7 DISKUSSION

↓109

7.1  Wirkung von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von Escherichia coli K12 und resultierende Konsequenzen für das Modell zum Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.

Angeregt durch die strukturelle Ähnlichkeit des Pseudotetrasaccharids Acarbose zu dem natürlichen Substrat Maltotetraose des Enterobakteriums Escherichia coli K12, wurde der Einfluss des α-Glukosidase-Hemmers auf einzelne Komponenten des Maltose/MaltodextrinStoffwechsels differenzierend untersucht. Die so erzielten Befunde sollten in das zu Beginn dieser Arbeit bestehende Modell zum Acarbose-Metabolismus integriert werden (s. Seite 9, Abschnitt 4.1).

7.1.1  Einfluss von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von
Escherichia coli K12

↓110

Bisherige Studien zur Wirkung von Acarbose beschränkten sich auf Untersuchungen zu Interaktionen mit vornehmlich extrazellulären und intestinalen Enzymen diverser pro- und eukaryotischer Organismen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte des Pseudotetrasaccharids auch auf das Verhalten intakter Zellen von E. coli K12 in Kultur ausgeweitet. Nachfolgend wurde der Einfluss von Acarbose auf einige der Komponenten, die an Substraterkennung bzw. -transport und Substratverwertung während des Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsels beteiligt sind, differenziert.

Zunächst konnte festgestellt werden, dass radioaktiv markierte Acarbose (nur die C-Atome des Acarviosyl-Restes sind durch das 14C-Isotop substituiert) in Zellen von E. coli aufgenommen wird und dass dieser Import bei Anwesenheit von Maltose inhibiert ist
(s. 6.1.1). E. coli synthetisiert eine periplasmatische α-Amylase MalS (SCHNEIDER ET AL., 1992), die gegenüber Acarbose bis zu einer Konzentration von 0,1 mM insensitiv ist (Spiess & Ehrmann, pers. Mitteilung). MalS katalysiert die Abspaltung von Maltohexaosen aus längerkettigen Dextrinen. Daher kann angenommen werden, dass unter den experimentellen Bedingungen der Transportmessungen (5,7 µM radioaktive Acarbose) keine Hydrolyseprodukte sondern Acarbose selbst transportiert wird. Zusammen mit den Ergebnissen einer Diplomarbeit (BRUNKHORST, 1998) lässt sich die Schlussfolgerung ziehen, dass Acarbose ein Substrat des Bindeprotein-abhängigen ABC-Transportsystems MalEFGK2 ist. Bereits hier konnte dokumentiert werden, dass Acarbose spezifisch sowohl das Wachstum von
E. coli K12 mit Maltose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle als auch den Maltoseimport hemmt.

Zunächst wurde erwogen, dass Acarbose durch das periplasmatische Maltose-Bindeprotein MalE als Substrat erkannt wird. In Fällungsexperimenten mit MalE-haltigen Osmoschock-Überständen und [U-14C]-Maltose bei Anwesenheit von Acarbose konnte diese Spekulation bestätigt werden (s. 6.1.2). Beide Zucker konkurrieren um die Bindetasche des MalE. Für das grampositive Bakterium Alicyclobacillus acidocaldarius wurde ebenfalls eine Hemmung des Maltose-Transports und der [U-14C]-Maltose-Bindung an das Maltose-Bindeprotein MalE durch Acarbose beschrieben (HÜLSMANN ET AL., 2000).

↓111

Das Wachstum einer Bindeprotein-unabhängigen Mutante (malF500, TREPTOW & SHUMAN, 1985) auf Maltose war durch Acarbose weniger beeinträchtigt (BRUNKHORST, 1998). Die Eigenschaft solcher Mutanten liegt neben anderen darin, dass sie nur Maltose (Km = 2 mM), aber keine Maltodextrine transportieren (TREPTOW & SHUMAN, 1985). In diesem Fall ist die Substratspezifität durch die Membranproteine MalFG bestimmt (MERINO & SHUMAN, 1997; s. auch Seite 17, Abschnitt 4.2.3.1). Als weitere am Import beteiligte Komponente ist auch das Maltoporin in der äußeren Membran von E. coli ein Angriffspunkt der Acarbose (BRUNKHORST ET AL., 1999).

Der Befund, dass durch 100 µM Acarbose die Bindung von Maltose an MalE zu 75 %, der Maltose-Transport jedoch zu fast 100 % gehemmt wurde, spiegelt die Summierung der aufgeführten, unabhängigen Interaktionen des Pseudotetrasaccharids mit den an der Substraterkennung beteiligten Bausteinen des Maltose-Transportsystems wider. Das Wachstum der Zellen von E. coli K12 wird erst bei fünffach höheren Acarbose-Konzentrationen deutlich gehemmt (BRUNKHORST, 1998). Hier sind bei der zur Kultivierung angebotenen Menge an Maltose (13,8 mM) die unspezifischen Porine OmpF und OmpC für eine Substratversorgung ausreichend, während unter den Bedingungen der Transportmessungen mit 5,7 µM Maltose das Maltoporin beteiligt ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse an, dass die N-glykosidische Bindung des Acarviosyl-Restes der Acarbose, welche die inhibitorische Wirkung auf Hydrolasen determiniert (s. Seite 10, Abschnitt 4.1), keine Relevanz für den Transportvorgang hat und Acarbose bis hierher strukturell als Maltotetraose betrachtet wird.

Zellen von E. coli K12 vermögen nicht mit Acarbose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen. Bei Ko-Kultivierung der Zellen mit Glycerin und Acarbose jedoch konnte in Immunoblot-Analysen eine erhöhte Synthese des Maltose-Bindeproteins MalE festgestellt werden (BRUNKHORST, 1998). Das erreichte Induktionslevel erwies sich allerdings als unzureichend für den Nachweis jeglicher Transportaktivität. Da für die Induktion des Maltoseregulons die Aktivierung des positiven Regulators MalT durch Maltotriose essentiell ist (BOOS & SHUMAN, 1998; s. Seite 21, Abschnitt 4.2.4), müssen Hydrolyseprodukte der Acarbose als Effektoren gewirkt haben. Unter Schlussfolgerung, dass Acarbose möglicherweise auch von den cytoplasmatischen Enzymen des MaltodextrinKatabolismus als Substrat erkannt und umgesetzt wird sowie dem Interesse folgend, den Verbleib der intrazellulär akkumulierten Acarbose nachzuvollziehen, wurden Experimente zur Quantifizierung freigesetzter Glukose mit Ganzzellextrakten durchgeführt (s. 6.1.3). Sowohl die Amylomaltase MalQ als auch die Maltodextrin-Glukosidase MalZ von E. coli hydrolysieren α-1,4-glykosidische Bindungen von Maltodextrinen (BOOS & SHUMAN, 1998) und sind damit potentiell durch Acarbose beeinflussbar (Abbildung 7.1; s. auch Seite 18, Abschnitt 4.2.3.1).

↓112

Abbildung 7.1: Maltodextrinabbau durch die zytoplasmatischen Enzyme MalQ, MalP und MalZ (verändert nach BOOS & SHUMAN, 1998).Die drei Enzyme sind farbig wiedergegeben: MalQ: Amylomaltase, MalZ: Maltodextrin-Glukosidase, MalP: Maltodextrin-Phosphorylase. Aus diesem Schema wird deutlich, dass der Abbau von Maltose nur in Gegenwart eines Maltosyl-Donors (Minimum Maltotriose) stattfinden kann.1: Maltodextrinabbau durch die zytoplasmatischen Enzyme MalQ, MalP und MalZ (verändert nach BOOS & SHUMAN, 1998).Die drei Enzyme sind farbig wiedergegeben: MalQ: Amylomaltase, MalZ: Maltodextrin-Glukosidase, MalP: Maltodextrin-Phosphorylase. Aus diesem Schema wird deutlich, dass der Abbau von Maltose nur in Gegenwart eines Maltosyl-Donors (Minimum Maltotriose) stattfinden kann.

In Ganzzellextrakten des E. coli Stammes CB39 (malQmalZ+) konnte eine geringe Menge freier Glukose, entlassen aus Acarbose durch die Aktivität der Maltodextrin-Glukosidase, nachgewiesen werden. Diese Beobachtung könnte auf das Induktionspotential einer aus Acarbose resultierenden Pseudotriose hinweisen. Damit würde auch das Aktivatorprotein MalT einen Pseudozucker als Substrat erkennen. Möglicherweise ist auch eine aus den Glukoseeinheiten formierte Maltotriose durch ein bisher hypothetisches Enzym (EHRMANN & BOOS, 1987; DECKER ET AL., 1993) der Induktor der Expression desmalE-Gens. Um die chemische Natur des Induktors zu verifizieren, sollte das Syntheselevel des MalE-Proteins nach Ko-Kultivierung des Stammes TK38 (malQ+ malZ) mit Glycerin und der Pseudotriose Komponente 2 (Acarviosyl-1,4-Glukose; vgl. Tabelle 6.2 auf Seite 77) überprüft werden. Mit diesem Stamm konnte eine Degradation der Acarbose durch die Amylomaltase nicht festgestellt werden. Darüber hinaus kann angenommen werden, dass Acarbose auch nicht von der ebenfalls in den verschiedenen Ganzzellextrakten enthaltenen MaltodextrinPhosphorylase MalP als Substrat erkannt wird. MalP katalysiert die Freisetzung von Glukose-1-Phosphat aus Maltopentaose und längerkettigen Maltodextrinen durch Phosphorolyse. Ob Acarbose hier, wie im Falle der Glykogen-Phosphorylase (GOLDSMITH ET AL., 1987), als Inhibitor wirkt, bleibt offen.

Entgegen der Feststellung, dass Acarbose allein nicht durch die Amylomaltase hydrolysierbar ist, konnte in Gegenwart von überschüssiger Maltose als Maltosyl- oder Pseudomaltotriosylakzeptor jedoch ein Umsatz von Acarbose als Glykosyl- oder Maltosyldonor durch MalQ bestimmt werden. MalQ transferiert Maltosyl- und Dextrinylreste auf das nicht reduzierende Ende eines Akzeptormoleküls (BOOS & SHUMAN, 1998). Anders als die oben aufgeführte Deutung, dass die N-glykosidische Bindung des Acarviosyl-Restes der Acarbose keine Relevanz für den Transportvorgang hat, verhindert diese Struktur des Acarviosins am nicht reduzierenden Ende der Acarbose dagegen einen enzymatischen Umsatz, da sie keine Akzeptorfunktion einnehmen kann. Dies ist anders bei der Cyclomaltodextrin-Glukanyltransferase (CGTase) aus Bacillus macerans. Ähnlich MalQ und MalZ sind auch CGTasen durch Acarbose hemmbar (STROKOPYTOV ET AL., 1995), das Enzym von B. macerans nutzt aber trotzdem das nicht reduzierende Ende der Acarbose als Empfänger für Maltohexaose (YOON & ROBYT, 2002).

↓113

Die lediglich durch die Aktivität von MalZ zur Verfügung stehenden Glukosemoleküle waren insgesamt nicht ausreichend, Wachstum von E. coli K12 mit Acarbose als einziger Kohlenstoffquelle zu ermöglichen. Im Gegenteil, der überwiegende Anteil der importierten Acarbose wird nicht abgebaut und führt durch Akkumulation zu einem cytotoxischen Effekt ähnlich der Anhäufung von Maltose in malQ-Mutanten (BOOS & SHUMAN, 1998).

Im Hinblick auf den Einsatz von Acarbose als Wirkstoff zur Behandlung des Diabetes mellitus, begleitet von einer stärkehaltigen Diät, muss neben der pharmakokinetischen und therapeutischen Eigenschaft dieser Substanz auch der Einfluss auf die Zusammensetzung der Darmflora des Patienten von Bedeutung sein. Für das Darmbakterium E. coli konnte eine spezifische Hemmung des Wachstums mit Maltose belegt werden, die bei AcarboseKonzentrationen über 0,5 mM sogar zu einer Lyse der Zellen führte. Dies betrifft sicherlich auch andere Mikroorganismen des Intestinaltraktes. Daher wäre es von therapeutischem Interesse, die Entwicklung der Darmflora unter Acarboseanwendung zu verfolgen.

7.1.2 Bedeutung der Befunde für den Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.

Die von STRATMANN (1997) formulierte Hypothese zur Bedeutung von Acarbose im Ökosystem von Actinoplanes sp. beschreibt einen intra- und extrazellulären Acarbosekreislauf, der gemeinsam mit den Aktivitäten der extrazellulären α–Amylase AcbE und der Acarviosyl-Transferase (ATase) AcbD der Erschließung von Kohlenstoffquellen dient. Dabei soll die Acarbose neben der Carbophor-Funktion auch eine Rolle als Inhibitor von maltolytischen Enzymen von Nahrungskonkurrenten übernehmen (s. Seite 12, Abschnitt 4.1).

↓114

Dieses zu Beginn der vorliegenden Arbeit bestehende Modell zur Bedeutung von Acarbose warf Fragen auf, die nun beantwortet werden können (s. auch Seite 109, Abschnitt 7.3.3). Trotz der Funktion von Acarbose als Inhibitor maltolytischer Enzyme von Nahrungskonkurrenten würden die im Habitat vorkommenden Mikroorganismen anderer Arten ausreichend mit den Produkten einer Stärkehydrolyse versorgt, nämlich durch die Aktivität von AcbE. So kann allein die Inhibition von Exoenzymen konkurrierender Bakterien oder Pilze keine befriedigende Erklärung zur Rolle von Acarbose liefern. Effektiver für Actinoplanes sp. wäre ein Inhibitionsmechanismus, der auch die Maltose/MaltodextrinTransportsysteme und den dazugehörigen Katabolismus von Nahrungskonkurrenten betrifft.

Abgeleitet aus den Ergebnissen dieser Arbeit, kann die Hypothese zur Funktion von Acarbose im natürlichen Habitat um diesen Aspekt erweitert werden. Die Befunde zum Einfluss von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von Escherichia coli sollten auch auf andere Mikroorganismen mit Stärke-Metabolismus übertragbar sein. Schließlich reicht das Spektrum der durch Acarbose und seine längerkettigen Derivate inhibierten Hydrolasen
α-1,4-glykosidischer Bindungen von intestinalen α-Glukosidasen wie Glukoamylasen, Saccharasen und Maltasen bis zu extrazellulären α-Glukosidasen und α-Amylasen verschiedener Pilze und Bakterien wie Saccharomyces sp. und Bacillus subtilis (TRUSCHEIT ET AL., 1981; MÜLLER, 1989). Der Vorteil, den sich Actinoplanes sp. durch den sehr energieaufwendigen Acarbose-Metabolismus verschafft, beruht also wahrscheinlich auch auf der Inhibierung der Aufnahmesysteme für Maltose und Maltodextrine. Möglicherweise geschieht dies so wie bei E. coli durch effektiven Import von Acarbose, der zu einer Wachstumsbeeinträchtigung bis hin zur Lyse der Zellen führen kann. Neben dem dadurch entstehenden Defizit im Energiehaushalt des Nahrungskonkurrenten aufgrund eines Mangels an Maltooligosacchariden, die für den Katabolismus bereit stehen sollten, könnte die intrazelluläre Akkumulation von Acarbose auch toxische Effekte haben. Im Fall von E. coli werden die cytoplasmatischen Enzyme MalQ und MalZ nur leicht in ihrer Aktivität gehemmt, Acarbose selbst wird nur schwach als Substrat erkannt und reichert sich im Cytosol an. Ein zu Hydrolyseprodukten der Stärke alternatives Wachstum mit dem Pseudotetrasaccharid ist nicht möglich.

Möglicherweise entsteht eine hemmende Wirkung von Acarbose und seinen Derivaten auch ohne tatsächlichen Import, sondern lediglich durch eine Art Verstopfung der Translokationspore. Dies könnte durch eine Interaktion mit dem Substrat-Bindeprotein realisiert werden, die nicht zur Initiation des Transportvorganges führt (s. auch Seite 15, Abschnitt 4.2.2). Einen solchen Einfluss zeigt z. B. die Bindung von β-Cyclodextrinen an das Maltose-Bindeprotein von E. coli. Ein Transport dieser Substanz findet nicht statt (HALL ET AL., 1997a; 1997b; 1997c), da sie nicht in der Lage ist, die geschlossene Konformation des MBP zu induzieren. Dabei entspricht die Bindungsaffinität derjenigen für Maltose und Maltotriose (THOMSON ET AL., 1998). Für den Maltosetransport in Zellen von Alicyclobacillus acidocaldarius konnte ebenfalls eine Hemmung durch Acarbose belegt werden. Dabei kompetitiert Acarbose mit Maltose um die Bindung an das Maltose-Bindeprotein MalE (HÜLSMANN ET AL., 2000). Ein tatsächlicher Import von Acarbose wurde hier nicht untersucht.

7.2 Charakterisierung des Maltose/Maltotriose-Transports bei Actinoplanes sp.

↓115

Während der Suche nach effizienten Acarbose-Produktionsstämmen, abgeleitet von Actinoplanes sp. SE50, zeigte sich, dass der Maltose- und Maltodextringehalt des Kulturmediums die Produktivität determiniert (FROMMER ET AL., 1975; FROMMER ET AL., 1977a; 1977b; RAUENBUSCH & SCHMIDT, 1987). Die kommerzielle Acarbose-Fermentation (Bayer AG, Wuppertal) benötigt hoch konzentriertes (10 % oder mehr) Stärkehydrolysat. Des weiteren gibt es Evidenzen für eine positive Beeinflussung durch Maltose und Maltodextrine aufgrund des Vorkommens einer Konsensus-Sequenz und einer möglichen MalT-Box in den Promotorbereichen einiger der Schlüsselgene der Acarbose-Biosynthese. Solche Sequenzen wurden auch in den regulatorischen Regionen von Genen des Stärke- bzw. MaltoseStoffwechsels verschiedener anderer Bakterien identifiziert, z. B. bei malP aus E. coli oder malE aus S. coelicolor (SCHWARTZ, 1987; VAN WEZEL ET AL., 1997b; STRATMANN, 1997;
s. auch Seite 21, Abschnitt 4.2.4).

Diese Befunde und das unter anderem darauf aufbauende Modell des Acarbose-Metabolismus fordern Aufnahmesysteme sowohl für Maltose und/oder Maltodextrine als auch für Acarbose und/oder die längerkettigen Homologe. Von STRATMANN (1997) wurde eine Beteiligung des im acb-Gencluster vertretenen ABC-Transporters AcbHFG diskutiert. Die Charakteristik des Maltose-, Maltotriose- und Acarbosetransports in Zellen von Actinoplanes sp. sollte einen weiteren Aspekt zum Verständnis des Acarbose-Metabolismus liefern (s. auch Seite 109, Abschnitt 7.3.3). Ein Modell der gefundenen Transportkapazitäten ist in Abschnitt 7.2.3 beschrieben.

7.2.1  Die Transportaktivitäten von Actinoplanes sp.

Zunächst wurde die generelle Fähigkeit der Zellen zum Maltose- und MaltotrioseTransport in Abhängigkeit von der zur Kultivierung angebotenen Kohlenstoff-Quelle überprüft (s. Abbildungen 6.6 und 6.9). Es zeigte sich überraschenderweise, dass die Transportraten in Zellen aus Anzuchten in Acarbose-Produktions-Medium oder anderen Maltose/Maltodextrin-haltigen Nährmedien relativ am niedrigsten waren. Höhere Raten erzielten die Zellen nach Wachstum in Saccharose und Trehalose. Die effizienteste Maltose- und Maltotriose-Transportaktivität wiesen Zellen aus Acarbose- und Glycerin-Kulturen auf. Die Translokation der Substrate über das ABC-Transportsystem AcbHFG kann ausgeschlossen werden, da zum Zeitpunkt der beschriebenen Messungen die extrazelluläre Komponente AcbH nicht zur Proteinausstattung von Actinoplanes sp. gehört (s. 6.7.1). Darüber hinaus ist für AcbH ein anderes Substratspektrum ermittelt worden (s. 6.5). Dafür konnte aus Kulturüberständen nach Anzucht der Zellen in Maltose/Maltodextrin-haltigen Medien ein potentielles Maltose/Maltodextrin-Bindeprotein isoliert werden (s. 6.3).

↓116

Für die Aufnahme von Maltose über einen Bindeprotein-abhängigen ABCTransportmechanismussprechen die kinetischen Parameter, die mit Km-Werten zwischen
3 µM und 33,3 µM im charakteristischen Konzentrationsbereich von ABC-Systemen liegen
(s. Tabelle 7.1). Unterstützend ist der Befund, dass in Experimenten zur Phosphorylierung von radioaktiver Maltose mit PEP in zellfreien Extrakten von Actinoplanes sp. keine Aktivität eines Maltose-PTS nachgewiesen werden konnte. Der erfolgreiche Nachweis einer Aktivität des Glukose-PTS (POSTMA ET AL., 1993) durch Phosphorylierung von Methyl-α-D-[U-14C]glukopyranosid in Zellextrakten von E. coli K12 wurde als Positivkontrolle herangezogen.

Tabelle 7.1: Kinetische Parameter verschiedener ABC-Transportsysteme für Maltose/Maltodextrine. Die angegebenen Parameter zeigen Zellen nach Anzuchten mit Maltose.1: Kinetische Parameter verschiedener ABC-Transportsysteme für Maltose/Maltodextrine. Die angegebenen Parameter zeigen Zellen nach Anzuchten mit Maltose.

Organismus

Kinetische Parameter des Maltosetransports

Referenz

Actinoplanes sp.

Km = 9,7 µM

Vmax = 3,5nmol/mg Protein x min

diese Arbeit

S. lividans

Km = 4,5 µM

Vmax = 0,8 nmol/mg Trockengewicht x min

SCHLÖSSER ET AL., 1997

S. reticuli

Km = 1,5 µM

Vmax = 1,3 nmol/mg Trockengewicht x min

SCHLÖSSER ET AL., 1997

A. acidocaldarius

Km = 1 µM

Vmax = 0,6 – 3,7 nmol/mg Protein x min

HÜLSMANN ET AL., 2000

E. coli

Km = 1 µM

Vmax = 20 nmol/109 Zellen x min

SZMELCMAN ET AL., 1976

Vmax = 3 nmol/ mg Protein x min*

* Berechnet auf der Basis von 109 Zellen = 150 µg Protein (MILLER, 1972; XAVIER ET AL., 1996)

Die Anzucht von Actinoplanes sp. mit Glukose führt nicht zur Ausbildung einer Transportkapazität für Maltose/Maltotriose. Der Einfluss der anderen verwendeten Kohlenstoffquellen beruht vermutlich auf einem Aktivierungsmechanismus. Möglicherweise wird ein Repressorprotein bei Anwesenheit der jeweiligen Induktoren ungleich effizient inaktiviert. Bei dem gramnegativen Bakterium Sinorhizobium meliloti wird die Synthese der redundanten, multiplen ABC-Transporter ThuEFGK und AglEFGK, die beide Maltose, Trehalose und Saccharose importieren, durch die einzelnen Substrate unterschiedlich stark induziert (JENSEN ET AL., 2002). Im Fall der Zellen aus Anzuchten mit Acarbose oder Glycerin ist eine induzierende Wirkung entweder dieser Substanzen oder aber von Folgeprodukten des Stoffwechsels denkbar. In die bisherigen Kenntnisse zum Habitus von Actinoplanes sp. ist die Bedeutung des für den Maltodextrin-Metabolismus als neutral zu beschreibenden Glycerins nicht integrierbar. Aus Fütterungsexperimenten mit [14C]-Glycerin ging hervor, dass diese Substanz in den Valienamin-Rest der Acarbose eingebaut wird (DEGWERT ET AL., 1987). Weiterhin gibt es lediglich den durch diese Arbeit erhaltenen Befund, dass Glycerin ebenso effektiv als Kohlenstoff- und Energiequelle wie Maltose, Maltodextrine, Trehalose und Saccharose genutzt werden kann. Bei A. acidocaldarius (HÜLSMANN ET AL., 2000) und E. coli fungiert Glycerin nicht als Induktor einer MaltoseTransportaktivität. Bei der Bewertung der Transportdaten muss auch berücksichtigt werden, dass innerhalb des Zeitraumes der Transportmessungen ein unbekannter, aber wahrscheinlich durchaus beträchtlicher Anteil der intrazellulär angereicherten Maltose bzw. Maltotriose verstoffwechselt wird. Die Radioaktivität geht dann durch Eintritt in die Atmosphäre in Form von [14C]-CO2 der Quantifizierung verloren. Verfolgt man diese Anmerkung, so lässt sich festhalten, dass die Verluste an Radioaktivität in Zellen aus Maltose/Maltodextrin-gefütterten Kulturen sowie aus TSB-Vollmedium (enthält Maltose) am größten sind. Daran muss eine Enzymausstattung beteiligt sein, die bei Zellen aus Kultivierungen mit Acarbose oder Glycerin möglicherweise nicht vorhanden ist. Ein radioaktives, nicht verstoffwechselbares Maltose-Analogon zur Überprüfung dieses Sachverhaltes steht nicht zur Verfügung.

↓117

Sobald genetische Manipulationen von Actinoplanes sp. realisierbar sind, könnten hier auch Transportexperimente mit Knock-out-Mutanten, z. B. im Gen der Maltase, aufschlussreich sein. Die Maltase von Actinoplanes sp. ist ein durch Acarbose hemmbares Enzym (DREPPER, 1997). Hierin ist möglicherweise auch eine Ursache für die hohen Mengen der intrazellulär nachgewiesenen [U-14C]-Maltose, zumindest im Fall der mit Acarbose kultivierten Zellen, zu sehen. Es liegen bisher keine Informationen darüber vor, ob unter diesen Wachstumsbedingungen die Acarbose-Kinase aktiv ist und die Hemmwirkung der Acarbose durch Phosphorylierung abschwächt (s. auch Seite 11 und Abbildung 4.2). Ein Hinweis auf fehlende Kinase-Aktivität könnte sein, dass das Wachstum von Actinoplanes sp. mit Acarbose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle nach ca. 24 Stunden zum Erliegen kommt und, ähnlich den Befunden für E. coli (s. Abbildung 6.4 und Abschnitt 7.1.1), aufgrund toxischer Effekte sogar zur Zelllyse führt.

Alternativ kann auch folgendes Szenario zum Maltose/Maltotriose-Transport von Actinoplanes sp. entworfen werden: Ein System erlaubt Transportaktivität bei Anzucht der Zellen mit Acarbose (und unter Vorbehalt mit Glycerin). Ein zweites System wird transkriptionell unterschiedlich effizient durch Saccharose, Trehalose, Maltose und Maltodextrine aktiviert. Hinweise darauf, dass zur Ausstattung von Actinoplanes sp. mindestens zwei verschiedene ABC-Transportsysteme gehören, die darüber hinaus ein multiples Substratspektrum aufweisen könnten, geben die ermittelten spezifischen Eigenschaften der Transportaktivität für Maltose/Maltotriose. Der Maltosetransport von Zellen aus Kultivierungen mit Acarbose, MD50, Maltose oder Maltodextrinen wird durch Trehalose, Saccharose und Maltodextrine und z. T. auch Acarbose inhibiert. Eine Auswahl der Befunde wurde ebenfalls für den Maltotriosetransport beobachtet (s. Abbildungen 6.7 und 6.10). Relevant für die Differenzierung von zwei Transportsystemen sind drei Auffälligkeiten der jeweiligen Hemmmuster. Sowohl der Maltose- als auch der Maltotriosetransport von Zellen aus Anzuchten mit Maltose oder Maltodextrinen werden durch Acarbose zu ca. 40 % inhibiert, hingegen findet man keine Einschränkungen beider Transportaktivitäten bei Zellen, die mit diesem Pseudotetrasaccharid kultiviert wurden. Damit lässt sich die in Acarbose-Zellen (und in Glycerin-Zellen) erfasste Transportaktivität von der in Maltose/MaltodextrinZellen vorhandenen Aktivität abgrenzen. Eine zweite, unterstützende Besonderheit beruht auf einem unterschiedlichen Ausmaß der Hemmung. Das bei Acarbose-Zellen involvierte System zeigt bei Anwesenheit von Trehalose und Saccharose nur noch halb so viel Restaktivität der Maltoseaufnahme (13 %) wie dasjenige von Zellen aus MD50-Kulturen (ca. 25 %). Wesentlich für eine Diskriminierung der jeweiligen Spezifitäten sind drittens auch die ungleichen Restaktivitäten nach Ausverdünnung des radioaktiven Substrats durch die homologe Zuckerstruktur: Mit Ausnahme der Aktivitäten von Acarbose-Zellen (Hemmung zu 80 %) wird der Maltotriosetransport von restlichen überprüften Kulturen durch Maltose nur zu ca. 50 % inhibiert. Der Maltosetransport wiederum ist bei Acarbose-Zellen durch Maltodextrine weniger gehemmt (Restakkumulation ca. 30 %) als die durch Ausverdünnung durch kalte Maltose erreichte Menge messbarer akkumulierter radioaktiver Maltose. So scheint es nicht abwegig, aus den Ergebnissen der Hemmstudien neben dem Vorhandensein zweier Maltose/Maltodextrin-Transportsysteme außerdem abzuleiten, dass das System in Acarbose-Zellen eher Maltose als Maltodextrine bevorzugt, während der zweite Transporter gegenteilige Präferenz zeigt. Das Maltose/Maltodextrinsystem von S. lividans weist solche Präferenzen nicht auf (SCHLÖSSER ET AL., 2001). Die beiden multiplen ABC-Transporter ThuEFGK und AglEFGK aus S. meliloti favorisieren Trehalose und Saccharose (JENSEN ET AL., 2002). Wie auch bei Actinoplanes sp. für den Maltoseimport beobachtet, haben Glukose und Laktose ebenfalls einen negativen Effekt auf den Trehalose- und Saccharose-Import. Die Autoren sprechen aber nicht von einer Hemmung und beziehen diese Zucker nicht in das Substratspektrum mit ein. Der durch die vorliegende Arbeit gefundene Sachverhalt, dass Zellen von Actinoplanes sp. aus Trehalose- und Saccharose-Kulturen höhere MaltoseTransportraten aufweisen als Zellen aus Maltose- oder Maltodextrin-Kulturen (s. Abbildung 6.6), gleicht den Befunden zu S. meliloti. Damit wird die Annahme untermauert, dass Actinoplanes sp. ebenfalls über zwei Transportsysteme mit multiplem Substratspektrum verfügt. Diese postulierten Systeme zeigen eine überlappende Spezifität, unterscheiden sich aber in ihrer Sensitivität gegenüber Acarbose. Ein bekannter ABC-Transporter mit multipler Funktion von grampositiven Bakterien ist das Msm-System (multiple sugar metabolism, Import von Melibiose, Raffinose und Isomaltotriose) von Streptococcus mutans (RUSSELL ET AL., 1992). Auch für S. coelicolor und S. lividanswerden redundante, multiple Transportsysteme für β-Xyloside und α-Glukoside vorausgesagt (BERTRAM ET AL., 2004). Die Autoren sprechen dem agl1EFG-Cluster von S. coelicolor die Kodierung einer Permease mit breitem Spektrum für Trehalose, Saccharose, Maltose und zusätzlich Trisacchariden zu.

Die Gene eines der postulierten, multiplen Transportsysteme könnten durch die Substrate Saccharose, Trehalose, Maltose und Maltodextrine unterschiedlich effizient induziert werden. Regulationsmechanismen, basierend auf der Inaktivierung eines Repressorproteins kataboler Operone, gibt es bei dem Msm-System von S. mutans (RUSSELL ET AL., 1992) und den Maltose/Maltodextrin-Transportern von S. pneumoniae (PUYET ET AL., 1993; NIETO ET AL., 2001), S. coelicolor (VAN WEZEL ET AL., 1997a) oder auch S. lividans (SCHLÖSSER ET AL., 2001).

↓118

Betrachtet man die Maltose- und Maltotriose-Transportaktivität in Abhängigkeit von der zur Kultivierung der Zellen angebotenen Substratkonzentration (s. Abbildungen 6.6 und 6.9), erscheint ein alternativer Regulationsmechanismus vorstellbar. Im Vergleich zu Wachstum mit 0,5 % MD50 erreichten Zellen nach Anzucht mit 7 % MD50 lediglich Transportraten von 50 % ([14C]-Maltose) bzw. 30 % ([14C]-Maltotriose). Eine Regulation, basierend auf Repression durch Substrat, findet man bei Thermotoga maritima. Die Maltose-Bindeaktivität von Periplasmaextrakten ist bei Anzucht der Zellen in Maltose schwächer als die GlukoseBindeaktivität, während umgekehrt bei Anzucht in Glukose die Maltose-Bindeaktivität höher ist als die Glukose-Bindeaktivität (NANAVATI ET AL., 2002). Bei T. maritima existieren interessanterweise zwei ORFs, annotiert als Maltose-Bindeproteine (NELSON ET AL., 1999; 2001), für die durch WASSENBERG ET AL. (2000) und NANAVATI ET AL. (2002) eine MaltoseBindeaktivität nachgewiesen wurde. Bei E. coli wird das Bindeprotein-abhängige Glukosetransportsystem Mgl bei mikromolaren Glukosekonzentrationen aktiviert, bei millimolaren Konzentrationen aber wieder reprimiert(DEATH & FERENCI,1993). Bei
A. acidocaldarius(HÜLSMANNET AL., 2000) befindet sich im Operon für die Aufnahme und Verwertung von Maltodextrinen das Gen malR, welches für ein Repressorprotein der LacIGalR-Familie kodiert. Die Repressorfunktion von MalR wird durch die Induktoren des Systems Maltose und Maltotriose inaktiviert (ZIELINSKI, 2003). Da das malR-Gen über keine eigene Promotorstruktur verfügt, wird dessen Expression möglicherweise wie die der übrigen Gene induziert. Vielleicht gibt es bei Actinoplanes sp. innerhalb eines noch zu identifizierenden mal-Operons (s. auch 6.3 und 7.2.2) ein Repressorgen, dessen Expression ebenfalls durch Maltose und/oder Maltodextrine induziert wird und bei hohem Substratangebot schließlich für eine Abschaltung des Systems sorgt. Diese Art der Regulation hoch affiner Transportsysteme ist ökonomisch sinnvoll. Die von Actinoplanes sp. im Falle der Anzucht mit 7 % MD50 erreichten Transportraten von ca. 1 nmol/mg Protein x min sind für das beobachtete Wachstum offenbar ausreichend, die Energie für eine aufwendige Produktion überschüssiger Translokationssysteme bleibt konserviert. Hiervon abgeleitet könnten die hohen Transportraten der Acarbose- und Glycerin-Zellen auch auf geringen Mengen intrazellulär formierter Maltose beruhen, die insgesamt nicht ausreichen, das Gen eines potentiellen Repressors zu induzieren.

Die Analyse des TSB-Vollmediums durch Dünnschicht-Chromatographie zur Überprüfung eines etwaigen Vorkommens von Zuckern in dieser Substanz enthüllte Glukose und Maltose als Bestandteile. Das Auftreten einer Maltose-Transportaktivität bei Actinoplanes sp. nach Anzucht in TSB lässt vermuten, dass Mechanismen einer Glukoserepression nicht nach dem Prinzip des Induktorausschlusses wie bei Enterobakterien wie z. B. E. coli (BOOS & SHUMAN, 1998) oder einer CcpA vermittelten Repression kataboler Operone wie bei grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt wie z. B. B. subtilis (SCHÖNERT ET AL., 1998; REIZER ET AL., 1998) funktionieren (Übersicht STÜLKE & HILLEN, 1999; TITGEMEYER & HILLEN, 2002; s. auch 4.2.4). Vielmehr gleicht der Befund, dass Maltosetransport in Actinoplanes sp.auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von Maltose und Glukose während des Wachstums stattfindet, den Ergebnissen von Transportstudien, die mit A. acidocaldarius(HÜLSMANN ET AL, 2000) oder S. lividans(SCHLÖSSER ET AL., 2001) erzielt wurden. Obwohl die Synthese von CebE, des Cellobiose-Bindeproteins aus S. reticuli, insgesamt anders reguliert wird als die der dem Transport-System assistierenden ABC-Komponente MsiK, können beide Proteine bei KoKultivierung der Zellen in Cellobiose und Glukose nachgewiesen werden (SCHLÖSSER ET AL., 1999). Bei der Glukose-Katabolitrepression in gramnegativen wie in grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt spielen Proteine des Phosphotransferase-Systems (PTS) nach einem jeweils eigenen Mechanismus eine zentrale Rolle. Als weiteres regulatorisches Element findet man bei grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt cre-Boxen vor oder auch innerhalb der Gene kataboler Enzyme (TITGEMEYER & HILLEN, 2002). Solche Elemente wurden für das analysierte Gencluster der Acarbose-Biosynthese nicht beschrieben (STRATMANN, 1997). In der Tat ist auch die Synthese der extrazellulären Enzyme AcbD und AcbE von Actinoplanes sp. nach Anzucht in Vollmedium TSB oder auch in Acarbose-Produktions-Medium mit Glukosezusatz nachweisbar. Gleiches gilt für die in dieser Arbeit dokumentierte Synthese des Proteins AcbH durch Zellen während der Kultivierung in TSBVollmedium (s. 6.7.1). Bei Actinomyceten ist bisher kein Glukose-spezifisches PTS gefunden worden, dem HPr-Protein des Fruktose-PTS von S. lividans wird keine Funktion innerhalb einer Katabolitrepression zugesprochen (NOTHAFT ET AL., 2003). Während die Synthese der α-Amylase in S. venezuelae durch Glukose reprimiert wird (VIROLLE ET AL., 1988), agiert bei S. limosus und S. thermoviolaceus Mannitol als Effektor (VIROLLE & BIBB, 1988; BAHRI & WARD, 1990). Durch weitere Transportexperimente mit Zellen aus Kultivierungen mit z. B. Mannitol, Mannose oder Fruktose etc. könnte eine reprimierende Kohlenstoffquelle identifiziert werden.

7.2.2 Charakterisierung eines potentiellen Maltose-Bindeproteins

Der für Actinoplanes sp. nachgewiesene und charakterisierte Maltose- und Maltotrioseimport impliziert die Beteiligung zweier Bindeprotein-abhängiger ABC-Transporter. Anhand der Befunde zur Substratspezifität und zum Syntheseprofil des Bindeproteins AcbH (s. 6.5 und 6.7.1) kann eine Beteiligung des im Acarbose-Biosynthese-Gencluster vertretenen ABCSystems AcbHFG ausgeschlossen werden. Mit Hilfe von Gensonden der MaltoseBindeproteine aus S. lividans und A. acidocaldarius wurde in DNA-DNAHybridisierungsexperimenten versucht, ein homologes Gen im Chromosom von Actinoplanes sp. zu finden. Vor allem aufgrund eines ähnlich hohen GC-Gehaltes der DNA von S. lividans und Actinoplanes sp. (69 % - 70 %) sowie einer aus den Leserahmen des acb-Genclusters ermittelten, für Streptomyceten typischen Kodon-Verwendung durch Actinoplanes sp. (STRATMANN, 1997), schien dieses Verfahren vielversprechend. Dennoch konnte unter verschiedenen Bedingungen mit keiner der verwendeten Sonden ein Hybridisierungssignal detektiert werden. Im Gegensatz dazu wurde mit einer Sonde des msiK-Gens aus S. lividans das Gen für ein ABC-Protein in Actinoplanes sp. und A. acidocaldarius identifiziert (s. Abschnitt 6.6.1, SCHÄFER, 1999; SCHEFFEL ET AL., 2004). Dabei waren vermutlich die hohen Sequenzähnlichkeiten zwischen ABC-Proteinen der CUT1-Familie (SAIER, 2000; SCHNEIDER, 2001) von Vorteil. Der Verwandtschaftsgrad von Actinoplanes und Streptomyces ist offensichtlich für die Identifizierung eines Substrat-Bindeproteins nicht ausreichend, zumal Bindeproteine neben der varianten Signatursequenz (vgl. Seite 20, Abbildung 4.5) keine weiteren charakteristischen Konsensussequenzen aufweisen. Das von STRATMANN (1997) gefundene Gen der dTDP-Glukose-4,6-Dehydratase (acbB) wurde unter Einsatz einer Sonde des verwandten Gens strE aus dem Streptomycin-Biosynthese-Gencluster von S. griseus detektiert. Hier reichte eine Identität von 66,3 % aus, während mit dem Gen der dTDPGlukose-Synthase strD das später anderweitig gefundene homologe Gen acbA in Hybridisierungsexperimenten nicht erfasst wurde (Identität 59 %).

↓119

Wie bei grampositiven Bakterien üblich, sind Substrat-Bindeproteine über einen N-terminalen Lipidanker in der Membran fixiert (s. 4.2.3.2). In einem alternativen Ansatz wurde daher versucht, ein Maltose-Bindeprotein nach Solubilisierung von Membranen aus Zellen nach der Anzucht mit Maltose und Maltodextrinen über Amylose-Affinitätschromatographie zu isolieren. Jedoch auch dieses Verfahren verlief ohne Erfolg.

Für Actinoplanes sp. hat sich im weiteren Verlauf dieser Arbeit der Befund ergeben, dass ein potentielles Maltose-Bindeprotein im Überstand von Zellkulturen vorhanden ist. Auch MsmE, das Bindeprotein für multiple Zucker aus S. mutans, ist frei im Kulturüberstand nachzuweisen (SUTCLIFFE ET AL., 1993). Auf einen ähnlichen Sachverhalt stößt man bei A. acidocaldarius (HÜLSMANN, 2000). Der größte Teil des MalE-Proteins konnte hier aus dem Kulturüberstand gewonnen werden. Dabei ist dieses Bindeprotein inklusive des Lipidankers N-terminal um 23 Aminosäuren verkürzt, vermutlich durch die Aktivität einer extrazellulären Protease. Eine Einschränkung der biochemischen Eigenschaften in vitro ist nicht beobachtet worden. Das identifizierte Protein von Actinoplanes sp. könnte ebenfalls nach Proteolyse aus der Membranfixierung entlassen werden, wobei die Aktivität offensichtlich erhalten bleibt. Ein experimenteller Beleg dafür ist das Bindungsvermögen an eine Amylose-Matrix und die spezifische Elution des Proteins durch Maltose und Maltodextrine (s. 6.3.1). Demgegenüber konnte mit Acarbose keine Ablösung des Proteins erreicht werden.

Zusammenfassend unterstützen diese Resultate die aus den Maltose-Transportmessungen abgeleiteten Annahmen, dass es sich bei den Maltosetransportern um Bindeprotein-abhängige ABC-Systeme handelt, von denen das eine insensitiv gegenüber Acarbose ist. Das aus dem Kulturüberstand isolierte potentielle Maltose-Bindeprotein könnte die dazugehörige extrazelluläre Komponente sein. Abschließend ist jedoch kein Beweis erbracht, dass es sich bei dem diskutierten Protein tatsächlich um das Maltose/Maltodextrin-Bindeprotein eines ABCTransporters handelt. Es könnte gleichermaßen eine α-Amylase mit Affinität zur AmyloseMatrix sein. In der Regel aber haben solche Enzyme eine größere molare Masse, z. B. AcbE (107 kDa) von Actinoplanes sp. (STRATMANN, 1997). Mit 51,3 kDa ist das isolierte Protein allerdings auch größer als die Mehrzahl der bekannten Bindeproteine (40 – 43 kDa). Mit den nach einer MALDI-TOF MS-Analyse erhaltenen Sequenzinformation der analysierten Peptide (s. Anhang ) konnte in Datenbanken keine Übereinstimmung zu bekannten Proteinen gefunden werden. Ein Abgleich mit den Sequenzdaten der Genprodukte des acb-Genclusters erbrachte ebenfalls keinerlei Übereinstimmung (pers. Mitteilung
U. Wehmeier).

↓120

Weitere Erkenntnisse zu diesem Sachverhalt können nur auf Basis von Arbeiten mit geeigneten Mutanten oder rekonstituierten Transportsystemen gewonnen werden. Eine bisher nicht realisierbare Strategie wäre die Deletion des Gens für das aus dem Kulturüberstand isolierte Maltose-Bindeprotein. Voraussetzung für eine Rekonstitution ist die Klonierung der beteiligten Gene. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit einer degenerierten DIG-markierten DNA-Sonde, abgeleitet aus der Sequenz eines der Peptide, zumindest ein Hybridisierungssignal detektiert werden (s. 6.3.2). Leider ist es bislang nicht gelungen, das entsprechende chromosomale Fragment zu klonieren. Es ist anzunehmen, dass toxische Genprodukte des rekombinierten Fragments wie z. B. die Membranproteine des erfassten Transportsystems oder ein Regulatorprotein den Wirtsstamm der Vektorkonstrukte (E. coli) schädigen. Eine Lösung dieses Problems könnte die allerdings verhältnismäßig aufwendige Nutzung von S. lividans als Empfängerstamm der Vektorkonstrukte sein. Ähnliche Schwierigkeiten treten bei der Klonierung des Gens für ein potentielles Regulatorprotein des acb-Genclusters auf (pers. Mitteilung U. Wehmeier). Regulatorische Gene sind oft in der Nähe von Operons lokalisiert, die für die Komponenten von Transportkomplexen kodieren, so z. B. bei den Maltose-Transportsystemen von S. coelicolor, S. lividans und Streptococcus pneumoniae (VAN WEZEL ET AL., 1997a; SCHLÖSSER ET AL., 2001; NIETO ET AL., 2001). Im Fall von A. acidocaldarius ist das Gen für einen möglichen Transkriptionsregulator innerhalb der Operonstruktur lokalisiert (HÜLSMANN ET AL., 2000).

7.2.3 Modell der Kapazitäten für die Aufnahme von Maltose und Maltotriose durch
Actinoplanes sp.

Die Aufnahme von Maltose und Maltotriose wird wahrscheinlich über zwei Bindeproteinabhängige ABC-Importsysteme realisiert, die in Abhängigkeit von der zum Wachstum angebotenen Kohlenstoffquelle exprimiert sind (Abbildung 7.2). Das System von mit Acarbose (und vermutlich Glycerin) kultivierten Zellen ist Acarbose-insensitiv. Das aus dem Kulturüberstand isolierte potentielle Maltose/Maltodextrin-Bindeprotein könnte die dazu gehörige extrazelluläre Komponente sein. Die Transportaktivität des zweiten Systems ist durch die Kohlenstoffquellen Saccharose, Trehalose, Maltose und Maltodextrine induzierbar und Acarbose-sensitiv. Beide Systeme verfügen möglicherweise über ein multiples Substratspektrum für Saccharose, Trehalose und Maltooligosaccharide.

Wie bei E. coli (BRUNKHORST, 1998; s. auch 6.1) und A. acidocaldarius(HÜLSMANN ET AL., 2000) findet man beiActinoplanes sp. nach Anzucht mit Maltose oder MD50 eine Hemmung des Maltose- und Maltotriosetransports durch Acarbose. Für solche Zellen konnte nur eine geringe Menge intrazellulär akkumulierter, radioaktiver Acarbose nachgewiesen werden (0,1 nmol/mg Protein x min). Ob die Acarbose tatsächlich, wie im Falle von E. coli, über dasselbe Transportsystem aufgenommen wird, bleibt unklar. Ebenso ist noch nicht bewiesen, dass Trehalose und Saccharose zusammen mit Maltose und Maltotriose über dasselbe System importiert werden. Trehalose z. B. induziert auch das Mal-System von E. coli, ohne durch dieses transportiert zu werden (KLEIN & BOOS, 1993). Das Substrat-Bindeprotein stellt die primäre Erkennungsstelle bakterieller Importsysteme dar und bestimmt dadurch die Spezifität. Substanzen, die mit dem natürlichen Substrat um die Bindestelle konkurrieren, werden nicht zwangsläufig auch transportiert. So wurde z. B. die Bindung von β-Cyclodextrinen und längerkettigen Maltodextrinen (> Heptaosen) an das Maltose-Bindeprotein von E. coli gezeigt, ein Transport dieser Substanzen findet jedoch nicht statt (HALL ET AL., 1997a; 1997b; 1997c; BOOS & SHUMAN, 1998).

↓121

Ausgeschlossen jedoch ist, dass das in Acarbose-Zellen aktive Maltosetransportsystem als Vehikel für den Import von Acarbose, der deutlich nur bei solchen Zellen nachgewiesen werden konnte (1,2 nmol/mg Protein x min), fungiert. Die Insensitivität des Systems gegenüber Acarbose deutet an, dass das Pseudotetrasaccharid über einen weiteren, bisher unbekannten Transporter aufgenommen wird. Möglicherweise dient dieser Komplex einem unspezifischen Eintritt ins Zellinnere, welcher Actinoplanes sp. langsames Wachstum mit dem Sekundärmetaboliten (s. Seite 50, Abbildung 6.4) vor Beginn der Synthese des AcbHFGTransporters erlaubt.

Abbildung 7.2: Mögliche Ausstattung von Actinoplanes sp. mit ABC-Transportern für Maltose und Maltodextrine. Das Transportsystem in mit Acarbose kultivierten Zellen präferiert Maltose gegenüber Maltodextrinen. Das andere System zeigt gegenteilige Präferenz. MBP: Maltose-Bindeprotein, das mit * gekennzeichnete MBP könnte das aus dem Kulturüberstand isolierte sein. MP: Membranprotein, ABC-P: ABCProtein.2: Mögliche Ausstattung von Actinoplanes sp. mit ABC-Transportern für Maltose und Maltodextrine. Das Transportsystem in mit Acarbose kultivierten Zellen präferiert Maltose gegenüber Maltodextrinen. Das andere System zeigt gegenteilige Präferenz. MBP: Maltose-Bindeprotein, das mit * gekennzeichnete MBP könnte das aus dem Kulturüberstand isolierte sein. MP: Membranprotein, ABC-P: ABCProtein.

7.3 Charakterisierung des potentiellen Acarbose-ABC-Transporters
AcbHFG-MsiK2

Zur Aufklärung der Substratspezifität der Genprodukte eines Operons (acbHFG) aus dem acb-Gencluster, das vermutlich die Komponenten eines Bindeprotein-abhängigen ABCImporters kodiert, wurden die Gene heterolog in E. coli und S. lividans exprimiert und die synthetisierten Proteine z. T. gereinigt (s. 6.4.3 und 6.6.2). So sollten Grundlagen für eine Rekonstitution des isolierten Transportkomplexes in Liposomen geschaffen werden. Da im acb-Gencluster kein Gen für ein den Transportkomplex komplettierendes ABC-Protein vorhanden ist, wurde das Produkt des msiK-Gens als potentiell zugehörige ATPase angeboten (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002). Für ABC-Proteine grampositiver Bakterien ist bekannt, dass sie mehreren Transportkomplexen assistieren können (SCHLÖSSER ET AL., 1997; SCHLÖSSER, 1999; SCHEFFEL ET AL., 2004) und das zugehörige Gen einer getrennten Lokalisation auf dem Chromosom und Regulation unterliegt (HORLACHER ET AL., 1998; GRELLER ET AL., 1999; HÜLSMANN ET AL., 2000). Außerdem war es ein besonderes Ziel, das Substratspektrum von AcbH aufzuklären (s. 6.5) sowie immunologisch das Induktionsprofil von AcbH in Actinoplanes sp. zu bestimmen (s. 6.7.1).

7.3.1  Der potentielle Transportkomplex AcbFG-MsiK2

↓122

Die Überexpression der Gene der Membranproteine AcbFG führte zunächst zu einer Wachstumsbeeinträchtigung des Expressionsstammes E. coli JM109. Durch Ko-Synthese mit dem von SCHÄFER (1999) identifizierten ABC-Protein MsiK jedoch konnten die nachteiligen Wachstumseffekte z. T kompensiert werden. Dadurch war es möglich, im Rahmen der Reinigung der Membranproteine höhere Ausbeuten zu erzielen (ELVERS, 2002). Darüber hinaus wurde in Ko-Elutionsstudien ein weiterer Hinweis auf eine Komplexbildung der Membranproteine AcbFG mit dem ATP-Bindeprotein MsiK, zumindest in E. coli, erhalten
(s. 6.6.2).

Mit einem gegen MsiK gewonnenen Antiserum konnten für ein erstmalig identifiziertes ABC-Protein aus Actinoplanes sp. immunologische Analysen mit Zellfraktionen unter-nommen werden. Es sollte gelingen, einen Hinweis auf die Ausbildung eines AcbFG-MsiK2-Komplexes im Acarboseproduzenten zu finden und einen Kontext mit dem AcarboseMetabolismus herzustellen (s. auch 6.7.2). Die für das ABC-Protein MsiK ermittelten konstitutiven Synthesebedingungen durch ELVERS (2002) geben jedoch keinen weiteren Hinweis auf eine den Membrankomplex AcbFG komplettierende Funktion in vivo. Im Gegensatz zum Induktionsprofil des acbH-Gens (vgl. 6.7.1) konnte unter den getesteten Wachstumsbedingungen weder eine repressive noch eine induzierende Substanz für das msiKGen gefunden werden. Das MsiK-Protein aus S. reticuli assistiert im Maltose- Cellobiose- und wahrscheinlich Trehalose-Transport. Bei einer basalen Genexpression während des Wachstums in Minimalmedium mit Glukose führt die Zugabe der zuvor erwähnten Disaccharide zur Induktion der Proteinsynthese. Das homologe Protein von S. lividans, mit dessen Gen das ABC-Protein in Actinoplanes sp. identifiziert wurde, ist nicht am TrehaloseImport beteiligt, erfährt dementsprechend nur Induktion durch Maltose und Cellobiose (SCHLÖSSER ET AL., 1999; SCHLÖSSER, 1999). Da Zellen von Actinoplanes sp. das MsiKProtein über einen Zeitraum von 72 Stunden, zumindest bei Kultivierung mit 0,5 % Acarbose oder MD50, synthetisieren (eigene Beobachtung), ist eine Zusammengehörigkeit von MsiK zu AcbHFG aber auch nicht auszuschließen. Ob das betrachtete Protein tatsächlich physiologisch relevant ist, kann nur durch eine Deletionsmutante geklärt werden.

Für zukünftige Arbeiten sollte ein Expressionssystem entwickelt werden, das eine der Stöchiometrie des Komplexes AcbFG-MsiK2 entsprechende Syntheserate der Einzelkomponenten ermöglicht. Sowohl für solch ein System als auch für die Expression von acbH könnten bei Verwendung der zugehörigen Promotorstrukturen auch Expressionsstudien in
S. lividans sinnvoll sein. Dabei jedoch muss darauf spekuliert werden, dass die Promotoren von Actinoplanes sp. durch die Regulations- und Transkriptionsmaschinerie in S. lividanserkannt werden. Im Fall der α-Amylase AcbE, nicht jedoch bei AcbD und AcbC, erwies sich diese Strategie als erfolgreich (STRATMANN, 1997). Als induzierende Effektoren könnten Maltose, Maltodextrine oder Acarbose eingesetzt werden (s. 6.7.1). WEHMEIER ET AL. (pers. Mitteilung) ist es mittlerweile gelungen, durch Expression eines das gesamte acb-Gencluster enthaltenen Cosmids die heterologe Acarbose-Produktion in S. lividans zu erzielen.

7.3.2 Das Substrat-Bindeprotein AcbH

↓123

Von insgesamt neun Plasmidkonstrukten zur Expression von acbH in E. coli mit dem Ziel einer Lokalisation des Genproduktes im Cytosol, führten sechs zu einer beträchtlichen Synthese von Proteinen mit verschiedenen Histidin-Tag-Fusionen, die jedoch alle als unlösliche Aggregate vorlagen. Ein ähnliches Resultat wurde für die Proteine AcbD, AcbE und AcbC erhalten (STRATMANN, 1997). Im Hinblick auf die Sequenzproblematik (s. 6.4.1) und die Substratbindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz (s. 6.5) war letztendlich nur das (His)10-AcbH-Fusionsprotein (Plasmid pCB10) zur weiteren Verwendung geeignet. Eine heterologe Überproduktion von Lipoproteinen führt in vielen Fällen zu Problemen für das Zellwachstum des Wirtsstammes (MARTIN ET AL., 1989; SUTCLIFFE ET AL., 1993; SCHNEIDER & HANTKE, 1993). Sämtlichen Klonen fehlt daher der für das Signalpeptid kodierende Sequenzabschnitt. Darüber hinaus wurde ein lethaler Effekt für die Expressionsstämme durch eine mögliche Lipidmodifikation am Cystein-1 des reifen Proteins durch Austausch dieser Aminosäure gegen Alanin oder Methionin vermieden.

Ein alternativer Ansatz, in dem es gelingen sollte, durch ein dem Protein vorgeschaltetes PelB-Signalpeptid aus E. coli eine Translokation des Proteins mit C-terminaler HistidinFusion in das Periplasma zu erreichen, schlug gänzlich fehl. In den dazu verwendeten Stämmen C41 und C43 konnte keine Proteinsynthese nachgewiesen werden. Es gibt Hinweise darauf, dass für eine erfolgreiche Translokation und Prozessierung neben dem Signalpeptid auch die Sequenz des reifen Proteins von Bedeutung ist (SIMONEN & PALVA, 1993; FEKKES & DRIESSEN, 1999). Möglicherweise wurde das mit dem PelB-Signalpeptid synthetisierte AcbH-Fusionsprotein vom Sec-System des Wirtsstammes (ECONOMOU, 1999) nicht erkannt und unterlag einer vollständigen proteolytischen Degradation. Durch Substitution der Signalsequenzen der Maltose- und Trehalose- bzw. Maltose-Bindeproteine von T. litoralis bzw. A. acidocaldarius durch die entsprechende Sequenz des MalE von E. coli wurde ebenfalls keine korrekte Prozessierung erreicht (HORLACHER ET AL., 1998; HÜLSMANN ET AL., 2000).

Im Gegensatz zur Verwendung von E. coli als Wirtsstamm konnte mit S. lividans TK23 lösliches Protein erhalten werden (s. 6.4.2). Hierbei erwies sich jedoch die Ausbeute als zu gering für weitere Untersuchungen. Deshalb wurde das Protein schließlich in denaturierter Form gereinigt und anschließend renaturiert. Die Vorteile unlöslicher Proteinaggregate liegen darin, dass die Proteine bereits angereichert vorliegen und oft nach geeigneten Zentrifugationen kaum noch mit anderen Proteinen verunreinigt sind. Überdies sind die Proteine, fixiert in den unlöslichen Aggregaten, meist geschützt vor proteolytischem Abbau (DE BERNARDEZ CLARK, 2001).

↓124

So wurde ein Protokoll zur Reinigung von AcbH unter denaturierenden Bedingungen und zur anschließenden Renaturierung entwickelt (s. 6.4.3) und der Erfolg mittels CD-Spektroskopie überprüft. Mit Elliptizitätsminima bei 222 nm und 207 nm ist deutlich eine α-helikale Konformation und damit die Voraussetzung für eine Aktivität des (His)10-AcbHFusionsproteins nachgewiesen (s. Seite 75, Abbildung 6.17). Diese Aktivität spiegelt sich in den Sensorgrammen in Abschnitt 6.5 wider. Insgesamt konnten trotz der Unterschiede im GC-Gehalt der DNA sowie bei der Kodon-Verwendung und der geringen Verwandtschaftsnähe in E. coli die besseren Ausbeuten an gereinigtem AcbH-Protein erzielt werden.

Hinweise auf mögliche Substrate von AcbHFG ergaben sich zu Beginn der vorliegenden Arbeit lediglich aus der Hypothese eines intra- und extrazellulären Acarbose-Kreislaufs
(s. Abschnitt 4.1). Die Befunde einiger in dieser Arbeit beschriebener Experimente wie die verbesserte Renaturierung von AcbH in Gegenwart von Acarbose (s. Seite 76, Abbildung 6.18) oder die Feststellung, dass das Protein nicht über eine Bindekapazität für Amylose verfügt (s. Seite 72, Abbildung 6.14), gaben weitere Anhaltspunkte. Mittels OberflächenPlasmonresonanz konnten für Acarbose und die längerkettigen Nebenkomponenten, nicht jedoch für Maltose, Maltodextrine und Saccharose Assoziation an (His)10-AcbH beobachtet werden (s. Abschnitt 6.5). Insgesamt wurde für Acarbose die stärkste Assoziation (höchste RU-Differenz), gefolgt von den längerkettigen Nebenkomponenten 5C und 6AB, festgestellt. Hingegen gab es nur eine sehr schwache Interaktion mit dem Komponentengemisch 4ABC. Die Ursachen hierfür bleiben unbekannt. Obwohl die gesättigte Belegung mit Acarbose von 74 % und ein deutlicher Anteil α-helikaler Strukturen für eine erfolgreiche Renaturierung des AcbH-Proteins sprechen, geben die ermittelten Affinitätskonstanten (KD) von 1,2 mM bis
3,8 mM nicht die für Substrat-Bindeproteine von ABC-Importern typischen Werte (0,01 µM bis 10 µM; s. Abschnitt 4.2.2) an. Man könnte spekulieren, dass die für die Substratbindung essentiellen Aminosäuren nach der Renaturierung ungewöhnlich exponiert vorliegen und deshalb eine physiologisch gute Bindungsrate über die RU-Differenz nur suggeriert wird. Die hohen KD-Werte würden sich dann aus einer strukturell nicht nativen Umgebung der Bindetasche ergeben, die keine Funktionalität erlaubt. Möglicherweise liegt hierin die Ursache für die mangelnde Assoziation der Nebenkomponenten 4ABC: Die einzelnen Substanzen könnten aufgrund ihrer gegenüber den Derivaten 5C und 6AB kürzeren Monomerenkette nur eine ungenügende Zahl an Wasserstoff-Brückenbindungen zum AcbHProtein ausbilden (s. Seite 77, Tabelle 6.2). Dem gegenüber ist Acarbose relativ klein genug, sich sterisch an Kavitäten der exponierten Bindetasche anzupassen. Für das CyclodextrinBindeprotein CycB aus B. subtilis wurden Affinitätskonstanten ermittelt, die mit Werten von
0,1 mM bis 0,5 mM ebenfalls außerhalb der charakteristischen Parameter für ABCTransporter liegen (KAMIONKA & DAHL, 2001).

Dem Modell des Acarbose-Metabolismus folgend, bilden die aus der Aktivität der Acarviosyl-Transferase (ATase) AcbD resultierenden Acarbosederivate die Substrate des ABC-Transportsystems AcbHFG. Berücksichtigt man die Affinität der ATase zu den Substraten Acarbose (Acarviosyl-Donor, Km = 0,6 mM) und Maltose (Acarviosyl-Akzeptor, Km = 1 mM) (HEMKER ET AL., 2001), liegen die für die Bindung von Acarbose und den Derivaten an das AcbH-Protein ermittelten Werte im selben Konzentrationsbereich. Hiervon abgeleitet, könnten die Affinitätskonstanten des renaturierten Zucker-Bindeproteins tatsächlich die physiologischen Eigenschaften des Proteins beschreiben.

↓125

Wie für die extrazellulären Enzyme AcbE und AcbD (STRATMANN, 1997) ist auch für das Substrat-Bindeprotein AcbH eine Induktion durch Maltose bzw. verstärkt Maltotriose und darüber hinaus insbesondere durch Acarbose nachgewiesen worden. Die Kohlenstoffquellen Glycerin und Glukose führten nicht zu einer Expression des acbH-Gens. (Abbildung 6.25). Wie bei den Lipid-modifizierten Zucker-Bindeproteinen grampositiver Bakterien üblich
(s. 4.2.3.2; SUTCLIFFE & RUSSELL, 1995), wurde entsprechend des vorhergesagten Lipoprotein-Charakters für AcbH eine ausschließliche Lokalisation in den Zytoplasmamembranen festgestellt. Weiterhin kann aufgrund des Vorkommens von AcbH in Zellen nach Kultivierung in Vollmedium TSB (enthält Maltose und Glukose) Glukose als KatabolitRepressor ausgeschlossen werden. Dieser Befund ist konsistent mit den bisherigen Beobachtungen zur Regulation der extrazellulären Enzyme AcbE und AcbD (STRATMANN, 1997) und der Maltose/Maltotriose-Transportaktivität in Actinoplanes sp. (s. auch Seite 98). Ebenso findet man das Cellulose-Bindeprotein CebE oder das Maltose-Bindeprotein MalE von S. reticuli bzw. A. acidocaldarius nach Ko-Kultivierung der Zellen in Minimalmedium mit Cellobiose bzw. Maltose und Glukose, nicht jedoch mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle (SCHLÖSSER ET AL., 1999; HÜLSMANN ET AL., 2000). Außerdem unterstützt das Induktionsprofil des AcbH-Proteins die postulierte Beteiligung des AcbHFGTransportkomplexes am Acarbose-Kreislauf im Rahmen des extra- und intrazellulären Maltodextrin-Metabolismus (s. Seite 11, Abbildung 4.2).

Setzt man voraus, dass die beiden auf der Höhe von ca. 107 kDa und 76 kDa befindlichen Proteine im SDS-Gel in Abbildung 6.23 die α-Amylase AcbE und die ATase AcbD darstellen, während AcbH zu diesem Zeitpunkt immunologisch noch nicht nachweisbar ist, lässt sich eine physiologisch sinnvolle unabhängige Regulation der drei zugehörigen Gene ableiten: Die Biosynthese von Acarbose durch Actinoplanes sp. beginnt bereits in der frühen exponentiellen Wachstumsphase. Offensichtlich sind AcbE und AcbD am extrazellulären Maltodextrin-Metabolismus bereits beteiligt, Acarbose und resultierende Derivate mit breiterem Hemmspektrum fungieren als effektive Inhibitoren der Substratverwertung von Nahrungskonkurrenten im Habitat (s. auch 7.1.2). Hingegen ergibt sich die Notwendigkeit eines Importsystems (AcbHFG) und einer Carbophor-Funktion von Acarbose erst mit Beginn des stationären Wachstums.

7.3.3 Erweitertes Modell des Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.

Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhaltenen Befunde können das zu Beginn existierende Modell zum intra- und extrazellulären Acarbose-Metabolismus (STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004) unterstützen bzw. erweitern (Abbildung 7.3; vgl. Seite 11, Abbildung 4.2).

↓126

Der Acarbose-Kreislauf beginnt mit der intrazellulären Biosynthese des phosphorylierten Acarviosins. Das tatsächliche Endprodukt ist bisher nicht bekannt. So ist unklar, ob das Pseudodisaccharid oder das mono- oder diglukosylierte Acarviosin (Acarbose-7-Phosphat) über das ABC-Exportsystem AcbWXY unter Dephosphorylierung ins umgebende Medium abgegeben wird (1). Außerhalb der Zelle katalysiert die Acarbose-insensitive α-Amylase AcbE die Freisetzung von Maltose und Maltooligosacchariden aus Stärke. Möglicherweise ist an diesem Prozess auch die α-Amylase AcbZ beteiligt (2). Durch die Aktivität der Acarviosyl-Transferase AcbD werden entweder Acarviosin oder die Acarviosyl-Reste der glukosylierten Derivate auf die Produkte der Stärkehydrolyse transferiert (3). Da für diese Reaktion Maltose den effektivsten Acarviosyl-Akzeptor darstellt und außerdem Acarviosin ein instabiles Molekül ist, spekulieren HEMKER ET AL. (2001), dass AcbD am terminalen Schritt der Acarbose-Synthese aus Acarviosin beteiligt ist. Acarbose und die verlängerten Homologe sind Inhibitoren von Hydrolasen α-1,4-glykosidischer Bindungen. Diese Eigenschaft führte zur Vorstellung einer Funktion der Pseudooligosaccharide im Wettbewerb um Nahrungsquellen: die Hemmung artfremder α-Amylasen (4). Diese Art des Konkurrenzverhaltens allein schien jedoch unzureichend, denn auch die Nahrungskonkurrenten im Habitat würden von den Produkten der Stärkehydrolyse profitieren (2 + 5). Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine ökonomisch sinnvollere Strategie aufgezeigt werden. Über eine Inhibition extrazellulärer Hydrolasen α-1,4-glykosidischer Bindungen von Bakterien und Pilzen hinaus übernimmt Acarbose wahrscheinlich eine weitere Rolle bei der Sicherung von Kohlenstoff- und Energiequellen im Habitat (s. auch 7.1.2): Das Pseudotetrasaccharid und vermutlich ebenso die längerkettigen Abkömmlinge haben das Potential, sowohl die Aktivität von Maltose/Maltodextrin-Importsystemen von Nahrungskonkurrenten zu stören als auch über diese Transportkomplexe tatsächlich transloziert zu werden (6). Im Zytoplasma angekommen, führen sie zu toxischen Effekten, die neben einer Akkumulation aufgrund mangelnder Enzymausstattung zum Abbau der Pseudozucker auch den Maltodextrin-Katabolismus betreffen (6). Die Zellen der Nahrungskonkurrenten sind nicht mehr in der Lage, Energiestoffwechsel zu betreiben und sterben ab. Dies konnte für E. coli gezeigt werden
(s. 6.1). Zusammengenommen könnte also der Vorteil, den sich Actinoplanes sp. durch die Biosynthese von Acarbose verschafft, auf einem (A) ausgedehnten physiologischen Hemmspektrum der Acarboseberuhen, welches die Exoenzyme und den Wachstumsstatus ganzer Zellen von konkurrierenden Mikroorganismen umfasst. HEMKER ET AL. (2001) betrachten Acarbose als „prodrug“, die auch durch die katalytische Aktivität der durch sie gehemmten Enzyme in effektivere Varianten mit z. B. zwei oder mehr Acarviosyl-Resten umgesetzt wird. So entstehen Acarbose-Homologe mit einem breiteren Hemmspektrum und damit können noch effektiver ökologische Nischen besetzt werden. Dies erscheint sinnvoll, denn Actinoplanes zeigt im Vergleich z. B. zu Bacillus subtilis ein langsameres Wachstum (pers. Mitteilung U. Wehmeier). Dieser der Wirkung von Antibiotika vergleichbare Effekt würde eine aufwendige Biosynthese von Acarbose rechtfertigen.

Durch den Hemmmechanismus geht ein Teil der Pseudooligosaccharide verloren und steht dem Acarboseproduzenten nicht mehr als C-Quelle zur Verfügung (Carbophor-Funktion,
s. auch Seite 111). Den Verlust an energiereichen Maltosyl- bzw. Maltodextrinylresten kann Actinoplanes sp. durch den ursprünglich geforderten und durch diese Arbeit bewiesenen
(B) Maltose/Maltodextrin-Importwieder ausgleichen (s. auch 7.2.3 und Abbildung 7.2). Hier anknüpfend kann eine weitere Lücke im ursprünglichen Modell des AcarboseMetabolismus geschlossen werden. Nämlich die Frage nach dem Verbleib der durch die Aktivität der Acarviosyl-Transferase AcbD freigesetzten Maltooligosaccharide aus Acarbose und Derivaten. Dem erweiterten Modell entsprechend stehen die entlassenen Moleküle den anderen Organismen aus dem Habitat aufgrund ihrer gehemmten Transportsysteme ebenso wenig wie die nach Stärkehydrolyse resultierenden Maltooligosaccharide als C-Quelle zur Verfügung. Vielmehr könnten die Maltooligosaccharide über den Import in Zellen von Actinoplanes sp. (7) entweder recycelt oder dem Katabolismus zugeführt wird.

Neben dem Hemmcharakter im Ökosystem wurde für Acarbose auch eine Rolle als Carbophor diskutiert. Die ursprünglich postulierte (C) Beteiligung des ABCTransportsystems AcbHFG an der Aufnahme von Acarbose und den verlängerten Homologen (8 + 3) kann aufgrund der für das Bindeprotein AcbH ermittelten Substratspezifität für diese Substanzen unterstützt werden (s. 6.5). Eine Beteiligung des genannten Transportkomplexes am Maltose/Maltodextrin-Import (7) kann hingegen ausgeschlossen werden, da AcbH nicht über eine Maltodextrin-Bindekapazität verfügt und außerdem unter den für die Transportmessungen gewählten Wachstumsbedingungen von Actinoplanes sp. nicht zur Proteinausstattung der Zellen gehört (vgl. Abbildungen 6.6 und 6.25).

↓127

Die Carbophor-Funktion von Acarbose allerdings kann aus drei Gründen gegenüber dem effektiven Hemmcharakter im Ökosystem von Actinoplanes sp. als sekundär betrachtet werden. (i) Die extrazelluläre Fixierung von Glukose-Einheiten an Acarviosin und deren Aufnahme über den AcbHFG-Transportkomplex stellt einen indirekten Importmechanismus über den Umweg eines Intermediatzustandes dar. Bei Klebsiella oxytoca ist ein ähnliches Szenario realisiert. Trotz einer Aufnahmekapazität für lineare Maltodextrine besitzen die Zellen zusätzlich das Cym-ABC-Transportsystem für α- und β-Cyclodextrine, die durch eine Cyclodextrin-Glukanyltransferase aus linearen Maltodextrinen erst gebildet werden. So wie in diesem Fall der Maltodextrin-Transporter keine Spezifität mehr für Cyclodextrine zeigt (PAJATSCH ET AL., 1998), konnte auch für das Acarbose-Bindeprotein AcbH von Actinoplanes sp. eine Affinität für Maltodextrine ausgeschlossen werden (s. 6.5). Die Carbophor-Funktion kann bei Import der verschiedenen Acarbosederivate, den es noch nachzuweisen gilt, zwar einen Nettogewinn an Glukose bieten. Dennoch sollte Actinoplanes sp. bei Wachstum auf Stärke in der Lage sein, auch ohne „Glukose-Falle“ (WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004) ausreichend verstoffwechselbares Substrat für erfolgreiches Wachstum zu importieren (7).

(ii) Darüber hinaus wurden nur niedrige Affinitäten des Substrat-Bindeproteins AcbH für Acarbose und verschiedene höhere Homologe festgestellt (s. 6.5). Ähnlich niedrige Affinitäten zeigt die ATase AcbD zu den Substraten Acarbose (Acarviosyl-Donor) und Maltose (Acarviosyl-Akzeptor) (HEMKER ET AL., 2001). Dass hier Maltose im Vergleich zu Maltodextrinen den effektivsten Acarviosyl-Akzeptor darstellt (anzumerken ist, dass Messansätze zu dieser Reaktion erst nach 18stündiger Inkubation gestoppt werden), ist im Sinne der Carbophor-Funktion nicht ökonomisch. So kann neben dem direkten Maltose/Maltodextrintransport (7)und in Relation zum aufwendigen Acarbose-Metabolismus, der Actinoplanes sp. unter anderem der Erschließung von Energiequellen dienen soll, kein für das Wachstum bedeutender Nettogewinn an Glukosemolekülen mehr realisiert werden.

Zur Unterstützung der für AcbH gefundenen Substratspezifität wurden Experimente zur Aufnahme radioaktiv markierter Acarbose (5,7 µM) in 72 Stunden alte, intakte Zellen durchgeführt. Zwar befand sich Actinoplanes sp. zu dieser Zeit in der stationären Wachstumsphase, bei Zellen aus der exponentiellen Phase jedoch konnte das AcarboseBindeprotein immunologisch nicht nachgewiesen werden. Für die Bindung von Acarbose an AcbH wurde eine Affinitätskonstante (KD) von 3,8 mM ermittelt. Die Transportmessungen erfolgten also weit unterhalb der notwendigen Substratkonzentration. Für das Maltose-ABCTransportsystem MalEFGK2 von E. coli (Km = 1 µM) waren die verwendeten AcarboseKonzentrationen ausreichend, eine dem Maltoseimport entsprechende Transportrate nachzuweisen (s. Seite 45, Abbildung 6.1). Möglicherweise spricht auch dieser Befund dafür, dass die nur niedrigen Affinitäten des ABC-Transportsystems AcbHFG aus Actinoplanes sp. tatsächlich physiologisch sind und die Aufnahme des Carbophors gegenüber der Hemmwirkung im Habitat nur sekundär ist.

↓128

(iii) Ein Teil der mit Glukose-Einheiten beladenen Carbophor-Moleküle geht durch den Hemmmechanismus verloren und steht dem Acarboseproduzenten nicht mehr als C-Quelle zur Verfügung (s. auch Seite 110).

Möglicherweise dient das Transportsystem AcbHFG vielmehr einem Recycling der Pseudooligosaccharide, so dass die Energie überschüssig exportierter Moleküle dem produzierenden Organismus Actinoplanes sp. wieder zugeführt wird. Ähnlich dem Mechanismus des „quorum sensing“ (SCHAUDER & BASSLER, 2001) könnten die Zellen dabei freie Sekundärmetabolite im Habitat und damit die Populationsdichte der Nahrungskonkurrenten erkennen.

Abbildung 7.3: Erweitertes Modell des Acarbose-Metabolismus.Die durch die vorliegende Arbeit aufgezeigten Befunde (A-C) sind grau hinterlegt. Die Vermutung einer Beteiligung des ABC-Transporters AcbHFG an der Aufnahme von Acarbose und höheren Homologen konnte unterstützt werden (C). Die als sekundär bewertete Carbophor-Funktion der Acarbose, die das AcbHFG-System benötigt, ist durch schmale Pfeile und kleinere Symbole gekennzeichnet. Freie Maltose oder Maltodextrine bzw. auch die durch AcbD aus der Acarbose entlassene Maltose werden wahrscheinlich über zwei Maltose/Maltodextrin-ABC-Systeme importiert (B) (vgl. Abbildung 7.2). Die assistierende ABC-Domäne aller drei Transporter könnte das MsiKProtein sein. Das ausgedehnte Hemmspektrum der Pseudooligosaccharide auf die Importsysteme und den Maltodextrin-Katabolismus von Nahrungskonkurrenten ist durch die roten Pfeile sowie den in rot dargestellten Katabolismus signalisiert (A). Dabei sind zwei mögliche Mechanismen dargestellt: Entweder die Pseudooligosaccharide verhindern die Maltodextrinaufnahme durch Verstopfung der Translokationspore und/oder Belegung des Substrat-Bindeproteins. Oder aber sie werden alternativ zu Maltooligosacchariden importiert.3: Erweitertes Modell des Acarbose-Metabolismus.Die durch die vorliegende Arbeit aufgezeigten Befunde (A-C) sind grau hinterlegt. Die Vermutung einer Beteiligung des ABC-Transporters AcbHFG an der Aufnahme von Acarbose und höheren Homologen konnte unterstützt werden (C). Die als sekundär bewertete Carbophor-Funktion der Acarbose, die das AcbHFG-System benötigt, ist durch schmale Pfeile und kleinere Symbole gekennzeichnet. Freie Maltose oder Maltodextrine bzw. auch die durch AcbD aus der Acarbose entlassene Maltose werden wahrscheinlich über zwei Maltose/Maltodextrin-ABC-Systeme importiert (B) (vgl. Abbildung 7.2). Die assistierende ABC-Domäne aller drei Transporter könnte das MsiKProtein sein. Das ausgedehnte Hemmspektrum der Pseudooligosaccharide auf die Importsysteme und den Maltodextrin-Katabolismus von Nahrungskonkurrenten ist durch die roten Pfeile sowie den in rot dargestellten Katabolismus signalisiert (A). Dabei sind zwei mögliche Mechanismen dargestellt: Entweder die Pseudooligosaccharide verhindern die Maltodextrinaufnahme durch Verstopfung der Translokationspore und/oder Belegung des Substrat-Bindeproteins. Oder aber sie werden alternativ zu Maltooligosacchariden importiert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
22.09.2006