Kristina Büscher: Expression und biologische Funktion von humanen endogenen Retroviren (HERVs), insbesondere von HERV-K

Kristina Büscher: Expression und biologische Funktion von humanen endogenen Retroviren (HERVs), insbesondere von HERV-K
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Anhang

I. Primer und Sonden

Primer und Sonde: Sigma-Genosys, Steinheim, Deutschland

Tabelle 1: verwendete Pimer und Sonden

Bezeichung	Lokalisation	Sequenz 5´→ 3´
GAPDH for	Glycerinaldehyd-3-posphatdehydogenase	5´CTCAGTGTAGCCCAGGATGC	60°C
GAPDH rev	Glycerinaldehyd-3-posphatdehydogenase	5´ACCACCATGGAGAAGGCTGG	60°C
hsGAPDH for	humane Glycerinaldehyd-3-posphatdehydogenase	5´GGCGATGCTGGCGCTGAGTAC	60°C
hsGAPDH rev	humane Glycerinaldehyd-3-posphatdehydogenase	5´TGGTCCACACCCATGACGA	60°C
MART-1 for	Melanona Antigen recognized by T-Cell -1	5´ACTGCTCATCGGCTGTTGGTATTG	58°C
MART-1 rev	Melanona Antigen recognized by T-Cell -1	5´TTTCAGCATGTCTCAGGTGTCTCG	58°C
HERV-H for	HERV-H gag	5´CTTTTATTACCCAATCTGCTCCCGAYAT ¹	50°C
HERV-H rev	HERV-H gag	5´TTTAGTGGTGGACAGTCTCTTTTCCARTG ²	50°C
HERV-R for	HERV-R env	5´CCATGGGAAGCAAGGGAACT	50°C
HERV-R rev	HERV-R env	5´CTTTCCCCAGCGAGCAATAC	50°C
HERV-W for	HERV-W pol	5´GGCCAGGCATCAGCCCAAGACTTG	50°C
HERV-W rev	HERV-W pol	CTTTAGGGCCTGGAAAGCCACT	50°C
rekTM for	HERV-K env (gp36)	5´CTGgAtCcGGAGTTGCATTGCACTCTTCTG ^3,4	55°C
rekTM rev	HERV-K env (gp36)	5´GAGAagctT ttaCGTAGTACTTCCAATGGTC ^3,5,6	55°C
np9-G	HERV-K np9aus Armbrüster 2004	5´cgcgcggatccATGAACCCATCGGAGATGCAA ^3,4	58°C
np9-H	HERV-K np9aus Armbrüster 2004	5´cgcgcggatccACAGAATCTCAAGGCAGAAG ^3,4



P1	HERV-K LTR (U5)	5´GAGGCTGGCGGGATCCTC	60°C
P2	HERV-K LTR (leader)	5´GAAGGTACGCTCGAGCGTAATCATTGAG
P3	HERV-K gag	5´GAGCCATTACCGGCTCTGCTACATATTCG
P4	HERV-K pol	5´GTACCACTCCTCAGATGCAACTTAATCTAGC
P5	HERV-K env (SU)	5´GTGACATCCCGCTTACCATGTGATAAGTG
P6	HERV-K env (gp36)	5´CGTCTAACCATGTCCCAGTGATGC
P7	HERV-K env (gp36)	5´ACAAAGCTTCCTACGTCATCATGGCCCG
np9 for	HERV-K np9aus Armbrüster 2004	5´ATGAACCCATCGGAGATGCAA	58°C
np9 rev	HERV-K np9aus Armbrüster 2004	5´ACAGAATCTCAAGGCAGAAG	58°C
HERV-K Sonde	HERV-K	FAM-5´AGGTACGCTCG AGCGTGGTCATTGAGG	67°C
Pfor	HERV-K LTR (leader)	5´CCAACGTGGAGGCTTTTCTCTAG	54°C
PrevVL	HERV-K VL	5´CCTGCTTGTTTTAGTTTCCTTACCA
PrevENV	HERV-K env	5´AGGGAGACTTACCACCATTGATAC
PrevREC	HERV-K rec	5´GGGTATACCTGCAGACACCATTG
PrevNP9	HERV-K np9	5´GTACACCTGCAGTCTCCGTCTCC
1 Y=Pyrimidin Base: C oder T , 2 R=Purin Base: G oder A, 3 a,c,g oder t nicht komplementäre Basen, 4 BamHI Schnittstelle ist fett dargestellt, 5 HindIII Schnittstelle ist fett dargestellt, 6 Stop Codon ist doppelt unterstrichen

Tabelle 1: verwendete Pimer und Sonden

kommerzielle Primer für die Sequenzierung
malE	MBP-Region in pMAL	5´GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC	60°C
T7 Promotor	T7-Promotor pCALn	5´TAATACGACTCACTATAGGG	50°C
T7 Terminator	T7-Terminator pCALn	5´GCTAGTTATTGCTCAGCGG	50°C
M13 reverse	M13 reverse priming site in pCR4-TOPO	5´CAGGAAACAGCTATGAC	55°C
M13 forward	M13 forward priming site in pCR4-TOPO	5´GTAAAACGACGGCCAG	55°C
T3	T3 priming site in pCR4-TOPO	5´ATTAACCCTCACTAAAGGGA	55°C
T7	T7 priming site in pCR4-TOPO	5´TAATACGACTCACTATAGGG	55°C

II. Melanomgewebe und -zellen

Tabelle 2: Expression in Melanomgeweben und -zellen

Gewebe		DNA	MART-1	Expression von HERV-K				Expression HERVs			klinische Daten
Gewebe		DNA	MART-1	VL	env	rec	np9	H	R	W	Alter1	Geschlecht	Tumor-dicke²	Stadium³	Typ⁴
1	VH	-	+	+	-	-	+	+	+	-	81	m	n.b	n.b	l
2	OL	-	+	+	-	-	-	+	+	-	41	m	n.b	n.b	n.b
3	WR	-	+	+	-	-	-	+	+	-	72	m	n.b	IV	k
4	BC5
5	PV	-	+	+	-	-	-	+	+	-	81	w	n.b	III	k
6	SV5
7	SE	-	+	+	+	+	-				86	w	n.b	IV	k
8	KLM	-	+	+	+	+	+	+	+	-	50	m	n.b	III	l
9	LG	-	+	+	-	-	-	+	+	-	75	m	n.b	III	l
10	HK	-	+	+	-	-	-	+	+	-	42	w	n.b	IV	k
11	SC	-	+	+	+	+ (hel)	-	+	+	-	64	m	n.b	III	l
12	SR	-	+	+	-	-	+	+	+	-	60	m	n.b	n.b	l
13	LH7	-	+	+	-	-	-	+	+	-	71	w	n.b	n.b	n.b
14	KH	-	+	+	-	-	-	+	+	-	64	w	n.b	III	k
15	LA	-	+	+	-	-	-	+	+	-	44	m	n.b	IV	k
16	JA	-	+	+	+/-	-	+	+	+	-
17	HÖK5
18	HI	-	+	+	-	+	-				67	w	n.b	IV	brain
19	SG5
20	WD	-	+	+	-	-	-	+	+	-	59	m	n.b	IV	l
21	TB	-	+	+	+	+ (hel)	+	+	+	-	58	w	n.b	IV	l
22	FM	-	+	+	+	+	+/-	+	+	-	28	w	n.b	IV	lung
23	KOH5
24	BN	-	+	+	-	-	-	+	+	-	44	m	n.b	III	l
25	SD5
26	GW	-	+	+/-	-	-	-	+	+	-
27	LU	-	+	+	-	-	-	+	+	-	69	w	n.b	III	k
28	MA	-	+	+	+	+ (hel)	-	+	+	-	58	w	n.b	IV	l
29	FE	-	+	+	+	+ (hel)	/-	+	+	-	80	w	n.b	III	l
30	LAN	-	+	+	-	+/-	-	+	+	-	65	m	n.b	III	l
31	GB	-	+/-	+	-	-	-	+	+	-	42	w	n.b	IV	lung
32	AA	-	+	+	+	+	+	-	+	-	62	m	n.b	IV	l
33	AB	-	+	+	+/-	+/-	-	-	+	-	68	m	1,1	IV	k
34	AC	-	+	+	+	+/-	-	+	+	+/-	69	w	n.b	IV	k
35	AD	-	+	+	-	-	-	-	+	-	55	w	n.b	III	l
36	AE	-	+	+	-	-	-	+	+	-	56	w	n.b	IV	k
37	AF	-	+	+	+/-	+ (hel)	-	-	+/-	-	39	m	1	IV	n.b
38	AG	-	+	+	-	+	-	-	+/-	-	80	w	0,64	IV	k
39	AH	-	+	+	+	+	-	-	+	-	44	w	n.b	IV	k
40	AI	-	+	+	-	-	-	-	+	+	47	m	n.b	IV	l
41	AJ	-	+	+	-	-	-	+	+	+/-	46	m	10	IV	k
42	AK	-	+	+	-	-	-	+/-	+	-	63	m	5	IV	l
43	AL	-	+	+	-	-	+	+	+	+
44	AM	-	+	+	-	-	-	+	+	+
45	AN	-	+	+	-	-	+	+	+	-
46	AO	-	+	+	+	+	+	+	+	+
47	AP	-	+	+	-	-	-	+	+	+
48	AQ	-	+	+	+	+	+	+	+	-
49	AR	-	+	+	-	-	-	+	+	+
50	AS	-	+	+	+	+/-	-	+	+	+/-
51	AT	-	+	+	+	+	+	+	+	-
52	AU	-	+	+	-	-	+	+	+	+
53	AV	-	+	+	-	-	-	+	+	+
54	AW	-	+	+	-	-	-	-	+/-	-
55	AX	-	+	+	-	-	-	+	+	-
Zelllinien		DNA	MART-1	Expression HERV-K				Expression HERVs			klinische Daten
Zelllinien		DNA	MART-1	VL	env	rec	np9	H	R	W	Alter¹	Geschlecht	Tumor-dicke²	Stadium³	Typ⁴
1	BA	-	+	+	+	+ (hel)	-	-	+	+	41	w	4	III	k
2	GL	-	+	+	-	-	-	-	+	+
3	KU	-	+	+	-	-	-	+	+	+	61	m	5	IV	k
4	LAU	-	+	+	+	+ (hel)	-	-	+	+	52	m	n.b	III	k
5	MA6	-	+	+	-	-	-	-	+	+	59	w	n.b	n.b	n.b
6	POS	-	+	+	-	-	-	-	+	+
7	RA	-	+	+	-	-	-	-	+	+	84	w	3,7	IV	k
8	SCHM	-	+	+	+	+	+	-	+	+	55	w	2	IV	k
9	SCHW	-	+	+	+	+	+	-	+	+	42	w	4	IV	k
10	SO	-	+	+	-	-	-	-	+	+	59	m	5	IV	l
11	TR	-	+	+	+	+					69	w	n.b	IV	l
12	ZD	-	+	+	-	-	-	-	+	+	55	m	5	IV	k
13	ZO	-	+	+	+	+ (hel)	-	-	+	+	64	w	2,55	III	k
32	AA	-	+	+	+	+	-	-	-	-	62	m	n.b	IV	l
33	AB	-	+	+	-	-	-	-	+/-	-	68	m	1,1	IV	k
34	AC	-	+	+	+	+	-	+	+	+	69	w	n.b	IV	k
35	AD	-	+	+	-	-	-	+	+	-	55	w	n.b	III	l
36	AE	-	+	+	-	-	-	+	+	+/-	56	w	n.b	IV	k
37	AF	-	+/-	+	-	-	-	+	+	+/-	39	m	1	IV	n.b
38	AG	-	+	+	-	-	-	+/-	+	+/-	80	w	0,64	IV	k
39	AH	-	+	+	+	+	-	+	+	-	44	w	n.b	IV	k
40	AI	-	+/-	+	-	-	-	+/-	+	-	47	m	n.b	IV	l
41	AJ	-	+	+	-	-	-	+	+	+	46	m	10	IV	k
42	AK	-	+/-	+	-	-	-	+	+	+	63	m	5	IV	l
43	AL	-	+	+	-	-	-	+/-	+	-
44	AM	-	+	+	-	-	-	+/-	+	+
45	AN	-	+	+	+	+	+	+	+	+
46	AO	-	+	+	+	+	-	+	+	+
47	AP	-	+	+	+	+	+	+	+	+
48	AQ	-	+	+	-	-	-	+	+	+/-
49	AR	-	+	+	-	-	-	+	+	-
50	AS	-	+	+	-	+/-	+	+	+	+
51	AT	-	+	+	+	+	+	+	+	+
52	AU	-	+	+	-	-	-	+	+	-
53	AV	-	+	+	-	-	-	+	+	+
54	AW	-	-	+	-	-	-	+	+	+
55	AX	-	+	+	-	-	-	+	+	+
+ Expression, +/- schwache Expression, - keine Expression, n.b. nicht bestimmt, 1 Alter bei der ersten Tumordiagnose, 2 Tumordicke in mm, 3 Stadium nach American Joint Committee on Cancer 2001 (siehe Einleitung Seite 18), 4 k – kutane Metastase l - Lymphknotenmetastase, 5 PCR ist durch Melanin inhibiert, 6 Brustkarzinom, 7 Merkelzellkarzinom, hel 1,5kB Fragment zusätzlich zu rec vorhanden
Kontrollzellen		DNA	MART-1	Expression von HERV-K				Expression HERVs
Kontrollzellen		DNA	MART-1	VL	env	rec	np9	H	R	W
56	Jurkat	-	-	+	-	-	-	+	+	+
57	A 27/80	-	-	+	-	-	-	+	+	+/-
58	HL60	-	-	+	-	-	-	+	+	+
59	U 87	-	-	+	-	-	-	+	+	-
60	SW 620	-	-	+	-	-	-	+	+	+
61	7774	-	-	+	-	-	-	+	+	+/-
62	SW 480	-	-	+	-	-	-	+	+	+/-
63	Hacat	-	-	+	-	-	-	+	+	+
64	120/87	-	-	+	+/-	-	-	+	+	+
65	257/85	-	-	+	-	-	-	+	+	+
66	K 562	-	-	+	-	-	-	+	+	+
67	Namalwa	-	-	+	-	-	-	+	+	+
68	SK70V3	-	-	+	+/-	-	-	+	+	+/-
69	D 181/80	-	-	+	-	-	-	+	+	+/-
70	EA 14	-	-	+	-	-	-	+	+	+/-
71	A 431	-	-	+	-	-	-	-	+	+

III. verwendete Seren und Antikörper

Tabelle 3: verwendete Antikörper

Bezeichnung	spezifisch für	Verdünnung	Herkunft
Ziege 7	HERV-K TM	1:500
Ziege 26	HERV-K TM	1:500
Kaninchen 3	HERV-K Rec	1:100	Dr. Löwer
Kaninchen 4	HERV-K Rec	1:450	Dr. Löwer
Ziege 29	HERV-K Np9	1:100
GAPDH	humanes GAPDH	1:100	abcam
β-Aktin	β-Aktin	1:100	Sigma
HMB45	humanes gp100	1:50	DAKO
Tyrosinase	humane Tyrosinase	1:50	Novocastra
α- Ziege	Ziegen IgGs	1:2000	DAKO
α- Kaninchen	Kaninchen IgGs	1:2000	DAKO
α- Maus	Maus IgGs	1:2000	DAKO
LSAB-Kit	Kaninchen, Ziege und Maus Ig´s	1:500	DAKO
α- Human	humane IgGs, IgA, IgM	1:2000	Sigma
α- Ziege IF	Ziegen IgGs	1:200	Sigma

Tabelle 4: verwendete Patientenseren

Patient		HERV-K TM Antikörper	HERV-K Np9 Antikörper	Klinische Daten
Patient		HERV-K TM Antikörper	HERV-K Np9 Antikörper	Alter¹	Geschlecht	Tumordicke²	Stadium³
1		+	-	72	w	2,7	III
2		+	-	36	w	19	IV
3		+	-	65	m	4,5	I
4		+	-	51	w	2	IV
5		+	-	31	m	n.b.	IV
6		+	-	82	w	6,5	III
7		+	-	70	m	1,24	III
8		+	-	60	m	3	I
9		+	-	39	w	1,1	I
10		+	-	79	m	13	II
11		+	-	59	m	2	II
12		+	-	40	w	n.b.	III
13		+	-	80	w	1,35	III
14		+/-	-	20	m	1,8	II
15		+/-	-	68	m	1,1	III
16		+/-	-	29	w	1,3	III
17		+/-	-	77	w	1,45	II
18		+/-	-	55	m	2,16	III
19		+/-	-	53	m	1,51	III
20		+/-	-	80	m	0,22	I
21		+/-	-	69	m	1,38	I
22		+/-	-	83	w	n.b.	I
23		-	-	62	w	2,5	II
24		-	-	71	m	1	I
25		-	-	49	w	3,2	III
26		-	-	65	m	0,26	III
27		-	-	40	m	1,2	III
28		-	-	52	m	0,95	I
29		-	-	47	m	n.b.	IV
30		-	-	52	m	0,99	III
31		-	-	40	m	0,96	III
32		-	-	62	m	2,4	I
33		-	-	62	w	2,86	II
34		-	-	90	w	0,65	II
35		-	-	49	w	3,2	IV
36		-	-	64	m	n.b.	IV
37		-	-	61	m	n.b.	IV
38		-	-	16	m	n.b.	III
39		-	-	67	m	3,5	III
40		-	-	68	m	1,8	IV
41		-	-	43	m	n.b.	IV
42		-	-	38	m	1,25	II
43		-	-	43	w	1,84	III
44		-	-	44	w	n.b.	II
45		-	-	45	m	0,5	III
46		-	-	51	m	2,79	IV
47		-	-	74	m	7	III
48		-	-	76	m	4	III
49		-	-	49	m	0,64	I
50		-	-	60	m	1,25	I
51		-	-	73	w	0,59	I
20		-	-	60	w	1,25	II
53		-	-	62	m	0,9	III
54		-	-	56	w	0,43	III
55		-	-	40	m	2,1	III
56		-	-	84	w	3,7	III
57		-	-	56	w	0,8	IV

58		-	-	63	m	0,62	I
59		-	-	60	m	4,22	III
60		-	-	83	w	n.b.	III
61		-	-
62		-	-
63		-	-
64		-	-
65		-	-
66		-	-
67		-	-
68		-	-
69		-	-
70		-	-
71		-	-
72		-	-
73		-	-
74		-	-
75		-	-
76		-	-
78		-	-
79		-	-
80 bis 100		negativ Kontrollen, Allopeziepatienten
101	AA	-	-	62	m	n.b	IV
102	AB	+	-	68	m	1,1	IV
103	AC	-	-	69	w	n.b	IV
104	AD	-	-	55	w	n.b	III
105	AF	-	-	56	w	n.b	IV
106	AG	-	-	39	m	1	IV
107	AH	-	-	80	w	0,64	IV
108	AI	-	-	44	w	n.b	IV
109	AJ	-	-	47	m	n.b	IV
110	AK	+	-	46	m	10	IV
111	AL	+	-	63	m	5	IV
112	AM	-	-
113	AN	-	-
114	AO	-	-
116	AQ	+	-
117	AR	-	-
118	AS	-	-
119	AT	-	-
120	AU	-	-
121	AV	-	-
122	AW	-	-
123	AX	-	-

25 Seren normaler Blurspender		negativ Kontrollen
+ positive Reaktion, +/- schwache Reaktion, - keine Reaktion, n.b. nicht bestimmt, 1 Alter bei der ersten Tumordiagnose, 2 Tumordicke in mm, 3 Stadium nach AJCC 2001 (siehe Einleitung Seite 18)

IV. Alignment der sequenzierten PCR-Transkripte von HERV-K

A Volllängen Transkripte

Verwendete HERV-K aus der NCBI DatenBank: HERV-K 101, 103, 113 und 115 (Accrnrs. AF164609, AF164611, AY037928 und AY037929), HERV-K HML2.HOM (Accnr. AF074086), HERKLTGAG (Accnr. Y08032) und HERV-K C7 (Accnrs. Y17832).

B Env Transkripte

Verwendete HERV-K env-mRNA aus der NCBI DatenBank: HERV-K 113 env (Accrnr. AY037928), HERV-K MERV env (Accnr. DQ058015) und HERV-K env (Accnr. M14123)

V. Plasmidkarten

pMAL HERV-K TM/gp36

Aminosäuresequenz des translatierten Fusionsproteins:
NH₂MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGSTSNGRQCAGIRLGSGVALHSSVQSVNFVNDWQKNSTRLWNSQSSIDQKLANQINDLRQTVIWMGDRLMSLEHRFQLQCDWNTSDFCITPQIYNESEHHWDMVRHHLQGREDNLTLDISNLKEQIFEASKPILNLVPGTEAIAGVADGLANLNPVTWVKTIGSTT-COOH

* bezogen auf HERV-K HML2.HOM; Accnr.Q69384
Die Klonierung erfolgte mit den Primern rekTM-forward und rekTM-reverse; Seite I
pMAL c2X: New England Biolabs

pCALn HERV-K/Np9

Aminosäuresequenz des translatierten Fusionsproteins:
NH₂MKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGALLVPRGSMNPSEMQRKGPPRRCLQVYPTAPKRQRPSRTGHDDDGGFVEKKRGKCGEKQERSDCYCVCVERSRHRRLHFVMC-COOH

* bezogen auf HERV-K; Armbrüster et al. (2002)
Die Klonierung erfolgte mit den Primern np9-G und np9-H; Seite I
pCALn: Stratagene

pHygEGFP (BD Bioscience, Palo Alto, CA, USA)

pCR4®-TOPO® (Invitogen)

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