Untersuchungen zum Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.:
Charakterisierung der Maltose/Maltotriose-Transportaktivitäten sowie
eines potentiellen ABC-Transporters für Acarbose

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl. Biol. Claudia Brunkhorst

(geb. 11.11.1969 in Soltau)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. Erwin Schneider
2. PD Dr. rer. nat. T. Eitinger
3. PD Dr. rer. nat. U. Wehmeier

eingereicht am: 10.08.2004

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2004

Abstrakt:

Acarbose hat als Inhibitor von Hydrolasen alpha-1,4-glykosidischer Bindungen medizinische Bedeutung. Das Acarbose-Biosynthese-Gencluster (acb) des grampositiven Produzenten Actinoplanes sp. wurde identifiziert und Genprodukte z. T. charakterisiert. Das Modell zum Acarbose-Metabolismus beschreibt einen Acarbosekreislauf, bei dem das Pseudotetrasaccharid als Carbophor fungiert. Das Molekül wird in das umgebende Medium abgegeben und durch das Zusammenwirken zweier extrazellulärer Enzyme nach Stärkehydrolyse mit einer unterschiedlichen Anzahl an Glukosemonomeren beladen. Nach dem vermuteten ReImport über ein Bindeprotein-abhängiges ABC-Transportsystem AcbHFG stünde dem Organismus dann ein Gewinn an Glukosemolekülen zur Verfügung. Neben diesem Vorteil gegenüber Nahrungskonkurrenten im Habitat fungiert Acarbose ebenso als Hemmer der artfremden extrazellulären alpha-Amylasen. Die ökologische Funktion des Pseudotetrasaccharids wurde durch Untersuchungen zum Einfluss auf den Maltodextrin-Stoffwechsel von E. coli verifiziert und ausgeweitet. Es lässt sich ein ökonomisch sinnvolleres Konkurrenzverhalten von Actinoplanes sp. ableiten. Von den durch den Acarboseproduzenten selbst bereitgestellten Maltosacchariden aus Stärke profitieren artfremde Mikroorganismen nicht, da neben den Exoenzymen auch die Maltodextrin-Aufnahmesysteme in ihrer Funktion gehemmt sind. Außerdem wurde eine für Actinoplanes sp. geforderte Kapazität zur Aufnahme von Maltose und Maltodextrinen in vivo gefunden und in Transportexperimenten mit radioaktiv markierten Zuckern charakterisiert. Die Transportaktivität wird wahrscheinlich über zwei Bindeprotein-abhängige ABC-Importer mit multiplem Substratspektrum realisiert. Das ABC-Importsystem AcbHFG wurde heterolog in E. coli und S. lividans synthetisiert und z. T. erfolgreich gereinigt. In Substrat-Bindungsstudien konnte für das Bindeprotein AcbH eine Interaktion mit Acarbose und längerkettigen Derivaten, nicht jedoch mit Maltose/Maltodextrinen beobachtet werden.

Eigene Schlagworte: Actinoplanes, Acarbose, ABC-Transporter, Maltosetransport

Abstract:

Acarbose acts as an inhibitor of alpha-glucosidases and is therefore clinically used. The biosynthesis gene cluster (acb) was identified and partly characterized. The proposed model describes a pathway in which acarbose might function as a carbophor. The molecule is secreted into the medium where, after hydrolysis of starch, it is charged with additional glucose moieties. Re-uptake by a binding-protein dependent ABC importer AcbHFG would then result in a net gain of carbon and energy. Besides extracting glucose from the extracellular pool acarbose also acts as an inhibitor of alpha-amylases secreted by competitors in the natural environment. Prompted by the structural similarity between acarbose and maltotetraose, the effects of acarbose on the metabolism of maltose and maltodextrins in whole cells of E. coli and on individual components of the maltose / maltodextrin system were studied. The results demonstrate that acarbose is efficiently transported but not metabolized by E. coli due to its poor performance as a substrate of maltodextrin-degrading enzymes. Thus, besides acting as a carbophor acarbose also severely inhibits growth of competitors on maltodextrins. Actinoplanes using starch as carbon source should be able to import maltose and maltodextrins. Experiments with radioactive sugars indicate the action of two different binding-protein dependent ABC transport systems with a multiple substrate spectrum. Within the acb cluster a putative operon (acbHFG) encoding components of an ABC import system was found. To elucidate gene functions the products were overproduced in E. coli and S. lividansand some of the proteins were purified. Surface plasmon resonance analysis showed that the substrate binding protein AcbH binds acarbose and longer derivatives, but not maltose and maltodextrins.

Keywords: Actinoplanes, acarbose, ABC-transporter, maltose transport

Inhaltsverzeichnis

• Publikationsliste
• 1 INHALTSVERZEICHNIS
• 2 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
• 3 ZUSAMMENFASSUNG
• 4 EINLEITUNG
  • 4.1  Acarbose-Metabolismus in Actinoplanes sp.
  • 4.2 ABC-Transportsysteme
    • 4.2.1  Die strukturelle Organisation von ABC-Transportern
    • 4.2.2 Bindeprotein-abhängige ABC-Importer
    • 4.2.3 Maltose-Importsysteme von Prokaryoten
      • 4.2.3.1  Maltose-Importsysteme von gramnegativen Bakterien
      • 4.2.3.2 Maltose-Importsysteme von grampositiven Bakterien und Archaeen
    • 4.2.4 Globale Regulationsmechanismen für Kohlenstoffquellen bei gramnegativen und grampositiven Bakterien
  • 4.3 Zielstellung der Arbeit
• 5 MATERIAL UND METHODEN
  • 5.1  Chemikalien, Enzyme, Isotope und Materialien
  • 5.2 Bakterienstämme
  • 5.3 Medien
    • 5.3.1  Kultivierung von Escherichia coli
    • 5.3.2 Kultivierung von Actinoplanes sp. und Streptomyces lividans
  • 5.4 Lagerung und Anzucht der Stämme
    • 5.4.1  Stammhaltung
    • 5.4.2 Anzucht und Wachstumsbedingungen
  • 5.5 Plasmide und Oligonukleotide
  • 5.6 Genetische und Molekularbiologische Methoden
    • 5.6.1  DNA-Präparationen
      • 5.6.1.1  Plasmid-Präparationen
      • 5.6.1.2 Präparation chromosomaler DNA aus Actinoplanes sp. 50/110 und Streptomyces lividans
    • 5.6.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
    • 5.6.3 DNA-Modifikationen
    • 5.6.4 Ortsgerichtete Mutagenese
    • 5.6.5 Elektrophoretische Auftrennung von DNA
    • 5.6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten
    • 5.6.7 Sequenzierungen
    • 5.6.8 Konstruktion ausgewählter Expressionsvektoren
      • 5.6.8.1  Das Expressionsplasmid pCB5
      • 5.6.8.2 Das Expressionsplasmid pCB10
      • 5.6.8.3 Das Expressionsplasmid pCB11
      • 5.6.8.4 Das Expressionsplasmid pCB12
    • 5.6.9 DNA-DNA-Hybridisierung
      • 5.6.9.1  Southern Blotting
      • 5.6.9.2 Hybridisierung
      • 5.6.9.3 Detektion
      • 5.6.9.4 Sonden
    • 5.6.10 Transformation
      • 5.6.10.1  Transformation von E. coli
      • 5.6.10.2 Transformation von S. lividans
  • 5.7 Analytische und Biochemische Methoden
    • 5.7.1  Zellaufschluss und Zellfraktionierung
      • 5.7.1.1  Zellaufschluss in einer French Pressure Cell
      • 5.7.1.2 Zellaufschluss durch Ultraschallbehandlung
      • 5.7.1.3 Zellfraktionierung
    • 5.7.2 Präparation des Osmoschock-Überstandes
    • 5.7.3 Bestimmung der Proteinkonzentration
    • 5.7.4 Gelelektrophoretische Darstellung von Proteinen
    • 5.7.5 Proteinelution aus SDS-Polyacrylamid-Gelen
    • 5.7.6 Western Blotting und Immunodetektion
    • 5.7.7 Transportversuche
    • 5.7.8 Maltose-PTS-Test
    • 5.7.9 Zuckerbindungsstudien in Fällungsexperimenten
    • 5.7.10 Zuckerbindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz
    • 5.7.11 Freisetzung von Glukose aus Acarbose
    • 5.7.12 Reinigung des AcbH-Proteins
    • 5.7.13 Renaturierung des AcbH-Proteins
    • 5.7.14 CD-Spektrum des renaturierten Proteins AcbH
    • 5.7.15 Solubilisierung des WT-AcbH aus Membranen
    • 5.7.16 Reinigung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins aus dem  Kulturüberstand von Actinoplanes sp.
    • 5.7.17 Massenanalyse und Peptidsequenzierung
• 6 ERGEBNISSE
  • 6.1  Einfluss von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von Escherichia coli K12
    • 6.1.1  Acarboseaufnahme in Zellen von Escherichia coliK12
    • 6.1.2 Interaktion von Acarbose mit dem Maltose-Bindeprotein MalE
    • 6.1.3 Acarbose als Substrat der cytoplasmatischen Enzyme MalQ und MalZ
  • 6.2 Untersuchungen zur Transportkapazität von Actinoplanes sp.
    • 6.2.1  Wachstum von Actinoplanes sp. 223/29 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen
    • 6.2.2 Maltoseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29
      • 6.2.2.1  Spezifität der beobachteten Maltosetransport-Aktivitäten
      • 6.2.2.2 Transportkinetik
    • 6.2.3 Maltotrioseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29
      • 6.2.3.1  Spezifität der beobachteten Maltotriosetransport-Aktivitäten
    • 6.2.4 Acarboseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29
  • 6.3 Identifizierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins aus dem Kulturüberstand von Actinoplanes sp.
    • 6.3.1  Isolierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins
    • 6.3.2 Klonierung des Gens eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins
    • 6.3.3 Zusammenfassung
  • 6.4 Heterologe Synthese und Reinigung des Proteins AcbH
    • 6.4.1  Klonierungen von acbH
    • 6.4.2 Heterologe Synthese von AcbH in S. lividans TK23 und Reinigung
    • 6.4.3 Heterologe Synthese von AcbH in E. coliund Reinigung
  • 6.5 Substratbindungsstudien mittels Oberflächen-Plasmonresonanz
  • 6.6 Heterologe Synthese und Reinigung der Proteine AcbFG und MsiK
    • 6.6.1  Identifizierung, heterologe Synthese in E. coli und Reinigung von MsiK
    • 6.6.2 Heterologe Ko-Synthese und Reinigung des Komplexes AcbFG-MsiK₂
  • 6.7 Immunochemische Analyse des Syntheseprofils von AcbH und MsiK in Actinoplanes sp.
    • 6.7.1  Das Syntheseprofil von AcbH
    • 6.7.2 Das Induktionsprofil von MsiK
    • 6.7.3 Zusammenfassung
• 7 DISKUSSION
  • 7.1  Wirkung von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von Escherichia coli K12 und resultierende Konsequenzen für das Modell zum Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.
    • 7.1.1  Einfluss von Acarbose auf den Maltose/Maltodextrin-Stoffwechsel von Escherichia coli K12
    • 7.1.2 Bedeutung der Befunde für den Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.
  • 7.2 Charakterisierung des Maltose/Maltotriose-Transports bei Actinoplanes sp.
    • 7.2.1  Die Transportaktivitäten von Actinoplanes sp.
    • 7.2.2 Charakterisierung eines potentiellen Maltose-Bindeproteins
    • 7.2.3 Modell der Kapazitäten für die Aufnahme von Maltose und Maltotriose durch Actinoplanes sp.
  • 7.3 Charakterisierung des potentiellen Acarbose-ABC-Transporters AcbHFG-MsiK₂
    • 7.3.1  Der potentielle Transportkomplex AcbFG-MsiK₂
    • 7.3.2 Das Substrat-Bindeprotein AcbH
    • 7.3.3 Erweitertes Modell des Acarbose-Metabolismus von Actinoplanes sp.
• 8 AUSBLICK
• LITERATUR
• DANKSAGUNG
• ANHANG  Peptidsequenzen des potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins
• Lebenslauf
• Selbständigkeitserklärung

Tabellen

• Tabelle 5.1: Liste der Bakterienstämme1: Liste der Bakterienstämme
• Tabelle 5.2: Liste der Plasmide2: Liste der Plasmide
• Tabelle 5.3: Liste der Oligonukleotide3: Liste der Oligonukleotide
• Tabelle 6.1: Kinetische Parameter des Maltosetransports bei Actinoplanes sp. 223/291: Kinetische Parameter des Maltosetransports bei Actinoplanes sp. 223/29
• Tabelle 6.2: Strukturelle Unterschiede der Nebenkomponenten im Vergleich zu Acarbose.2: Strukturelle Unterschiede der Nebenkomponenten im Vergleich zu Acarbose.
• Tabelle 7.1: Kinetische Parameter verschiedener ABC-Transportsysteme für Maltose/Maltodextrine. Die angegebenen Parameter zeigen Zellen nach Anzuchten mit Maltose.1: Kinetische Parameter verschiedener ABC-Transportsysteme für Maltose/Maltodextrine. Die angegebenen Parameter zeigen Zellen nach Anzuchten mit Maltose.

Bilder

• Abbildung 4.1: Struktur des Sekundärmetaboliten Acarbose. Bei dem Pseudotetrasaccharid ist ein Ringsystem keine Hexose, sondern ein ungesättigtes C1: Struktur des Sekundärmetaboliten Acarbose. Bei dem Pseudotetrasaccharid ist ein Ringsystem keine Hexose, sondern ein ungesättigtes C₇-Cyclitol (Valienamin). Die glykosidische Bindung innerhalb der Acarviosineinheit wird über ein Stickstoffatom realisiert und ist durch α-Glukosidasen nicht spaltbar (HEIKER ET AL., 1981).
• Abbildung 4.2: Modell des Acarbose-Metabolismus (verändert nach STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Dargestellt ist ein aktuelles Modell, das bereits die erzielten Ergebnisse zweier im Rahmen der vorliegenden Arbeit angefertigten Diplomarbeiten (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002) berücksichtigt. Gezeigt ist der hypothetische Zyklus von Acarbose zwischen einem intra- und extrazellulären StärkeMetabolismus. AcbWXY: ABC-Exporter, AcbHFG-MsiK2: Modell des Acarbose-Metabolismus (verändert nach STRATMANN, 1997; WEHMEIER & PIEPERSBERG, 2004). Dargestellt ist ein aktuelles Modell, das bereits die erzielten Ergebnisse zweier im Rahmen der vorliegenden Arbeit angefertigten Diplomarbeiten (SCHÄFER, 1999; ELVERS, 2002) berücksichtigt. Gezeigt ist der hypothetische Zyklus von Acarbose zwischen einem intra- und extrazellulären StärkeMetabolismus. AcbWXY: ABC-Exporter, AcbHFG-MsiK₂?: ABC-Importer, AcbQ: Amylomaltase, AcbD: Acarviosyl-Transferase, AcbZ, AcbE: α-Amylasen. (n) kennzeichnet variable Anzahlen an Glukoseresten. Die Darstellung der in diesem Schema möglichen Funktion von AcbHFG-MsiK₂? als Maltose/Maltodextrin-Importer ist nicht Bestandteil des von STRATMANN (1997) und WEHMEIER & PIEPERSBERG (2004) aufgestellten Modells.
• Abbildung 4.3: Struktureller Aufbau von ABC-Transportern (verändert nach SCHNEIDER, 2000). Schematisch dargestellt sind prokaryotische Bindeprotein-abhängige Importer (A bis D) sowie pro- und eukaryotische Exporter (E resp. F). Einzelne Domänen können separat (A), teilweise fusioniert (B, C, D, E) oder auf einer einzigen Polypeptidkette (F) vorliegen. Das für bakterielle Systeme typische, extrazelluläre bzw. periplasmatische Bindeprotein ist in (A und B) symbolisiert. Die Verbindungslinie zur Membran in (A) symbolisiert den Lipidanker der fixierten Bindeproteine bei grampositiven Bakterien.3: Struktureller Aufbau von ABC-Transportern (verändert nach SCHNEIDER, 2000). Schematisch dargestellt sind prokaryotische Bindeprotein-abhängige Importer (A bis D) sowie pro- und eukaryotische Exporter (E resp. F). Einzelne Domänen können separat (A), teilweise fusioniert (B, C, D, E) oder auf einer einzigen Polypeptidkette (F) vorliegen. Das für bakterielle Systeme typische, extrazelluläre bzw. periplasmatische Bindeprotein ist in (A und B) symbolisiert. Die Verbindungslinie zur Membran in (A) symbolisiert den Lipidanker der fixierten Bindeproteine bei grampositiven Bakterien.
• Abbildung 4.4: SchematischeDarstellungder Maltose-Importsysteme von Prokaryoten (verändert nach SCHNEIDER, 2003). Neben den aufgeführten Maltooligosacchariden stellen auch höhere Homologe mit bis zu sieben Glukoseeinheiten Substrate dar. Weitere Erklärungen sind dem Text zu entnehmen.4: SchematischeDarstellungder Maltose-Importsysteme von Prokaryoten (verändert nach SCHNEIDER, 2003). Neben den aufgeführten Maltooligosacchariden stellen auch höhere Homologe mit bis zu sieben Glukoseeinheiten Substrate dar. Weitere Erklärungen sind dem Text zu entnehmen.
• Abbildung 4.5: Alignment der Signatursequenzen von Bindeproteinen. Die Zahlen geben die Position der jeweils ersten Aminosäure des Motivs an. Das hoch konservierte Lysin (K) ist rot hervorgehoben, weitere konservierte Reste sind grün markiert. Asp.: Actinoplanes sp., CebE Sr: Cellobiose-Bindeprotein aus S. reticuli, MalE Sc: Maltose-Bindeprotein aus S. coelicolor, MalE Ec: Maltose-Bindeprotein aus E. coli, MsmE Sm: multiple-sugar-metabolism-Bindeprotein aus S. mutans.5: Alignment der Signatursequenzen von Bindeproteinen. Die Zahlen geben die Position der jeweils ersten Aminosäure des Motivs an. Das hoch konservierte Lysin (K) ist rot hervorgehoben, weitere konservierte Reste sind grün markiert. Asp.: Actinoplanes sp., CebE Sr: Cellobiose-Bindeprotein aus S. reticuli, MalE Sc: Maltose-Bindeprotein aus S. coelicolor, MalE Ec: Maltose-Bindeprotein aus E. coli, MsmE Sm: multiple-sugar-metabolism-Bindeprotein aus S. mutans.
• Abbildung 5.1: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB5.Durch diese Klonierung ist MalE vor der Aminosäure Lys 1 des reifen Proteins zusammen mit den Kodons der BamHI-Schnittstelle für Gly und Ser N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MRGSH1: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB5.Durch diese Klonierung ist MalE vor der Aminosäure Lys 1 des reifen Proteins zusammen mit den Kodons der BamHI-Schnittstelle für Gly und Ser N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MRGSH₍₆₎GS fusioniert.
• Abbildung 5.2: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB10.Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, zusammen mit dem ersten Kodon der NdeI-Schnittstelle für His N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MGH2: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB10.Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, zusammen mit dem ersten Kodon der NdeI-Schnittstelle für His N-terminal mit einem Histidin-Tag mit der Sequenz MGH₍₁₀₎SSGHID₍₄₎KH fusioniert.
• Abbildung 5.3: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB11.Durch die Mutagenese wurde die Sequenz der NdeI-Schnittstelle CATATG ortsspezifisch zu CACATG umgewandelt, so dass die Sequenz des resultierenden N-terminalen Histidin-Tags derjenigen des Expressionsproduktes von pCB10 entspricht.3: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB11.Durch die Mutagenese wurde die Sequenz der NdeI-Schnittstelle CATATG ortsspezifisch zu CACATG umgewandelt, so dass die Sequenz des resultierenden N-terminalen Histidin-Tags derjenigen des Expressionsproduktes von pCB10 entspricht.
• Abbildung 5.4: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB12. pPWW49-GenPoly ist ein Shuttle-Vektor und enthält zwei Origins der Replikation (ori pUC19 für Replikation in E. coli, ori pIJ101 für Replikation in S. lividans) sowie zwei Antibiotika-Resistenzgene (Ampicillin, Thiostrepton). Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, mit der Sequenz MH4: Konstruktion des Expressionsplasmids pCB12. pPWW49-GenPoly ist ein Shuttle-Vektor und enthält zwei Origins der Replikation (ori pUC19 für Replikation in E. coli, ori pIJ101 für Replikation in S. lividans) sowie zwei Antibiotika-Resistenzgene (Ampicillin, Thiostrepton). Durch diese Klonierung ist AcbH vor der Aminosäure Met, die das Cys 1 des reifen Proteins ersetzt, mit der Sequenz MH₍₁₀₎SSGHID₍₄₎KH fusioniert
• Abbildung 5.5: Prinzip der Biomolekularen Interaktions-Analyse5: Prinzip der Biomolekularen Interaktions-Analyse
• Abbildung 6.1: Aufnahme von Acarbose über das Maltosetransportsystem von E. coli K12.Die Zellen wurden in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose kultiviert und bei Erreichen der spät exponentiellen Wachstumsphase für die Messungen vorbereitet. Die Konzentration der radioaktiven Zuckerlösungen betrug1: Aufnahme von Acarbose über das Maltosetransportsystem von E. coli K12.Die Zellen wurden in Minimalmedium M63 mit 0,5 % Maltose kultiviert und bei Erreichen der spät exponentiellen Wachstumsphase für die Messungen vorbereitet. Die Konzentration der radioaktiven Zuckerlösungen betrug 5,7 µM. Zur Überprüfung der Spezifität wurde den Ansätzen in einer anderen Messung zusätzlich je 0,1 mM des Strukturhomologen zugegeben.
• Abbildung 6.2: Einfluss von Acarbose auf die Bindung von Maltose an MalE von E. coli K12.Von den periplasmatischen Fraktionen wurden je 120 µg Gesamtprotein für die Studien eingesetzt, daran anteilig war MalE mit ca. 5 %. Mit Ausnahme der Kontrolle wurden die einzelnen Messansätze für eine Minute mit verschiedenen Acarbose-Konzentrationen vorinkubiert und dann erfolgte der Reaktionsstart durch Zugabe von [U-2: Einfluss von Acarbose auf die Bindung von Maltose an MalE von E. coli K12.Von den periplasmatischen Fraktionen wurden je 120 µg Gesamtprotein für die Studien eingesetzt, daran anteilig war MalE mit ca. 5 %. Mit Ausnahme der Kontrolle wurden die einzelnen Messansätze für eine Minute mit verschiedenen Acarbose-Konzentrationen vorinkubiert und dann erfolgte der Reaktionsstart durch Zugabe von [U-¹⁴C]-Maltose. Die ohne zusätzliche Acarbose im Messansatz erreichte Bindung von radioaktiv markierter [U-¹⁴C]-Maltose (5 µM, 300 nCi) an das Protein MalE betrug 2,6 nmol/120 µg Gesamtprotein (= 100 %).
• Abbildung 6.3: Freisetzung von Glukose durch die Amylomaltase MalQ und die Maltodextrin-Glukosidase MalZ in Gegenwart von Acarbose.Die Menge an freier Glukose wurde mit der GOD-POD-Methode quantifiziert (BERGMEYER, 1974).3: Freisetzung von Glukose durch die Amylomaltase MalQ und die Maltodextrin-Glukosidase MalZ in Gegenwart von Acarbose.Die Menge an freier Glukose wurde mit der GOD-POD-Methode quantifiziert (BERGMEYER, 1974).
• Abbildung 6.4: Wachstum des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen C-Quellen zu je 0,5 % über einen Zeitraum von drei Tagen angezogen.4: Wachstum des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen C-Quellen zu je 0,5 % über einen Zeitraum von drei Tagen angezogen.
• Abbildung 6.5: Aufnahme von Maltose in Zellen des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 – Darstellung der Linearität.Die Zellen wurden Vollmedium TSB und Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen Zuckern zu je 0,5 % angezogen und nach 24 Stunden Wachstum für die Messungen entnommen.5: Aufnahme von Maltose in Zellen des Stammes Actinoplanes sp. 223/29 – Darstellung der Linearität.Die Zellen wurden Vollmedium TSB und Minimalmedium MNS mit den in der Legende angegebenen Zuckern zu je 0,5 % angezogen und nach 24 Stunden Wachstum für die Messungen entnommen.
• Abbildung 6.6: Durchschnittliche Maltoseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium, Vollmedium TSB bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je 0,5 % bzw. 7 % MD50 kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Transportmessungen eingesetzt.6: Durchschnittliche Maltoseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium, Vollmedium TSB bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je 0,5 % bzw. 7 % MD50 kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Transportmessungen eingesetzt.
• Abbildung 6.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.
• Abbildung 6.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.7: Inhibierung der Maltoseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose (A) bzw. MD50 (B) kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Kontrollen ( = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte sind die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 11,1 nmol Maltose/mg Protein x min und bei solchen, die mit MD50 angezogen wurden, bei 2,3 nmol Maltose/mg Protein x min.
• Abbildung 6.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.
• Abbildung 6.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.8: Bestimmung der kinetischen Parameter des Maltosetransports.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit 0,5 % Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Messung eingesetzt. A: V/S-Diagramm, B: Lineweaver-Burk-Diagramm.
• Abbildung 6.9: Durchschnittliche Maltotrioseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je9: Durchschnittliche Maltotrioseaufnahme in Zellen von Actinoplanes sp. 223/29.Die Zellen wurden in Acarbose-Produktions-Medium bzw. Minimalmedium MNS mit den angegebenen Zuckern zu je 0,5 % bzw. 7 % MD50 kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Transportmessungen eingesetzt.
• Abbildung 6.10: Inhibierung der Maltotrioseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose, Glycerin, MD50 bzw. Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Wachstumszuckern (Kontrollwerte = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte waren die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 9,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min und bei solchen, die mit Glycerin angezogen wurden, bei 5,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min. Die Kontrollwerte von Maltose- bzw. MD50Zellen betrugen 5,6 bzw. 3,5 nmol Maltotriose/mg Protein x min.10: Inhibierung der Maltotrioseaufnahme durch verschiedene Zucker.Die Zellen wurden in Minimalmedium MNS mit je 0,5 % Acarbose, Glycerin, MD50 bzw. Maltose kultiviert und nach 24 Stunden Wachstum für die Hemmstudien eingesetzt. Die Zucker, deren Einfluss auf den Transport überprüft werden sollte, sind jeweils rechts neben den Wachstumszuckern (Kontrollwerte = 100 %) aufgeführt. Kontrollwerte waren die ohne zusätzlichen Zucker im Messansatz erreichten Transportraten. Sie lagen im Falle der Zellen, die mit Acarbose gewachsen waren, bei 9,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min und bei solchen, die mit Glycerin angezogen wurden, bei 5,3 nmol Maltotriose/mg Protein x min. Die Kontrollwerte von Maltose- bzw. MD50Zellen betrugen 5,6 bzw. 3,5 nmol Maltotriose/mg Protein x min.
• Abbildung 6.11: Isolierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Für die Isolierung des potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins wurden 2 ml konzentrierter Kulturüberstand auf 0,5 ml Amylose-Matrix pipettiert. Im Anschluss an Waschungen mit je 6 Säulenvolumina Puffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,2, 1 mM CaCl11: Isolierung eines potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Für die Isolierung des potentiellen Maltose/Maltodextrin-Bindeproteins wurden 2 ml konzentrierter Kulturüberstand auf 0,5 ml Amylose-Matrix pipettiert. Im Anschluss an Waschungen mit je 6 Säulenvolumina Puffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,2, 1 mM CaCl₂) wurde das Protein mit jeweils 0,5 ml 20 mM Maltose eluiert. Jeweils 36 µl der Proben des Säulenlaufs wurden untersucht. Das betrachtete Protein ist mit einem schwarzen Pfeilkopf (◄) markiert.
• Abbildung 6.12: DNA-DNA-Hybridisierung.Dargestellt ist die Hybridisierung der DIG-markierten Sonde „fishingMBP2“ mit Fragmenten chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. 50/110. Nach dem Verdau der DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen wurden die Fragmente in einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt. Die Hybridisierung erfolgte mit 50 ng Sonde/ml Hybridisierungslösung über Nacht bei 56°C. Die erhaltenen Signale liegen bei DNA-Fragmenten mit den Größen ~ 10 kB (BamHI), ~ 5,5 kB (SalI) und ~ 3 kB (SmaI).12: DNA-DNA-Hybridisierung.Dargestellt ist die Hybridisierung der DIG-markierten Sonde „fishingMBP2“ mit Fragmenten chromosomaler DNA von Actinoplanes sp. 50/110. Nach dem Verdau der DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen wurden die Fragmente in einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt. Die Hybridisierung erfolgte mit 50 ng Sonde/ml Hybridisierungslösung über Nacht bei 56°C. Die erhaltenen Signale liegen bei DNA-Fragmenten mit den Größen ~ 10 kB (BamHI), ~ 5,5 kB (SalI) und ~ 3 kB (SmaI).
• Abbildung 6.13: Nachweis der heterologen Expression von acbH in S. lividans TK23 <pCB12> und Reinigung des (His)13: Nachweis der heterologen Expression von acbH in S. lividans TK23 <pCB12> und Reinigung des (His)₁₀-AcbH-Fusionsproteins über Ni-Affinitätschromatographie.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des (His)₁₀-AcbH (47,3 kDa) mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)₆-AcbH von pCB7 (44,8 kDa). A:Für den Nachweis der Expression von acbH wurden 30 µg (20 µl) Gesamtprotein von S. lividans TK23 <pCB12> bzw. von Zellen ohne Plasmid (Kontrolle) analysiert. B: Für die Reinigung von (His)₁₀-AcbH wurden 4 ml Cytosolfraktion mit 0,5 ml Ni-Matrix für eine Stunde bei 4 °C inkubiert. Nach Waschungen mit 4 Säulenvolumina MNS-Medium pur und mit 20 mM Imidazol erfolgte die Elution mit jeweils 0,5 ml 150 mM Imidazol. Jeweils 30 µl der Proben des Säulenlaufs wurden untersucht.
• Abbildung 6.14: Überprüfung einer Maltodextrin-Bindeaktivität von (His)14: Überprüfung einer Maltodextrin-Bindeaktivität von (His)₁₀-AcbH. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des (His)₁₀-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. 1,5 ml dialysiertes Cytosol wurden mit 0,5 ml Amylose-Matrix gut durchmischt, anschließend erfolgten vier Waschungen und vier Elutionsschritte mit 20 mM Maltodextrinen. Jeweils 30 µl dieser Proben wurden untersucht.
• Abbildung 6.15: Nachweis der heterologen Expression von acbH in E. coli BL21(DE3) <pLysS, pCB10>.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)15: Nachweis der heterologen Expression von acbH in E. coli BL21(DE3) <pLysS, pCB10>.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)₁₀-AcbH (47,3 kDa) ist mit einem schwarzen Pfeilkopf (◄) markiert. Jeweils 15 µl der Proben wurden untersucht. Hinweis: die in der Cytosolfraktion auffällige, vielversprechende Proteinbande auf der Höhe von 45 kDa (*) ist durch Immunoblotting nachweisbar nicht AcbH!.
• Abbildung 6.16: Denaturierende Reinigung und Renaturierung des (His)16: Denaturierende Reinigung und Renaturierung des (His)₁₀-AcbH-Fusionsproteins aus E. coli BL21(DE3) <pLysS, pCB10>.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. A: Für die Reinigung von (His)₁₀-AcbH wurden 5 mg LSP (4 ml) 1:10 in 8 M Harnstofflösung für 30 Minuten solubilisiert. Nach Ultrazentrifugation wurde das Solubilisat mit 2 ml Ni-NTA-Matrix inkubiert. Im Anschluss an Waschungen mit je 5 Säulenvolumina Puffer pur und mit 20 mM Imidazol wurde das Protein mit jeweils 1 ml 150 mM Imidazol eluiert. Jeweils 15 µl der Proben des Säulenlaufs wurden untersucht. B: Die Renaturierung wurde mit dem in Eluatfraktion 3 aus (A) enthaltenen AcbH durchgeführt. Nach einer 1,5:1 Verdünnung mit 2,5 M Arginin wurde das Protein über zwei hintereinandergeschaltete PD10-Säulen zunächst nach 1 M Arginin, dann nach Tris-Puffer umgesetzt. Durch abschließende Ultrazentrifugation konnte das im Überstand befindliche lösliche AcbH-Protein (0,23 µg/µl) für weitere Experimente genutzt werden. Jeweils 10 µl der Proben der Renaturierungsprozedur wurden untersucht.
• Abbildung 6.17: CD-Spektrum des renaturierten AcbH.Die Messung wurde mit einer Proteinkonzentration von 150 µg/ml durchgeführt. Das Protein lag vor in 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 5 % Glycerin, 150 mM NaCl17: CD-Spektrum des renaturierten AcbH.Die Messung wurde mit einer Proteinkonzentration von 150 µg/ml durchgeführt. Das Protein lag vor in 20 mM Tris/HCl, pH 7,2, 5 % Glycerin, 150 mM NaCl₂. Die Anwesenheit von Chlorid-Ionen bei den Messungen war zwar störend, das Protein konnte aber nicht ohne NaCl bzw. alternativ mit NaF renaturiert werden.
• Abbildung 6.18: Wirkung von Acarbose auf den Renaturierungserfolg von (His)18: Wirkung von Acarbose auf den Renaturierungserfolg von (His)₁₀-AcbH.Die Renaturierungen wurden wie für Abbildung 16B beschrieben durchgeführt. Im parallelen Ansatz enthielten sowohl die Arginin- als auch die Tris-Lösung Acarbose (20 mM). Nach abschließender Ultrazentrifugation wurden die Anteile des in den jeweiligen Überständen befindlichen löslichen AcbH-Proteins in einer SDS-PAGE analysiert.
• Abbildung 6.19: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit Acarbose und Nebenkomponenten. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen von Acarbose an AcbH vergleichend dargestellt. Die rechte Darstellung zeigt das unterschiedliche Bindungsvermögen der Acarbosederivate in Relation zu Acarbose bei Konzentrationen von jeweils 10 mM. Hier ist auch zu sehen, dass Maltodextrine (ebenfalls 10 mM) keinerlei Affinität zu AcbH aufwiesen. Die Bezeichnung der Nebenkomponenten ist in Kurzform angegeben (Komponentengemisch 4ABC, Komponente 5C, Komponenten 6AB). Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.19: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit Acarbose und Nebenkomponenten. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen von Acarbose an AcbH vergleichend dargestellt. Die rechte Darstellung zeigt das unterschiedliche Bindungsvermögen der Acarbosederivate in Relation zu Acarbose bei Konzentrationen von jeweils 10 mM. Hier ist auch zu sehen, dass Maltodextrine (ebenfalls 10 mM) keinerlei Affinität zu AcbH aufwiesen. Die Bezeichnung der Nebenkomponenten ist in Kurzform angegeben (Komponentengemisch 4ABC, Komponente 5C, Komponenten 6AB). Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.
• Abbildung 6.20: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit den Nebenkomponenten 5C, 6AB. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen des Acarbosederivates 5C mit AcbH vergleichend dargestellt, im rechten Bild ist es das Gemisch der Acarbosederivate 6A und 6B. Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.20: Sensorgramme der Interaktion von AcbH mit den Nebenkomponenten 5C, 6AB. Im linken Bild ist die Bindung verschiedener Konzentrationen des Acarbosederivates 5C mit AcbH vergleichend dargestellt, im rechten Bild ist es das Gemisch der Acarbosederivate 6A und 6B. Der weiße Pfeil kennzeichnet den Injektionsstart und den Beginn der Assoziationsphase, der schwarze Pfeil das Injektionsende und die Dissoziationsphase.
• Abbildung 6.21: Nachweis der heterologen Synthese von MsiK in E. coli JM109 <pDE03> sowie denaturierende Reinigung und Renaturierung (verändert nach ELVERS, 2002).Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)21: Nachweis der heterologen Synthese von MsiK in E. coli JM109 <pDE03> sowie denaturierende Reinigung und Renaturierung (verändert nach ELVERS, 2002).Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Lokalisation des (His)₆-MsiK (40,8 kDa) ist mit einem schwarzen Pfeilkopf (◄) markiert. A: Zum Vergleich wurden je 30 µg der Proteine des LSPs und der Cytosolfraktion untersucht. B: Für die Reinigung von (His)₆-MsiK wurden 5 mg LSP mit 8 M Harnstofflösung für 30 Minuten solubilisiert. Nach Ultrazentrifugation wurde das Solubilisat (8 ml) mit 1 ml Ni-NTA-Matrix inkubiert. Im Anschluss an Waschungen mit 10 Säulenvolumina Puffer wurde das Protein mit 50 mM Imidazol eluiert. Jeweils 15 µl der einzelnen Proben wurden untersucht. Die anschließende Renaturierung erfolgte durch schnelles Ausverdünnen (1 : 50) des Denaturierungsagens. Nach 45 minütiger Inkubation auf Eis wurde das Volumen des Ansatzes eingeengt, durch abschließende Ultrazentrifugation konnte das im Überstand befindliche lösliche MsiK-Protein nach einer Umlagerung in einen geeigneten Messpuffer für die ATPase-Aktivitätsmessungen genutzt werden. Weitere Details sind der Originalarbeit zu entnehmen.
• Abbildung 6.22: Ko-Elution des Komplexes AcbFG-MsiK22: Ko-Elution des Komplexes AcbFG-MsiK₂ (verändert nach ELVERS, 2002).Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des (His)₆-AcbF (39,1 kDa) wurde mit Anti-RGS-Antiserum, der des MsiK (39,2 kDa) mit Anti-MsiK-Antiserum geführt. Die Detektion des MsiK zusammen mit AcbF erfolgte in unabhängigen Immunoblot-Analysen. Weitere Details sind der Originalarbeit zu entnehmen.
• Abbildung 6.23: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in AcarboseProduktionsmedium.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des23: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in AcarboseProduktionsmedium.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)₆-AcbH von pCB7 (45,8 kDa). Das Protein AcbD ist durch einen weißen, das Protein AcbE durch einen schwarzen Pfeil markiert.
• Abbildung 6.24: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in 0,5 % Maltodextrinen.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)24: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht in 0,5 % Maltodextrinen.Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen (oberes Bild) und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet (unteres Bild). Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)₆-AcbH von pCB7 (45,8 kDa). Das Protein AcbD ist durch einen schwarzen Pfeil markiert.
• Abbildung 6.25: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Vollmedium TSB und Minimalmedium mit je25: Expression von wt-acbH in Actinoplanes sp. bei Anzucht mit verschiedenen Kohlenstoffquellen.Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Vollmedium TSB und Minimalmedium mit je 0,5 % Glukose, MD50, Acarbose, Maltose und Glycerin. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle dienten ca. 0,1 µg des (His)₆-AcbH von pCB7 (45,8 kDa).
• Abbildung 6.26: Solubilisierung des wt-AcbH aus Membranen von Actinoplanes sp. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)26: Solubilisierung des wt-AcbH aus Membranen von Actinoplanes sp. Die einzelnen Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der immunologische Nachweis des wt-AcbH mit Anti-AcbH-Antiserum (◄) wurde durch Detektion der Chemilumineszenz geführt. Als Blotkontrolle diente das (His)₆-AcbH von pCB7 (45,8 kDa). Der Solubilisierungsansatz enthielt Membranen mit 390 µg Proteinanteil. Nach einer 40minütigen Inkubation unter vorsichtigem Rühren auf Eis wurde der Ansatz ultrazentrifugiert, das Solubilisat vom Pellet getrennt und dieses im Ausgangsvolumen Solubilisierungspuffer (1,1 % Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 5 % Glycerin, 0,1 mM PMSF in Minimalmedium MNS) resuspendiert.
• Abbildung 7.1: Maltodextrinabbau durch die zytoplasmatischen Enzyme MalQ, MalP und MalZ (verändert nach BOOS & SHUMAN, 1998).Die drei Enzyme sind farbig wiedergegeben: MalQ: Amylomaltase, MalZ: Maltodextrin-Glukosidase, MalP: Maltodextrin-Phosphorylase. Aus diesem Schema wird deutlich, dass der Abbau von Maltose nur in Gegenwart eines Maltosyl-Donors (Minimum Maltotriose) stattfinden kann.1: Maltodextrinabbau durch die zytoplasmatischen Enzyme MalQ, MalP und MalZ (verändert nach BOOS & SHUMAN, 1998).Die drei Enzyme sind farbig wiedergegeben: MalQ: Amylomaltase, MalZ: Maltodextrin-Glukosidase, MalP: Maltodextrin-Phosphorylase. Aus diesem Schema wird deutlich, dass der Abbau von Maltose nur in Gegenwart eines Maltosyl-Donors (Minimum Maltotriose) stattfinden kann.
• Abbildung 7.2: Mögliche Ausstattung von Actinoplanes sp. mit ABC-Transportern für Maltose und Maltodextrine. Das Transportsystem in mit Acarbose kultivierten Zellen präferiert Maltose gegenüber Maltodextrinen. Das andere System zeigt gegenteilige Präferenz. MBP: Maltose-Bindeprotein, das mit * gekennzeichnete MBP könnte das aus dem Kulturüberstand isolierte sein. MP: Membranprotein, ABC-P: ABCProtein.2: Mögliche Ausstattung von Actinoplanes sp. mit ABC-Transportern für Maltose und Maltodextrine. Das Transportsystem in mit Acarbose kultivierten Zellen präferiert Maltose gegenüber Maltodextrinen. Das andere System zeigt gegenteilige Präferenz. MBP: Maltose-Bindeprotein, das mit * gekennzeichnete MBP könnte das aus dem Kulturüberstand isolierte sein. MP: Membranprotein, ABC-P: ABCProtein.
• Abbildung 7.3: Erweitertes Modell des Acarbose-Metabolismus.Die durch die vorliegende Arbeit aufgezeigten Befunde (A-C) sind grau hinterlegt. Die Vermutung einer Beteiligung des ABC-Transporters AcbHFG an der Aufnahme von Acarbose und höheren Homologen konnte unterstützt werden (C). Die als sekundär bewertete Carbophor-Funktion der Acarbose, die das AcbHFG-System benötigt, ist durch schmale Pfeile und kleinere Symbole gekennzeichnet. Freie Maltose oder Maltodextrine bzw. auch die durch AcbD aus der Acarbose entlassene Maltose werden wahrscheinlich über zwei Maltose/Maltodextrin-ABC-Systeme importiert (B) (vgl. Abbildung 7.2). Die assistierende ABC-Domäne aller drei Transporter könnte das MsiKProtein sein. Das ausgedehnte Hemmspektrum der Pseudooligosaccharide auf die Importsysteme und den Maltodextrin-Katabolismus von Nahrungskonkurrenten ist durch die roten Pfeile sowie den in rot dargestellten Katabolismus signalisiert (A). Dabei sind zwei mögliche Mechanismen dargestellt: Entweder die Pseudooligosaccharide verhindern die Maltodextrinaufnahme durch Verstopfung der Translokationspore und/oder Belegung des Substrat-Bindeproteins. Oder aber sie werden alternativ zu Maltooligosacchariden importiert.3: Erweitertes Modell des Acarbose-Metabolismus.Die durch die vorliegende Arbeit aufgezeigten Befunde (A-C) sind grau hinterlegt. Die Vermutung einer Beteiligung des ABC-Transporters AcbHFG an der Aufnahme von Acarbose und höheren Homologen konnte unterstützt werden (C). Die als sekundär bewertete Carbophor-Funktion der Acarbose, die das AcbHFG-System benötigt, ist durch schmale Pfeile und kleinere Symbole gekennzeichnet. Freie Maltose oder Maltodextrine bzw. auch die durch AcbD aus der Acarbose entlassene Maltose werden wahrscheinlich über zwei Maltose/Maltodextrin-ABC-Systeme importiert (B) (vgl. Abbildung 7.2). Die assistierende ABC-Domäne aller drei Transporter könnte das MsiKProtein sein. Das ausgedehnte Hemmspektrum der Pseudooligosaccharide auf die Importsysteme und den Maltodextrin-Katabolismus von Nahrungskonkurrenten ist durch die roten Pfeile sowie den in rot dargestellten Katabolismus signalisiert (A). Dabei sind zwei mögliche Mechanismen dargestellt: Entweder die Pseudooligosaccharide verhindern die Maltodextrinaufnahme durch Verstopfung der Translokationspore und/oder Belegung des Substrat-Bindeproteins. Oder aber sie werden alternativ zu Maltooligosacchariden importiert.