5 MATERIAL UND METHODEN

↓17

5.1  Chemikalien, Enzyme, Isotope und Materialien

Sämtliche Basischemikalien, Lösungsmittel, Detergenzien, Puffersubstanzen sowie Kohlenhydrate, Aminosäuren und Antibiotika wurden von den Firmen ROTH (Karlsruhe), VWR (Darmstadt), Sigma (Deisenhofen), Riedel de Haen (Seelze), Serva Feinbiochemika (Heidelberg), Biomol (Hamburg), DIFCO (Detroit, USA) und OXOID (Wesel) bezogen. Die Acarbose sowie das Maltooligosaccharid-Gemisch MD50 wurden freundlicherweise von der Bayer AG (Wuppertal) zur Verfügung gestellt.

Die Radiochemikalien [U-14C]-Maltose, [U-14C]-Maltotriose sowie Methyl-α-D-[U-14C]-glukopyranosid und die Szintillationsflüssigkeit wurden von den Firmen ICN (Eschwege), ARC-Biotrend (Köln) und Amersham Pharmacia Biotech (England) bezogen. Die 14C-Acarbose wurde freundlicherweise von der Bayer AG Wuppertal (Dr. Brehmer) zur Verfügung gestellt.

↓18

Als Säulenmaterialien zur Reinigung von Proteinen dienten zur Ionenaustauschchromatographie DEAESepharose-Matrix von Amersham Pharmacia Biotech (Schweden) und zur Affinitätschromatographie die NickelNTA-Agarose von Qiagen (Hilden) sowie die Amylose-Matrix von New England Biolabs (Schwalbach). Des weiteren wurden phosphorylierte Zucker mit Hilfe des Ionenaustauschmaterials Dowex 1x2 (50 – 100 mesh, Cl¯-Form) der Firma Fluka Chemie (Schweiz) aus Lösungen separiert. Die PD10-Säulen von Amersham Pharmacia Biotech wurden herangezogen, um per Gelfiltration verschiedene Lösungen umzupuffern. Das Kit zur Fusionierung von Proteinen mit einem Strep-Tag und deren Reinigung stammte von der IBA-GmbH (Göttingen).

Zur Bestimmung von Proteingehalten wurde das „BCA-Protein-Assay-Kit“ der Firma Pierce (Rockford, USA) verwendet.

Die DNA-Polymerase (Platinum-Pfx), Oligonukleotide (z. T. DIG-markiert) und die Kb-DNA-Leiter wurden von den Firmen Invitrogen (Eggenstein) und MWG Biotech (Ebersberg) bezogen. Nukleotide, Restriktionsendonukleasen und die T4-Ligase stammten ebenfalls von Invitrogen sowie auch von New England Biolabs (Schwalbach) und Promega (Madison, USA). Die alkalische Phosphatase (aus Shrimps) wurde von Amersham Pharmacia Biotech bezogen. Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das CONCERT Rapid Gel Extraction System von Life Technologies (Eggenstein) benutzt, die Präparation von Plasmid-DNA wurde mit dem CONCERT High Purity Plasmid Miniprep System durchgeführt. Zur ortsspezifischen Mutagenese wurde das „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“ der Firma Stratagene (La Jolla, USA) verwendet. Die Herstellung weiterer DIG-markierter Oligonukleotide erfolgte mit Hilfe des „DIG DNA Labeling and Detection Kit, Nonradioactive“ der Firma Roche Diagnostics (Mannheim).

↓19

Für die Southern Blots wurde die Nylontransfermembran Hybond-N+, Porenweite 0,45 µm, von AmershamBuchler benutzt, in Western Blots wurden Nitrocellulosemembranen, Porenweite 0,45 µm, und Filterpapiere von Schleicher & Schuell (Dassel) verwendet. Ebenso von Schleicher & Schuell bezogen wurden Membranfilter für die Transportmessungen (OE67) und die Substrat-Bindungsstudien (NC45) sowie auch Filtriereinheiten (FP 30/0, PV 050/3) zur Sterilisation von Nährlösungen.

Zum Einengen von Suspensionen wurde eine Amicon-Rührzelle zusammen mit YM10-Filtern (Ausschlussgröße 10 kDa) von Millipore (Bedford, USA) verwendet.

Für den immunologischen Nachweis von Proteinen wurden folgende Antiseren eingesetzt:

↓20

Anti-MalE (Laborsammlung), Anti-AcbH und Anti-MsiK (polyklonal, Laborsammlung, Immunisierung von Kaninchen durch die Firma Pineda-Antikörper-Service) und monoklonale Anti-RGS, Anti-Penta-His (Qiagen, Hilden), Anti-(His)10 (Stratagene) und Peroxidase-gekoppelte Anti-Kaninchen- bzw. Anti-Maus-IgG (Amersham Biosciences, England). Die Immunodetektion erfolgte durch Verwendung des „Western Blot Chemiluminescense Reagent Plus System“ (NEN, Boston, USA), die Chemilumineszenz wurde mittels Hyperfilm (Amersham-Buchler, Braunschweig) bzw. im Lumi-Imager (Roche) nachgewiesen.

Der Nachweis DIG-markierter DNA-Sonden wurde mit Alkalische-Phosphatase gekoppelten Anti-DIG-Fabfragmenten und dem Chemilumineszenzsubstrat CSPD geführt (Roche Diagnostics Mannheim). Die Chemilumineszenz wurde ebenfalls mittels Hyperfilm (Amersham-Buchler, Braunschweig) nachgewiesen.

5.2 Bakterienstämme

Die Tabelle 5.1 umfasst die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme.

↓21

Tabelle 5.1: Liste der Bakterienstämme1: Liste der Bakterienstämme

Stamm

Relevanter Genotyp/Beschreibung

Quelle/Referenz

Escherichia coli

BB4564

MC4100 groEL140 zjd::Tn10 zje::ΩSpcr/Strr

MOGK ET AL., 1999

BB4565

MC4100 groEL44 zjd::Tn10 zje::kan

MOGK ET AL., 1999

BL21(DE3)

Fˉ lon ompT hsdSB (rB ˉ mB ˉ)gal(λcIts857 ind1 S am7 nin5lacUV5-T7 gene 1)

STUDIER & MOFFAT, 1986

BL21-CodonPlus-RP

E. coliB FˉompT hsdS(rB ˉ mB ˉ) dcm+Tetrgal endAHte

[argU proLCamr]

Stratagene (Amsterdam, NL)

C41 (DE3)

Derivat von BL21 (DE3)

MIROUX & WALKER, 1996

C43 (DE3)

Derivat von C41 (DE3)

MIROUX & WALKER, 1996

CB39

MC4100 malQ::Tn10

DECKER ET AL., 1993

HS3018

MC4100 malTc-1 ΔmalE444

EHRMANN & BOOS, 1987

JM109

e14ˉ(mcrA) recA1 endA1 gyrA96 supE44hsdR17 (rK ˉ, mK + ) relA1 thi Δ(lac-proAB) F' [traD36proAB+lacIqlacZΔM15]

YANISCH-PERRON ET AL., 1985

K12

Wildtyp

DSM 498

LMG194

F-ΔlacX74 gal E thi rpsL ΔphoA (PvuII) Δara714 leu::Tn10

Invitrogen (Karlsruhe)

TK38

MC4100 malZSpecr

W. Boos über M. Ehrmann

TOP10

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ф80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 nupG

Invitrogen (Karlsruhe)

Actinoplanessp.

SE 50/110

Acarbose-Produzent, WT

ATCC 31044

SN 223/29

Acarbose-Produzent

Bayer AG, Wuppertal

Streptomyces lividans

TK23

Actinorhodin, spc-1

W. Piepersberg über M. Jarling

5.3 Medien

5.3.1  Kultivierung von Escherichia coli

Vollmedien

LB-Medium setzte sich aus 1 % Bacto Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 1 % NaCl zusammen und wurde mit 1 N NaOH-Lösung auf pH 7 eingestellt. Platten enthielten zusätzlich 1,5 % Agar-Agar (MILLER, 1972). 2 x LBMedium bestand aus 2 % Bacto Trypton, 2 % Hefeextrakt und 0,5 % NaCl und wurde mit 1 N NaOH-Lösung auf pH 7 eingestellt (DEAN ET AL., 1992). 2YT-Medium enthielt 2 % Bacto Trypton, 2 % Hefeextrakt und 1 % NaCl und wurde mit 1 N NaOH-Lösung auf pH 7 eingestellt (SAMBROOK ET AL., 1989). NB-Medium bestand aus 0,8 % DIFCO-Bacto-Nutrient-Broth und 0,5 % NaCl (ROTH, 1970). TPi-Medium setzte sich aus 2 % Bacto Trypton, 1,5 % Hefeextrakt, 0,8 % NaCl, 0,2 % Na2HPO4 und 0,1 % KH2PO4 zusammen (MOORE ET AL., 1993).SOB-Medium bestand aus 2 % Bacto Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,05 % NaCl und 2,5 mM KCl und wurde mit 1 N NaOH-Lösung auf pH 7 eingestellt. Zur Herstellung des SOC-Mediums wurde SOB-Medium zusätzlich mit 10 mM MgCl2 und 20 mM Glukose versetzt (HANAHAN, 1983).

Minimalmedium

M63-Medium (MILLER, 1972) bestand aus 0,19 g MgSO4 x 6 H20, 13,6 g KH2PO4 und 2 g (NH4)2SO4 ad 1 l A. dest. Mit KOH wurde der pH auf 7 eingestellt. Nach dem Autoklavieren wurden 80 µl einer sterilen 0,5 %igen FeSO4-Lösung zugegeben. Als Kohlenstoff-Quellen wurden Maltose, Glukose oder Glycerin zu je 0,5 % angeboten.

Medienzusätze bzw. Antibiotika und Supplemente

↓22

Den Medien wurden bei Bedarf zur Selektion auf Plasmide die entsprechenden Antibiotika in folgenden Endkonzentrationen zugesetzt: Ampicillin 100 µg/ml, Chloramphenicol 20 µg/ml (in 70 % Ethanol), Kanamycin 50 µg/ml.

5.3.2 Kultivierung von Actinoplanes sp. und Streptomyces lividans

Vollmedium

TSB-Medium enthielt 30 % Trypton Soja Broth (Oxoid) (HOPWOOD ET AL., 1985). NB-S-Medium setzte sich zusammen aus 1 % Glukose, 0,4 % Pepton aus Casein, 0,05 % MgSO4, 0,2 % KH2PO4, 0,4 % K2HPO4 und 0,4 % Hefeextrakt. SMA-Platten bestanden aus je 20 % Mannit, Sojamehl (entfettet) und Agar (DISTLER ET AL., 1985). SPMR-Platten enthielten 10,3 % Saccharose, 1 % MgCl2, 0,5 % Hefeextrakt (DIFCO), 5 % Glukose, 20 ml 1 M TES-Puffer (pH 7,6), 2 ml Spurenelemente-Lösung (s. unter Minimalmedium) und 2,2 % Agar (DIFCO). Nach dem Autoklavieren wurden 2 ml einer 5 M CaCl2-Lösung dazugegeben (BABCOCK & KENDRICK, 1988).

Minimalmedium

MNS-Medium (Minimalmedium nach NEUMANN mit Spurenelementen) bestand aus 5,7 g Tris-HCl, 1 g NaCl, 2 g (NH4)2SO4, 0,5 g K2SO4, 0,2 g MgSO4, 0,1 g CaCl2, 0,34 g KH2PO4 ad 1 l A. dest. Mit einer 20 %igen H2SO4-Lösung wurde der pH-Wert auf 7,2 eingestellt. Nach dem Autoklavieren wurden 10 ml einer sterilen Spurenelemente-Lösung (HOPWOOD, 1985) hinzugegeben. Diese Spurenelemente-Lösung setzte sich wie folgt zusammen: 40 mg ZnCl2, 200 mg FeCl3 x 6 H2O, 10 mg CuCl2 x 2 H2O, 10 mg MnCl2 x 4 H2O, 10 mg Na2B4O7 x 10 H2O, 10 mg (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O ad 1 l A. dest. Als Kohlenstoff-Quellen wurden Acarbose, Glycerin, Glukose, Maltose, Maltodextrine (Maltotriose bis Maltohexaose), MD50 (Stärkehydrolysat, enthält Maltose und Maltotriose), Laktose, Trehalose, Saccharose so wie Haferspelzen- und Birkenholzxylan zu je 0,5 % und im Falle von MD50 auch zu 7 % angeboten.

Acarbose-Produktionsmedium

↓23

Das Acarbose-Produktionsmedium (STRATMANN, 1997) setzte sich aus drei verschiedenen Lösungen zusammen, die getrennt voneinander angesetzt und anschließend zusammengegeben und sterilfiltriert wurden. Lösung 1 bestand aus 70 g MD50, 5 g (NH4)2SO4 und 2 g Hefeextrakt ad 400 ml A. dest. Die Lösung 2 enthielt 1 g K2HPO4, 1 g KH2PO4 und 5 g Tri-Natrium-Citrat ad 400 ml A. dest. Lösung 3 bestand aus 1 g MgCl2 x 6 H20, 0,25 g FeCl3 x 6 H2O und 2 g CaCl2 x 2 H2O ad 200 ml A. dest.

Medienzusätze bzw. Antibiotika

Zur Selektion auf Plasmide wurde Thiostrepton in einer Endkonzentration von 25 µg/ml Medium (Stock 25 mg/ml DMSO, mit Wasser verdünnen) zugegeben.

5.4 Lagerung und Anzucht der Stämme

5.4.1  Stammhaltung

Escherichia coli: Zum Anlegen von Dauerkulturen der verschiedenen Stämme und Transformanten wurden
800 µl einer frischen, in NB-Medium gezogenen, ü.N.-Kultur mit 70 µl DMSO in einem Wheaton-Röhrchen (Zinsser, Frankfurt/Main) vermischt und bei – 80°C gelagert.

↓24

Actinoplanes sp.: Die beiden Stämme von Actinoplanes sp. wurden zur dauerhaften Lagerung zunächst für drei Tage in 5 ml TSB-Medium gezogen. 500 µl dieser Kulturen wurden schließlich mit 400 µl 87 %igem Glycerin in einem Wheaton-Röhrchen vermischt und ebenfalls bei – 80°C gelagert.

Streptomyces lividans: Zellen von Streptomyces lividans wurden als Sporensuspension dauerhaft bei – 20°C gelagert. Zur Herstellung solcher Sporensuspensionen wurden Einzelkolonien auf SMA-Platten ausgestrichen und für vier bis sechs Tage bei 30°C inkubiert. Während dieser Zeit entwickelten sich die Sporen, die dann mit 5 ml 20 % Glycerin überschwemmt und mit der Impföse abgestrichen wurden. Um enthaltene Agarreste zu entfernen, wurde die Suspension schließlich durch Haushaltswatte (gestopft in eine Einwegspritze und autoklaviert) filtriert.

5.4.2 Anzucht und Wachstumsbedingungen

Escherichia coli: Für die Anzucht der verschiedenen Stämme und Transformanten wurden vorab Ausstriche von Dauerkulturen bzw. Reinigungsausstriche von Transformationsansätzen auf LB-Platten angefertigt. Von diesen Platten, die als Stammplatten für einige Tage bei 4°C aufbewahrt werden konnten, erfolgte zunächst die Inokulation von 2 – 5 ml Flüssigmedium im Glasröhrchen zur Vorkultivierung der Zellen bei 37°C über Nacht. Für die Überexpression plasmidkodierter Gene, die Transportversuche sowie die Herstellung von Zellextrakten wurden schließlich verschiedene Flüssigmedien in einem Volumenverhältnis von 1:100 aus den Vorkulturen angeimpft. Die Anzuchten solcher Hauptkulturen (25 – 500 ml) erfolgten in der Regel bei Temperaturen von 30°C oder 37°C und stets in Schikanekolben so wie unter guter Belüftung (220 rpm, Modell G25, New Brunswick Scientific, Nürtingen). Das Wachstum wurde durch Messung der Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 650 nm in einem Spektralphotometer (Ultrospec 2000, Pharmacia) verfolgt.

↓25

Actinoplanes sp.: Die Kultivierung der beiden Stämme erfolgte zunächst durch Anzuchten von Vorkulturen. Dazu wurden 5 ml TSB-Medium im Glasröhrchen mit 400 µl Dauerkultur beimpft. Nach drei Tagen wurden die Hauptkulturen für die Ermittlung von Transportraten und Proteinmustern angelegt. Dafür wurden entweder Minimalmedium MNS oder Vollmedium TSB bzw. Acarbose-Produktionsmedium (je 100 ml in
1 l Schikanekolben) in einem Volumenverhältnis 1:100 aus den Vorkulturen angeimpft. Für die Präparation chromosomaler DNA erfolgte die Kultivierung in 30 ml NB-S-Medium im 250 ml Schikanekolben. Die Anzucht solcher Hauptkulturen erfolgte stets bei einer Temperatur von 30°C so wie unter guter Belüftung (280 rpm, Modell G25, New Brunswick Scientific, Nürtingen). Das Wachstum wurde durch Bestimmung des Proteingehaltes der Kultur (s. 5.7.3) verfolgt.

Streptomyces lividans: Die Anzucht erfolgte so wie bei Actinoplanessp. unter guter Belüftung und stets bei 30°C. Zur Kultivierung wurden 5 ml TSB-Medium im Glasröhrchen mit 75 µl Sporensuspension inokuliert. Diese Vorkultur wurde drei Tage bebrütet, um damit in einem Volumenverhältnis von 1:50 die Hauptkulturen (50 ml in 250 ml Schikanekolben) für die Herstellung von Protoplasten, die Expressionsversuche und die Präparation chromosomaler DNA anzuimpfen.

5.5 Plasmide und Oligonukleotide

Die Tabellen 5.2 und 5.3 umfassen die in dieser Arbeit verwendeten Klonierungsvektoren, Expressionsplasmide und Oligonukleotide.

↓26

Tabelle 5.2: Liste der Plasmide2: Liste der Plasmide

Plasmid

Resistenz

Beschreibung

Referenz/Herkunft

Klonierung

p103B3.1

Amp

acbHFG in pUC18

M. Jarling, AG Prof. Piepersberg (Wuppertal)

pASK-IBA7

Expressionsvektor , ptet, N-term. Strep-TagII

IBA-GmbH (Göttingen)

pBAD/HisA

Amp

Expressionsvektor, paraBAD, N-term. (His)6-Tag

Invitrogen (Karlsruhe)

pFSA14

Amp

malEA.a in pGem-t

SCHEFFEL, 2004

pLysS

Cam

ptet, gene 1 (T7-Lysozym)

STUDIER, 1991

pPWW49-GenPoly

Tsr/Amp

Shuttlevektor, ori pUC18, ori pIJ101, ermEp

DOUMITH ET AL., 2000, über U. Wehmeier

pET19b

Amp

Expressionsvektor, pT7lac, N-term. (His)10-Tag

Novagen

pET22b

Amp

Expressionsvektor, pT7lac, C-term. (His)6-Tag, pelB-Signalsequenz

Novagen

pUC18/19

Amp

Klonierungsvektor, , plac

YANISCH-PERRON ET AL., 1985

pQE9

Amp

Expressionsvektor, pT5, N-term. RGS-(His)6-Tag

Qiagen (Hilden)

PQE60

Amp

Expressionsvektor, pT5, C-term. (His)6-Tag

Qiagen (Hilden)

pOFX tac-SL1

Kan

groES groEL auf pOFX, ptac

CASTANIÉ ET AL., 1997

Expression

pCB2

Amp

acbH in pBAD/HisA, Cys1Met

diese Arbeit

pCB3

Amp

acbH in pASK-IBA7, Cys1Met

diese Arbeit

pCB5

Amp

malE in pQE9

diese Arbeit, Abbildung 5.1

pCB6

Amp

acbH in pQE9, Cys1Met, Thr430Ala, Ile431Asp

diese Arbeit

pCB7

Amp

acbH in pQE9, Cys1Ala, Thr430Ala, Ile431Asp

diese Arbeit

pCB8

Amp

acbH in pQE60, Cys1Met, Thr430Ala, Ile431Asp

diese Arbeit

pCB9

Amp

acbH in pET19b, Cys1Met, Thr430Ala, Ile431Asp

diese Arbeit

pCB10

Amp

acbH in pET19b, Cys1Met

diese Arbeit, Abbildung 5.2

pCB11

Amp

pCB10 ohne NdeI-Schnittstelle vor acbH

diese Arbeit, Abbildung 5.3

pCB12

Tsr/ Amp

(His)10-acbH von pCB11 amplifiziert in pPWW49-GenPoly

diese Arbeit, Abbildung 5.4

pCB14

Amp

acbH in pET22b, Cys1Met

diese Arbeit

Tabelle 5.3: Liste der Oligonukleotide3: Liste der Oligonukleotide

Bezeichnung

Sequenz

Konstruktion/

Amplifikation von

PCR

acbH1, 5' 7

gac gac 1 CTC GAG2ATG3 GGC AGT GAC GAC AAG AGC

XhoI, pCB2

acbH2, 3'

ctt acc GGT ACC TCA TCA 4 GCG GAA AAT CGT CTT

KpnI, pCB2

acbH3, 5'

gac gac GGA TCC ATG GGC AGT GAC GAC AAG AGC GG

BamHI, pCB3/4/6

acbH4, 3'

acc agc AAG CTT TCA GCG GAA AAT CGT CTT CGC CT

HindIII, pCB3/4

acbH5, 3'

acc agc AAG CTT TCA GCG GAA ATC GGC CTT CGC CTG

HindIII, pCB6/7

acbH6, 5'

gac gag GGA TCC GCC GGC AGT GAC GAC AAG AGC GGG

BamHI, pCB7

acbH7, 5'

gac cgg gCC ATG GGC AGT GAC GAC AAG AGC GGG ACG

NcoI, pCB8/14

acbH8, 3'

agc ccc AGA TCT5 GCG GAA ATC GGC CTT CGC CTG GTC

BglII, pCB8

acbH9, 5'

gac gag CATATG GGC AGT GAC GAC AAG AGC GGG ACG

NdeI, pCB9

acbH10, 3'

acc agc GGA TCCTCA GCG GAA ATC GGC CTT CGC CTG

BamHI, pCB9

acbH12, 5'

c gag cgg CATATG GGC AGT GAC GAC AAG AGC GGG ACG

NdeI, pCB10

acbH13, 3'

ccc gcc GGA TCC CCG GTC GAA TGG TCG GGG TCA TCA

BamHI, pCB10/12

acbH16, 5'

t ata tgg CATATGCAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT

NdeI, pCB12

acbH17, 3'

agc ccc GGA TCC5 GCG GAA AAT CGT CTT CGC CTG

BamHI, pCB14

malE1pQE, 5'

acg cga GGA TCC AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG

BamHI, pCB5

malE2pQE, 3'

cta aag AAG CTTTTA CTT GGT GAT ACG AGT CTG

HindIII, pCB5

Frs24, 5'

TTA TCG GAT CCG CGG GAA CCT CGA ACG GTG GTC

malEvon

A. acidocaldarius

KH2, 3'

TTT AAA GGA TCC TTG TGC CAT GAT GCC TTT TTG

malEvon

A. acidocaldarius

malE-S.coel1, 5'

TGC GGC GGA GAC GGC GAC AGC GAC AGC GAG TCG GG

malEvon

S. lividans

malE-S.coel2, 3'

CTA CTT GCT GAA GTC CGG CAC CAG CTT GGC GAT GC

malEvon

S. lividans

Mutagenese

acbH14

C GAC GAC GAC GAC AAG CAC 6 ATG GGC AGT GAC GAC AAG AGC

pCB11

acbH15

GCT CTT GTC GTC ACT GCC CAT GTG CTT GTC GTC GTC GTC G

pCB11

Hybridisierung

fishingMBP

5'-Digoxigenin-GCC TCC ACC GAC GAG GTC ACC GCC CCG GCC CTG GAC GGC TAC TGC

PS 8: ASTDEVTAPA LDGYC

fishingMBP2

5'-Digoxigenin-AAC TTC TA(CT) GAC CCG TA(CT) (AT)(GC)C TGG

PS: NFYDPYSW

1 nicht-komplementäre Sequenz, die der eingeführten Schnittstelle angrenzt
2 eingeführte Restriktionsschnittstellen
3 Austausch Cys zu Met oder Ala
4 Stopcodon
5 Deletion Stopcodon
6 Austausch Mutagenese (Eliminierung der Restriktionsschnittstelle für NdeI)
7 5': 5'-Primer, 3': 3'-Primer
8 PS: Peptidsequenz

5.6 Genetische und Molekularbiologische Methoden

5.6.1  DNA-Präparationen

5.6.1.1  Plasmid-Präparationen

Die Präparation von Plasmid-DNA aus Zellen von E. coli wurde prinzipiell mit dem CONCERT High Purity Plasmid Miniprep System von Life Technologies durchgeführt.

5.6.1.2 Präparation chromosomaler DNA aus Actinoplanes sp. 50/110 und Streptomyces lividans

↓27

Die Isolierung chromosomaler DNA erfolgte anfänglich in Anlehnung an das von POSPIECH & NEUMANN (1995) erstellte Protokoll durch enzymatische Lyse der Zellen. Später wurden die Zellen im Falle von Actinoplanes sp. mechanisch im Mörser aufgeschlossen.

Enzymatische Lyse: Nach dreitägiger Anzucht in NB-S-Medium (s. 5.4.2) wurden die pelletierten Zellen in 10 ml SET (75 mM NaCl, 25 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) resuspendiert. Parallel zur Lysozymbehandlung (1 mg/ml) erfolgte die Inkubation bei 37°C für eine Stunde zusätzlich mit 100 U/ml Mutanolysin. Nach der Zugabe von 1/10 Volumen 10 % SDS und 0,5 mg/ml Proteinase K wurde die Suspension unter gelegentlichem Schütteln für zwei Stunden bei 55°C gehalten. Anschließend erfolgte die Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 5000 g. Der Überstand wurde mit 1/3 Volumen 5 M NaCl und 1 Volumen Chloroform versetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde der Überstand über das Protokoll von Pospiech und Neumann hinaus einer zweifachen Phenol/Chloroform-Behandlung unterzogen. Dazu wurde jeweils der Überstand mit 1/2 Volumen Phenol und 1/2 Volumen eines Isoamylalkohol/Chloroform-Gemisches (1 : 24) versetzt, gemischt und für 20 Minuten bei 8000g und Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dieser Abtrennung verunreinigender Proteine wurde die DNA-haltige obere, wässrige Phase mit 1/3 Volumen 3 M Na-Acetat (pH 4,8) gemischt und anschließend mit dreifachem Volumen eiskaltem Ethanol über Nacht bei – 20°C zur Fällung der DNA gehalten. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde das DNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen und in 500 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) mit 1 µg RNase gelöst.

Mechanische Lyse: Die Zellen wurden ebenso wie zur enzymatischen Lyse angezogen, pelletiert und in SET (allerdings hier mit 300 mM NaCl) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann tröpfchenweise in flüssigem Stickstoff eingefroren, in einen ebenfalls durch flüssigen Stickstoff gekühlten Mörser überführt und mit dem eiskalten Stößel pulverisiert. Dabei wurde streng darauf geachtet, durch wiederholte Zugabe von fl. Stickstoff die Zellen bzw. pulverisierten Zellen konsequent in gefrorenem Zustand zu halten. In einen zweiten Mörser, der lediglich durch Halten auf Eis vorgekühlt war, wurde 1 Volumen des Gemisches Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) zusammen mit 1 % SDS vorgelegt. In dieses Gemisch hinein wurden die pulverisierten Zellen gegeben und unter weiterem Stößeln gut durchmischt. Nach einer Zentrifugation bei Raumtemperatur (5000 g, 20 Minuten) wurde die obere Phase mit 1 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol gemischt, kräftig geschüttelt und zentrifugiert. Aus dieser oberen Phase nun konnte durch Zugabe von 2,5 Volumen eiskaltem 96 %igen Ethanol die DNA ausgefällt und abzentrifugiert (5000 g, fünf Minuten, 4°C) werden. Das DNA-Pellet wurde in kaltem 70 %igen Ethanol gewaschen und schließlich in 0,5 ml H2O gelöst. Zum Abbau störender RNA-Moleküle wurde 1 µg RNase hinzugegeben.

↓28

Zur Bestimmung der DNA-Konzentration und -Reinheit wurde die Absorption der Lösung bei den Wellenlängen 260 nm und 280 nm in einem Spektralphotometer (Ultrospec 2000, Pharmacia) gemessen. Nach HARWOOD & CUTTING (1990) konnte die Konzentration anhand folgender Formel berechnet werden:

CDNA [µg/µl] = (OD260 x 0,063) – (OD280 x 0,036)

Zur Bestimmung des Reinheitsgrades wurde der Quotient aus OD260 und OD280 gebildet. Bei einem Quotienten von 1,8 bis 2,0 lagen reine DNA-Präparationen vor (SAMBROOK ET AL., 1989).

5.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

↓29

Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurden ausgewählte DNA-Bereiche in vitro amplifiziert. Sowohl Plasmid-DNA als auch chromosomale DNA aus E. coli, Actinoplanes sp. und S. lividans dienten als Matrize (s. 5.6.1.2). Im Falle von E. coli wurde hierfür nicht das Chromosom isoliert, sondern lediglich 1 ml einer Übernachtkultur (LB-Vollmedium) für fünf Minuten gekocht und nach Zentrifugation (1 Minute, 13000g) 1 µl des resultierenden Überstandes als Template eingesetzt. Durch die Auswahl jeweils spezifischer Oligonukleotidprimer wurden die Amplifikate mit für die Klonierungen geeigneten Restriktionsschnittstellen versehen (s. Tab 5.3 und 5.6.8).

Die Amplifikationen erfolgten im TRIO-Thermoblock 48 der Firma Biometra und in Anlehnung an Vorschläge zur Profilgestaltung und Zusammensetzung der Reaktionen durch den Hersteller der DNA-Polymerase. In Abhängigkeit von der Größe und Art des Amplifikats (GC-Gehalt) und der generierten Oligonukleotidprimer variierten letztlich die PCR-Profile in der initiierenden Denaturierungsdauer der DNA, in der Mg2+Konzentration, in der Anlagerungstemperatur der Primer und in der Dauer für die Primerverlängerung. Konstant blieben das Endvolumen der Reaktionsansätze von 50 µl, die jeweilige Überschichtung mit Mineralöl, die ausschließliche Verwendung von 1U der Platinum-Pfx-DNA-Polymerase und der Einsatz von final 2 µM eines dNTP-Gemisches so wie final 100 µM bzw. 10 µM Primer für die Amplifikation von DNA aus Actinoplanes sp. und S. lividans resp. E. coli.

Detaillierte Profilgestaltungen der Reaktionen sind in den entsprechenden Abschnitten zu Konstruktionen der verschiedenen Expressionsplasmide (5.6.8) und zu DNA-DNA-Hybridisierungen (5.6.9.4) aufgeführt.

5.6.3 DNA-Modifikationen

↓30

Die in vitro Veränderungen von DNA-Molekülen wie Restriktionen, Dephosphorylierungen linearisierter Vektoren mit alkalischer Phosphatase und Ligationen zur Konstruktion von Expressionsvektoren erfolgten nach den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen.

Die Herstellung DIG-markierter DNA-Sonden erfolgte mit Hilfe des „DIG DNA Labeling and Detection Kit, Nonradioactive“ der Firma Roche Diagnostics (Mannheim). Lediglich die Markierung der DNA-Fragmente, die aus den Peptidsequenzen abgeleitet wurden, wurde von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) übernommen.

5.6.4 Ortsgerichtete Mutagenese

Die ortsgerichtete Mutagenese wurde mit Hilfe des „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“ der Firma Stratagene (La Jolla, USA) genau nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Der Erfolg der Mutagenese konnte durch Sequenzierung des Allels bestätigt werden.

5.6.5 Elektrophoretische Auftrennung von DNA

↓31

Die analytische und präparative Auftrennung von ungeschnittener bzw. geschnittener DNA erfolgte mittels horizontaler Elektrophorese in 1 %igen Agarosegelen in 1 x TOE-Puffer (20 x Stocklösung: 9,68 % Tris, 1,36 % Na-Acetat und 0,74 % EDTA, pH8 mit konz. Essigsäure) nach SAMBROOK ET AL. (1989). Die Proben wurden mit 1/10 Volumen Probenpuffer (50 % Glycerin, 1 % SDS, 0,1 M EDTA und 0,1 % Bromphenolblau in 1 x TOE-Puffer) versetzt. Als Größenstandard diente eine Kb-DNA-Leiter. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 110 V durchgeführt. Zur Sichtbarmachung der DNA im UV-Licht wurden die Gele für 15 Minuten in einer Ethidiumbromidlösung (4 µg/ml H20) gefärbt und anschließend in Wasser gewaschen.

5.6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten

Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das CONCERT Rapid Gel Extraction System von Life Technologies benutzt.

5.6.7 Sequenzierungen

DNA-Sequenzierungen von klonierten DNA-Fragmenten wurden durch die Firma AGOWA (Berlin) sowie durch Dr. M. Meixner (Dienstleistungen in der Molekularbiologie, DLMBC) vorgenommen.

5.6.8 Konstruktion ausgewählter Expressionsvektoren

↓32

Durch Sequenzierung der Konstrukte wurden die Erfolge der Klonierungen überprüft und konnten bestätigt werden.

5.6.8.1  Das Expressionsplasmid pCB5

Das malE-Gen wurde ohne die Sequenz für das Signalpeptid mit den Primern malE1pQE/malE2pQE in einer PCR mit 4 mM MgSO4 vom Chromosom von E. coli amplifiziert. Die Profigestaltung war folgende: initiierende Denaturierung: 3 Min, 94°C; Primeranlagerung: 60°C; Elongation: 68°C. Über die durch die Primer vorgegebenen Restriktionsschnittstellen wurde das Amplifikat in den Vektor pQE9 ligiert (Abbildung 5.1).

↓33

Abbildung 5.1: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB5.Durch diese Klonierung ist MalE vor der Aminosäure Lys 1 des reifen Proteins zusammen mit den Kodons der BamHI-Schnittstelle für Gly und Ser N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MRGSH1: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB5.Durch diese Klonierung ist MalE vor der Aminosäure Lys 1 des reifen Proteins zusammen mit den Kodons der BamHI-Schnittstelle für Gly und Ser N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MRGSH(6)GS fusioniert.

5.6.8.2 Das Expressionsplasmid pCB10

Das acbH-Gen wurde ohne die Sequenz für das Signalpeptid mit den Primern acbH12/acbH13 in einer PCR mit 2 mM MgSO4 vom Chromosom von Actinoplanes sp. 50/110 amplifiziert. Die Profigestaltung war folgende: initiierende Denaturierung: 5 Min, 98°C; Primeranlagerung: 69°C; Elongation: 68°C. Über die durch die Primer vorgegebenen Restriktionsschnittstellen wurde das Amplifikat in den Vektor pET19b ligiert (Abbildung 5.2).

Abbildung 5.2: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB10.Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, zusammen mit dem ersten Kodon der NdeI-Schnittstelle für His N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MGH2: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB10.Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, zusammen mit dem ersten Kodon der NdeI-Schnittstelle für His N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MGH(10)SSGHID(4)KH fusioniert.

5.6.8.3 Das Expressionsplasmid pCB11

↓34

In Vorbereitung der Konstruktion des pCB12 wurde die NdeI-Schnittstelle vor dem acbH-Gen in pCB10 durch ortsspezifische Mutagenese (5.6.4) in einer PCR mit den Primern acbH14/acbH15 entfernt. Die Profigestaltung war folgende: initiierende Denaturierung: 30 Sek, 95°C; Primeranlagerung: 55°C; Elongation: 8 Min, 68°C (Abbildung 5.3).

Abbildung 5.3: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB11.Durch die Mutagenese wurde die Sequenz der NdeI-Schnittstelle CATATG ortsspezifisch zu CACATG umgewandelt, so dass die Sequenz des resultierenden N-terminalen Histidin-Tags derjenigen des Expressionsproduktes von pCB10 entspricht.3: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB11.Durch die Mutagenese wurde die Sequenz der NdeI-Schnittstelle CATATG ortsspezifisch zu CACATG umgewandelt, so dass die Sequenz des resultierenden N-terminalen Histidin-Tags derjenigen des Expressionsproduktes von pCB10 entspricht.

5.6.8.4 Das Expressionsplasmid pCB12

Das acbH-Gen wurde zusammen mit der durch den Vektor pET19b vorgegebenen Sequenz für einen Histidin-Tag mit den Primern acbH16/acbH13 in einer PCR mit 2 mM MgSO4 von pCB11 amplifiziert. Die Profigestaltung war folgende: initiierende Denaturierung: 1 Min, 95°C; Primeranlagerung: 69°C; Elongation: 68°C. Über die durch die Primer vorgegebenen Restriktionsschnittstellen wurde das Amplifikat in den Vektor pPWW49-GenPoly ligiert. Das Gen acbH steht unter der Kontrolle des konstitutiven ermEp-Promotors.

↓35

Abbildung 5.4: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB12. pPWW49-GenPoly ist ein Shuttle-Vektor und enthält zwei Origins der Replikation (ori pUC19 für Replikation in E. coli, ori pIJ101 für Replikation in S. lividans) sowie zwei Antibiotika-Resistenzgene (Ampicillin, Thiostrepton). Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, mit der Sequenz MH4: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB12. pPWW49-GenPoly ist ein Shuttle-Vektor und enthält zwei Origins der Replikation (ori pUC19 für Replikation in E. coli, ori pIJ101 für Replikation in S. lividans) sowie zwei Antibiotika-Resistenzgene (Ampicillin, Thiostrepton). Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, mit der Sequenz MH(10)SSGHID(4)KH fusioniert

5.6.9 DNA-DNA-Hybridisierung

5.6.9.1  Southern Blotting

Die DNA wurde aus dem Agarosegel (s. 5.6.5) unter Vakuum (40 cm H20) mit einer LKB2016 VacuGene-Kammer (Pharmacia, Freiburg) in Anlehnung an das Protokoll der Hersteller auf eine Hybond-N+ Nylonmembran transferiert. Dabei wurde das Agarosegel so lange unter Depurinierungslösung gehalten, bis sich die Bromphenolblau-Bande der Lauffront gelb färbte. Die dafür notwendige Zeit betrug in der Regel 25 Minuten. Ebenso lange wurde danach das Gel zunächst unter der Denaturierungslösung, anschließend unter der Neutralisierungslösung gehalten. Der DNA-Transfer erfolgte schließlich für eine Stunde unter der 20 x SSC-Lösung. Nach dem Blotting wurde die DNA drei Minuten mit UV-Licht bestrahlt und so auf der noch feuchten Nylonmembran durch crosslinking fixiert. Zur späteren Orientierung wurden noch der DNA-Standard und die Probentaschen unter UV-Licht markiert.

5.6.9.2 Hybridisierung

Die verschiedenen Hybridisierungen wurden prinzipiell so wie im „DIG System User’s Guide for Filter Hybridization“ von Roche Diagnostics (Mannheim) vorgeschlagen durchgeführt. Die 30 minütigen Prähybridisierungen so wie die Hybridisierungen über Nacht mit 5 bis 50 ng DIG-markierter Sonde/ml Hybridisierungslösung (s. 5.6.3) erfolgten im Hybridisierungsofen (Mini Oven II, MWG-Biotech) bei Temperaturen zwischen 55°C und 59°C. Im Anschluss wurden die Nylonmembranen unter stringenten Bedingungen gewaschen, um ungebundene DNA-Sonden zu entfernen.

↓36

In einzelnen Fällen wurden auch gebundene DNA-Sonden wieder entfernt (stripping), um die entsprechenden Membranen für Rehybridisierungen einsetzen zu können.

5.6.9.3 Detektion

Die hybridisierten DNA-Sonden wurden über gebundene, Alkalische Phosphatase-gekoppelte Anti-DIG-Antikörper und das Chemilumineszenzsubstrat CSPD detektiert. Die Chemilumineszenz wurde mittels Hyperfilm sichtbar gemacht.

5.6.9.4 Sonden

Zur Herstellung der Sonden wurden die jeweiligen malE-Gene vom Chromosom (S. lividans) und von pFSA14 (A. acidocaldarius) in einer PCR mit jeweils 2 mM MgSO4 amplifiziert und wie unter 5.6.3 beschrieben mit DIG markiert. Die Profigestaltung für beide Gene war folgende: initiierende Denaturierung: 5 Min, 95°C; Primeranlagerung: 65°C; Elongation: 68°C.

↓37

Die Primer Frs24 und KH2 und das Plasmid pFSA14 wurden freundlicherweise von F. Scheffel zur Verfügung gestellt.

5.6.10 Transformation

5.6.10.1  Transformation von E. coli

E. coli Zellen wurden entweder nach der CaCl2-Methode (SAMBROOK ET AL., 1989) transformiert oder – zur Erhöhung der Transformationseffizienz bei Ligationsansätzen – mittels Elektroporation. Hierfür wurden Zellen von E. coli JM109 nach dem Protokoll des Herstellers des Elektroporationsgerätes EasyjecT (Eurogentec, Belgien) kompetent gemacht. Die Transformation über Elektroporation erforderte die Entsalzung des Ligationsansatzes durch eine Butanolfällung. Dazu wurde der Ligationsansatz mit H2O auf 50 µl aufgefüllt, mit 450 µl n-Butanol versetzt und für zehn Sekunden gevortext. Nach 15 minütiger Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, das DNA-Pellet getrocknet und in 10 µl H2O gelöst. 5 bis 10 µl wurden dann für die Elektroporation eingesetzt. Die elektroporierten Zellen wurden in 1 ml SOC-Medium resuspendiert, für eine Stunde bei 37°C geschüttelt und auf eine geeignete LB-Antibiotikum-Platte aufgetragen. Schließlich erfolgte ein Einzelkolonieausstrich, von dem eine Dauerkultur angelegt wurde.

5.6.10.2 Transformation von S. lividans

Für die Transformation von S. lividanswar es zunächst notwendig, Protoplasten herzustellen.

↓38

Herstellung von Protoplasten: Für eine Vorkultur wurden 5 ml TSB-Medium mit 5 % PEG8000, 0,5 % Glycerin und 5 mM MgCl2 von einer Sporensuspension angeimpft. Die Hauptkultur wurde im gleichen Medium für 16 Stunden gezogen, durch Zentrifugation (4000 g, 10 Minuten, 20°C) geerntet und dann mit 20 ml einer 10,3 %igen Saccharoselösung gewaschen. Das Zellpellet wurde schließlich in 8 ml P-Puffer resuspendiert, auf 1 mg/ml Lysozym eingestellt und so lange bei 37°C inkubiert, bis mikroskopisch betrachtet überwiegend Protoplasten und kein Mycel mehr erkennbar waren. Nach einer weiteren Zugabe von 8 ml P-Puffer wurde die Suspension durch Haushaltswatte (gestopft in eine Einwegspritze und autoklaviert) filtriert. Das Filtrat wurde zentrifugiert (3500 rpm in der Eppifuge, 10 Minuten, 20°C) und das Pellet in 1 ml P-Puffer resuspendiert. Zu Aliquots von 50 µl wurden die Protoplasten zunächst bei – 20°C über Nacht eingefroren und schließlich bei
– 80°C gelagert (Motto: langsam einfrieren – schnell auftauen).

P-Puffer(HOPWOOD, 1985)

103 g

Saccharose

0,5 g

K2SO4

2,0 g

MgCl2

2 ml

Spurenelemente-Lösung

ad 800 ml H2O, autoklavieren und Zugabe von

↓39

100 ml

TES-Puffer (5,73 %, pH 7,2)

1 ml

KH2PO4 (0,5 %)

100 ml

CaCl2 (3,68 %)

Transformation: Die zu je 50 µl aliquotierte Protoplastensuspension wurde zügig aufgetaut, zentrifugiert (3500 rpm in der Eppifuge, sieben Minuten, Raumtemperatur) und der Überstand vorsichtig abgenommen. Die Protoplasten wurden ebenfalls vorsichtig wieder in 50 µl P-Puffer resuspendiert und dann das Plasmid zugegeben (maximal 10 µl). Nach Zugabe von 200 µl T-Puffer wurde der Ansatz mit der Pipette durchmischt und unmittelbar darauf 1 ml P-Puffer hinzugefügt. Sofort danach wurden von der Suspension unterschiedliche Volumina auf SPMR-Platten aufgetragen. Die Platten inkubierten für einen Tag bei 30°C und wurden dann erst zur Selektion mit dem Antibiotikum Thiostrepton überschichtet und für weitere fünf bis sieben Tage inkubiert. Schließlich erfolgte ein Einzelkolonieausstrich auf SMA-Thiostrepton-Platten und nach einigen Tagen konnte eine Sporensuspension (s. 5.4.1) angelegt werden.

T-Puffer(HOPWOOD, 1985)

25 ml

10,3 % Saccharose

0,2 ml

Spurenelemente-Lösung

1 ml

K2SO4 (2,5 %)

↓40

ad 75ml H2O, autoklavieren und Zugabe von

0,2 ml

CaCl2 (3,68 %)

0,5 ml

Tris/Maleinsäure (1 M, pH 8)

Zum Gebrauch 1:1 (v:w) mit sterilem PEG8000 im 80°C heißen Wasserbad mischen.

5.7 Analytische und Biochemische Methoden

5.7.1  Zellaufschluss und Zellfraktionierung

5.7.1.1  Zellaufschluss in einer French Pressure Cell

↓41

E. coli: Die Zellen aus den Hauptkulturen (s. 5.4.2) wurden pelletiert (8000 g, 20 Minuten, 4°C) und in 1 ml Aufschlusspuffer pro 50 ml Kultur OD650 = 1 aufgenommen. Diese Suspension wurde einmal bei 16 000 psi durch die große kalte Kammer einer French Pressure Cell gepresst. Direkt im Anschluss erfolgte die Zellfraktionierung (s. 5.7.1.3).

Aufschlusspuffer

20 mM

Tris/HCl, pH 7,2

5 %

Glycerin

300 mM

NaCl

20 mM

β-Mercaptoethanol

0,1 mM

PMSF

Spatelspitze

DNase

↓42

Actinoplanes sp.: Aus den Hauptkulturen (s. 5.4.2) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums die Zellen geerntet (5000 g, 20 Minuten, 4°C) und je nach Zelldichte in 5 ml bis 15 ml Minimalmedium MNS mit 0,1 mM PMSF resuspendiert. Nach Zugabe einer Spatelspitze DNase wurde die Suspension zweimal hintereinander bei 14 000 psi durch die kleine kalte Kammer einer French Pressure Cell gepresst. Direkt im Anschluss erfolgte die Zellfraktionierung (s. 5.7.1.3).

5.7.1.2 Zellaufschluss durch Ultraschallbehandlung

Streptomyces lividans: Aus den Hauptkulturen (s. 5.4.2) wurden die Zellen geerntet (5000 g, 20 Minuten, 4°C) und in geeignete Volumina Minimalmedium MNS mit 0,1 mM PMSF resuspendiert. Nach Zugabe einer Spatelspitze DNase wurde die Suspension einer Ultraschallbehandlung mit einem BRANSON-Sonifier 250 (Heinemann, Schwäbisch Gmünd) unterzogen. Die stets auf Eis gehaltenen Zellen wurden dabei drei mal für eine Minute mit jeweils einer Minute Pause bei 40 % bis 60 % Output beschallt. Direkt im Anschluss erfolgte die Zellfraktionierung (s. 5.7.1.3).

5.7.1.3 Zellfraktionierung

Nach dem Zellaufschluss wurden die Zellbestandteile von E. coli, Actinoplanes sp. und Streptomyces lividans in gleicher Weise nach einer modifizierten Methode von HOBSON ET AL. (1984) fraktioniert. Zelltrümmer und nicht aufgeschlossene Zellen wurden bei 14.000 g (15 min, 4 °C) als Low Speed Pellet (LSP) abzentrifugiert. Die im Überstand enthaltenen Membranen wurden dann durch Ultrazentrifugation bei 200.000 g (1 h, 4 °C) vom Cytosol getrennt. Membranen und LSPs wurden in geeigneten Volumina des jeweiligen Puffers, der auch für den Zellaufschluss verwendet wurde, resuspendiert. Die einzelnen Zellfraktionen wurden schließlich in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

5.7.2 Präparation des Osmoschock-Überstandes

↓43

Die für die Fällungsexperimente eingesetzten Periplasmafraktionen (s. 5.7.9) wurden so wie bei NOSSAL & HEPPEL (1966) beschrieben durch eine Osmoschock-Behandlung der Zellen E. coli K12 gewonnen. Die Zellen wuchsen über Nacht in 25 ml Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose, um die Expression des chromosomal kodierten Gens malE zu induzieren. Ein MalE freier Osmoschock-Überstand wurde von solchen Zellen präpariert, denen zum Wachstum alternativ 0,5 % Glukose angeboten wurde. Abschließend wurden die Fraktionen zweimal gegen 1000-faches Volumen 10 mM Tris/HCl, pH 7,5 dialysiert.

5.7.3 Bestimmung der Proteinkonzentration

Der Gehalt an Protein verschiedener Lösungen wurde in Abhängigkeit von der Abkunft der Proben mittels zweierlei Verfahren ermittelt.

Nach der Methode von DULLEY & GRIEVE (1975), basierend auf dem Protokoll von LOWRY ET AL. (1951), wurde der Proteingehalt ganzer Zellen von Actinoplanes sp. bestimmt. Dazu wurden geeignete Aliquots der Kulturen pelletiert und drei „Freeze-Thaw“-Zyklen (Wechselbad zwischen 95 °C und flüssigem Stickstoff) unterzogen. Je nach Zelldichte wurden die Pellets dann in bis zu 800 µl 1 N NaOH-Lösung resuspendiert und unter Schütteln bis zur Lyse der Zellen bei 95 °C gehalten. Als Standardprotein diente RSA, welches auf gleiche Weise mit 1 N NaOH (3 : 1) behandelt wurde. Für die Zusammenstellung der Lowry-Lösung wurde das Na2CO3nicht in NaOH angesetzt sondern in H2O.

↓44

Die Mengen an gereinigtem Protein so wie Proteingehalte von Zellfraktionen wurden mit Hilfe des „BCA-Protein-Assay-Kit“ der Firma Pierce (Rockford, USA) quantifiziert. Dabei wurden in Anlehnung an das Herstellerprotokoll geeignete Aliquots der einzelnen Proben mit dem gleichen Puffer, in dem diese bereits vorlagen, auf 50 µl aufgefüllt, mit 1 ml Reagenzgemisch versetzt und für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Als Standardprotein diente RSA, welches ebenfalls mit dem jeweils entsprechenden Puffer behandelt wurde.

5.7.4 Gelelektrophoretische Darstellung von Proteinen

Zur Darstellung von Proteinmustern wurden SDS-Polyacrylamidgele nach LAEMMLI (1970) eingesetzt. Bei allen Gelen betrug im Sammelgel die Acrylamidkonzentration 4,9 % und die Bisacrylamidkonzentration 0,13 %. Im Trenngel lag die Acrylamidkonzentration bei 10 % oder 12,5 % und die Bisacrylamidkonzentration bei 0,27 % resp. 0,32 %. Die Elektrophorese von Minigelen (Trenngellänge etwa 6 cm, Geldicke 0,75 mm) erfolgte in einer mit 1 x Elektrophoresepuffer gefüllten Kammer des Typs Mini-ProteanII der Firma BioRad (München) bei einer Spannung von 150 V. Die Proben wurden entsprechend der Proteinkonzentration mit 2 x oder 10 x Probenpuffer versetzt. Zur Bestimmung der relativen molaren Massen der aufgetrennten Proteine wurde der „broad range“ Standard (BioRad), der zusätzlich das Maltose-Bindeprotein (40 kDa) von E. coli enthielt, mitgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine durch ein zehnminütiges Bad in 40 % Isopropanol/10 % Essigsäure im Gel fixiert und anschließend in einer Serva-Blau R.-Lösung durch zweiminütiges Erhitzen in einer Mikrowelle gefärbt. Abschließend wurde das Gel zur Entfärbung des Hintergrundes in 10 % Essigsäure gewaschen (WALTER, 1992, WONG ET AL., 2000).

Elektrophoresepuffer (10 x)

0,25 M

Tris

1,92 M

Glycin

35 mM

SDS

↓45

Probenpuffer (2 x)

4 %

SDS

25 %

Sammelgelpuffer

30 %

Glycerin

10 %

β-Mercaptoethanol

0,002 %

Bromphenolblau

Probenpuffer (10 x )

20 %

SDS

50 %

Sammelgelpuffer (5 x

30 %

Glycerin

5 %

β-Mercaptoethanol

0,05 %

Bromphenolblau

Sammelgelpuffer

0,5 M

Tris/HCl, pH 6,76

0,4 %

SDS

Trenngelpuffer

1,5 M

Tris/HCl, pH 8,6

0,4 %

SDS

5.7.5 Proteinelution aus SDS-Polyacrylamid-Gelen

↓46

Für die Gewinnung eines polyklonalen Anti-AcbH-Antiserums wurde das Antigen AcbH aus Polyacrylamid-Gelen eluiert. Dafür wurden nach Überexpression des acbH von pCB7 (durchgeführt wie für pCB10 unter 5.7.12 beschrieben, Anzucht ohne Cam) auf 5 mg berechnete LSPs (5.7.1.3) in 10 %igen SDS-Gelen (Trenngellänge 12 cm) unter Standardbedingungen (5.7.4) aufgetrennt. Nach dem Anfärben der Proteine aus zwei Referenzstreifen wurde ein Gelstreifen mit nicht fixiertem AcbH ausgeschnitten und für die Elektroelution in einem Elektro-Eluter Modell 422 nach Angaben des Herstellers (BioRad) eingesetzt.

5.7.6 Western Blotting und Immunodetektion

Der Elektrotransfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembran erfolgte modifiziert nach TOWBIN ET AL. (1979). Dazu wurden Gel, Membran und Filterpapiere in Blotpuffer equilibriert. Für den Transfer wurde die „Trans-Blot SD semi-dry“-Apparatur nach Angaben des Herstellers (BioRad, München) verwendet. Die Transferzeit betrug 25 Minuten bei einer konstanten Spannung von 20 Volt. Im Anschluss wurde die Membran mit Ponceau (0,2 % Ponceau S in 3 % TCA) gefärbt, um den Proteinstandard zu markieren und schließlich mit TNT wieder entfärbt.

Für die Immunodetektion gesuchter Proteine wurde im weiteren Verlauf die Membran über Nacht bei 4°C in 10 ml 2 % RSA Fraktion V (in TNT) inkubiert, um unbelegte Protein-Bindungsstellen abzusättigen. Direkt in diese Lösung hinein wurde dann eine geeignete Antiserumverdünnung des primären Antikörpers gegeben. Nach einstündiger Inkubation unter leichtem Schwenken bei Raumtemperatur wurde die Membran intensiv mit TNT gewaschen. Für die Detektion wurde die Membran mit dem sekundären Antikörper (Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG) 1 : 30 000 in 10 ml TNT ebenfalls für eine Stunde geschwenkt. Dieser war mit einer Meerrettich-Peroxidase konjugiert und konnte so mit Hilfe des „Western Blot Chemiluminescense Reagent Plus System“ nachgewiesen werden. Die Chemilumineszenz wurde mittels Hyperfilm bzw. im Lumi-Imager sichtbar gemacht.

↓47

Im Falle des Strep-Tag-AcbH-Fusionsproteins wurde nach dem Protokoll der Herstellerfirma IBA-GmbH (Göttingen) verfahren.

Blotpuffer

25 mM

Tris/HCl, pH 8,3

192 mM

Glycin

20 %

Methanol

TNT

20 mM

Tris/HCl, pH 7,5

50 mM

NaCl

0,05 %

Tween 20

↓48

Antiseren

α-AcbH

1 : 60 000

α-MalE

1 : 20 000

α-MsiK

1 : 40 000

α-RGS

1 : 10 000

α-(His)10

1 : 10 000

α-(His)5

1 : 20 000

5.7.7 Transportversuche

Die Aufnahme radioaktiv markierter Substrate in Zellen von E. coli und Actinoplanes sp. wurde durch Transportversuche analysiert, die prinzipiell so wie bei SCHNEIDER & WALTER (1991) für das Arbeiten mit S. typhimurium beschrieben durchgeführt wurden. Zum Abzug unspezifischer Bindung der radioaktiven Substrate wurden zur Kontrolle gekochte Zellen eingesetzt.

Escherichia coli: Die Zellen wurden in Minimalmedium M63 entweder nur mit 0,5 % Maltose bzw. 0,5 % Glycerin oder zusätzlich mit 0,5 % Acarbose bis zu einer OD650 von 0,8 kultiviert (s. auch 5.4.2). Nach der Ernte (5000 g, 15 Minuten, 4°C) wurden die Zellen zwei mal in M63 gewaschen und für die Messungen zu
OD650 = 7,5 resuspendiert. Die Zellen wurden dann auf Eis gehalten und der Reaktionsstart erfolgte durch Zugabe von 10 µl dieser Suspensionen zu den einzelnen Messansätzen (985 µl M63, 5 µl 14C-Lösung). Zur Verifizierung der Spezifität des Transportes enthielten weitere Messansätze zusätzlich 100 µM unmarkierte Maltose bzw. Acarbose. Nach 10, 20, 30 und 40 Sekunden wurden Aliquots von 180 µl entnommen, in einem Vakuum-Filtrationsgerät bei 20 Torr über Membranen (s. 5.1) gefiltert und mit jeweils 5 ml eiskaltem M63 nachgewaschen. Abschließend wurden die Filter mit den Zellen darauf in 4,5 ml Szintillationsflüssigkeit (Zinsser Aquasafe 300 plus) gegeben und die intrazellulär akkumulierte Maltose bzw. Acarbose konnte über die Messung der Radioaktivität (cpm) in einem Zählgerät der Firma Packard GmbH (Modell 1600 TR) quantifiziert werden.

↓49

14C-Acarbose/Ansatz

5,7 nmol

14C-Acarbose (1)

ad 5 µl

M63

14C-Maltose/Ansatz

0,5 nmol

[U-14C]-Maltose (1)

5,2 nmol

kalte Maltose

ad 5 µl

M63

Berechnung

cpm x Volumen (1000 µl/180 µl) x Faktor F (2)

= nmol Substrat/109 Zellen/min

Zelldichte (10 µl x OD/1000 µl) x Zeit

↓50

Actinoplanes sp.: Aus den Hauptkulturen (s. 5.4.2) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums Zellen aus jeweils 15 ml geerntet (5000 g, 20 Minuten, 4°C), zwei mal mit Minimalmedium MNS gewaschen, in 0,2 bis 1,0 ml MNS aufgenommen und bis zur Messung auf Eis gehalten. Von diesen Suspensionen wurden 60 µl für die Transportmessungen eingesetzt und zwei mal 60 µl für Doppelbestimmungen der Ganzzell-Proteinmenge (s. 5.7.3) entnommen, um die ermittelten Transportdaten auf mg Protein zu beziehen.(3)

Das Endvolumen eines Messansatzes betrug stets 1 ml (aufgefüllt mit MNS). Neben den Zellen enthielten solche Ansätze, die zur Ermittlung der Substratspezifität der Transportaktivitäten (Hemmstudien) durchgeführt wurden, zusätzlich andere, verschiedene Zucker in einer Konzentration von jeweils 1 mM. Die so vorbereiteten Messansätze inkubierten vor dem Reaktionsstart für eine Minute und dann während der gesamten Messzeit bei 30°C und 1100 rpm, um für die Zellen optimale Temperaturbedingungen zu erreichen. Außerdem wurde so gewährleistet, dass die Zellpellets gleichmäßig in der Lösung verteilt waren und nicht zu Boden des Reaktionsgefäßes sanken. Durch Zugabe von 10 µl der radioaktiven Maltose-, Maltotriose- bzw. Acarboselösung wurde die Messung gestartet. Nach einer, drei, fünf und sieben Minuten wurden Aliquots von 180 µl entnommen, in einem Vakuum-Filtrationsgerät bei 20 Torr über Membranen (s. 5.1) gefiltert und mit jeweils
5 ml eiskaltem MNS nachgewaschen. Das weitere Verfahren zur Quantifizierung der intrazellulär akkumulierten Maltose, Maltotriose bzw. Acarbose erfolgte wie oben für die Messungen mit E. coli beschrieben.

14C-Lösung/Ansatz

1 nmol

14C-Substrat ([U-14C]-Maltose oder [U-14C]-Maltotriose)

oder 5,7 nmol

14C-Acarbose

50 nmol

kaltes Substrat (Maltose oder Maltotriose, keine Acarbose)

ad 10 µl

MNS

↓51

Für die Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports variierte der Anteil kalter Maltose in der 14C-Lösung von Null bis 60 nmol.

Berechnung

cpm x Volumen (1000 µl/180 µl) x Faktor F (2)

nmol Substrat/Messansatz

(1) Je nach Charge hatte die radioaktive Maltose eine Spezifische Aktivität von 610 mCi/mmol (Amersham Pharmacia Biotech),
594 mCi/mmol oder 570 mCi/mmol (ICN). Die Spezifischen Aktivitäten der radioaktiven Maltotriose lagen bei 900 mCi/mmol und
800 mCi/mmol (ARC-Biotrend), die der 14C-Acarbose bei 50 mCi/mmol (hier war lediglich der Acarviosyl-Rest markiert).

↓52

(2) In die Berechnung der Transportdaten wurde ein Faktor F einbezogen, der auf der Basis 1 Ci = 2,2 x 1012 cpm den Zusammenhang zwischen insgesamt transportiertem Substrat (heißes und kaltes) und gezählter Radioaktivität in cpm berücksichtigt. Für die z. B. oben beschriebene 14C-Maltoselösung ergibt sich bei einer Spezifischen Aktivität von 610 mCi/mmol folgender Faktor F:

1 nmol 14C-Maltose = 0,61 µCi = 1,34 x 106 cpm

1 nmol 14C-Maltose + 50 nmol Maltose = 51 nmol Gesamtmaltose

d. h.

51 nmol Gesamtmaltose entspricht 1,34 x 106 cpm

↓53

also ist Faktor F:

38 x 10-6 nmol Maltose/cpm

(3) Die Zellzahlen von Actinoplanes sp. konnten aufgrund des pelletartigen Wachstums nicht über die Optische Dichte quantifiziert werden. So war es weder möglich, die Suspensionen für die Messungen auf gleiche Zellmengen einzustellen noch die Transportraten auf Zellzahlen zu beziehen. Da in Abhängigkeit von Wachstumsmedium und Erntezeitpunkt pro 15 ml entnommener Kultur deutlich sichtbar variierende Mengen an Zellen vorlagen, wurden die Volumina zur Resuspension der gewaschenen Zellen nun derartig angepasst, dass per Augenmaß in etwa ähnliche Zelldichten entstanden. Trotz dieser Verfahrensweise ergaben die Doppelbestimmungen der Ganzzell-Proteine für jede Kultur abweichende Werte, so dass im Rückschluss dennoch variierende Zellzahlen in den einzelnen Messansätzen vorhanden waren. Eine Beeinflussung der Transportraten durch schwankende Zellzahlen konnte jedoch in einem Kontrollexperiment, in dem unterschiedliche Zellmengen der selben Kultur eingesetzt wurden, ausgeschlossen werden.

5.7.8 Maltose-PTS-Test

Die Beteiligung eines Phosphoenolpyruvat (PEP)-abhängigen Phosphotransferase-Systems (PTS) am Import von Maltose bei Actinoplanes sp. wurde über einen Test auf PEP-abhängige Phosphorylierung von [U-14C]-Maltose nach PARCHE ET AL. (1999) überprüft. Ähnlich wie unter 5.7.1.1 beschrieben wurden Zellaufschlüsse von Actinoplanes sp. hergestellt, lediglich der Aufschlusspuffer hatte eine andere Zusammensetzung: 10 mM Tris/HCl, pH 7, 200 mM NaCl, 0,1 mM PMSF und 5 mM DTT. Nach Abzentrifugation der LSPs wurden die membranenhaltigen, cytosolischen Überstände gegen 1000-faches Volumen 25 mM Tris/HCl, pH 7 dialysiert, um metaboles ATP und PEP zu entfernen. In einem Endvolumen von 100 µl (aufgefüllt mit 25 mM Tris/HCl, pH 7) wurden jeweils 200 µg dieser Proteinextrakte mit 50 µl PTS-Mix gemischt und für fünf Minuten bei 30°C vorinkubiert. Durch Zugabe von 10 µl [U-14C]-Maltose (51 µM) wurden die Reaktionen gestartet und die Ansätze weitere 30 Minuten inkubiert. Um schließlich vorhandene phosphorylierte [U-14C]-Maltose aus den einzelnen Extrakten zu separieren, wurden die Ansätze auf Säulen mit 1,5 ml Anionenaustauschmatrix (Dowex 1 x 2, equilibriert mit 2 ml 0,2 M HCl und dann gewaschen mit 2 ml A. dest) pipettiert. Nach Waschung mit dreifachem Säulenvolumen A. dest erfolgte die Elution mit 2 ml 0,2 M HCl. Die Eluatfraktionen wurden in Szintillationsröhrchen aufgefangen und mit 3,5 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt. Über die Messung der Radioaktivität (cpm) in einem Zählgerät der Firma Packard GmbH (Modell 1600 TR) konnte dann das Vorhandensein phosphorylierter [U-14C]-Maltose überprüft werden.

↓54

Zur Überprüfung des Gelingens dieser Methode wurden solche Experimente in gleicher Weise auch mit Extrakten von E. coli K12 durchgeführt. Dabei wurde die Phosphorylierung von Methyl-α-D-[U-14C]-glukopyranosid (12,5 µM) durch Extrakte von Zellen nach Wachstum in M63 mit 0,5 % Glukose bzw. vergleichend Maltose nachvollzogen.

PTS-Mix

5 mM

DTT

5 mM

PEP

5 mM

MgCl2

25 mM

Tris/HCl, pH 7

14C-Lösung/Ansatz

0,1 nmol

[U-14C]-Maltose (1) (s. 5.7.7)

5 nmol

kalte Maltose

ad 10 µl

Tris/HCl, pH 7

5.7.9 Zuckerbindungsstudien in Fällungsexperimenten

Die Interaktion von Acarbose mit dem Maltose-Bindeprotein MalE (wt) aus E. coli K12 wurde in Bindungsstudien mit 14C-Maltosenach RICHARME & KEPES (1983) untersucht. Für diese Studien wurden Osmoschock-Überstände verwendet, die von Zellen von E. coli K12 nach Wachstum in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose bzw. alternativ 0,5 % Glukose präpariert wurden (s. 5.7.2). Die Fluids wurden durch Ultra-filtration ankonzentriert und gegen 2000-faches Volumen 10 mM Tris/HCl, pH 7,5 dialysiert. Von den so gewonnenen periplasmatischen Fraktionen wurden je 120 µg Gesamtprotein für die Studien eingesetzt, daran anteilig war MalE mit ca. 5 %. In einem Endvolumen von 100 µl (aufgefüllt mit 10 mM Tris/HCl, pH 7,5) inkubierten diese einzelnen Ansätze zusammen mit 5 µM [U-14C]-Maltose (300 nCi (1) , s. 5.7.7) bei 37°C. Nach 30 Sekunden wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml einer gesättigten NH4SO2-Lösung gestoppt. Diese Mischung wurde sofort in einem Vakuum-Filtrationsgerät bei 20 Torr über Membranen (s. 5.1) gefiltert. Die Filter wurden dann noch mal mit 5 ml der gesättigten NH4SO2-Lösung und anschließend mit 5 ml A. dest gewaschen. Für die Quantifizierung der in den Proteinaggregaten gebundenen [U-14C]-Maltosewurde mit den Filtern so wie bereits für die Transportmessungen (5.7.7) beschrieben verfahren. Um schließlich den Einfluss von Acarbose zu testen, wurden einzelne Messansätze zunächst mit verschiedenen Acarbose-Konzentrationen für eine Minute, ebenfalls bei 37°C, vorinkubiert und dann erst die Reaktion durch Zugabe von [U-14C]-Maltose gestartet.

5.7.10 Zuckerbindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz

↓55

Die Suche nach Substraten des Bindeproteins AcbH aus Actinoplanes sp. erfolgte mit Hilfe einer Methode, durch die es möglich ist, biomolekulare Interaktionen in Echtzeit zu beobachten und zwar ohne dass die beteiligten Moleküle markiert sein müssen. Die Biomolekulare Interaktions-Analyse (BIA) macht sich dabei die Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR: Surface Plasmon Resonance) zunutze, mit der minimale Masseänderungen (< 1 pg/mm2) auf der Oberfläche eines Sensorchips detektiert werden können. Das daraus resultierende Sensorgramm zeigt einen Plot des SPR-Signal in RU (Resonance Units) gegen die Zeit in Sekunden (s. Abb. 5.5). Das SPR-Signal und die an der Chip-Oberfläche gebundenen Makromoleküle stehen in enger Korrelation zueinander (1000 RU = 1 ng/mm2) und verhalten sich bis zu 50 ng/mm2 linear. Die Studien wurden an dem Gerät BIACORE X der Firma BIACORE (Schweden) mit der dazugehörigen Software und einem Ni-NTA-Sensorchip, der speziell für die Immobilisierung von HisTag-Fusionsproteinen geeignet ist, bei 25°C durchgeführt. Als Laufpuffer wurde der Puffer gewählt, in dem das gereinigte und renaturierte (His)10-AcbH vorlag (s. 5.7.13).

Zur Analyse wurde gereinigtes (His)10-AcbH auf der Oberfläche eines zuvor nach Herstellerangaben aktivierten Ni-NTA-Sensorchips immobilisiert. Bei einer Flußrate von 10 µl/min wurde das Protein in Etappen injiziert, so dass sich eine Beschichtung von durchschnittlich 13.000 RU ergab. Die zu testenden Zuckersubstrate wurden als verschieden konzentrierte Lösungen (angesetzt in Laufpuffer) bei einer Flußrate von ebenfalls 10 µl/min injiziert. Die Beobachtung von Assoziation und Dissoziation der Zucker an die immobilisierten Proteine erfolgte jeweils für zwei Minuten.

Als Referenzprotein diente (His)10-MalK, das mir freundlicherweise von Bettina Blüschke zur Verfügung gestellt wurde.

↓56

Die Regeneration des Sensorchips erfolgte nach Herstellerempfehlung mit SDS und EDTA.

Abbildung 5.5: Prinzip der Biomolekularen Interaktions-Analyse5: Prinzip der Biomolekularen Interaktions-Analyse

5.7.11 Freisetzung von Glukose aus Acarbose

Mit Hilfe zellfreier Extrakte der Stämme E. coli HS3018, CB39 und TK38, präpariert nach EHRMANN & BOOS (1987), wurde die Aktivität der beiden Enzyme MalQ und MalZ in Anwesenheit von Acarbose analysiert. Die Zellen wurden wie unter 5.4.2 beschrieben in Vollmedium LB mit 0,2 % Maltose angezogen. Nach dem Zellaufschluss in 100 mM NaPO4-Puffer und der Abtrennung des LSPs (s. 5.7.1) wurden die Extrakte über Nacht gegen 1000-faches Volumen 100 mM NaPO4-Puffer dialysiert. In Messansätzen von 100 µl wurden je
60 µg Extrakt zusammen mit verschiedenen Mixturen an Maltose, Maltotetraose und Acarbose in unterschiedlichen Konzentrationen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurden durch zweiminütiges Kochen gestoppt. Nach einer Zentrifugation (5 Minuten, 13 000g) wurde die im Überstand enthaltene Glukose mit Hilfe der GOD-POD-Methode quantifiziert (BERGMEYER, 1974).

5.7.12 Reinigung des AcbH-Proteins

↓57

Das Fusionsprotein (His)10-AcbH wurde nach Überexpression des acbH-Gensvon pCB10 in E. coli BL21(DE3)<pLysS> mit Harnstoff aus dem LSP solubilisiert und über Nickel-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Dazu wurden die Zellen wie unter 5.4.2 beschrieben als Hauptkultur in Vollmedium LB mit den Antibiotika Amp und Cam angezogen. Die Induktion der Expression erfolgte bei einer OD650 von 1 mit 0,1 mM IPTG. Nach drei Stunden wurde die Kultur geerntet und einem Zellaufschluss unterzogen (s. 5.7.1). Das LSP wurde abzentrifugiert, im selben Volumen Aufschlusspuffer resuspendiert und zu 5 mg Protein mit 8 M Harnstoff (gelöst in Aufschlusspuffer) für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken solubilisiert. Nach einer Ultrazentrifugation für 30 Minuten bei 200 000g wurde dann das Solubilisat mit 2 ml Ni-NTA-Matrix ebenfalls bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubiert. Es folgten Waschungen zunächst mit 10 ml reinem Harnstoffpuffer, dann mit zusätzlich 20 mM Imidazol. Schließlich wurde das Protein mit 4 ml 150 mM Imidazol in Harnstoffpuffer eluiert.

Für die Reinigung des (His)10-AcbH nach Expression des acbH-Gens von pCB12 in S. lividans wurden die Zellen wie unter 5.4.2 beschreiben mit dem Antibiotikum Thiostrepton für zwei Tage angezogen. Der Säulenlauf mit 0,5 ml Ni-Matrix wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen mit der nach Zellfraktionierung erhaltenen Cytosolfraktion (s. 5.7.1) analog dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Die Reinigung des (His)6-MalE nach Überexpression des malE-Gens von pCB5 in E. coli JM109 wurde analog dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Zellen wuchsen in Vollmedium 2YT, der Säulenlauf wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen mit der nach Zellfraktionierung erhaltenen Cytosolfraktion (s. 5.7.1) durchgeführt.

5.7.13 Renaturierung des AcbH-Proteins

↓58

Die Renaturierung des denaturierend gereinigten (His)10-AcbH (s. 5.7.12) erfolgte mit Hilfe von Arginin über zwei hintereinander geschaltete Gelfiltrationen mittels PD10-Säulen (DE BERNARDEZ CLARK, 1998; MIDDELBERG, 2002). Im ersten Schritt wurde das nach der Reinigung in Harnstoffpuffer vorliegende Protein in
1 M Argininpuffer gemischt, auf eine PD10-Säule pipettiert und mit 1 M Argininpuffer wieder eluiert. In einem zweiten Schritt wurde das nun in Argininpuffer vorliegende AcbH direkt auf die nächste PD10-Säule gegeben und auf Eis mit einem Puffer aus 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 5 % Glycerin und 300 mM NaCl eluiert. Nach einer Ultrazentrifugation bei 200 000g für 30 Minuten bei 4°C wurde das lösliche Protein sofort für die Zuckerbindungsstudien (s. 5.7.10) verwendet.

Die Renaturierung des denaturierend gereinigten (His)6-AcbH erfolgte mit dem Renaturierungsreagenz Roti®-Fold (8x) nach Angabe des Herstellers (Firma ROTH). Alternativ sollte in einem Verfahren das Protein durch eine schnelle Dialyse gegen 1000-faches Volumen Puffer (50 mM Tris, pH7,2, 300 mM NaCl, 5 % Glycerin) renaturiert werden. Die „Artificial Chaperon“-Methode wurde nach DAUGHERTY ET AL. (1998) durchgeführt.

5.7.14 CD-Spektrum des renaturierten Proteins AcbH

Der Nachweis einer α-helikalen Konformation des renaturierten Bindeproteins AcbH konnte in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Margitta Dathe und Frau Nikolenko (Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin-Buch) durch die Aufnahme eines CD-Spektrums erbracht werden. Darüber hinaus allerdings ließen sich anhand des Spektrogramms keine quantitativen Aussagen über die α-Helizität treffen, da bei den Messungen die Anwesenheit von Chlorid-Ionen störend war, das Protein aber nicht ohne NaCl bzw. alternativ mit NaF renaturiert werden konnte. Das Protein lag vor in 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 5 % Glycerin, 150 mM NaCl2, das Spektrum (260 nm bis 190 nm) wurde in dem Gerät Jasco 720 (Japan) aufgenommen.

5.7.15 Solubilisierung des WT-AcbH aus Membranen

↓59

Membranfraktionen von Zellen nach Anzucht in Minimalmedium mit 0,5 % Acarbose wurden zu 390 µg Proteinanteil in 300 µl Solubilisierungspuffer (1,1 % Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 5 % Glycerin, 0,1 mM PMSF in Minimalmedium) aufgenommen. Der Ansatz wurde für 30 Minuten auf Eis gerührt und anschließend ultrazentrifugiert (200 000 g, 30 Minuten). Das Membranpellet wurde im Ausgangsvolumen Solubilisierungspuffer resuspendiert. Durch den Auftrag gleicher Volumina auf SDS-Gele konnte die Solubilisierungseffizienz nach Immunoblot-Analyse mit Anti-AcbH-Antiserum (s. 5.7.6) überprüft werden.

Für einen ersten Reinigungsversuch über Anionen-Austauschmatrix (DEAE-Sepharose) wurde das Solubilisat über Nacht gegen 2 Liter Säulenpuffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 0,01 % DDM) dialysiert und auf 0,5 ml DEAE-Sepharose-Matrix gegeben. Durch schrittweises Waschen mit steigenden NaCl-Konzentrationen sollte das Protein von der Matrix eluiert werden.

5.7.16 Reinigung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins aus dem
Kulturüberstand von Actinoplanes sp.

Die Reinigung des potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins erfolgte affinitätschromatographisch mittels Amylose-Matrix nach FERENCI & KLOTZ, 1978. Nach Anzucht von Actinoplanes sp. in Minimalmedium MNS mit verschiedenen Kohlenstoffquellen (s. 5.4.2) wurden die Proteine aus dem Kulturüberstand in einer Amicon-Rührzelle (YM10-Filter, s. 5.1) bei einem Druck von 1 bar ankonzentriert. Nach Erreichen von ca. 1/50 des Ausgangsvolumens wurde der Druck wieder abgebaut und das Rühren für weitere 30 Minuten fortgesetzt, um Protein vom Filter zu lösen. Anschließend folgte eine Dialyse über Gelfiltration mittels PD10-Säulen gegen 25 mM Tris/HCl, pH 7,2, 1mM CaCl2 und die Probe wurde auf eine Amylose-Säule (0,5 ml Bed) pipettiert. Nach Waschungen mit sechs Säulenvolumen Puffer wurde das Protein mit 20 mM Maltose oder Maltodextrinen eluiert.

↓60

Analog wurde mit dem MalE von E. coli nach Überexpression des Gens von pCB5 verfahren, die Cytosolfraktion wurde über Nacht gegen 2000-faches Volumen 50 mM Tris/HCL, pH 7,2 dialysiert. Die Zellanzucht erfolgte wie unter 5.7.12 beschrieben.

Analog wurde auch mit dem (His)10-AcbH nach Expression des Gens von pCB12 in S. lividans verfahren. Die Zellanzucht und Fraktionierung erfolgte wie unter 5.7.12 beschrieben, die Cytosolfraktion wurde über Nacht gegen 2000-faches Volumen 50 mM Tris/HCL, pH 7,2 dialysiert.

5.7.17 Massenanalyse und Peptidsequenzierung

Das im Kulturüberstand gefundene, potentielle Maltose/Maltodextrin-Bindeprotein wurde einer MALDI-TOF MS-Analyse (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight Massen Spektrometrie)
unterzogen. Die Arbeiten hierzu wurden freundlicherweise überwiegend von Frau Dr. Sophie Haebel (Max Planck Institut, Potsdam) übernommen. Die Sequenzen einzelner Peptide sind im Anhang aufgelistet.

↓61

Außerdem konnte das von pCB7 synthetisierte Protein, welches für die Immunisierung von Kaninchen zur Gewinnung eines Anti-AcbH-Antiserums verwendet wurde (s. auch 5.7.5), durch MALDI-TOF-Analyse als AcbH bestätigt werden.

Das Protein wurde in der ausgeschnittenen, Coomassie gefärbten Gelbande nach Entfärbung in einem Mix aus 40% Acetonitril und 60% 50 mM NH4HCO3 und Trocknung durch Vakuumzentrifugation über Nacht bei 37°C mit Trypsin verdaut (30 ng/µl in 50 mM NH4HCO3). Dann wurden die Peptide durch Zugabe von 30 µl 0.1% Trifluoressigsäure (TFA) und zehn Minuten später 50 µl Acetonitril aus den Gelfragmenten extrahiert. Der Überstand wurde abgenommen und nach einer zweiten Extraktion wurden die Überstände vereinigt und lyophilisiert.
Die MALDI-TOF-Massenspektren wurden an einem Reflex II MALDI-TOF Instrument (Bruker-Daltonik, Bremen) aufgenommen. Alle Spektren wurden im Reflektormodus mit α-Cyano-4-hydroxy-Zimtsäure
(15 mg/ml in 60 % Acetonitril/40 % flüssiger TFA (0,1 % v/v) als Matrix aufgenommen.

Das Peptidgemisch wurde mit RP-HPLC (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, SMART System, Pharmacia, Uppsala, Schweden) über eine Pharmacia C2/C18 SC 2.1/10-Säule in einem linearen Acetonitril-Gradienten (0 – 50 % in 0,1 % TFA in 50 Minuten) getrennt. Bei einer Fußrate von 100 µl/Minute wurden die Peptide bei einer Wellenlänge von 214 nm detektiert. Die Fraktionen wurden manuell aufgefangen.

↓62

Peptidhaltige Fraktionen wurden mit nano-ESI (Elektrospray-Ionisierung) analysiert und MS/MS Spektren wurden auf einem API QSTAR Pulsar I LC/MS/MS Massenspektrometer der Firma Applied Biosystems/MDS Sciex (Toronto, Kanada) aufgenommen. Die MS/MS Spektren lieferten die partielle oder vollständige Sequenzinformation der analysierten Peptide.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
22.09.2006