. Weitere Erklärungen sind dem Text zu entnehmen.4: SchematischeDarstellungder Maltose-Importsysteme von Prokaryoten (verändert nach SCHNEIDER, 2003). Neben den aufgeführten Maltooligosacchariden stellen auch höhere Homologe mit bis zu sieben Glukoseeinheiten Substrate dar. Weitere Erklärungen sind dem Text zu entnehmen.

Im Katabolismus werden die im Zytoplasma ankommenden Maltose und Maltodextrine zu Glukose und Glukose-1-Phosphat degradiert. Dies geschieht durch die gemeinsamen Aktivitäten der Amylomaltase MalQ, der Maltodextrin-Phosphorylase MalP und der Maltodextrin-Glukosidase MalZ. Da Maltodextrine > Hexaosen nur schlecht durch das MalEFGK2-System importiert werden, sorgt eine periplasmatische Amylase MalS für deren Verkürzung. MalQ transferiert Maltosyl- oder längere Dextrinylreste auf das nicht reduzierende Ende von Glukose, Maltose und längere Maltodextrine, dabei wird jeweils ein Glukosemolekül entlassen. Die kleinste erkannte Einheit ist eine Maltotriose. MalP bildet Glukose-1-Phosphat durch sequenzielle Phosphorolyse vom nicht reduzierenden Ende von Maltopentaose und längeren Maltodextrinen. MalZ hydrolysiert vom reduzierenden Ende Maltoheptaose bis Maltotriose konsekutiv zu vornehmlich Glukose und auch Maltose (s. auch Seite 89, Abbildung 7.1).

4.2.3.2 Maltose-Importsysteme von grampositiven Bakterien und Archaeen

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Im Vergleich zu den Systemen der Enterobakterien sind Transporter von grampositiven Organismen bisher nur wenig charakterisiert. Oft wurden über die Beobachtung extrazellulärer Enzymaktivitäten wie z. B. durch Amylasen (SCHWERMANN ET AL., 1994) oder Cellulasen (WACHINGER ET AL., 1989) in weitergehenden Untersuchungen die zugehörigen Gene eines Transportsystems identifiziert und aufgrund von Sequenzähnlichkeiten mit enterobakteriellen Komplexen den ABC-Importsystemen zugeordnet (HERRMANN ET AL., 1996; HÜLSMANN ET AL., 2000; SCHLÖSSER & SCHREMPF, 1996; SCHLÖSSER ET AL., 1997). Bindeprotein-abhängige ABC-Transportsysteme grampositiver Bakterien und Archaea weisen prinzipiell die gleiche Zentralstruktur wie die Verwandten der gramnegativen Organismen auf (Abbildung 4.4). Offensichtliche Unterschiede liegen zunächst in einer nicht notwendigen Beteiligung eines Porins. Außerdem erfolgt eine Fixierung des Substrat-Bindeproteins in der Zytoplasmamembran über eine kovalente Lipidmodifikation des N-terminalen Cysteins der reifen Form (SUTCLIFFE & RUSSELL, 1995), die das Lipoprotein anstelle eines periplasmatischen Raumes in physischer Nähe zu dem Transportkomplex hält. Des weiteren gibt es Variationen in der genetischen Organisation der Transportkomponenten. Während bei gramnegativen Bakterien die Gene für die Transportproteine gruppiert in Operonstrukturen vorliegen, fehlt den entsprechenden Operons grampositiver Bakterien und Archaea oftmals ein Gen für das ABC-Protein (GRELLER ET AL., 1999; SCHLÖSSER ET AL., 1999; HÜLSMANN ET AL., 2000).

Aufgrund der Verwandtschaft von Actinoplanes sp. zu den Streptomyceten sollen hier im weiteren die Maltose-Importer von S. lividans, S. reticuli und S. coelicolor kurz beschrieben werden (VAN WEZEL ET AL., 1997a, b; SCHLÖSSER ET AL., 1997, 2001). In allen drei Organismen wurden Maltose- und Maltotriose-Transport nachgewiesen und die zugehörigen malEFG-Operone z. T. identifiziert und charakterisiert. In S. lividans und S. reticuli wurde Cellobiose-Transportaktivität, in S. reticuli darüber hinaus auch Trehalose-Transportaktivität nachgewiesen. Das ceb-Operon von S. reticuli ist identifiziert und enthält ebenfalls kein Gen für ein ABC-Protein (SCHLÖSSER ET AL., 1999). Bei beiden Organismen assistiert das ABC-Protein MsiK (multiple sugar import) jeweils den zwei bzw. drei erwähnten Transportsystemen mit unterschiedlicher Substratspezifität und unterliegt vermutlich einer getrennten Regulation. MsiK hat starke Ähnlichkeit zu MsmK aus Streptococcus mutans (RUSSELL ET AL., 1992; HURTUBISE ET AL., 1995), diese ABC-Domäne komplettiert nur das Msm-Transportsystem (multiple sugar metabolism), welches für die Aufnahme von Raffinose, Melibiose und Isomaltotriose spezifisch ist. Bei grampositiven Bakterien und Archaea scheint entweder die Rekrutierung eines ABC-Proteins für mehrere Transporter oder aber die Erfassung mehrerer Substratspezifitäten durch ein System ein Prinzip zu sein.

Auch im Acarbose-Biosynthesegencluster von Actinoplanessp. wurde kein Gen einer ATP-hydrolysierenden Transporter-Untereinheit für das ABC-Importsystem AcbHFG gefunden (STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Die Gene des putativen Bindeprotein-abhängigen ABC-Transporters mit dem höchsten Grad an Ähnlichkeit zum MsmEFGK2-Importer von S. mutans sind in einem Operon organisiert. acbH repräsentiert ein extrazelluläres Substrat-Bindelipoprotein AcbH (47,3 kDa), acbFG kodiert die beiden Membranproteine AcbF (36,3 kDa) und AcbG (29,1 kDa). Wie auch die msm-Gene sind die Gene acbHFG vermutlich translational gekoppelt. Für AcbF wurden fünf bis sechs, für AcbG fünf Transmembransegmente vorhergesagt. Das Protein AcbH besitzt eine für extrazelluläre Lipoproteine typische Signalsequenz (FEKKES & DRIESSEN, 1999; TJALSMA ET AL., 2000). Zusammen mit dem Sequenzmotiv innerhalb des verlängerten C-Terminus der ABC-Proteine (s. 4.2.3) wird ein N-terminaler Sequenzbereich von Bindeproteinen herangezogen, um eine Zuordnung zu Transporter-Familien zu leisten (TAM & SAIER, 1993; SCHNEIDER, 2003). In Abbildung 4.5 ist gezeigt, dass das Protein AcbH ein neues Mitglied der CUT1-Familie sein könnte. Neben einigen anderen der Signatursequenz entsprechenden Aminosäuren enthält AcbH auch das invariante Lysin.

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Abbildung 4.5: Alignment der Signatursequenzen von Bindeproteinen. Die Zahlen geben die Position der jeweils ersten Aminosäure des Motivs an. Das hoch konservierte Lysin (K) ist rot hervorgehoben, weitere konservierte Reste sind grün markiert. Asp.: Actinoplanes sp., CebE Sr: Cellobiose-Bindeprotein aus S. reticuli, MalE Sc: Maltose-Bindeprotein aus S. coelicolor, MalE Ec: Maltose-Bindeprotein aus E. coli, MsmE Sm: multiple-sugar-metabolism-Bindeprotein aus S. mutans.5: Alignment der Signatursequenzen von Bindeproteinen. Die Zahlen geben die Position der jeweils ersten Aminosäure des Motivs an. Das hoch konservierte Lysin (K) ist rot hervorgehoben, weitere konservierte Reste sind grün markiert. Asp.: Actinoplanes sp., CebE Sr: Cellobiose-Bindeprotein aus S. reticuli, MalE Sc: Maltose-Bindeprotein aus S. coelicolor, MalE Ec: Maltose-Bindeprotein aus E. coli, MsmE Sm: multiple-sugar-metabolism-Bindeprotein aus S. mutans.

4.2.4 Globale Regulationsmechanismen für Kohlenstoffquellen bei gramnegativen
und grampositiven Bakterien

Sind Bakterien einer Komposition verschiedener Kohlenstoffquellen ausgesetzt, ermöglichen Anpassungsmechanismen die Präferenz des für das Wachstum profitabelsten Substrates. Diese Mechanismen sind vor allem in E. coli und B. subtilis gut untersucht und werden unter dem Begriff Karbon-Katabolit-Repression (CCR, carbon catabolite repression) zusammengefasst (STÜLKE & HILLEN, 1999; TITGEMEYER & HILLEN, 2002). CCR involviert hier Komponenten des Glukose-spezifischen PTS (Phosphotransferase-System; POSTMA ET AL., 1996; SAIER ET AL., 1996; HUECK & HILLEN, 1995) und basiert hauptsächlich auf einer globalen Transkriptionskontrolle und dem Prinzip des Induktorausschlusses.

Bei Enterobakterien wie E. coli übernimmt die zentrale Rolle innerhalb der CCR das Enzym EIIAGlk des PTS, welches über den Phosphorylierungsstatus den physiologischen Zustand der Zelle signalisiert. Bei Abwesenheit von Glukose stimuliert EIIAGlk~P die Adenylat-Cyclase, resultierendes cAMP aktiviert zusammen mit dem CAP (catabolite activator protein) die Transkription Katabolit-kontrollierter Gene wie z. B. mal oder lac. Bei Anwesenheit von Glukose vermittelt dephosphoryliertes EIIAGlk den Mechanismus des Induktorausschlusses durch allosterische Hemmung zytoplasmatischer Enzyme wie die Glycerin-Kinase oder von Transportsystemen. Im Falle des MalEFGK2-Transportsystems geschieht dies über eine Bindung des EIIAGlk an die regulatorische Domäne im C-Terminus von MalK. Damit ist die den Transportvorgang energetisierende ATP-Hydrolyse gestört und die Induktoren des Systems können nicht mehr importiert werden (DEAN ET AL., 1990; LANDMESSER ET AL., 2002). Die Initiation der Transkription des Maltoseregulons durch den cAMP-CAP-Komplex erfolgt z. T. synergistisch mit dem positiven Regulatorprotein MalT. Nach Aktivierung von MalT durch den Induktor Maltotriose ist das Regulatorprotein nur bei gleichzeitiger Anwesenheit von cAMP-CAP in der Lage, an die MalT-Boxen aufwärts der Promotoren der Gene des Transport-Komplexes effektiv zu binden (BOOS & SHUMAN, 1998; BOOS & BÖHM, 2000).

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Bei grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt wieB. subtilis reflektiert der Phosphorylierungsstatus des Proteins HPr des PTS die Nährstoffsituation in der Zelle. HPr wird deshalb als funktionelles Äquivalent des EIIAGlk der Enterobakterien betrachtet. Bei Anwesenheit von Glukose stimuliert das glykolytische Intermediat Fruktose-1,6-Bisphosphat das Enzym HPr-Kinase, welches HPr an einer ausschließlich regulatorischen Position, nämlich Serin 46, phosphoryliert. HPr-S46~P interagiert als Ko-Repressor mit dem Regulatorprotein CcpA (catabolite control protein A), der resultierende Komplex kontrolliert die Transkription durch Bindung an die cre-Sequenzen (catabolite responsive element) Katabolit-kontrollierter Gene wie z. B. die der Amylase oder der Phosphofruktokinase. In Abhängigkeit von der Lokalisation der cre-Box wird die Transkription inhibiert (cre innerhalb der Promotorsequenz oder der kodierenden Region) oder aktiviert (cre aufwärts des Promotors).

Vergleichsweise wenig ist bekannt zu den Mechanismen der CCR bei grampositiven Bakterien mit hohem GC-Gehalt wie Streptomyceten. Katabolitrepression durch Glukose und andere Zucker ist bekannt, ein Transportsystem für das Monosaccharid ist bisher nicht identifiziert worden. BERTRAM ET AL. (2004) halten einen Protonensymporter für möglich. In S. lividans und S. coelicolor konnten funktionelle Fruktose-PTS nachgewiesen werden, eine Beteiligung des HPr in CCR wird nicht vermutet, Hinweise auf eine HPr-Kinase fehlen (TITGEMEYER ET AL., 1995). Beidiesen Organismen ist der Maltooligosaccharid-Transport nach Kultivierung der Zellen in Maltotriose- und Glukosehaltigem Medium nicht reprimiert und bei Wachstum mit Glukose nicht induziert (SCHLÖSSER ET AL., 2001).

Bisherige Befunde zur Regulation der acb-Gene in Actinoplanes sp. (STRATMANN, 1997) schließen Glukose als Katabolit-Repressor aus. Für die extrazellulären Enzyme AcbE und AcbD ist eine Induktion durch Maltose bzw. insbesondere Maltotriose nachgewiesen worden. Ein Gen für ein potentielles Regulatorprotein konnte mittlerweile identifiziert werden (U. Wehmeier, pers. Mitteilung).

4.3 Zielstellung der Arbeit

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Die Anfertigung der vorliegenden Arbeit erfolgte mit dem Ziel, einige der von STRATMANN (1997) formulierten Aspekte des Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp. zu überprüfen.

Eine erste Aufgabe war es, in Untersuchungen mit ganzen Zellen und Zellextrakten von E. colieinen Einfluss von Acarbose als Inhibitor von Hydrolasen α-1,4-glykosidischer Bindungen und als Strukturanalogon von Maltotetraose auf den Maltose- und MaltodextrinStoffwechsel des gramnegativen Bakteriums zu überprüfen. Die erzielten Befunde sollten einen Rückschluss auf die vermutete Funktion der Acarbose bei der Erschließung von Kohlenstoffquellen in Stärke- und Maltodextrinhaltigen Habitaten zulassen. Die bisher diskutierte Rolle des Pseudotetrasaccharids als Hemmstoff der Exoenzyme von Nahrungskonkurrenten vernachlässigte die durch die α-Amylase von Actinoplanes sp. selbst bereitgestellten Hydrolyseprodukte, die dadurch auch für die artfremden Mikroorganismen zugänglich waren. Diese Art des Konkurrenzverhaltens allein konnte keine ökologisch sinnvolle Strategie im Nahrungswettbewerb beschreiben.

Weiterhin sollte in Actinoplanes sp. nach Aufnahmekapazitäten für Maltose und Maltodextrine, die Induktoren des Acarbose-Metabolismus, gesucht werden. Neben einer indirekten Aufnahme von Maltooligosacchariden über ein beladenes Acarbosemolekül (Carbophor) sollte es für die Zellen möglich sein, während des Wachstums mit Stärke auch den direkten Import zu leisten. Diese Untersuchungen sollten mit ganzen Zellen und radioaktiv markierten Substraten unternommen werden.

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In einem dritten Teil dieser Arbeit galt das Interesse der Aufklärung der Funktion des im Acarbose-Biosynthese-Genclusters kodierten Bindeprotein-abhängigen ABC-Transportsystems AcbHFG, für das eine Beteiligung am Import von Acarbose und längerkettigen Homologen im Rahmen des Kreislauf-Modells postuliert wurde. Die einzelnen Transporterkomponenten sollten heterolog in E. coli und S. lividans synthetisiert und anschließend gereinigt werden, um die Voraussetzungen für eine Rekonstitution des Systems in der definierten Umgebung von Proteoliposomen zu schaffen. Dafür sollte ein assistierendes ABC-Protein identifiziert werden. In Zucker-Bindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz und immobilisiertem Substrat-Bindeprotein AcbH sollte das Substratspektrum des betrachteten Systems ermittelt werden.


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22.09.2006