Plant-Bacteria Interactions: Molecular Mechanisms of
Phytostimulation by Bacillus amyloliquefaciens FZB42

Dissertation

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Der Humboldt-Universität zu Berlin

von
M. Biotech. Anto   Budiharjo

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. rer. nat. Andreas Herrmann

Gutachter:
1. Prof. i. R. Dr. rer. nat. Rainer Borriss
2. Prof. Dr. rer. nat. Thomas Börner
3. PD. Dr. Joachim Vater

Datum der Promotion: 20 Mai 2011

Summary

Bacillus amyloliqufaciens FZB42 has been known as PGPR which has an impressive effect to improve plant growth. It produces not only vast array of secondary metabolites with antibacterial and antifungal activities, but also produces the plant hormone IAA. Although many mechanisms have been elucidated, our knowledge about basic molecular mechanisms responsible for its beneficial action is far from complete. In this study, transposon mutagenesis based on mariner tranposon was applied to generate tranposon library which then was screened to identify the genes involved in plant growth-promoting activity. Three mutants that were impaired in their ability to colonize plant surface due to defects in biofilm formation and swarming motility were found. One mutant (degU mutant) showed defect in biofilm formation and swarming motility, as well, two mutants (yusV mutant and pabB mutant) impaired in biofilm formation were confirmed by complementation and retransformation. Screening by the Lemna biosystem and further assays with A. thaliana revealed three genes responsible for reduction in plant growth promoting activity of B. amyloliqufaciens FZB42. Colonization studies of these mutants in A. thaliana roots revealed patterns different to the wild type. A further issue pursued in this study was to discover new antibiotics using a mutant which has been blocked in its nonribosomally pathway. Screening of tranposon librabries from this mutant led to the finding of two novel ribosomally synthesized antibiotics. Further characterization revealed that these new antibiotics belonged to a novel bacteriocin (Amylocyclicin A) and a novel thiazole/oxazole-modified microcin (Plantazolicin). Last work in this study was looking for genes responsible for nematocidal production. Four mutants which showed reduction in nematocidal activity due to transposon insertion were found.

Keywords: B. amyloliquefaciens FZB42, PGPR, transposon mutagenesis, plant growth promotion

Zusammenfassung

Bacillus amyloliquenaciense FZB42 ist ein bekanntes Pflanzenwachstum-stimulierendes Rhizobakterium. Es produziert neben einer Vielzahl an Sekundärmetaboliten mit antibakterieller und antifungaler Wirkung, auch das Pflanzenhormon IAA. Obwohl viele dieser Mechanismen diskutiert werden, ist wenig darüber bekannt, auf welche Weise die Bakterien das Pflanzenwachstum fördern. In dieser Arbeit wurde eine Transposonmutagenese mithilfe des ‘mariner-transposons’ durchgeführt, und so eine Transposonbibliothek erstellt. Diese wurde dann auf geeignete Phänotypen untersucht, um die Gene zu finden, welche bestimmte Phänotypen verursachen. So konnten drei Mutanten erzeugt werden, die auf Grund der gestörten Biofilmbildung und der Fähigkeit zu schwärmen die Pflanzenwurzeln nicht mehr kolonialisieren konnten. Eine solche degU-Mutante, welche in der Biofilmbildung und ‚Swarming’ defizitär war und zwei Mutanten (yusV und pabB), die eine Beeinträchtigung in der Biofilmbildung aufwiesen, konnten durch Komplementation und Retransformation bestätigt werden. Mithilfe des Lemna-Biosystems und anderer Analysen mit A. thaliana konnten drei Gene bei B. amyloliqufaciens FZB42 gefunden werden, die wichtig für die Förderung des Pflanzenwachstums sind. Koloniesierungsexperimente der Wurzeln von A. thaliana mit diesen Mutanten zeigten deutlich verändertes Wachstum, verglichen mit dem Wildtypstamm. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es neue Antibiotika in Mutanten, die in ihren nicht-ribosomalen Synthesen blockiert sind, zu finden. So konnten durch die Untersuchungen der Transposonbibliothek der Mutanten zwei neue Antibiotika entdeckt werden. Genauere Analysen dieser Antibiotika bestätigten, dass es sich um ein neues Bacteriocin (Amylocyclicin A) und ein neues Thiazol/Oxazole-modifiziertes Microcin (Plantazolicin) handelt. Die abschließenden Arbeiten beschäftigten sich dann mit Untersuchungen von Genen, welche für die Produktion von Substanzen gegen Nematoden verantwortlich sind. Hierbei konnten vier Mutanten gefunden werden, die durch eine Transposoninsertion eine schlechtere.

Eigene Schlagworte: B. amyloliquefaciens FZB42, Pflanzenwachstum-stimulierendes Rhizobakterium, Transposonmutagenese, Pflanzenwachstum förderung

Inhaltsverzeichnis

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13.10.2011