6 ERGEBNISSE

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6.1  Einfluss von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von
Escherichia coli K12

Das von STRATMANN (1997) aufgestellte Modell des Acarbose-Metabolismus in Actinoplanes sp. beschreibt neben einer Carbophor-Funktion der Acarbose auch die Rolle dieses Moleküls als Inhibitor von α-Amylasen und α-Glukosidasen von Nahrungs-konkurrenten im Habitat. Vor diesem Hintergrund und der strukturellen Ähnlichkeit des Pseudotetrasaccharids Acarbose zu Maltotetraose (vgl. Seite 10, Abbildung 4.1) wurde der Einfluss von Acarbose auf den Maltose- und Maltodextrinstoffwechsel von E. coli K12, der durch Maltotriose induziert wird, untersucht (s. Abschnitt 4.2.4). Im Rahmen einer Diplomarbeit (BRUNKHORST, 1998) konnte bereits dokumentiert werden, dass Acarbose spezifisch sowohl das Wachstum von E. coli K12 mit Maltose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle als auch den Maltoseimport über das Bindeprotein-abhängige ABC-Transportsystem MalEFGK2 hemmt (s. auch Abbildung 6.1). Wachstum der Zellen mit Acarbose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle war nicht möglich, darüber hinaus wurde aber bei Ko-Kultivierung von E. coli K12 mit Glycerin und Acarbose in Immunoblot-Analysen eine erhöhte Synthese des Maltose-Bindeproteins MalE festgestellt. Da auch das Wachstum einer Bindeprotein-unabhängigen Mutante (s. Abschnitt 4.2.3.1; malF500, TREPTOW & SHUMAN, 1985) auf Maltose durch Acarbose beeinträchtigt war, wurde spekuliert, dass Acarbose von individuellen Komponenten des Maltose- und Maltodextrinstoffwechsels als Substrat erkannt wird.

In weitergehenden Untersuchungen wurde daher zu Beginn der vorliegenden Arbeit zunächst das Vermögen von Escherichia coli K12, [14C]-Acarbose zu importieren, überprüft. Außerdem wurden die Interaktion von Acarbose mit dem Maltose-Bindeprotein MalE und der Einfluss des Pseudozuckers auf den Maltose-Katabolismus mit Blick auf die intrazellulären Enzyme MalQ und MalZ differenziert.

6.1.1  Acarboseaufnahme in Zellen von Escherichia coliK12

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Um zu überprüfen, ob Zellen von E. coli K12 die Kapazität besitzen, über das Maltose- und Maltodextrintransportsystem MalEFGK2 auch das Pseudotetrasaccharid Acarbose zu importieren, wurden vergleichende Untersuchungen zur Aufnahme von [U-14C]-Maltose bzw. [14C]-Acarbose (je 5,7 µM und 300 nCi, im Falle der radioaktiven Acarbose waren lediglich die C-Atome des Acarviosyl-Restes durch das 14C-Isotop ersetzt) durchgeführt. Dafür wurden die Zellen in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose kultiviert und, wie unter 5.7.7 beschrieben, für die Messungen vorbereitet. Die Spezifität des jeweiligen Transportprozesses wurde in solchen Ansätzen verglichen, in denen die Zellen vor dem Reaktionsstart durch Zugabe der radioaktiven Zuckerlösung mit einem Überschuss des entsprechenden Strukturhomologen (0,1 mM) inkubiert worden waren. Die gewonnenen Werte (Abbildung 6.1) wurden jeweils auf 109 Zellen/min berechnet und gemittelt.

Abbildung 6.1: Aufnahme von Acarbose über das Maltosetransportsystem von E. coli K12.Die Zellen wurden in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose kultiviert und bei Erreichen der spät exponentiellen Wachstumsphase für die Messungen vorbereitet. Die Konzentration der radioaktiven Zuckerlösungen betrug1: Aufnahme von Acarbose über das Maltosetransportsystem von E. coli K12.Die Zellen wurden in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose kultiviert und bei Erreichen der spät exponentiellen Wachstumsphase für die Messungen vorbereitet. Die Konzentration der radioaktiven Zuckerlösungen betrug
5,7 µM. Zur Überprüfung der Spezifität wurde den Ansätzen in einer anderen Messung zusätzlich je 0,1 mM des Strukturhomologen zugegeben.

Über den gesamten Messzeitraum von 40 Sekunden war eine Linearität des Transports gegeben. Der Acarboseimport wurde mit einer dem Maltosetransport ähnlichen Rate realisiert und in Gegenwart von Maltose kompetitiv auf 10 % reduziert. Zusammen mit dem Befund, dass Zellen aus Anzuchten mit Glycerin keine Acarbose-Transportaktivität aufwiesen (nicht gezeigt), lässt sich konstatieren, dass Acarbose über das ABC-System MalEFGK2 von E. coli transportiert wird.

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Das bei Ko-Kultivierung von E. coli K12 mit je 0,5 % Glycerin und Acarbose durch Immunoblot-Analysen nachgewiesene erhöhte Syntheselevel des Maltose-Bindeproteins (BRUNKHORST, 1998) wurde mit Zellen solcher Anzuchten in weiteren Transportexperimenten näher untersucht. Im Gegensatz zu Kontrollzellen, die mit 0,5 % Maltose angezogen wurden, konnte jedoch weder Maltose- noch Acarbose-Transportaktivität beobachtet werden (nicht gezeigt).

6.1.2 Interaktion von Acarbose mit dem Maltose-Bindeprotein MalE

Die Differenzierung der Interaktion von Acarbose mit einzelnen Komponenten des Maltose und Maltodextrinstoffwechsels von E. coli K12 wurde zunächst in Kompetitionsexperimenten mit MalE und gleichzeitiger Anwesenheit von Maltose und steigenden AcarboseKonzentrationen vorgenommen (s. 5.7.9). Dafür wurde die Periplasmafraktion von Zellen aus Anzuchten in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose präpariert (s. 5.7.2). Ein MalE-freier Osmoschock-Überstand wurde durch Kultivierung der Zellen mit 0,5 % Glukose gewonnen und ebenfalls in die Messungen eingesetzt. In Abbildung 6.2 sind die gemittelten Daten einer Doppelbestimmung zusammengefasst und in Prozent des Kontrollwertes angegeben.

Abbildung 6.2: Einfluss von Acarbose auf die Bindung von Maltose an MalE von E. coli K12.Von den periplasmatischen Fraktionen wurden je 120 µg Gesamtprotein für die Studien eingesetzt, daran anteilig war MalE mit ca. 5 %. Mit Ausnahme der Kontrolle wurden die einzelnen Messansätze für eine Minute mit verschiedenen Acarbose-Konzentrationen vorinkubiert und dann erfolgte der Reaktionsstart durch Zugabe von [U-2: Einfluss von Acarbose auf die Bindung von Maltose an MalE von E. coli K12.Von den periplasmatischen Fraktionen wurden je 120 µg Gesamtprotein für die Studien eingesetzt, daran anteilig war MalE mit ca. 5 %. Mit Ausnahme der Kontrolle wurden die einzelnen Messansätze für eine Minute mit verschiedenen Acarbose-Konzentrationen vorinkubiert und dann erfolgte der Reaktionsstart durch Zugabe von [U-14C]-Maltose. Die ohne zusätzliche Acarbose im Messansatz erreichte Bindung von radioaktiv markierter
[U-14C]-Maltose (5 µM, 300 nCi) an das Protein MalE betrug 2,6 nmol/120 µg Gesamtprotein (= 100 %).

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Die Abbildung 6.2 stellt die Interaktion von Acarbose mit dem Maltose-Bindeprotein von E. coli deutlich dar. Bereits in Gegenwart von 0,001 mM Acarbose wurde die Maltose-Bindeaktivität des Proteins zu 16 % gehemmt. Noch höhere Acarbose-Konzentrationen resultierten in Restaktivitäten von nur noch 25 % (0,1 mM Acarbose, vgl. Abbildung 6.1). Die Inhibition der Bindung von 5 µM [14C]-Maltose war halb-maximal bei einer Acarbose-Konzentration von 17 µM (nicht gezeigt).

Bei Verwendung des MalE-freien Osmoschock-Überstandes wurde keine Maltose-Bindeaktivität beobachtet.

6.1.3 Acarbose als Substrat der cytoplasmatischen Enzyme MalQ und MalZ

Aufgrund der bisher beschriebenen Befunde zum Einfluss von Acarbose auf den Maltose- und Maltodextrinstoffwechsel von E. coli sollte abschließend überprüft werden, inwieweit die importierte Acarbose im Cytoplasma enzymatisch verwertet wird. Unter Verwendung von Ganzzellextrakten der Stämme HS3018, der die mal-Gene konstitutiv exprimiert, und TK38 (malQ+ malZ) bzw. CB39 (malQ malZ+) wurde bei Anwesenheit verschiedener Konzentrationen und Kombinationen an Maltotetraose, Maltose und Acarbose die Menge freigesetzter Glukose quantifiziert (s. 5.7.11; s. auch 4.2.3.1 und Seite 89, Abbildung 7.1).

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Aus Abbildung 6.3A ist zunächst ersichtlich, dass Acarbose kein gutes Substrat der Maltodextrin-metabolisierenden Enzyme Amylomaltase MalQ und Maltodextrin-Glukosidase MalZ ist. Im Vergleich zur Freisetzung von Glukose aus Maltotetraose (Spur 1 ) entstanden aus Acarbose lediglich 3 % freie Glukose (Spur 2). Darüber hinaus wirkt Acarbose nur als schwacher Inhibitor von MalQ und MalZ, denn die Verwertung von Maltotetraose (10 mM) in Gegenwart von 1 mM Acarbose war kaum beeinträchtigt (Spur 3). Die Spuren 6 und 7 beschreiben, da MalQ als Glykosyldonor Maltotriose oder höhere Homologe benötigt, dass Acarbose bei Anwesenheit von Maltose (mit 10 mM im Überschuss) als solch ein Glykosyldonor (0,5 µmol freie Glukose/mg Protein), aber kaum als Akzeptor genutzt wurde.

Betrachtet man das gleiche Experiment unter Verwendung eines Ganzzellextraktes des Stammes CB39 (Abbildung 6.3B), bestätigt sich Acarbose als schwaches Substrat der Maltodextrin-Glukosidase. Verglichen mit der Glukosefreisetzung aus Maltotetraose (Spur 1) wurden aus Acarbose nur ca. 30 % Glukose abgespalten (Spuren 2 und 7). Die Hemmung von MalZ durch Acarbose betrug bei verbleibender Restaktivität von 0,24 µmol/mg Protein 40 % (Spur 3).

Für die Aktivität der Amylomaltase (Abbildung 6.3C) gilt ebenso die Eigenschaft der Acarbose als schwacher Inhibitor der Freisetzung von Glukose aus Maltotetraose mit Maltose als Maltotriosyl-Akzeptor (vgl. Spuren 4 und 5), nicht jedoch die als Substrat (Spuren 2
und 7).

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Abbildung 6.3: Freisetzung von Glukose durch die Amylomaltase MalQ und die Maltodextrin-Glukosidase MalZ in Gegenwart von Acarbose.Die Menge an freier Glukose wurde mit der GOD-POD-Methode quantifiziert (BERGMEYER, 1974).3: Freisetzung von Glukose durch die Amylomaltase MalQ und die Maltodextrin-Glukosidase MalZ in Gegenwart von Acarbose.Die Menge an freier Glukose wurde mit der GOD-POD-Methode quantifiziert (BERGMEYER, 1974).

Zusammenfassend geben diese Ergebnisse an, dass Acarbose in E. coli K12 intrazellulär akkumuliert wird und wahrscheinlich aufgrund eines resultierenden toxischen Effektes das Wachstum der Zellen bis hin zur Lyse beeinträchtigt.

6.2 Untersuchungen zur Transportkapazität von Actinoplanes sp.

Actinoplanes sp. steht als Acarbose-Produzent und Angehöriger der großen Gruppe der Actinomyceten, die sich durch die Synthese verschiedenster Sekundärmetabolite mit medizinischer und ökonomischer Bedeutung auszeichnen, in besonderem wissenschaftlichen Interesse. Sekundärmetabolismus arrangiert sich auf der Basis von Vorstufen aus dem Primärmetabolismus. Ein wichtiger Schlüssel zum Verständnis der Entstehung von sekundären Metaboliten ist daher die Aufklärung des primären Metabolismus dieser Organismen.

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Bereits 1979 wurde von PARENTI & CORONELLI für verschiedene Arten der Bakteriengattung Actinoplanes eine Beteiligung am Abbau pflanzlicher Pentosane vorgeschlagen, da Xylose und Arabinose gute Substrate darstellen. Weiterhin bekannt als Kohlenstoffquellen waren
z. B. Glukose, Fruktose, Saccharose, für einige Spezies auch Laktose und nur für zwei Arten Cellulose (VOBIS, 1989).

Mit dem Ziel der Optimierung der Acarbosefermentation liegen nun seit einigen Jahren die Schwerpunkte zu Arbeiten mit Actinoplanes sp. auf einer detaillierten Charakterisierung der Biosynthese des Sekundärmetaboliten Acarbose und seiner Funktion. Im Rahmen dieser Studien sind als nutzbare Kohlenstoffquellen Glukose, Maltose so wie Maltotriose und auch höhere Homologe bekannt geworden (STRATMANN, 1997, WEHMEIER, 2003).Zu Beginn dieser Arbeit lagen darüber hinausreichende Erkenntnisse zum Substratimport so wie zur Nutzung weiterer Zuckersubstrate als Kohlenstoff- und Energiequelle im primären Metabolismus von Actinoplanes sp. nicht vor.

Das dieser Arbeit zu Grunde liegende Modell des Acarbose-Metabolismus (STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004; s. Seite 11, Abbildung 4.2) involviert sowohl einen extrazellulären Stärke/Maltodextrin-Stoffwechsel wie auch einen intrazellulären Maltodextrin/Maltose-Stoffwechsel. Postuliert sind dazugehörige Importsysteme für die entsprechenden Substrate, darunter das Bindeprotein-abhängige ABC-System AcbHFG.

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Um nun diesen Substratimport zu belegen, des weiteren Hinweise auf Transport- so wie Regulationsmechanismen zu erhalten und Einblicke in die Nutzung von Zuckern durch Actinoplanes sp. zu gewinnen, wurden verschiedene in vivo Experimente zur Aufnahme von radioaktiv markierter Maltose und Maltotriose (je 51 µM) und Acarbose (5,7 µM) durchgeführt. Dazu wurden die Zellen mit diesen und alternativen Kohlenstoffquellen kultiviert. Das Wachstumsverhalten dieser Kulturen wurde untersucht und für die Transportmessungen wurden Zellen aus der exponentiellen Wachstumsphase eingesetzt. Diese dargestellten Experimente wurden fast ausschließlich mit dem Stamm 223/29 durchgeführt. Die Ergebnisse, die in den Abbildungen 6.4-6.10 gezeigt sind, konnten in Stichproben mit Zellen des Stammes 50/110 bestätigt werden.

6.2.1  Wachstum von Actinoplanes sp. 223/29 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen

Die Kulturen wurden, wie unter 5.4.2 beschrieben, über einen Zeitraum von 72 Stunden mit verschiedenen Zuckern als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle angezogen. Die Wachstumskurven, in Abbildung 6.4 dargestellt, wurden über die Bestimmung des Proteingehaltes ganzer Zellen (s. 5.7.3) aufgestellt. Die Daten begründen sich als Mittelwerte auf jeweils zwei unabhängigen Experimenten.

Abbildung 6.4: Wachstum des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen C-Quellen zu je 0,5 % über einen Zeitraum von drei Tagen angezogen.4: Wachstum des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen C-Quellen zu je 0,5 % über einen Zeitraum von drei Tagen angezogen.

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Die Abbildung 6.4 zeigt einheitliches Wachstum der Zellen in statischer Kultur mit so unterschiedlichen Substraten wie Glycerin, Trehalose, Saccharose und Maltooligosacchariden. Bei einer Verdopplungszeit von ca. zehn Stunden erreichten die Zellen nach etwa 28 – 30 Stunden (mit Trehalose nach 24 Stunden) jeweils die stationäre Phase.

* MD50 ist ein Gemisch aus Maltose und Maltotriose und zu 7 % Bestandteil des von STRATMANN (1997) zusammengestellten Acarbose-Produktions-Mediums. Es enthält auch Spuren von höheren Homologen.

Mit einer verringerten Verdopplungszeit von ungefähr 17 Stunden wuchsen die Zellen außerdem auf Acarbose, nach 24 Stunden war aber ein abrupter Stillstand des Zellwachstums zu beobachten. Von den überprüften Kohlenstoffquellen konnte lediglich für Laktose kaum Wachstum festgestellt werden.

↓71

Ebenfalls als gute Substrate dienten Xylose, Haferspelzen- und besser Birkenholzxylan (eigene Beobachtung). Dieses Resultat unterstützt eine den Genen asp3.1 und asp3.2 aus dem acb-Gencluster zugesprochene Funktion im Xylanabbau (M. Jarling, pers. Mitteilung). Von STOLPE konnten 2001 Enzyme eines Trehalose-Metabolismus identifiziert werden

6.2.2 Maltoseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29

Actinoplanes sp. ist in der Lage, auf verschiedenen Zuckern als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen (s. Abbildung 6.4). Dem Modell des Acarbose-Metabolismus folgend sollte der Maltoseimport in intakte Zellen von Actinoplanes sp. nachgewiesen und in einen Zusammenhang mit dem Wachstumssubstrat gebracht werden. Dafür wurden Kulturen, die in Minimalmedium mit sämtlichen dieser getesteten Zucker so wie zusätzlich Glukose und auch in Vollmedium TSB so wie Acarbose-Produktions-Medium angezogen wurden, in den Transportmessungen eingesetzt.

Die Experimente zur Aufnahme von Maltose wurden mit Zellen durchgeführt, die aus der späten exponentiellen Wachstumsphase (nach 24 Stunden) entnommen wurden. Die Vorbereitung der Zellen und die Transportmessungen erfolgten wie unter 5.7.7 beschrieben.

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Abbildung 6.5: Aufnahme von Maltose in Zellen des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 – Darstellung der Linearität.Die Zellen wurden Vollmedium TSB und Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen Zuckern zu je 0,5 % angezogen und nach 24 Stunden Wachstum für die Messungen entnommen.5: Aufnahme von Maltose in Zellen des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 – Darstellung der Linearität.Die Zellen wurden Vollmedium TSB und Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen Zuckern zu je 0,5 % angezogen und nach 24 Stunden Wachstum für die Messungen entnommen.

Zu Beginn der Illustration der erzielten Ergebnisse soll die Abbildung 6.5 anhand einiger Transportexperiment repräsentieren, dass über den gesamten Messzeitraum von sieben Minuten eine Linearität des Transports gegeben war.

Hier ist bereits zu sehen, dass die Aufnahme radioaktiv markierter Maltose (51 µM) in Zellen fast aller Kulturen, unabhängig von der C-Quelle, prinzipiell nachgewiesen werden konnte. Lediglich Wachstum mit Glukose erlaubte kaum einen Import dieses Zuckers.

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Die folgende Abbildung 6.6 ist eine Zusammenfassung sämtlicher Transportdaten aus bis zu 11 unabhängigen Messungen (vgl. auch Abbildung 6.9). Für diese Darstellung wurden alle gewonnenen Werte jeweils auf mg Protein/min bezogen und anschließend gemittelt.

Abbildung 6.6: Durchschnittliche Maltoseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium, Vollmedium TSB bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je 0,5 % bzw. 7 % MD50 kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Transportmessungen eingesetzt.6: Durchschnittliche Maltoseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium, Vollmedium TSB bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je 0,5 % bzw. 7 % MD50 kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Transportmessungen eingesetzt.

Es zeigten sich Unterschiede im Maltosetransport hinsichtlich der verwendeten Kohlenstoffquelle bei Anzucht der Zellen. Die Transportaktivität wurde also abhängig vom Wachstumszucker unterschiedlich reguliert. So erreichten Zellen aus Acarbose- bzw. Glycerinkulturen deutlich die höchsten Raten. Hingegen resultierte Wachstum in sämtlichen Maltose- und Maltodextrin-haltigen Medien so wie in Laktose und TSB (enthält herstellungs-bedingt Glukose und Maltose, Firma OXOID) in den niedrigsten Transportaktivitäten.

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Die Transportraten von TSB-Zellen lassen vermuten, dass die Mechanismen einer Glukoserepression nicht nach dem Prinzip des Induktorausschlusses bei Enterobakterien wie E. coli oder einer CcpA vermittelten Repression kataboler Operone bei grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt wie B. subtilis (Übersicht: STÜLKE & HILLEN, 1999) funktionieren (s. Abschnitt 4.2.4).

6.2.2.1  Spezifität der beobachteten Maltosetransport-Aktivitäten

Ausgehend von den obigen Befunden wurden die für den Acarbose-Metabolismus wesentlichen Kohlenstoffquellen Acarbose und MD50 ausgewählt, um im weiteren Verlauf der Charakterisierung des Maltosetransports die Substratspezifität des bzw. der beteiligten Maltosetransporter(s) zu ermitteln. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit den genannten Zuckern kultiviert, für die Transportmessungen vorbereitet und vor Zugabe der radioaktiven Maltose (51 µM) mit einem Überschuss an verschiedenen Zuckern (1 mM) inkubiert
(s. 5.7.7). Für die Abbildung 6.7 wurden neun (Acarbose-Zellen) bzw. fünf (MD50-Zellen) unabhängig durchgeführte Hemmstudien zusammengefasst. Alle gewonnenen Werte wurden jeweils auf mg Protein/min berechnet und gemittelt und dann in Prozent des Kontrollwertes angegeben.

Die Inkubation der Zellen von Actinoplanes sp. mit einem Überschuss an Maltodextrinen, Trehalose und Saccharose resultierte, unabhängig vom Wachstumssubstrat, in einer drastischen Hemmung des Maltosetransports. Dieses Resultat wurde bei Zellen aus Anzuchten mit Maltose und Maltodextrinen MD ebenfalls beobachtet (Daten nicht gezeigt).

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Auffällig war, dass bei Acarbose-Zellen die Restaktivität in Gegenwart von Maltodextrinen ungefähr doppelt so hoch lag wie in Gegenwart von Trehalose und Saccharose (28 % im Vergleich zu 13 %), während diese multiple Hemmung bei MD50-Zellen keine Unterschiede zeigte und mindestens noch 21 % Restaktivität erlaubte. Deutlich war weiterhin die 41 bzw. 34 %ige Inhibierung durch Glukose. Dagegen wurde die Maltoseaufnahme kaum durch Laktose und nur bei MD50-Zellen durch Acarbose (unter Beachtung der Schwankungen konstatiert) beeinflusst (vgl. auch Abbildung 6.10).

Mit Ausnahme des Acarbose-Effektes waren die Hemmmuster insgesamt ähnlich, unterschieden sich aber im Hinblick auf die Wirkungen von Trehalose, Saccharose und Maltodextrinen im Ausmaß der Inhibition. Bei Acarbose-Zellen gar glich im Falle von Trehalose und Saccharose die Hemmung dem Ausverdünnungseffekt durch kalte Maltose als Ausdruck einer gleichwertigen Konkurrenz dieser drei Zucker um den Transport. So könnten dieses unterschiedliche Ausmaß der Inhibition und der Acarbose-Effekt zwei Hinweise darauf sein, dass die Maltosetransportaktivität von Zellen aus Acarbose- und MD50-Kulturen von verschiedenen Transportsystemen realisiert wird.

Abbildung 6.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.

Abbildung 6.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.

6.2.2.2 Transportkinetik

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Bei grampositiven Bakterien wurden verschiedene Energie-abhängige Mechanismen für den Transport von Maltose identifiziert. Zum Beispiel wird bei Bacillus licheniformis Maltose über einen Protonensymporter in die Zelle aufgenommen (TANGNEY ET AL., 1992; TANGNEY ET AL., 1998), bei Streptococcus bovis hingegen über ein Phosphoenolpyruvat (PEP)abhängiges Phosphotransferasesystem (PTS) (MARTIN & RUSSELL, 1987). Bakterien wie Streptomyces lividans oder Alicyclobacillus acidocaldarius wiederum nutzen für die Translokation von Maltose Bindeprotein-abhängige ABC-Transporter (SCHLÖSSER ET AL., 1997; HÜLSMANN ET AL., 2000; SCHEFFEL ET AL., 2004).

Diese nach verschiedenen Mechanismen funktionierenden Transportsysteme differenzieren sich anhand der jeweils charakteristischen kinetischen Parameter. So lassen sich ganz klar die primären von den sekundären Transportern abgrenzen. Km-Werte von ABC-Systemen oder Phosphotransferasesystemen liegen im Bereich von 0,1 bis 10 µM, während Protonensymporter deutlich niedrigere Substrataffinitäten aufweisen (10-100-fach) (LENGELER, 1993).

Um Hinweise auf den Mechanismus des Maltoseimports zu erhalten und im weiteren zu überprüfen, ob die unterschiedlichen Transportraten eventuell auf Systeme mit verschiedenen Affinitäten zurückzuführen sind, wurde der Maltosetransport von Zellen aus Anzuchten in Minimalmedium mit je 0,5 % Acarbose, Glycerin, MD50 und Maltose hinsichtlich seiner kinetischen Parameter Km und Vmax charakterisiert. Dazu wurden die Transportraten bei verschiedenen Substratkonzentrationen (1 – 61 µM Maltose) in jeweils zwei bzw. drei unabhängigen Experimenten gemessen und gemittelt.

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Beispielhaft sind in einem V/S-Diagramm in Abbildung 6.8A die Transportwerte von mit Maltose kultivierten Zellen dargestellt. Zur Ermittlung der kinetischen Parameter des Transports wurden die Werte der einzelnen Messungen jeweils in einem Lineweaver-Burk-Diagramm analysiert (Abbildung 6.8B für Maltose-Zellen) und in der Tabelle 6.1 zusammengefasst.

Die Transportkinetiken zeigten geringe, aber deutliche Unterschiede. Festzustellen ist, dass bei Glycerin-kultivierten Zellen der Maltosetransport mit höchster Substrataffinität, aber relativ langsam stattfand. Ähnlich schwach aktive Systeme hatten auch Zellen aus MD50 bzw. Maltose-Kulturen. Hingegen transportierten Zellen einer Acarbose-Kultur mit der höchsten Geschwindigkeit, jedoch weniger affin. Die niedrigste Affinität zu Maltose wies das Transportsystem von MD50-kultivierten Zellen. Der Km lag zehn- bzw. dreifach höher als der von Glycerin- bzw. Acarbose-Kulturen.

Abbildung 6.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.

Abbildung 6.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.

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Tabelle 6.1: Kinetische Parameter des Maltosetransports bei Actinoplanes sp. 223/291: Kinetische Parameter des Maltosetransports bei Actinoplanes sp. 223/29

Medium

0,5 % Acarbose

0,5 % Glycerin

0,5 % MD50

0,5 % Maltose

 

MNS mit je

 

  

Km (µM)

11,7

3,0

33,3

9,7

  

Vmax (nmol/mg x min)

17,9

6,0

3,4

3,5

Insgesamt sprechen die kinetischen Daten in allen vier Fällen für den Import von Maltose über einen primären Carrier. Durch Experimente zur Phosphorylierung von radioaktiver Maltose mit PEP in zellfreien Extrakten von Actinoplanes sp. konnte keine Aktivität eines PTS nachgewiesen werden (s. 5.7.8). So ist die Annahme vertretbar, dass die Maltoseaufnahme über einen Bindeprotein-abhängigen ABC-Transportmechanismus realisiert wird.

6.2.3 Maltotrioseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29

Dem Modell des Acarbose-Metabolismus und der Feststellung, dass der Maltosetransport in Zellen von Actinoplanes sp. neben anderen Zuckern auch durch Maltodextrine stark gehemmt wurde, folgend (s. Abbildung 6.7), sollte auch der Maltotrioseimport in intakte Zellen von Actinoplanes sp. untersucht werden. Dabei wurden in Anlehnung an die erzielten Daten des Maltosetransports signifikante Experimente ausgewählt, um die in vivo Studien abschließend zu festigen.

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So sollte die Maltotrioseaufnahme zunächst in einen Zusammenhang mit dem Wachstumssubstrat gebracht werden. Dafür wurden Kulturen, die mit einer Auswahl der bereits für die Maltosetransport-Messungen verwendeten Kohlenstoffquellen angezogen wurden, in den Maltotriosetransport-Messungen eingesetzt. Die Zellen wurden aus der späten exponentiellen Wachstumsphase (nach 24 Stunden) entnommen und, wie unter 5.7.7 beschrieben, für die Messungen vorbereitet. Die Abbildung 6.9 ist eine Zusammenfassung sämtlicher Transportdaten aus bis zu 8 unabhängigen Messungen. Für diese Darstellung wurden alle gewonnenen Werte jeweils auf mg Protein/min bezogen und anschließend gemittelt.

Prinzipiell war der Maltotriosetransport ähnlich dem Maltosetransport (vgl. Abbildung 6.6). Die Aufnahme radioaktiv markierter Maltotriose (51 µM) konnte in Zellen fast aller Kulturen, unabhängig von der C-Quelle, prinzipiell nachgewiesen werden konnte. Lediglich Wachstum mit Glukose erlaubte auch hier kaum einen Import dieses Zuckers.

Es zeigten sich Unterschiede im Maltotriosetransport hinsichtlich der verwendeten Kohlenstoffquelle bei Anzucht der Zellen. Die Transportaktivität wurde also ebenfalls abhängig vom Wachstumszucker unterschiedlich reguliert. So erreichten wieder deutlich die höchsten Raten Zellen aus Acarbose-Kulturen, die Raten für Maltotrioseimport von GlycerinKulturen lagen jedoch um ein Drittel niedriger als die Maltosetransport-Raten. Die niedrigste Transportaktivität für Maltotriose zeigten Zellen aus Minimalmedium mit 7 % MD50, mit
1,1 nmol Maltotriose/mg Protein x min gleichsam der Maltosetransport-Aktivität. Auffällig ist, dass bei Zellen aus Anzuchten mit MD50 sowohl der Maltotriose- als auch der Maltosetransport bei steigender Substratkonzentration abnahm (1,1 nmol importierte Maltotriose gegenüber 3,2 nmol/mg Protein x min; vgl. Abbildung 6.6).

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Abbildung 6.9: Durchschnittliche Maltotrioseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je9: Durchschnittliche Maltotrioseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je
0,5 % bzw. 7 % MD50 kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Transportmessungen eingesetzt.

6.2.3.1  Spezifität der beobachteten Maltotriosetransport-Aktivitäten

Zur weiteren Charakterisierung wurde die Spezifität der beobachteten MaltotriosetransportAktivitäten untersucht. Als Kohlenstoffquellen zur Anzucht der Zellen in Minimalmedium wurden Acarbose, Glycerin, Maltose und MD50 zu jeweils 0,5 % ausgewählt. Die Zellen wurden nach 24 Stunden Wachstum geerntet, für die Transportmessungen vorbereitet und vor Zugabe radioaktiver Maltotriose (51 µM) mit einem Überschuss an Acarbose und Maltose
(1 mM) inkubiert (s. 5.7.7). Für die Abbildung 6.10 wurden drei (Glycerin-, Maltose- und MD50-Zellen) bzw. zwei (Acarbose-Zellen) unabhängig durchgeführte Hemmstudien zusammengefasst (vgl. auch Abbildung 6.7). Alle gewonnenen Werte wurden jeweils auf mg Protein/min berechnet und gemittelt und dann in Prozent des Kontrollwertes angegeben.

So wie Maltodextrine den Maltosetransport inhibierten, resultierte umgekehrt die Inkubation der Zellen von Actinoplanes sp. mit einem Überschuss an Maltose ebenfalls, unabhängig vom Wachstumssubstrat, in einer deutlichen Hemmung des Maltotriosetransports. Insgesamt allerdings waren, mit Ausnahme der deutlich am stärksten inhibierten Transportraten von Acarbose-Zellen (21 %), die Restaktivitäten des Maltotriosetransports in Gegenwart von Maltose in etwa doppelt so hoch wie die des Maltosetransports in Gegenwart von Maltodextrinen (47 % bis 52 % gegenüber 21 % und 28 %). Auffällig ist außerdem, dass – wiederum mit Ausnahme der Transportraten von Acarbose-Zellen – der Maltotriosetransport wie der Maltosetransport sensitiv gegenüber Acarbose war. Es wurde für den Maltotriosetransport von Zellen aus Anzuchten mit 0,5 % MD50 bzw. Maltose eine bis zu
41 %ige Hemmung durch Acarbose festgestellt.

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Abbildung 6.10: Inhibierung der Maltotrioseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose, Glycerin, MD50 bzw. Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Wachstumszuckern (Kontrollwerte = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte waren die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 9,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min und bei solchen, die mit Glycerin angezogen wurden, bei 5,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min. Die Kontrollwerte von Maltose- bzw. MD50Zellen betrugen 5,6 bzw. 3,5 nmol Maltotriose/mg Protein x min.10: Inhibierung der Maltotrioseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose, Glycerin, MD50 bzw. Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Wachstumszuckern (Kontrollwerte = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte waren die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 9,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min und bei solchen, die mit Glycerin angezogen wurden, bei 5,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min. Die Kontrollwerte von Maltose- bzw. MD50Zellen betrugen 5,6 bzw. 3,5 nmol Maltotriose/mg Protein x min.

6.2.4 Acarboseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29

Das Modell des Acarbose-Metabolismus fordert neben einer Aufnahmekapazität für Maltose und Maltodextrine ebenso ein Acarbose-Transportsystem. Es konnte gezeigt werden, dass Actinoplanes sp. in der Lage ist, mit dem Pseudotetrasaccharid als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen (s. Abbildung 6.4). Für Transportexperimente mit [14C]-Acarbose (5,7 µM) wurden Kulturen verwendet, die mit je 0,5 % Acarbose, Maltose, MD50, Saccharose und Trehalose angezogen wurden. Die Zellen wurden nach 24stündigem bzw. dreitägigem (Kultivierung mit Acarbose) Wachstum geerntet und, wie unter 5.7.7 beschrieben, für die Messungen vorbereitet.

Bei Zellen aus Kultivierungen in Minimalmedium mit je 0,5 % Maltose, MD50, Saccharose und Trehalose konnte nur eine geringe Menge intrazellulär akkumulierter [14C]-Acarbose festgestellt werden (0,1 nmol/mg Protein x min). Zellen aus der Kultivierung mit dem Pseudotetrasaccharid hingegen erreichten Transportraten von 1,2 nmol/mg Protein x min. Vergleichend wurden in Experimenten mit 6 µM [U-14C]-Maltose Transportraten von
1,2 nmol/mg Protein x min (Maltose-kultivierte Zellen) und 0,6 nmol/mg Protein x min (MD50-kultivierte Zellen) und 7,7 nmol/mg Protein x min (Acarbose-kultivierte Zellen) festgestellt. Die Untersuchung der Transportaktivität von Zellen aus der späten stationären Wachstumsphase ergab Raten von lediglich 0,2 nmol Acarbose/mg Protein x min.

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Es konnte nicht ausgeschlossen werden, dass Actinoplanes sp. die angebotene Acarbose während des Messzeitraumes enzymatisch degradiert und lediglich den unmarkierten Maltosylrest importiert. In qualitativen Analysen der Cytosolfraktion per Dünnschicht-Chromatographie (nicht gezeigt) konnte aber das Vorhandensein einer Tetraose detektiert werden.

6.3 Identifizierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins aus dem Kulturüberstand von Actinoplanes sp.

Die nachgewiesene Maltose/Maltotriose-Transportaktivität der Zellen wird vermutlich über zwei Bindeprotein-abhängige ABC-Transportsysteme realisiert (s. Abschnitt 6.2). Maltose und Maltodextrin-Bindeproteine wie z. B. die Proteine MalE aus E. coli oder
A. acidocaldarius lassen sich charakteristischerweise durch Affinitätschromatographie mittels Agarose-gekoppelter Amylose reinigen (FERENCI & KLOTZ, 1978; HÜLSMANN ET AL., 2000). So wurde überprüft, ob sich ein mögliches Maltose-Bindeprotein (MBP), vermutlich über einen N-terminalen Lipidanker in der Membran fixiert (s. auch 4.2.3.2), nach Solubilisierung via Amylose-Affinitätschromatographie (analog 5.7.15 und 5.7.16) isolieren lässt. Parallel dazu wurde versucht, über DNA-DNA-Hybridisierungsexperimente mit Gensonden der Maltose-Bindeproteine aus S. lividans und A. acidocaldarius auf chromosomaler Ebene ein homologes Gen bei Actinoplanes sp. zu finden. Beide Strategien verliefen jedoch erfolglos. Im Zuge der Ermittlung der Synthesebedingungen für das Substratbindeprotein AcbH
(s. Abschnitt 6.7) bei Anzucht von Actinoplanes sp. in Maltodextrin-haltigen Medien aber fiel in SDS-PAGE-Analysen von Kulturüberständen eine prominente Proteinbande bei einer für Bindeproteine typischen Laufhöhe von entsprechender relativer molarer Masse zwischen 40 und 45 kDa auf. Damit erschien ein Kandidat für ein Maltose/Maltotriose-Bindeprotein gefunden.

6.3.1  Isolierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins

Kulturüberstände aus 24 stündigen Zellanzuchten in Minimalmedium mit je 0,5 % Maltose und MD50 sowie in Acarbose-Produktions-Medium wurden, wie unter 5.7.16 beschrieben, aufgearbeitet und einer Affinitätschromatographie mit Agarose-gekoppelter Amylose unterzogen. Die Abbildung 6.11 zeigt eine Zusammenfassung der hierzu erzielten Ergebnisse.

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Abbildung 6.11: Isolierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Für die Isolierung des potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins wurden 2 ml konzentrierter Kulturüberstand auf 0,5 ml Amylose-Matrix pipettiert. Im Anschluss an Waschungen mit je 6 Säulenvolumina Puffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,2, 1 mM CaCl11: Isolierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Für die Isolierung des potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins wurden 2 ml konzentrierter Kulturüberstand auf 0,5 ml Amylose-Matrix pipettiert. Im Anschluss an Waschungen mit je 6 Säulenvolumina Puffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,2, 1 mM CaCl2) wurde das Protein mit jeweils 0,5 ml
20 mM Maltose eluiert. Jeweils 36 µl der Proben des Säulenlaufs wurden untersucht. Das betrachtete Protein ist mit einem schwarzen Pfeilkopf (◄) markiert.

Mit 20 mM Maltose, oder auch Maltodextrinen (nicht gezeigt), konnte aus den Überständen von Kulturen aus Anzuchten mit MD50 und Maltose, nicht jedoch aus Anzuchten in Acarbose-Produktionsmedium, ein Protein mit Maltose/Maltodextrin-Bindeaktivität isoliert werden. In MALDI-TOF MS-Analysen (s. 5.7.17) konnte bestätigt werden, dass es sich bei den betrachteten Banden der Kulturüberstände im SDS-Gel nicht um verschiedene Proteine handelte, die sich während der Chromatographie unterschiedlich verhielten. Da sich das potentielle MBP bei Kultivierung der Zellen in Acarbose-Produktions-Medium in einer hochkonzentrierten Zuckerlösung befand (ca. 7 % MD50), wurde deshalb angenommen, dass es auch nach der Dialyse gegen Tris-Puffer noch mit Maltose und/oder Maltotriose bzw. längerkettigen Homologen ligandiert war, daher keine freie Bindekapazität für die Amylosematrix aufwies und unmittelbar im Durchlauf bzw. den Waschfraktionen wieder zu finden war.

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Alternativ könnte die während der Kultivierung von den Zellen synthetisierte Acarbose das MBP über eine Dialyse hinaus blockieren (die im Rahmen der Transportexperimente ermittelte Substratspezifität eines der postulierten Maltosetransporter deutet auf die Existenz eines Bindeproteins, das auch Acarbose akzeptiert). Um diese Vermutung zu überprüfen, wurden die Proteine des Überstandes von Kultivierungen mit 0,5 % MD50 zur Simulation der hohen Zuckerkonzentration des Acarbose-Produktions-Mediums für je 15 Minuten mit
7 % Acarbose bzw. parallel 7 % MD50 bei 30°C inkubiert. Nach exzessiver Dialyse gegen Tris-Puffer konnte nur das MBP aus dem Ansatz, der mit Acarbose inkubiert worden war, affinitätschromatographisch isoliert werden. Das Protein aus dem Ansatz mit der hohen MD50-Konzentration hingegen verhielt sich wie dasjenige aus dem oben beschriebenen Säulenlauf mit Kulturüberstand nach Anzucht der Zellen in Acarbose-Produktions-Medium. Zusammen mit dem im weiteren Verlauf der Experimente erhaltenen Befund, dass 20 mM Acarbose das MBP nicht von der Amylosematrix eluierten, erhärtete dies die Hinweise auf die Identifizierung eines Acarbose-insensitiven Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins.

Ein diesem potentiellen MBP entsprechendes Protein war auch in Kulturüberständen von Zellanzuchten in Vollmedium TSB und in Minimalmedium mit 7 % MD50 und je 0,5 % Acarbose bzw. Glycerin vorhanden (nicht gezeigt).

Die durch die MALDI-TOF MS-Analyse des isolierte Proteins identifizierten Sequenzen einzelner Peptide sind im Anhang aufgeführt. Die Arbeiten hierzu wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Sophie Haebel, Universität Potsdam, durchgeführt. Die Suche nach signifikanten Übereinstimmungen zu anderen Proteinen mit Hilfe des erhaltenen Peptid-Massenspektrums, das für das potentielle Maltose/Maltotriose-Bindeprotein eine relative molare Masse von
51,3 kDa angibt, und den Peptidsequenzen in Datenbanken erbrachte leider keine Hinweise auf die Funktion dieses Proteins von Actinoplanes sp..

6.3.2 Klonierung des Gens eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins

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Für die Identifizierung eines Maltose-Bindeproteins auf chromosomaler Ebene wurden in verschiedenen DNA-DNA-Hybridisierungen (s. 5.6.9) mit chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. 50/110 zunächst DIG-markierte Sonden der malE-Gene aus S. lividans und
A. acidocaldarius verwendet. Die Amplifikationen per PCR und anschließenden Modifizierungen mit DIG sind unter 5.6.3 und 5.6.9.4 beschrieben. Die Amplifikation des malE-Gens von S. lividans erfolgte dabei mit Primern, die von der Sequenz des malE-Gens von S. coelicolor abgeleitet wurden (VAN WEZEL ET AL., 1997b). In keinem der Verfahren konnte eine Hybridisierung der Sonden mit chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. detektiert werden.

Schließlich gelang es, mit zwei weiteren DIG-markierten Oligos Hybridisierungssignale zu erhalten. Deren Nukleotidsequenzen wurden anhand der Peptidsequenzen des in 6.3.1 charakterisierten potentiellen Maltose/Maltotriose-Bindeproteins unter Berücksichtigung der bisher für Actinoplanes sp. ermittelten „codon usage“ (STRATMANN, 1997) generiert. Dabei gab die Verwendung des degenerierten Oligos „fishingMBP2“ (s. Seite 29, Tabelle 5.3), welches aufgrund eines im zugehörigen Peptid hohen Anteils an Aminosäuren mit relativ invarianten Kodons (W, Y, D, F und N) ausgewählt wurde, sehr distinkte Hybridisierungssignale. Hierfür wurde chromosomale DNA von Actinoplanes sp. über Nacht mit den Restriktionsenzymen BamHI, SalI und SmaI behandelt. Nach einem Southern-Blot-Verfahren (s. 5.6.9) wurden die Signale mittels Hyperfilm sichtbar gemacht (Abbildung 6.12).

Für die weitere Analyse der identifizieren DNA-Fragmente sollten die nach erneuter Restriktion der DNA mit SalI und SmaI und Auftrennung in einem Agarosegel entsprechenden Banden bei ~ 5,5 kB und ~ 3 kB aus dem Gel eluiert und in geeignete Vektoren, z. B. pUC18 und pUC19, subkloniert werden. Jedoch konnte bislang im weiteren Verlauf des Verfahrens keine ausreichende Anzahl an Transformanten für Koloniehybridisierungen erhalten werden.

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Abbildung 6.12: DNA-DNA-Hybridisierung.Dargestellt ist die Hybridisierung der DIG-markierten Sonde „fishingMBP2“ mit Fragmenten chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. 50/110. Nach dem Verdau der DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen wurden die Fragmente in einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt. Die Hybridisierung erfolgte mit 50 ng Sonde/ml Hybridisierungslösung über Nacht bei 56°C. Die erhaltenen Signale liegen bei DNA-Fragmenten mit den Größen ~ 10 kB (BamHI), ~ 5,5 kB (SalI) und ~ 3 kB (SmaI).12: DNA-DNA-Hybridisierung.Dargestellt ist die Hybridisierung der DIG-markierten Sonde „fishingMBP2“ mit Fragmenten chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. 50/110. Nach dem Verdau der DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen wurden die Fragmente in einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt. Die Hybridisierung erfolgte mit 50 ng Sonde/ml Hybridisierungslösung über Nacht bei 56°C. Die erhaltenen Signale liegen bei DNA-Fragmenten mit den Größen ~ 10 kB (BamHI), ~ 5,5 kB (SalI) und ~ 3 kB (SmaI).

6.3.3 Zusammenfassung

Actinoplanessp. ist in der Lage, so unterschiedliche Substanzen wie Glycerin, Trehalose, Saccharose und Maltooligosaccharide als Kohlenstoffquellen zu nutzen. Auch der durch dieses Bakterium synthetisierte Sekundärmetabolit Acarbose konnte als C-Quelle verwertet werden, löste aber nach 24stündiger Kultivierung einen abrupten Stillstand des Zellwachstums aus.

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Sämtliche dieser Zucker führten zur Ausbildung von Transportkapazitäten für Maltose und Maltotriose. Während die höchsten Transportraten bei Zellen nach Anzucht mit Acarbose oder Glycerin beobachtet wurden, zeigten Zellen aus Maltose- und Maltodextrinhaltigen Medien die niedrigsten Raten. Der Maltoseimport war durch Maltodextrine, Trehalose und Saccharose inhibierbar. Für den Maltotriosetransport wurde eine Hemmung durch Maltose nachgewiesen. Darüber hinaus hemmte auch Acarbose die Aufnahme von Maltose und Maltotriose. Eine Ausnahme bildet das Transportsystem von Zellen, die mit dem Pseudotetrasaccharid kultiviert wurden. Hier konnte keine Sensitivität gegenüber Acarbose festgestellt werden. Die unterschiedlichen Spezifitäten der erfassten Transportaktivitäten deuten an, dass Actinoplanes sp. über zwei verschiedene Systeme zum Import von Maltooligosacchariden verfügt. Die ermittelten kinetischen Daten des Maltosetransports von Zellen aus Kultivierungen mit Acarbose, Glycerin, Maltose und dem Maltose/Maltotriose-Gemisch MD50 erlauben keine eindeutige Differenzierung der involvierten Transporter. Die hohen Substrataffinitäten von Km = 3 µM – 33 µM lassen sich jedoch mit der Annahme vereinbaren, dass der Maltoseimport über einen Bindeprotein-abhängigen ABC-Transportmechanismus realisiert wird. Die Beteiligung eines Phosphotransferase-Systems kann ausgeschlossen werden. Ein potentielles Maltose/Maltodextrin-Bindeprotein konnte aus Kulturüberständen nach Zellanzuchten mit Maltose und MD50 isoliert werden. Dieses Protein hat keine Sensitivität gegenüber Acarbose.

Der Import von Acarbose konnte deutlich nur bei solchen Zellen nachgewiesen werden, denen das Pseudotetrasaccharid auch zum Wachstum angeboten wurde. Sowohl die Wachstums- als auch die Transportraten waren im Vergleich zu Verwertung und Import von Maltose vermindert.

6.4 Heterologe Synthese und Reinigung des Proteins AcbH

Innerhalb des Acarbose-Biosynthese-Genclusters von Actinoplanes sp. liegt das Gen acbH, welches für ein potentielles Zucker-Bindeprotein der CUT1-Familie (s. 4.2.3.2) als Komponente eines ABC-Importers kodiert. Hinweise zum Substratspektrum gab es aufgrund der Hypothese zum Acarbose-Metabolismus, die den Import von Maltose und Maltodextrinen sowie Acarbose und seinen Derivaten fordert (s. 4.1). Für Experimente zur Ermittlung der Substratspezifität dieses Proteins AcbH war es zunächst notwendig, ein Expressionssystem für acbH zu etablieren, um ausreichende Mengen des Proteins reinigen zu können. Daher wurden verschiedene Plasmide für die heterologe Synthese von Strep-TagII- bzw. (His)6-und (His)10-AcbH-Fusionsproteinen in E. coli und S. lividans TK23 konstruiert (s. 5.6.8), um diese schließlich mittels Strep-Tactin- bzw. Ni-NTA- Affinitätschromatographie zu reinigen. Für die Verwendung der zuvor aufgeführten Expressionsstämme galten gleichgewichtige Argumente, denn der höhere Verwandtschaftsgrad von S. lividans zu Actinoplanes sp. bot Vorteile im Hinblick auf die „codon usage“. Dem gegenüber standen die Vorzüge einer einfacheren Handhabung von E. coli-Zellen.

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Aufgrund der Absicht, das Bindeprotein aus dem Cytosol des jeweiligen Wirtsstammes zu reinigen, fehlt den Klonen der für das Signalpeptid kodierende Sequenzabschnitt. Das Signalpeptid von AcbH bilden die 29 N-terminalen Aminosäuren des Prelipoproteins mit einer typischen Lipobox (27LAA &30C) für die Prozessierung durch die Signalpeptidase II (FEKKES & DRIESSEN, 1999; TJALSMA ET AL., 2000). Die vermutete Spaltstelle wurde durch Analyse mit dem SignalP V1.1-Programm (http://www.cbs.dtu.dk/services/) (NIELSEN ET AL., 1999) bestätigt. Außerdem wurde das Cystein, an dem das native Protein die N-terminale Lipidmodifikation erfährt, durch ortsspezifische Mutagenese zu Alanin oder Methionin umgewandelt. Dadurch sollte ein lethaler Effekt einer möglichen Lipidmodifikation vermieden werden (KEMPF ET AL., 1997). In einem alternativen Ansatz sollte eine mit dem Signalpeptid PelB fusionierte AcbH-Variante in einer Anreicherung des Proteins im Periplasma von E. coli resultieren.

6.4.1  Klonierungen von acbH

Subklonierung von acbH auf Grundlage eines fehlerhaften Template: Mit dem Ziel der heterologen Expression in E. coli wurde das acbH-Gen in die Expressionsvektoren pBAD/HisA und pASK-IBA7 kloniert, um AcbH N-terminal mit einem (His)6-Tag bzw. einem Strep-TagII zu fusionieren. Als Template für die Amplifikation von acbH mittels PCR diente das Plasmid p103B3.1 (M. Jarling, AG Prof. Piepersberg, Wuppertal). Die Induktion der Genexpression von den als pCB2 und pCB3 bezeichneten Plasmiden durch Arabinose bzw. Anhydrotetracyclin führte in beiden Fällen zu einer sehr schwachen Synthese überwiegend unlöslicher Proteinaggregate in den E. coli-Stämmen TOP10 und LMG194 bzw. JM109. Der Nachweis wurde durch eine Western-Blot-Analyse mit einem Anti-(His)5-Antikörper bzw. Streptavidin-konjugierter alkalischer Phosphatase geführt. Auch durch Variation der Kultivierungs- und Induktionsparameter wie Verwendung verschiedener Nährmedien (LB, 2 x LB, 2YT, NB und TPi), Wachstumstemperaturen (26, 30 und 37°C) und Induktorkonzentrationen sowie Induktions- und Erntezeitpunkte ließ sich keine Optimierung der Synthese erreichen.

Daraufhin wurde mit pQE9 als Vektorhintergrund ein weiteres Expressionssystem für acbH konstruiert, das an den N-Terminus des Proteins die Sequenz RGS(His)6GS fusioniert. Nach Induktion der Genexpression vom resultierenden Plasmid pCB4 durch IPTG konnte in diesem Fall die starke Synthese eines Proteins als N-terminale (His)6-Fusion über die immunologische Analyse eines Western Blots mit Anti-RGS-Antikörpern nachgewiesen werden. Das Protein lag allerdings ebenfalls in aggregierter Form vor. In diesem Fall gelang es jedoch, durch sukzessives Kombinieren einzelner Kultivierungs- und Induktionsparameter den löslichen Anteil von AcbH im Cytosol von E. coli JM109 entscheidend zu erhöhen. Dabei wurde neben den für die Expression des acbH-Gens von pCB2 und pCB3 erwähnten Variationen auch die Ko-Expression mit einem Chaperon getestet (von pOFX-tac-SL1). So konnte eine Reinigung des Proteins über Ni-NTA-Chromatographie und anschließende Ionenaustauschchromatographie erreicht werden. Es folgten Experimente zur Aufklärung der Substratspezifität durch Amylose-Affinitätschromatographie (Methodik entspr. 5.7.16), durch Fällungsexperimente mit radioaktiv markierter Maltose (analog 5.7.9) sowie Immobilisierungsversuche auf dem BIAcore-Sensorchip Ni-NTA (s. 5.7.10). Des weiteren wurden mit dem von pCB4 synthetisierten Protein polyklonale Antikörper hergestellt, woraufhin mit der Eruierung des Syntheseprofils des wt-AcbH in Actinoplanes sp. begonnen wurde. Entgegen der Erwartung führten Western-Blot-Analysen (s. 5.7.6) unter keinen Bedingungen zur Detektion des Proteins in Zellfraktionen. Diese Tatsache veranlasste zur Kontrolle der bisher angewandten Klonierungsstrategien. Da hierbei keine Fehler unterlaufen waren, wurde das klonierte Gen in pCB4 durch Sequenzierung analysiert. Für eine Überprüfung des Plasmids pCB4 gab es zuvor keinerlei Motivation, da dass synthetisierte Protein im SDS-Gel die erwartete Größe von ca. 46 kDa zeigte und zudem die N-terminale (His)6-Fusion an diesem Protein mit einem Anti-His-Antikörper nachgewiesen werden konnte. Es stellte sich heraus, dass ab dem fünften Nukleotid der acbH-Sequenz keine weitere Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz des klonierten Fragmentes vorhanden war. Zumindest die Fusion und die korrekte Klonierung im Hinblick auf die Einhaltung des Leserahmens und den Austausch von Cystein zu Methionin wurden durch die Sequenzierung bestätigt. Somit ist zu erklären, warum die Western-Blot-Analysen nicht gelingen konnten, denn im Antiserum waren keine Antikörper gegen AcbH vorhanden.

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Als Kontrolle für den Erfolg der angewandten Methoden zur Charakterisierung des AcbH-Proteins sollte das Maltose-Bindeprotein MalE aus E. coli dienen, das ebenfalls als (His)6-Fusionsprotein rekombiniert wurde (malE ohne Sequenz für das Signalpeptid in pQE9,
s. 5.6.8.1). Nach Induktion der Genexpression vom resultierenden Plasmid pCB5 durch IPTG konnte das Protein leicht sowohl über Ni-NTA- als auch Amylose-Affinitätschromatographie (analog 5.7.12 und 5.7.16) gereinigt werden. Die in diesem Falle homologe Expression verlief quantitativ und qualitativ äußerst erfolgreich, das Protein ließ sich sauber in hohen Mengen und aktiv reinigen.

Zu dieser Zeit traten korrigierte Sequenzdaten zu acbH vom Kooperationspartner auf. Anstelle der viert- und drittletzten Kodons für die Aminosäuren Thr und Ile zeigte die neue Sequenz die Aminosäuren Ala und Asp. Für die sukzessive Konstruktion sämtlicher neuer Expressionssysteme (pCB6 – pCB9) wurde chromosomale DNA von Actinoplanes sp. 50/110 präpariert (s. 5.6.1.2) und anstelle des bisher eingesetzten p103B3.1 als Template für die Amplifikation des acbH-Gens verwendet. pCB6 wurde unter Einsatz eines für die PCR neu generierten 3'-Primers entsprechend der Strategie für pCB4 hergestellt. pCB7 stellt eine Variante von pCB6 dar, in der das Cystein nicht wie bisher durch Methionin sondern durch Alanin ausgetauscht ist. Im Rahmen der weiteren Optimierung der Synthese in Richtung eines löslich im Cytosol vorliegenden Proteins wurde außerdem ein AcbH-Fusionsprotein mit
C-terminalem (His)6-Tag entwickelt (in pQE60, pCB8). Da die zwischenzeitlich unternommenen Versuche zur Immobilisierung des (His)6-MalE an die Sensor-Chips CM5 und Ni-NTA unbefriedigend verliefen, in letztgenanntem Fall vermutlich aufgrund mangelnder Affinität zur Ni-Matrix, wurde des weiteren eine Variante von AcbH mit einem längeren (His)10-Tag rekombiniert (pCB9, acbH in pET19b). Die Sequenzanalyse dieser vier neuen Expressionssysteme identifizierte nach dem Nukleotid 288 des acbH-Gens jeweils stets einen zusätzlichen Sequenzbereich von 48 Nukleotiden. Parallel zu dieser Feststellung ergab sich in Kommunikation mit der Wuppertaler Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Piepersberg, dass im selben Zeitraum ebenfalls Sequenzunstimmigkeiten innerhalb des acb-Genclusters erkannt wurden, die der weiteren Analyse bedurften. Daraufhin wurde dort begonnen, eine erneute Sequenzanalyse des gesamten Acarbose-Biosynthese-Genclusters durchzuführen.

Unterdessen, in Abwartung eines Konsens der Sequenzdaten, wurden die Arbeiten mit pCB6 – pCB9 fortgesetzt. Dies schien gerechtfertig, denn die identifizierten Sequenzbereiche waren für die Richtigkeit der heterolog synthetisierten Proteine nicht von Bedeutung. Sie verursachten keinen frame shift und waren nicht durch die Klonierungsstrategien beeinflusst. Da hier für die Amplifikationen von acbH chromosomale DNA als Template eingesetzt wurde, spiegelten die identifizierten Bereiche vielmehr die tatsächliche Sequenz des acbHGens wider und somit lagen dem Wildtyp entsprechende AcbH-Varianten vor. Außerdem galt es, neues Anti-AcbH-Antiserum für die Aufklärung des Syntheseprofils des wt-AcbH in Actinoplanes sp. zu erhalten. Zusammenfassend beschrieben, konnte durch Expressionsanalysen dieser vier neuen Klone per SDS-PAGE mit Ausnahme des pCB8 eine starke Überproduktion der jeweiligen AcbH-Varianten durch die E. coli-Stämme JM109 (pCB6, pCB7 und pCB8) und BL21(DE3)<pLysS> (pCB9) gezeigt werden, die erneut fast ausschließlich als unlösliche Aggregate im LSP vorlagen.

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Die Optimierung der Synthese eines (His)6-AcbH-Fusionsproteins in Richtung einer Erhöhung des Anteils löslichen Poteins wurde mit den für die Expressionssysteme pCB2 – pCB4 beschriebenen Methoden (s. Seite 67) versucht. Um die Expression der GC-reichen DNA des acbH-Gens zu unterstützen, erfolgten außerdem Untersuchungen zur heterologen Synthese von AcbH in dem Expressionsstamm E. coli BL21-CodonPlus-RP, der plasmidkodierte Kopien der argU und proL tRNA-Gene enthält. Des weiteren wurde mit zwei Expressionsstämmen (BB4564 und BB4565) mit einem GroEL¯ Phänotyp gearbeitet, um in Anlehnung an Ergebnisse von MAR CARRIÓ & VILLAVERDE (2003) eine mögliche Chaperonvermittelte Aggregation von AcbH zu reduzieren. Aufgrund der insgesamt nur geringen Proteinausbeuten wurde alternativ zu den Modifikationen der Expressionsparameter dazu übergegangen, das aggregierte AcbH nach einer Solubilisierung mit 8 M Harnstoff und anschließender Renaturierung zu nutzen. Zur Renaturierung des gereinigten Proteins wurden verschiedene Methoden angewandt (s. 5.7.13). Dabei erbrachten weder die langsame Dialyse mit Hilfe des Renaturierungsreagenz Roti®-Fold (8x) der Firma ROTH noch eine schnelle Dialyse gegen 1000-faches Volumen Puffer (50 mM Tris, pH7,2, 300 mM NaCl,
5 % Glycerin) den gewünschten Erfolg. In einem weiteren Verfahren wurde unter Zusatz von 4,8 mM β-Cyclodextrin die „Artificial Chaperon“-Methode nach DAUGHERTY ET AL. (1998) versucht. Diese Methodik verlief ebenfalls erfolglos, schließlich konnte aber durch Einsatz des „low molecular weight additive“ Arginin eine zufriedenstellende Renaturierung von AcbH erzielt und auch im Falle des (His)10-AcbH nach Expression von pCB10 angewandt werden (Abschnitt 6.4.3).

Die endgültigen Sequenzdaten nach Resequenzierung des gesamten acb-Genclusters bestätigten die durch die vorliegende Arbeit gefundenen Insertionen. Jedoch waren die beiden Aminosäuren Thr und Ile, die zuvor Anlass gaben, die neuen Plasmidkonstrukte pCB6 – pCB9 mit Ala und Asp zu erzeugen, durchaus korrekt. Für die Experimente zur Substratspezifität jedoch war es unerlässlich, ein Protein mit fehlerfreier Sequenz einzusetzen. Daher wurden drei weitere Klone (pCB10 - pCB12, s. 5.6.8.2 – 5.6.8.4) für die Synthese von ausschließlich (His)10-AcbH-Fusionsproteinen hergestellt. Hierbei wurden zur Generierung der jeweiligen 3'-Primer für die Amplifikationen des acbH-Gens vom Chromosom die Sequenzen so ausgewählt, dass das Anlagern an das Template außerhalb des acbH-Gens erfolgte. So sollte in diesem kritischen Bereich der Sequenzvariationen jeglicher Einfluss vermieden werden. Nach Sequenzanalyse dieser Klone konnten Thr und Ile tatsächlich als die viert- und drittletzten Aminosäuren von AcbH verifiziert werden (Manuskript zur Veröffentlichung der acb-Gene in Vorbereitung; U. Wehmeier, pers. Mitteilung) .

Da zwei Aminosäuren für ein polyklonales Antiserum kein relevantes Epitop darstellen, wurde davon ausgegangen, dass die beiden Aminosäureaustausche nicht störend waren. Um absolute Sicherheit zu erreichen, wurde das Aliquot gereinigten (His)6-AcbH von pCB7, welches für die erneute Immunisierung von Kaninchen verwendet wurde (s. 5.7.5), zusätzlich einer MALDI-TOF MS-Analyse unterzogen und konnte damit als das Protein AcbH bestätigt werden (s. 5.7.17).

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Die Herstellung der drei neuen Plasmidkonstrukte pCB10 – pCB12 sowie die Synthese und Reinigungen der (His)10-Fusions-Proteine sind auf den folgenden Seiten unter 6.4.2 und 6.4.3 beschrieben.

6.4.2 Heterologe Synthese von AcbH in S. lividans TK23 und Reinigung

Für die Reinigung des AcbH aus S. lividans per Ni-Affinitätschromatographie musste vorab ein geeignetes Expressionssystem konstruiert werden, das N-terminal an das Protein einen (His)10-Tag fusioniert. Dafür wurde zunächst das Plasmid pCB10 (s. Abschnitt 6.4.3) einer ortsspezifischen Mutagenese unterzogen, um die Restriktionsschnittstelle für NdeI unmittelbar vor dem Gen zu eliminieren (= pCB11, s. 5.6.8.3). Von diesem Template wurde dann das acbH-Gen zusammen mit der Sequenz für den His-Tag in einer PCR amplifiziert und schließlich über die durch die mismatch-Primer vorgegebenen Schnittstellen NdeI/BamHI in den Shuttle-Vektor pPWW49-GenPoly kloniert (= pCB12, s. 5.6.8.4). Durch die Klonierung ist N-terminal an AcbH die Sequenz MH10SSGHIDDDDKH fusioniert. Die Anzucht von S. lividans TK23 <pCB12> erfolgte, wie unter 5.7.12 beschrieben. Nach einer Zellfraktionierung (s. 5.7.1.2) wurde die Lokalisation des Expressionsproduktes durch Western Blot-Analysen analysiert (s. 5.7.6) (nicht gezeigt). Das lösliche Protein AcbH befand sich innerhalb der Cytosolfraktion.

Das gewonnene Cytosol wurde mit der Absicht verwendet, das (His)10-AcbH über eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie (s. 5.7.12) zu reinigen. Da hier wie auch bei der Darstellung des Gesamtproteins in einer SDS-PAGE keine für AcbH prominente Proteinbande identifiziert werden konnte (nicht gezeigt), wurde der Verlauf der Chromatographie in einem Western Blot nachgeprüft (Abbildung 6.13A und B).

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Abbildung 6.13: Nachweis der heterologen Expression von acbH in S. lividans TK23 <pCB12> und Reinigung des (His)13: Nachweis der heterologen Expression von acbH in S. lividans TK23 <pCB12> und Reinigung des (His)10-AcbH-Fusionsproteins über Ni-Affinitätschromatographie.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des (His)10-AcbH (47,3 kDa) mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)6-AcbH von pCB7 (44,8 kDa). A:Für den Nachweis der Expression von acbH wurden 30 µg (20 µl) Gesamtprotein von S. lividans TK23 <pCB12> bzw. von Zellen ohne Plasmid (Kontrolle) analysiert. B: Für die Reinigung von (His)10-AcbH wurden 4 ml Cytosolfraktion mit 0,5 ml Ni-Matrix für eine Stunde bei 4 °C inkubiert. Nach Waschungen mit
4 Säulenvolumina MNS-Medium pur und mit 20 mM Imidazol erfolgte die Elution mit jeweils 0,5 ml 150 mM Imidazol. Jeweils 30 µl der Proben des Säulenlaufs wurden untersucht.

Festgestellt werden konnte, dass der überwiegende Teil von (His)10-AcbH an die Ni-Matrix gebunden und mit Imidazol wieder eluiert wurde. Jedoch war der Reinigungseffekt unbefriedigend, da im zugehörigen SDS-Gel zahlreiche weitere Proteine in den Eluatfraktionen sichtbar waren, die AcbH gegenüber quantitativ dominant unspezifisch an die Ni-Matrix gebunden hatten.

Im Rahmen der Ermittlung der Substratspezifität wurde das Potential des Proteins AcbH zur Bindung an Maltodextrine über die Affinität zu einer Amylose-Matrix überprüft
(s. 5.7.16 und vgl. Abschnitt 6.3.1). Nach Anzucht von S. lividans TK23 <pCB12> und Zellfraktionierung wurden 1.5 ml Cytosol über 20 Stunden gegen 1000-faches Volumen MNS-Medium dialysiert und auf eine Säule mit 0,5 ml Amylose-Matrix gegeben, um schließlich (His)10-AcbH mit 20 mM Maltodextrinen eluieren zu können. Der Verlauf der Chromatographie wurde nach Entwicklung eines Western Blots überprüft (Abbildung 6.14).

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Abbildung 6.14: Überprüfung einer Maltodextrin-Bindeaktivität von (His)14: Überprüfung einer Maltodextrin-Bindeaktivität von (His)10-AcbH. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des (His)10-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. 1,5 ml dialysiertes Cytosol wurden mit 0,5 ml Amylose-Matrix gut durchmischt, anschließend erfolgten vier Waschungen und vier Elutionsschritte mit 20 mM Maltodextrinen. Jeweils 30 µl dieser Proben wurden untersucht.

Dieses Experiment hat gezeigt, dass AcbH nicht über die Eigenschaft verfügt, Maltodextrine zu binden. Sämtliches auf die Säule pipettierte Protein wurde nicht von der Matrix zurückgehalten, sondern befand sich unmittelbar im Durchlauf oder in den ersten beiden Waschfraktionen.

6.4.3 Heterologe Synthese von AcbH in E. coliund Reinigung

Das acbH-Gen wurde für eine Überexpression in E. coliBL21(DE3) <pLysS > ohne die für das Signalpeptid kodierende Sequenz nach Amplifikation durch PCR über die durch die mismatch-Primer vorgegebenen Restriktionsschnittstellen in den Expressionsvektor pET19b kloniert (= pCB10, s. 5.6.8.2). Dabei wurde das Cys-Kodon durch das Met-Kodon ausgetauscht, um eine mögliche Lipidmodifikation zu vermeiden. Durch die Klonierung ist N-terminal an AcbH die Sequenz MGH(10)SSGHID(4)KH fusioniert. Die Anzucht von E. coliBL21(DE3) <pLysS, pCB10> erfolgte, wie unter 5.7.12 beschrieben.

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Das Protein AcbH befand sich, wie aufgrund der Vorversuche erwartet (s. Seite 69), in aggregierter Form innerhalb der LSP-Fraktion (Abbildung 6.15). Die Lokalisation des Expressionsproduktes wurde durch Western Blot-Analysen verifiziert (s. 5.7.6) (nicht gezeigt).

Abbildung 6.15: Nachweis der heterologen Expression von acbH in E. coli BL21(DE3) <pLysS, pCB10>.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)15: Nachweis der heterologen Expression von acbH in E. coli BL21(DE3) <pLysS, pCB10>.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)10-AcbH (47,3 kDa) ist mit einem schwarzen Pfeilkopf (◄) markiert. Jeweils 15 µl der Proben wurden untersucht. Hinweis: die in der Cytosolfraktion auffällige, vielversprechende Proteinbande auf der Höhe von 45 kDa (*) ist durch Immunoblotting nachweisbar nicht AcbH!.

Neben dem Ziel der intrazellulären Anreicherung des Proteins wurde auch versucht, durch Fusion mit dem PelB-Signalpeptid den Export in das Periplasma zu erreichen. Dafür wurde das acbH-Gen in den Expressionsvektor pET22b kloniert (= pCB14) und in den Stämmen
E. coliC41 und C43 mit C-terminalem (His)6-Tag exprimiert. Leider konnte in diesen Fällen keinerlei AcbH-Synthese beobachtet werden. Aufgrund der bisherigen Erfahrungen mit den AcbH-Varianten der Expressionssysteme pCB6 – pCB9 wurden weitere Bemühungen, die Gewinnung des AcbH-Proteins im Hinblick auf seine Löslichkeit zu optimieren, vernachlässigt.

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In Orientierung an Vorschläge von DE BERNARDEZ CLARK (2001) und MIDDELBERG (2002) wurde (His)10-AcbH mit einer 8 M Harnstofflösung aus dem LSP solubilisiert und denaturierend über Ni-Affinitätschromatographie gereinigt (s. 5.7.12; Abbildung 16A).

Abbildung 6.16: Denaturierende Reinigung und Renaturierung des (His)16: Denaturierende Reinigung und Renaturierung des (His)10-AcbH-Fusionsproteins aus
E. coli BL21(DE3) <pLysS, pCB10>.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. A: Für die Reinigung von (His)10-AcbH wurden 5 mg LSP (4 ml) 1:10 in 8 M Harnstofflösung für 30 Minuten solubilisiert. Nach Ultrazentrifugation wurde das Solubilisat mit 2 ml Ni-NTA-Matrix inkubiert. Im Anschluss an Waschungen mit je 5 Säulenvolumina Puffer pur und mit 20 mM Imidazol wurde das Protein mit jeweils 1 ml 150 mM Imidazol eluiert. Jeweils 15 µl der Proben des Säulenlaufs wurden untersucht. B: Die Renaturierung wurde mit dem in Eluatfraktion 3 aus (A) enthaltenen AcbH durchgeführt. Nach einer 1,5:1 Verdünnung mit
2,5 M Arginin wurde das Protein über zwei hintereinandergeschaltete PD10-Säulen zunächst nach 1 M Arginin, dann nach Tris-Puffer umgesetzt. Durch abschließende Ultrazentrifugation konnte das im Überstand befindliche lösliche AcbH-Protein (0,23 µg/µl) für weitere Experimente genutzt werden. Jeweils 10 µl der Proben der Renaturierungsprozedur wurden untersucht.

Anschließend erfolgte eine Renaturierung zu löslichem Protein in zwei Schritten (Abbildung 16B), durch Austausch des Denaturierungsagens zunächst gegen 1 M Argininlösung und dann gegen Tris-Puffer mittels Gelfiltrationen (PD10-Säule) (s. 5.7.13). Nach einer abschließenden Ultrazentrifugation wurde reines AcbH aus dem resultierenden Überstand für die Substratbindestudien an einem BIAcore-Gerät verwendet (s. Abschnitt 6.5). Trotz der relativ hohen Verluste war die Ausbeute an löslichem Bindeprotein AcbH enorm: umgerechnet etwa 14 mg/1 Liter Kultur.

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Durch die Aufnahme eines CD-Spektrums (s. 5.7.14) konnte eine α-helikale Konformation des renaturierten Bindeproteins AcbH und damit die Voraussetzung für Aktivität nachgewiesen werden. Die Spektralcharakteristik entspricht der einer dominierenden helikalen Struktur mit Elliptizitätsminima bei 222 nm und 207 nm (Abbildung 6.17).

Abbildung 6.17: CD-Spektrum des renaturierten AcbH.Die Messung wurde mit einer Proteinkonzentration von 150 µg/ml durchgeführt. Das Protein lag vor in 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 5 % Glycerin, 150 mM NaCl17: CD-Spektrum des renaturierten AcbH.Die Messung wurde mit einer Proteinkonzentration von 150 µg/ml durchgeführt. Das Protein lag vor in 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 5 % Glycerin, 150 mM NaCl2. Die Anwesenheit von Chlorid-Ionen bei den Messungen war zwar störend, das Protein konnte aber nicht ohne NaCl bzw. alternativ mit NaF renaturiert werden.

Mit E. coli als heterologem Expressionsstamm konnten unter den Aspekten Ausbeute und Reinheit weitaus befriedigendere Ergebnisse erzielt werden, zumal durch das CD-Spektrum eine α-Helizität als Zeichen einer Rückfaltung nach der Renaturierung bestätigt wurde.

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Im Rahmen der Optimierung der Renaturierung und nachdem bekannt war, dass AcbH keine Maltodextrin-Bindeaktivität besitzt (s. Abschnitt 6.4.2), wurde auch ein Ansatz gewählt, in dem während des Umpufferungsverfahrens Acarbose zu 20 mM in den jeweiligen Lösungen vorhanden war. In Abbildung 6.18 ist zu sehen, dass durch den Zusatz von Acarbose tatsächlich eine Verbesserung der Rückfaltung erzielt werden konnte. Dieses Experiment gab einen ersten Hinweis darauf, dass vielmehr Acarbose zu den potentiellen Substraten dieses Proteins gehört.

Abbildung 6.18: Wirkung von Acarbose auf den Renaturierungserfolg von (His)18: Wirkung von Acarbose auf den Renaturierungserfolg von (His)10-AcbH.Die Renaturierungen wurden wie für Abbildung 16B beschrieben durchgeführt. Im parallelen Ansatz enthielten sowohl die Arginin- als auch die Tris-Lösung Acarbose (20 mM). Nach abschließender Ultrazentrifugation wurden die Anteile des in den jeweiligen Überständen befindlichen löslichen AcbH-Proteins in einer SDS-PAGE analysiert.

6.5 Substratbindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz

Die aufgrund der bisherigen Experimente gefundenen Hinweise auf mögliche Substrate des potentiellen Zucker-Bindeproteins AcbH sollten in Biomolekularen Interaktions-Analysen (BIA) an einem BIAcore-Gerät überprüft werden. Unmittelbar nach der Reinigung und Renaturierung von (His)10-AcbH (s. 5.7.12, 5.7.13) wurde das Protein, wie unter 5.7.10 beschrieben, auf einem Ni-NTA-Sensorchip immobilisiert. Als Referenzprotein für unspezifische Interaktionen der zu testenden Substrate diente (His)10-MalK, das ABC-Protein des Maltosetransporters von S. typhimurium, welches mir freundlicherweise von Bettina Blüschke zur Verfügung gestellt wurde. Im Falle von MalK ergab sich eine Beschichtung von 6.000 RU (0,15 pmol), von AcbH konnten 13.000 RU (0,273 pmol) immobilisiert werden. Da davon ausgegangen werden kann, dass unspezifische Zucker-Protein-Interaktionen wenn überhaupt in einem Maßstab größer als 1:1 (mehrere Zuckermoleküle pro ein Proteinmolekül) stattfinden, war dieser Beladungsunterschied nicht von Belang.

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Als Zuckersubstrate wurden Acarbose sowie im Zuge der Acarbose-Biosynthese durch Actinoplanes sp. entstehende Derivate (Tabelle 6.2), aber auch Maltose, Maltodextrine und Saccharose getestet. Die daraus resultierenden Sensorgramme sind in den Abbildungen 6.19 und 6.20 dargestellt.

Tabelle 6.2: Strukturelle Unterschiede der Nebenkomponenten im Vergleich zu Acarbose.2: Strukturelle Unterschiede der Nebenkomponenten im Vergleich zu Acarbose.

Bezeichnung

Komposition

Acarbose

Acarviosyl-1,4-Maltose

Nebenkomponente 4A

Acarviosyl-1,4-Maltose-1,4-Fruktose

Nebenkomponente 4B

Acarviosyl-1,4-Maltose-1,4-Glukose

Nebenkomponente 4C

Acarviosyl-1,4-Maltose-1,1-Glukose

Nebenkomponente 5C

Acarviosyl-1,4-Maltose-1,4-Glukose-1,1-Glukose

Nebenkomponente 6A

Acarviosyl-1,4-Maltose-1,4-Maltose-1,4-Fruktose

Nebenkomponente 6B

Acarviosyl-1,4-Maltose-1,4-Maltose-1,4-Glukose

Die strukturellen Unterschiede untereinander und zu Acarbose sind fett gedruckt. Diese hier dargestellten, aus der Kulturbrühe von Actinoplanes sp. isolierten und freundlicherweise von Herrn Dr. Wehlmann (Bayer AG) zur Verfügung gestellten Nebenkomponenten der Acarbose-Biosynthese wurden in den Substratbindestudien an einem BIAcore-Gerät verwendet. Nebenkomponentengemisch 4A, 4B, 4C: Präparat LEJ 3333/3, Nebenkomponente 5C: Präparat LEJ 3333/6, Nebenkomponentengemisch 6A, 6B: Präparat LEJ 3333/5.

Die Bindung von Acarbose und seinen Derivaten an das Protein AcbH wurde ganz klar nachgewiesen, hingegen konnten bei Substraten wie Maltodextrinen oder auch Maltose und Saccharose (nicht gezeigt) keine Interaktionen beobachtet werden. Von den Pseudooligosacchariden assoziierte Acarbose am stärksten, gefolgt von den längerkettigen Nebenkomponenten 5C und 6AB, die gegenüber Acarbose wiederum schneller dissoziierten.

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Abbildung 6.19: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit Acarbose und Nebenkomponenten. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen von Acarbose an AcbH vergleichend dargestellt. Die rechte Darstellung zeigt das unterschiedliche Bindungsvermögen der Acarbosederivate in Relation zu Acarbose bei Konzentrationen von jeweils 10 mM. Hier ist auch zu sehen, dass Maltodextrine (ebenfalls 10 mM) keinerlei Affinität zu AcbH aufwiesen. Die Bezeichnung der Nebenkomponenten ist in Kurzform angegeben (Komponentengemisch 4ABC, Komponente 5C, Komponenten 6AB). Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.19: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit Acarbose und Nebenkomponenten. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen von Acarbose an AcbH vergleichend dargestellt. Die rechte Darstellung zeigt das unterschiedliche Bindungsvermögen der Acarbosederivate in Relation zu Acarbose bei Konzentrationen von jeweils 10 mM. Hier ist auch zu sehen, dass Maltodextrine (ebenfalls 10 mM) keinerlei Affinität zu AcbH aufwiesen. Die Bezeichnung der Nebenkomponenten ist in Kurzform angegeben (Komponentengemisch 4ABC, Komponente 5C, Komponenten 6AB). Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.

Nur relativ wenig Interaktion gab es mit den Nebenkomponenten 4ABC. Legt man den optimalen Fall einer 1 : 1 Bindung von Acarbosemolekül zu Protein zugrunde ist theoretisch, unter Einberechnung der molaren Massen der beteiligen Partner und bei System-gegebener Korrelation von 1000 RU = 1 ng Makromolekül, eine Änderung der Response Units RU von 176 möglich. Bei Injektion von 10 mM Acarbose (645 g/mol) und einer resultierenden
RU-Differenz von bis zu 130 waren somit 74 % von AcbH mit Zucker belegt, was für einen guten Renaturierungserfolg spricht. Für die Affinität des Zucker-Bindeproteins zu Acarbose wurde durch die BIAcore-Software in einem Fit nach Langmuir (1 : 1) eine Konstante KD = 3,8 x 10-3 M ermittelt.

Die Affinität von AcbH zu der Nebenkomponente 5C betrug KD = 1,2 x 10-3 M, für das Nebenkomponentengemisch 6AB wurde die KD = 1,8 x 10-3 M berechnet.

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Abbildung 6.20: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit den Nebenkomponenten 5C, 6AB. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen des Acarbosederivates 5C mit AcbH vergleichend dargestellt, im rechten Bild ist es das Gemisch der Acarbosederivate 6A und 6B. Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.20: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit den Nebenkomponenten 5C, 6AB. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen des Acarbosederivates 5C mit AcbH vergleichend dargestellt, im rechten Bild ist es das Gemisch der Acarbosederivate 6A und 6B. Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.

6.6 Heterologe Synthese und Reinigung der Proteine AcbFG und MsiK

Das Gen für das Acarbose-Bindeprotein AcbH (s. Abschnitt 6.5) bildet zusammen mit den acbFG-Genen, die für die zwei Membrankomponenten eines ABC-Importers kodieren, innerhalb des Acarbose-Biosynthesegenclusters eine Transkriptionseinheit. Das Gen für ein den Transporter komplettierendes ABC-Protein zur notwendigen Energetisierung des Transportvorgangs hingegen ist, wie bei grampositiven Bakterien durchaus üblich, nicht in diesem Cluster vertreten (s. 4.2.3.2). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zur Identifizierung eines möglicherweise assistierenden ABC-Proteins (MsiK) und zur heterologen Synthese der Membranproteine AcbFG sowie zu Reinigungsversuchen des Komplexes AcbFG-MsiK2 zwei Diplomarbeiten angefertigt (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002). Deren Ergebnisse werden hier zusammenfassend dargestellt.

6.6.1  Identifizierung, heterologe Synthese in E. coli und Reinigung von MsiK

Mit Hilfe der Verwendung des msiK-Gens aus S. lividans als DIG-markierte Sonde in DNADNA-Hybridisierungsexperimenten wurde in chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. 50/110 ein Leserahmen identifiziert, dessen abgeleitetes Genprodukt die charakteristischen Kriterien eines ABC-Proteins der CUT1-Familie zeigte (SCHÄFER, 1999). Das ebenfalls als msiK bezeichnete Gen wurde in geeignete Vektoren kloniert und in verschiedenen E. coliStämmen exprimiert (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002). Wie auch für das AcarboseBindeprotein AcbH beobachtet, resultierte die heterologe Synthese von (His)6-MsiK stets in einer Anreicherung aggregierten Proteins (Abbildung 6.21A). Bemühungen im Hinblick auf eine Erhöhung des löslichen Anteils von MsiK (exprimiert von pDE03, msiK auf pQE9) führten ebenso zu keinem Erfolg. Dabei wurden einige der für AcbH beschriebenen Strategien getestet (s. Abschnitt 6.4.1) und darüber hinaus auch Ko-Synthesen mit den Chaperonen DnaK, DnaJ und GrpE (CASTANIÉ ET AL., 1997) sowie eine Ko-Induktion chromosomal kodierter Chaperonsysteme durch 2 % Ethanol. Außerdem wurde nach MAR CARRIÓ & VILLAVERDE (2000) versucht, aggregiertes MsiK durch Abbruch der Proteinbiosynthese in dem Expressionsstamm E. coli JM109 nach Zugabe von Chloramphenicol zu remobilisieren.

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Nachdem mit dem nur dürftig im Cytosol vorliegenden (His)6-MsiK Reinigungsversuche über Ni-Affinitätschromatographie durchgeführt und bezüglich Ausbeute und Reinheit als unzufriedenstellend bewertet wurden, erfolgte die Reinigung unter denaturierenden Bedingungen. Das MsiK-Protein konnte nach Solubilisierung aus dem LSP mit 8 M Harnstoff in hinreichenden Mengen erhalten und durch schnelles Ausverdünnen des Denaturierungsagens renaturiert werden (Abbildung 6.21B). Die im Rahmen der Charakterisierung von MsiK in einem ersten Versuch durchgeführten ATPaseAktivitätsmessungen zeigten allerdings keine ATPase-Aktivität des Proteins. Als naheliegendste Ursache hierfür wurde die Möglichkeit einer größtenteils inkorrekten Rückfaltung diskutiert.

Des weiteren wurde für die Gewinnung eines polyklonalen Anti-MsiK-Antiserums das Antigen MsiK analog der für AcbH beschriebenen Methode unter 5.7.5 aus Polyacrylamid-Gelen eluiert.

Abbildung 6.21: Nachweis der heterologen Synthese von MsiK in E. coli JM109 <pDE03> sowie denaturierende Reinigung und Renaturierung (verändert nach ELVERS, 2002).Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)21: Nachweis der heterologen Synthese von MsiK in E. coli JM109 <pDE03> sowie denaturierende Reinigung und Renaturierung (verändert nach ELVERS, 2002).Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)6-MsiK (40,8 kDa) ist mit einem schwarzen Pfeilkopf (◄) markiert. A: Zum Vergleich wurden je 30 µg der Proteine des LSPs und der Cytosolfraktion untersucht. B: Für die Reinigung von (His)6-MsiK wurden 5 mg LSP mit 8 M Harnstofflösung für 30 Minuten solubilisiert. Nach Ultrazentrifugation wurde das Solubilisat (8 ml) mit 1 ml Ni-NTA-Matrix inkubiert. Im Anschluss an Waschungen mit 10 Säulenvolumina Puffer wurde das Protein mit 50 mM Imidazol eluiert. Jeweils 15 µl der einzelnen Proben wurden untersucht. Die anschließende Renaturierung erfolgte durch schnelles Ausverdünnen (1 : 50) des Denaturierungsagens. Nach 45 minütiger Inkubation auf Eis wurde das Volumen des Ansatzes eingeengt, durch abschließende Ultrazentrifugation konnte das im Überstand befindliche lösliche MsiK-Protein nach einer Umlagerung in einen geeigneten Messpuffer für die ATPase-Aktivitätsmessungen genutzt werden. Weitere Details sind der Originalarbeit zu entnehmen.

6.6.2 Heterologe Ko-Synthese und Reinigung des Komplexes AcbFG-MsiK2

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Für eine sichere Charakterisierung eines Transportsystems ist es unerlässlich, den vollständigen Komplex in der definierten Umgebung von Proteoliposomen zu rekonstituieren. Als Voraussetzung dafür muss es gelingen, die Membranproteine in Solubilisierungsverfahren aus den Ursprungsmembranen herauszulösen und zu reinigen. Gleichzeitig können im Rahmen der Reinigung durch Ko-Elutionsstudien Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen Proteinen gefunden werden.

Indizien für eine Interaktion der Membranproteine AcbFG mit dem ABC-Protein MsiK zeigten sich in Wachstumsversuchen, da die toxische Wirkung der Synthese der Membrankomponenten, die zu einer Stagnation des Kulturwachstums führte, durch Ko-Expression des msiK-Gens zum Teil aufgehoben wurde (SCHÄFER, 1999). Dieser Befund wurde von ELVERS (2002) bestätigt und durch Ko-Elutionsstudien weiter unterstützt. Dafür wurde mit einem zwei-Plasmid-System in E. coli JM109 <pGEO4, pGEO7> gearbeitet, das acbFG von pQE9 und msiK von pSU18 ko-exprimiert. AcbF wurde dabei N-terminal mit einem (His)6-Tag fusioniert, über den in Immunoblots mit Anti-RGS-Antiserum dieses Membranprotein detektiert werden konnte. Da die Synthese von AcbFG vermutlich translational gekoppelt ist, wurde auch von einer AcbG-Synthese ausgegangen. Das MsiK-Protein hingegen lag unfusioniert vor.

Die sich nach einer Solubilisierung der Membranproteine mit 1,1 % Dodecyl-β-D-maltosid und anschließender Reinigung des Komplexes über eine Ni-Säule in den Eluatfraktionen befindenden Proteine AcbF und MsiK konnten in einem Immunoblot detektiert werden (Abbildung 6.22). Die Darstellung der Prozedur in einer SDS-PAGE sagte allerdings aus, dass für eine Rekonstitution des AcbFG-MsiK2-Komplexes die Reinigung optimiert werden muss, da zahlreiche weitere Proteine in den Eluaten enthalten waren.

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Abbildung 6.22: Ko-Elution des Komplexes AcbFG-MsiK22: Ko-Elution des Komplexes AcbFG-MsiK2 (verändert nach ELVERS, 2002).Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des (His)6-AcbF (39,1 kDa) wurde mit Anti-RGS-Antiserum, der des MsiK
(39,2 kDa) mit Anti-MsiK-Antiserum geführt. Die Detektion des MsiK zusammen mit AcbF erfolgte in unabhängigen Immunoblot-Analysen. Weitere Details sind der Originalarbeit zu entnehmen.

6.7 Immunochemische Analyse des Syntheseprofils von AcbH und
MsiK in Actinoplanes sp.

Für die ebenfalls im Acarbose-Biosynthesegencluster codierten extrazellulären Proteine AcbE (α-Amylase) und AcbD (Acarviosyl-Transferase) wurden Kultivierungsbedingungen ermittelt, die eine Synthese dieser Enzyme induzieren (STRATMANN, 1997) (s. Abschnitte 4.1 und 4.2.4). Dabei konnten Maltose und Maltotriose, insbesondere im Acarbose-Produktionsmedium, als Moleküle mit solch einer Wirkung identifiziert werden. Diese Untersuchungen wurden mit Zellen aus dreitägiger Anzucht unternommen. Wie auch für den Maltosetransport beschrieben (s. Abschnitt 6.2.2), hatte der Zusatz von Glukose keinen reprimierenden Effekt im Sinne einer Katabolitrepression.

6.7.1  Das Syntheseprofil von AcbH

Um nun die Synthesevoraussetzungen für ein weiteres Protein aus dem acb-Gencluster, nämlich AcbH, aufzuklären und in einen Kontext mit dem Modell des Acarbose-Metabolismus zu bringen, wurden Zellen von Actinoplanes sp. mit verschiedenen Kohlenstoffquellen (Acarbose-Produktionsmedium, TSB-Vollmedium und Minimalmedium mit je 0,5 % Maltodextrinen MD, MD50, Maltose, Acarbose, Glukose und Glycerin) angezogen. Während des Wachstums (nach 24, 48 und 72 Stunden) wurden Proben entnommen, in die Zellbestandteile fraktioniert (s. 5.7.1) und Western Blot-Analysen mit Anti-AcbH-Antiserum (s. 5.7.6) unterzogen. Für sämtliche Analysen wurden jeweils 30 µg Protein eingesetzt

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Abbildung 6.23 zeigt, dass die Synthese von AcbH (44,5 kDa ohne Lipidmodifizierung) nach 24 stündigem Wachstum immunologisch noch nicht nachzuweisen war. Hingegen waren zwei prominente Proteinbanden im Kulturüberstand zu finden, die aufgrund ihrer Größe als AcbE (107 kDa) und AcbD (76 kDa) benannt werden könnten (entsprechende Antiseren stehen nicht zur Verfügung). Dieser Befund lies auf eine unterschiedliche Regulation der Synthese schließen.

Bestätigt und sogar noch erweitert wird diese Spekulation durch das Bild bei Wachstum der Zellen von zwei bzw. drei Tagen mit 0,5 % Maltodextrinen (Abbildung 6.24). Es scheint als würden auch AcbE und AcbD unabhängig voneinander reguliert. In dieser Abbildung ist zu erkennen, dass nach zweitägiger Anzucht nur AcbD und weder die α-Amylase noch das Bindeprotein vorhanden waren. Wiederum unabhängig wurde das Protein AcbH nur von drei Tage alten Zellen produziert.

Abbildung 6.23: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in AcarboseProduktionsmedium.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des23: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in AcarboseProduktionsmedium.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des
wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)6-AcbH von pCB7 (45,8 kDa). Das Protein AcbD ist durch einen weißen, das Protein AcbE durch einen schwarzen Pfeil markiert.

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Abbildung 6.24: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in 0,5 % Maltodextrinen.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)24: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in 0,5 % Maltodextrinen.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)6-AcbH von pCB7 (45,8 kDa). Das Protein AcbD ist durch einen schwarzen Pfeil markiert.

Da, wie auch in Abbildung 6.24 zu sehen, die Lokalisation von AcbH auf die Membranen beschränkt war und des weiteren frühestens (unter den gewählten Erntezeitpunkten) nach 48 stündiger Kultivierung detektierbar, wurden für die Abbildung 6.25 alle weiteren Induktionsmuster geschmälert zusammengefasst.

Abbildung 6.25: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Vollmedium TSB und Minimalmedium mit je25: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Vollmedium TSB und Minimalmedium mit je
0,5 % Glukose, MD50, Acarbose, Maltose und Glycerin. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle dienten ca. 0,1 µg des (His)6-AcbH von pCB7 (45,8 kDa).

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Die Kohlenstoffquellen Glukose und Glycerin führten nicht zu einer Produktion von AcbH. Überraschenderweise führte jedoch Acarbose zur ausgeprägtesten Synthese des Bindeproteins, und zwar gegenüber allen anderen getesteten Substraten schon nach zwei Tagen Kultivierung der Zellen. Ebenfalls eine Wirkung auf die Expression von acbH hatten, nach dreitägiger Anzucht, die für die Expression von acbD und acbE beschriebenen Zucker Maltose und Maltotriose. Der hier erbrachte Nachweis einer AcbH-Synthese in Vollmedium TSB (enthält 0,25 % Glukose und Maltose) nach drei Tagen spiegelt, wie schon bei den Transportexperimenten unter 6.2.2 und für AcbD und AcbE (STRATMANN, 1997) gefunden, keine Glukoserepression wider. Das von den Zellen produzierte AcbH lag in quantitativer Hinsicht stets weit unter dem Level der beiden extrazellulären Enzyme, welche zu allen drei Erntezeitpunkten (Abbildungen 6.23 und 6.24 sowie STRATMANN, 1997) bereits in Coomassie-Blue –gefärbten SDS-Gelen deutlich sichtbar waren.

Unterstützend für die hier dargebrachten Ergebnisse sind Analysen auf mRNA-Basis. Transkripte von acbH sind ebenfalls in nur geringen Mengen und erst nach zwei bis drei Tagen nachzuweisen (U. Wehmeier, pers. Mitteilung).

Um die Befunde einer Lokalisation des AcbH in den Membranen von Actinoplanes sp. zu unterstützen und einen falsch positiven Befund durch Pelletierung aggregierten Proteins auszuschließen, wurde versucht, das wt-Protein aus Membranen von Zellen nach Kultivierung mit 0,5 % Acarbose mit 1,1 % des Detergenz Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) zu solubilisieren (s. 5.7.15). Die Abbildung 6.26 stellt dar, dass unter den gewählten Bedingungen das gesamte in den Membranen enthaltene Protein herausgelöst werden konnte. Einen gleichwertigen Effekt erzielte auch die Verwendung von 0,1 % des Detergenz TritonX-100 (nicht gezeigt).

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Abbildung 6.26: Solubilisierung des wt-AcbH aus Membranen von Actinoplanes sp. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)26: Solubilisierung des wt-AcbH aus Membranen von Actinoplanes sp. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)6-AcbH von pCB7 (45,8 kDa). Der Solubilisierungsansatz enthielt Membranen mit 390 µg Proteinanteil. Nach einer 40minütigen Inkubation unter vorsichtigem Rühren auf Eis wurde der Ansatz ultrazentrifugiert, das Solubilisat vom Pellet getrennt und dieses im Ausgangsvolumen Solubilisierungspuffer (1,1 % Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 5 % Glycerin, 0,1 mM PMSF in Minimalmedium MNS) resuspendiert.

Erste Reinigungsversuche über Anionen-Austauschmatrix (DEAE-Sepharose), bei einem für AcbH errechneten pI von 5,2 unter pH-Bedingungen von 7,5 durchgeführt, hatten leider keinen Erfolg.

6.7.2 Das Induktionsprofil von MsiK

Die Wachstumsexperimente sowie die Ko-Elutionsstudien aus Abschnitt 6.6.2 gaben Hinweise darauf, dass das ABC-Protein MsiK möglicherweise dem Transportsystem AcbHFG als energetisierende Domäne assistiert. So wurden in Zusammenarbeit mit
D. ELVERS (2002) die Zellfraktionen auch auf Vorhandensein von MsiK mit Anti-MsiKAntiserum überprüft, zu dieser Zeit allerdings lediglich aus Kulturen nach 24 stündiger Anzucht. Dabei wurden zusätzlich Fraktionen von Zellen nach Wachstum in Minimalmedium mit 0,5 % Cellobiose untersucht, da das homologe, multiple ABC-Protein MsiK aus
S. lividans den Maltose- und den Cellobiosetransporter bedient.

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Die Synthese von MsiK war unabhängig vom Wachstumszucker in allen getesteten Kulturen in etwa gleichen Mengen nachzuweisen, und zwar überwiegend in den Membranen und zu einem geringen Anteil im Cytosol. Dieses Induktionsprofil deckt sich nicht mit dem des Zucker-Bindeproteins AcbH, welches weder nach 24 Stunden Kulturwachstum noch bei Anzucht der Zellen mit Glukose oder Glycerin detektierbar war. Die vorwiegende Lokalisation des betrachteten Proteins in den Membranen deutet auf eine Assoziation an membranintegrale Komponenten eines Transportkomplexes.

6.7.3 Zusammenfassung

Zur Charakterisierung des im Acarbose-Biosynthese-Genclusters kodierten, Bindeproteinabhängigen ABC-Importsystems AcbHFG wurden die entsprechenden Gene heterolog in
E. coli und S. lividans exprimiert und z. T. gereinigt.

Während in S. lividans nur eine schwache Synthese des AcbH-Proteins beobachtet wurde, konnte in E. coli eine starke Anreicherung erzielt werden. Da das (His)10-Fusionsprotein hier in aggregierter Form vorlag, wurde es unter denaturierenden Bedingungen über Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend renaturiert. Durch die Aufnahme eines CD-Spektrums wurde eine α-helikale Konformation des renaturierten Proteins nachgewiesen. In Substratbindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte eine Interaktion von AcbH mit Acarbose und längerkettigen Derivaten, nicht jedoch mit Maltose, Maltodextrinen und Saccharose gezeigt werden.

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Durch Immunoblot-Analysen mit Anti-AcbH-Antiserum wurde das Syntheseprofil des Bindeproteins in Actinoplanes sp. untersucht. AcbH wurde nur bei Zellen aus der stationären Wachstumsphase detektiert, denen Acarbose oder Maltose/Maltodextrine als Kohlenstoffquelle angeboten wurden. Dem vorhergesagten Lipoprotein-Charakter entsprechend wurde eine ausschließliche Lokalisation in den Membranfraktionen festgestellt.

Im acb-Gencluster ist kein Gen für ein ABC-Protein kodiert, das den Komplex AcbFG komplettiert. Durch SCHÄFER (1999) wurde das Gen einer möglicherweise assistierenden ABC-Domäne (MsiK) identifiziert. In Ko-Expressions- und Ko-Elutionsstudien (ELVERS, 2002) konnten Hinweise auf eine Komplexbildung der Membranproteine AcbFG mit MsiK erhalten werden. Die im Gegensatz zu AcbH konstitutive Synthese von MsiK erlaubt jedoch keinen Rückschluss auf die Zusammengehörigkeit der Komponenten in Actinoplanes sp..


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22.09.2006