3. Material und Methoden

↓19

3.1  Chemikalien

↓20

Wenn nicht anders in den Protokollen aufgeführt, wurden alle verwendeten Chemikalien von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) bezogen.

3.2 Zellbiologische Methoden

3.2.1  Melanomgewebe

Alle verwendeten Melanomgewebe wurden von Dr. Trefzer und Dr. Hofmann von der Dermatologie der Charité, Berlin zur Verfügung gestellt (siehe Anhang Seite IV). Bei den hier verwendeten Gewebestücken handelt es sich ausschließlich um Melanommetastasen. Ein Teilstück der Metastasen wurde sofort nach der Entnahme eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.

3.2.2 Zellen und Medien

In der Dermatologie der Charité wurden aus Melanommetastasen Zelllinien etabliert und zur Verfügung gestellt (siehe Anhang Seite V). Des weiteren wurden dort die Nicht-Melanomzelllinien kultiviert und als Kontrollen ebenfalls zur Verfügung gestellt: Jurkat (T-Lymphoblasten), HL60 (Promyeloblasten), A27/80, 7774 und SK70V3 (ovariale Karzimome), U87 (Astrozytome, Grad III), SW620 und SW480 (kolorectale Adenocarcinome), Hacat (Keratinozyten), 120/87 (Mammakarzinom), 257/85 (Magenkarzinom), K562 (Knochenmark, chronische myelogene Leukämie), Namalwa (B- Lymphocyten), D181/85 (Pancreas), EA14 (Gliom) und A431 NS (epidermales Karzinom), alle von der American Type Culture Collection (ATCC/LGC Promochem, Wesel, Deutschland, siehe Anhang Seite V).

↓21

Alle weiteren verwendeten Zelllinien wurden bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC, UK), bei ATCC oder Cascade Biologics (über LGC Promochem) bestellt, die jeweiligen Katalognummern sind angeben (siehe Tabelle 1).

Medien und Zusätze:

Die Medien DMEM 4,5g/L Glucose (Biochrom KG, Berlin, Deutschland), RPMI (Invitrogen, Karlsruhe Deutschland) und McCoy´s 5A (Biochrom) wurden jeweils mit 10% (v/v) FBS (Biochrom) 2mM L-Glutamin (200mM; Biochrom), 100U/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin (Penicillin 10000U/ml, Streptomycin 10mg/ml; Biochrom) und 15mM HEPES (1M; Biochrom) versetzt. Für SK-MEL 28 und SK-MEL-1 Zellen wurden 1,5g/l Natrium-Hydrogencarbonat anstelle von HEPES verwendet. Wie in Tabelle1 angegeben wurden folgende weitere Zusätze verwendet: 1% (v/v) Non Essential Amino Acids (NEAA) und 1mM Natrium-Pyruvat (1M). Neonatale Melanozyten wurden mit Medium 154 (Cascade Biologics) und folgenden Zusätzen kultiviert: Human Melanocyte Growth Supplement (HMGS; Cascade Biologics) und Penicillin, Streptomycin, & AmphotericinB (PSA; Cascade Biologics).

↓22

Des weiteren wurden PBS ohne Kalzium und Magnesium (Biochrom), Trypsin (0,25%) und Hygromycin (50mg/ml; beides Invitrogen) verwendet.

Zellen:

Tabelle 1: verwendete Zelllinien

Zellen

Zellart/Herkunft

Spezies

Medium

Zusätze

GH

Teratokarzinom-Zelllinie

human

DMEM

293

embryonale Nierenzelllinie

human

DMEM

ATCC CRL-1573

MEWO

malignes Melanom

human

DMEM

ECACC 93082609

NEAA

G-361

caucasian malignes Melanom

human

McCoy´s 5A

ECACC 88030401

GR-M

caucasian Melanom

human

RPMI

ECACC 95032301

SK-MEL-28

malignes Melanom der Haut

human

DMEM

Na-Pyruvat

ATCC HTB-72

NEAA

NaH2PO4

SK-MEL-1

malignes Melanom der Haut

human

DMEM

Na-Pyruvat

ATCC HTB-67

NEAA

Na2HCO3

Melanom- Zelllinien

Dermatologie der Charité

human

RPMI

HEMn-LP

neonatale epidermale

human

Medium 154

HMGS

Melanozyten

PSA

Cascade Biologics C-002-5C

HEMn-DP

neonatale epidermale

human

Medium 154

HMGS

Melanozyten

PSA

Cascade Biologics C-202-5C

LNCaP

Prostatakarzimom

human

ATCC CRL-1740

MDBK

Nierenzelllinie

bovine

DMEM

NEAA

ECACC 90050801

PG4

Astrozytenzelllinie

felin

McCoys 5A

NEAA

ECACC 94102703

oder DMEM

3T3

Fibroblasten-Zelllinie

murin

DMEM 

ATCC CCL-92

PK15

Nierenzelllinie

porcin

DMEM

ATCC CCL-33

3.2.3 Kulturbedingungen für immortalisierte Zelllinien

↓23

Das Wachstum von immortalisierten Zelllinien wird prinzipiell nur durch das Angebot an Platz und Nährstoffen limitiert. Daher müssen Zellen in Kultur in regelmäßigem Abstand (je nach Zelllinie alle 2-4 Tage) mit frischem Nährmedium versorgt und/oder verdünnt werden. Suspensionszellen (hier nur SK-MEL-1) können direkt verdünnt werden, adhärent wachsende Zellen dagegen, müssen dazu vom Untergrund gelöst werden. Dies kann entweder durch mechanische Methoden (Zellschaber) oder durch proteolytischen Verdau der Adhäsionsproteine durch Trypsin geschehen. Alle Zellkulturversuche fanden unter sterilen L3*** in dafür vorgesehen Sterilbänken (Kendro, Langensebold, Deutschland) mit laminarem Luftstrom statt. Sowohl Suspensionszellen als auch adhärent wachsenden Zellen wurden in Zellkulturflaschen (T25, T75 und T150 von TPP, Schweiz) mit den entsprechenden Medien kultiviert (siehe oben). Zum Passagieren der Zellen wurde das Medium aus den Kulturflaschen komplett entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen. Zum Ablösen der Zellen von der Oberfläche wurden sie mit 3 bis 7ml Trypsin für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Ablösung der Zellen wurde unter dem Mikroskop kontrolliert und durch die Zugabe der doppelten Menge serumhaltigen Mediums beendet. Die abgelösten Zellen wurden durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vereinzelt, die Suspension in Zentrifugenröhrchen überführt, für 5 Minuten bei 500g zentrifugiert und das Pellet resuspendiert. Je nach Zellart wurde ein Zehntel bis ein Drittel der Zellsuspension mit frischem Vollmedium auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt. Suspensionszellen wurden zunächst bei 500g für 5min. pelletiert, dann in 10-20ml Vollmedium aufgenommen und die Zellen vereinzelt. Ein Drittel der Zellsuspension wurde mit frischem Vollmedium auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt. Alle Zellen wurden bei 37°C, 95% Luftfeuchte und 5% CO2 im Brutschrank (Kendro) inkubiert.

3.2.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Die langfristige Lagerung von Zellen über mehrere Jahre ist nur in flüssigem Stickstoff bei -196°C möglich. Um zu gewährleisten, dass möglichst wenige Zellen beim Einfrierprozess in Folge der Bildung von Eiskristallen im Zellinneren Schaden nehmen, müssen diese mit einem „Frostschutzmittel“ eingefroren werden. Die Zellen wurden in Suspension gebracht, vereinzelt (siehe 3.2.2) und bei 500g für 5 Minuten pelletiert. Bis zu 2x106 Zellen wurden in 1ml vorgekühltem FBS mit 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) aufgenommen und in ein 2ml Kryogefäß überführt. Die Röhrchen wurden für einige Stunden bei -20°C eingefroren und dann in einer verschlossenen Styroporbox bei -80°C über Nacht gelagert. Nach einem Tag wurden die Zellen in einen Kryotank gegeben. So wird sichergestellt, dass der Einfrierprozess langsam abläuft und die Zellen geschont werden.

↓24

Zum Auftauen der Zellen wurden die Kryogefäße im Wasserbad bei 37°C möglicht schnell aufgetaut und der Inhalt in eine Kulturflasche überführt, in die bereits warmes Vollmedium vorgelegt war.

3.2.5 Bestimmung der Vitalität und der Zellzahl mit Trypanblau

Trypanblau ist ein Farbstoff, der durch die Membran lebender Zellen zurückgehalten wird, tote Zellen mit poröser Zellmembran sind für den Farbstoff permeabel und färben sich blau. Mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer kann so die Gesamtzellzahl ermittelt und gleichzeitig die Zellen auf ihre Vitalität überprüft werden. Hierzu werden gleiche Volumina (20µl) Zellsuspension (siehe 3.2.2) und 0,4% Trypanblau-Lösung gemischt und in einer Neubauer-Zählkammer rasch ausgezählt, da Trypanblau nach kurzer Zeit auch lebende Zellen anfärbt. Durch Auszählen der Zellen in allen vier Großquadraten kann die Zellzahl berechnet werden

3.2.6 Transfektion von Zellen

Für spätere Ansätze zur Kokultivierung wurden 293, PG4 und MDBK Zellen mit einem Selektionsmarker transformiert. Hierzu wurde der Vektor pHygEGFP (BD Biosciences Palo Alto, CA, USA) verwendet (siehe Anhang Seite XVIII). Hygromycin, wirkt auf die Proteinsynthese am 80s Ribosom und die optimale Konzentration liegt zwischen 255-1000µg/ml. Zunächst wurde die Konzentration an Selektionsreagenz ermittelt, bei welcher sensitive Zellen binnen einer Woche absterben. Hierzu wurden 60.000 Zellen/well in eine 6-well Platte gesät und über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurden 0, 150, 300, 450, 600 und 700µg/ml Hygromycin zugegeben und der Verlauf der Kultivierung die nächsten Tage unter dem Mikroskop kontrolliert.

↓25

Zur Transfektion wurden die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen/cm2 in Zellkulturschalen ausgesät und bis zu 80% Konfluenz in Vollmedium kultiviert. Dann wurden 15ml serumfreies Medium zugegeben und die Zellen über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurden pro Schale 24µg Vektor-DNA mit 1,5ml serum- und antibiotikafreiem Medium gemischt, parallel wurden 60µl des Transfektionsreagenz Lipofectamin 2000 (Invitrogen) mit 1,5ml serum- und antibiotikafreiem Medium gemischt. Beides wurde 5min. bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend gemischt und nochmals 20min. inkubiert. Dann wurde das Gemisch gleichmäßig auf den Zellen verteilt. Nach Inkubation für 24 Stunden im Brutschrank wurde das Medium durch Vollmedium ersetzt und die Zellen weitere 48 Stunden kultiviert. Zur Selektion wurden nun 500µg/ml Hygromycin in Vollmedium zugegeben und die Zellen weiter kultiviert. Die vollständige Selektion wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop überprüft.

3.2.7 Infektion von Zellen mit HERV-K

Infektion mit virushaltigem Überstand

Zur Infektion mit HERV-K wurden virusproduzierende Zellen (hier SK-MEL-28 und GH) in T150 Flaschen mit 100.000 Zellen/cm2 ausgesät und drei Tage kultiviert. Das Medium wurde aus den Flaschen in Röhrchen überführt und bei 500g für 5min. pelletiert. Der so erhaltene zellfreie Überstand wurde durch einen 0,45µm Sterilfilter (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) filtriert und zu den zu infizierenden Zellen gegeben. PG4, MDBK und 3T3 wurden mit HERV-K Überstand infiziert. Der Versuch wurde jeweils ohne und mit 6µg/ml Polybrene durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht wurde das Medium gegen frisches ausgetauscht. Die Infektion erfolgte alle vier Tage bis zu zehn Mal in Folge. Anschließend wurden die Zellen weitere 14 Tage in Kultur gehalten und bei jeder Passage ein Aliquot zur Bestimmung der Provirusintergration genommen.

↓26

Infektion durch Kokultivierung

Die Infektion mittels Kokultivierung bietet den Vorteil, dass zwischen den Zellen Kontakte entstehen können, welche die Infektion erleichtern. Hierzu wurden virus-produzierende SK-MEL-28-Zellen zusammen mit den zu infizierenden Zellen PG4p/HygEGFP, MDBK/pHygEGFP und 293/pHygEGFP (siehe 3.2.5) kultiviert. Zur Kokultivierung wurden insgesamt 10.000 Zellen pro Fasche in den Verhältnissen 1:2, 1:1, 2:1 und 3:1 SK-MEL-28 zu PG4/pHYG, MDBK/pHYG bzw. 293/pHYG ausgesät. Die Kokultivierung erfolgte für 14 Tage in normaler Kultivierungsroutine. Anschließend wurde Selektions-medium, Vollmedium mit 500µg/ml Hygromycin, zugegeben, um die Hygromycin sensitiven SK-MEL-28-Zellen abzutöten. Die Zellen wurden eine weitere Woche kultiviert. Nach dieser Zeit sollten alle in der Kultur vorhandenen SK-MEL-28-Zellen abgetötet und ausverdünnt worden sein. Die Zellen wurden noch weitere 14 Tage in Kultur gehalten und bei jeder Passage ein Aliquot zur Bestimmung der Provirusintergration genommen.

3.3 Molekularbiologische Methoden

3.3.1  RNA-Aufreinigung

Zur Aufreinigung von RNA, DNA und Protein aus derselben Probe wurde TRI-Reagent von Sigma verwendet. Hierzu wurden kultivierte Zellen mit PBS gewaschen und dann direkt in einer ausreichenden Menge an TRI-Reagent suspendiert. Gewebeproben wurden zunächst in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill (Roth, Karlsruhe, Deutschland) zerkleinert und anschließend im Homogenisatorgefäß mit passendem Kolben (Wheaton, Millville, NJ, USA) in TRI-Reagent homogenisiert. Die Proben können in TRI-Reagent bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

↓27

Zur Trennung der Phasen wurde 1/5 Volumen Chloroform zu den Proben gegeben und nach einer Inkubation für 15min. bei Raumtemperatur mit 12.000g bei 4°C für 15min. zentrifugiert. Es entstanden drei Phasen: die oberste, wässrige Phase enthielt RNA, die weiße Interphase DNA und die untere, organische Phase Protein.

Zur Aufreinigung der RNA aus der wässrigen Phase wurde der RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet. Die wässrige Phase wurde abgenommen in ein neues Gefäß überführt und ab Schritt 4 den Angaben im Protokoll des RNeasy Mini Kits gefolgt. Der im Protokoll optional angegebene Verdau der DNA wurde bei allen Proben durchgeführt. Aufgereinigte RNA wurde mittels OD-Messung quantifiziert (siehe 3.3.3) und bis zu weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.

3.3.2 DNA-Aufreinigung

↓28

Zur Aufreinigung von DNA wurde der aus der RNA Aufreinigung verbleibende Rest TRI-Reagent verwendet. Die DNA wurde nach den Angaben des Herstellers mittels Ethanol ausgefällt und aufgereinigt. Im Anschluss wurde die DNA-Menge über Messung der optischen Dichte quantifiziert (siehe Kapitel 3.3.3) und die Proben bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.

Proben, die nur zur Aufreinigung der DNA dienten, wurden nicht in TRI-Reagent aufgenommen, sondern mit Hilfe des QIAmp Blood Kit Mini (Qiagen) nach dem Protokoll des Herstellers aufgereinigt.

3.3.3 Quantifizierung und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Quantifizierung und die Bestimmung der Reinheit von Nukleinsäuren erfolgte über eine OD-Bestimmung (Photometer Eppendorf). Es wurde die OD bei 260nm (Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren) und 280nm (Absorptionsmaximum von Proteinen) aufgenommen. Aus dem Verhältnis der OD-Werte von 260nm zu 280nm wurde die Proteinverunreinigung bestimmt. Die Proben sollten mindestens ein Verhältnis von 1 zu 1,4 aufweisen.

3.3.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

↓29

Der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) liegt eine spezifische Bindung und Verlängerung zweier der zu amplifizierenden DNA oder cDNA komplementärer Oligonukleotide zugrunde. Diese Oligonukleotide (Primer) flankieren 5` und 3` den zu amplifizierenden DNA-Bereich und dienen als Start der DNA-Amplifikation. Mit Hilfe der PCR lassen sich spezifische DNA-Fragmente, ausgehend von sehr kleinen DNA-Mengen, durch diese zyklisch ablaufende Reaktion exponentiell vermehren (Mullis, et al., 1986). Zunächst wird die Doppelhelix der Ausgangs-DNA (Template) durch Erhitzen auf 95°C in ihre Einzelstränge aufgespalten. Im Anschluss hybridisieren die Primer durch Absenken der Reaktionstemperatur (auf ca. 45-65°C, abhängig von der Schmelztemperatur der Primer) komplementär mit je einem der beiden DNA-Stränge. Bei einer Reaktionstemperatur von 72°C werden die Primer am 3´OH-Ende in der anschließenden DNA-Synthese durch die thermostabile Taq-Polymerase gemäß des Matrizenstranges verlängert, wobei die Syntheserichtungen der beiden Primer gegeneinander gerichtet sind. Diese drei Schritte - Denaturierung der DNA, Hybridisierung der Primer und DNA-Synthese - stellen einen PCR-Zyklus dar. Durch Wiederholung der Zyklen wird theoretisch eine exponentielle Amplifikation des durch die Primer flankierten DNA-Abschnitts erzielt. So kann eine spezifische Sequenz amplifiziert werden.

Ein typischer PCR-Ansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- bis zu 300ng genomische DNA

- 2µl 10x PCR-Puffer (Roche, Mannheim, Deutschland)

- 250nM forward Primer (Sigma-Genosys, Steinheim, Deutschland)

- 250nM reverse Primer (Sigma-Genosys, Steinheim, Deutschland)

- 10nmol dNTP-Mix (10mM each; Peqlab, Erlangen, Deutschland)

- 1-5U Ampli-Taq-Gold DNA-Polymerase (Roche, Mannheim, Deutschland)

add 20µl ddH2O

Da eine einfache Taq-Polymerase schon bei der Vorbereitung der PCR zu unspezifischen Amplifikaten führen kann, wurde ein hot-start Enzym (Hot-Star-Taq-Polymerase) benutzt.

3.3.5 one-step Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)

↓30

Die one-step Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (reverse Polymerase Kettenreaktion) kombiniert die Umschreibung von RNA (siehe 3.3.4) zu cDNA und die anschließende PCR im Einsatz mit genspezifischen Primern. Zunächst fand das Umschreiben der eingesetzten RNA in cDNA bei 45°C für 30min. statt. Dem folgte für 5min. bei 94°C die Inaktivierung der Reversen Transkriptase und gleichzeitige Aktivierung der Taq DNA Polymerase. Im Anschluss wurde eine konventionelle PCR (siehe 3.3.5) mit 35 Zyklen durchgeführt. Es wurde der SuperScript™ One-Step RT-PCR System mit Platinum® Taq DNA Polymerase Kit von Invitrogen verwendet.

Ein typischer RT-PCR Ansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- 100ng gesamt RNA

- 10µl 2x Reaktions-Puffer (0,2mM je dNTP und 1,2mM MgSO4 Endkonzentration)

- 250nM forward Primer (Sigma-Genosys)

- 250nM revese Primer (Sigma-Genosys)

- 0,5µl SuperScript™ Reverse Transkriptase/Platinum® Taq DNA Polymerase Mix

add 20µl ddH2O

3.3.6 Agarosegelelektrophorese von DNA

Agarosegele wurden zur größenspezifischen Auftrennung von DNA-Fragmenten, z.B. nach einer PCR oder einem Restriktionsverdau verwendet. Dabei läuft die negativ geladene DNA im elektrischen Feld Richtung Anode durch ein grobmaschiges Netz aus Zuckerpolymeren. Die ideale Laufbedingung beträgt dabei 5Volt/cm. Je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente wurden 1-2% (w/v) Agarosegele verwendet. Als Größenstandard diente ein kommerziell erhältlicher DNA-Standard (Invitrogen). Die DNA wurde durch einen interkalierenden, UV-detektierbaren Farbstoff (0,5µg/ml Ethidiumbromid) markiert und unter UV-Licht (302nm) fotografisch dokumentiert, hierbei können Banden ab ca. 20ng visuell wahrgenommen werden.

3.3.7 Reverse Transkriptase real-time PCR

↓31

Die real-time PCR ist eine Methode zur gleichzeitigen, spezifischen Amplifikation und Detektion von DNA [Higuchi, et al. 1992] und ermöglicht es, die PCR-Reaktion in allen Zyklen zu verfolgen. Die eigentliche Reaktion verläuft wie bei der konventionellen, semiquantitativen PCR, dem Reaktionsansatz wird aber zusätzlich eine fluoreszenz-makierte Hybridisierungssonde (TaqMan PCR) oder ein DNA-interkalierender Farbstoff zugesetzt. Anfangs wurde der DNA-Interkalator Ethidiumbromid in den PCR-Ansatz integriert, später wurde es durch das weniger giftige und sensitivere SYBR Green® ersetzt. Über eine optische Einheit wird bei beiden Methoden die Fluorenzenz in jedem Zyklus der PCR-Reaktion bestimmt.

Moderne real-time PCR-Verfahren verwenden amplifikatspezifische, fluoreszenz-markierte Sonden. So wird die Signalspezifität erhöht, weil das Signal sowohl von der Bindung von zwei spezifischen Primern, als auch von der Bindung der spezifischen Sonde abhängt. Die Sonde ist ein Oligonucleotid an dessen 5´-Ende ein Reporter- Fluoreszenz-Farbstoff und an dessen 3´-Ende ein Quencher-Farbstoff konjugiert sind. Bei einer intakten Sonde wird durch den geringen Abstand (Förster-Radius) zwischen Quencher und Reporter die Fluoreszenz des Reporters durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) unterdrückt. Während der Elongationphase der PCR trifft die Taq-DNA-Polymerase auf das 5´-Ende der Sonde und der Reporter wird über die 5´-3´-Exonuclease der Polymerase von der Sonde abgespalten, der Abstand von Quencher und Reporter wird zu groß um die UV-Anregung des Reporters zu unterdrücken und detektierbares Licht wird vom Reporter emittiert [Lee et al. 1993]. Die Real-time PCR ermöglicht im Gegensatz zur Standard-PCR einen quantitativen Vergleich der Amplifikate aus zwei Proben und hat einen weiteren, dynamischen Messbereich. Für die real-time PCR wurde der MX4000-Cycler von Stratagene verwendet.

Zur quantitativen Bestimmung mittels real-time PCR wurde ebenfalls eine Reverse Transkriptase PCR verwendet (Invitrogen), um die Variabilität durch die cDNA-Synthese so gering wie möglich zu halten. Zunächst wurden die optimalen Reaktionsbedingungen der Reaktion mit 20ng RNA der positiven Kontrolle GH bestimmt. Hierfür wurde als erstes die Sonde zwischen 300nM und 50nM verdünnt. In einem zweiten Schritt wurden die Primer zwischen 500nM und 100nM verdünnt und bei zwei verschiedenen MgSO4-Konzentrationen (3mM und 5mM) verglichen.

↓32

Hieraus ergab sich der folgende optimale Reaktionsansatz:

- 20ng RNA Template

- 10µl 2x Reaktionspuffer (0,2mM je dNTP und 3mM MgSO4 Endkonzentration)

- 0,5µl ROX Referenz Farbstoff

- 250nM forward Primer (Sigma-Genosys)

- 250nM revese Primer (Sigma-Genosys)

- 200nM Sonde (Sigma-Genosys)

add 20µl ddH2O

Alle Ansätze wurden in mindestens drei Replikaten gemessen mit einer Laufzeit von 45 Zyklen, die Daten einer PCR wurden in jeden Zyklus bei der Annealingtemperatur aufgenommen.

Auswertung der real-time RT-PCR

↓33

Die Analyse der real-time RT-PCR erfolgt digital über die während der RT-PCR aufgenommenen Daten durchgeführt und nicht über eine Gelanalyse. Die Auswertung erfolgte über den Threshold Cycle (CT). Dieser gibt den Zyklus der PCR an, in dem die Fluoreszenz einer Probe das erste Mal deutlich über der Hintergrundfluoreszenz (Schwellenwert) liegt. Hierbei gilt, je mehr Zielgen in der Probe vorhanden ist, desto kleiner ist der CT-Wert.

Die Effizienz der Reaktion bei optimalen Bedingungen kann über die Steigung der Geraden der CT-Werte bei definierten Verdünnungen bestimmt werden (Stratagene Application Note #10). Für akkurate und reproduzierbare Daten sollte die Effizienz nahe bei 100% liegen, d.h. die Template-DNA wird mit jedem Zyklus verdoppelt. Hierfür wurde die GH-RNA seriell zwischen 40ng und 0ng verdünnt und die Effizienz der einzelnen Primer bestimmt.

Für die Berechnung der Effizienz gilt:

Exponentielle Amplifikation = 10(-1/Steigung)

und

Effizienz E = [10(-1/Steigung)] -1

↓34

Die weitere Auswertung erfolgte nach Modifikation der von K.Livak beschriebenen ΔΔCT-Methode [Livak 1997]. Statt der beschriebenen Abgleichung der Proben auf ein Haushaltsgen wurden für jeden Ansatz 50ng Gesamt-RNA verwendet. Für die einzelnen Proben wird dann die Expression relativ zu einem Kalibrator bestimmt. Als Kalibrator wurde GH- oder SK-MEL-28-RNA verwendet. Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate sowie die Bestimmung der relativen Expression von HERV-K wurden mit dem Tabellenkalkulations-Programm Microsoft Excel durchgeführt.

Es gilt:

relative Expression = (1+E) –ΔCT

und

ΔCT = CT Probe – CT Kalibrator

3.4  Proteinchemische Methoden

3.4.1  Protein-Aufreinigung

Zur Protein-Aufreinigung wurde der verbleibende Überstand TRI-Reagent aus der DNA Isolation eingesetzt. Hieraus wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers die Proteine mit Isopropanol ausgefällt und aufgereinigt. Proteine wurden in 1% SDS bei -20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

↓35

Des weiteren wurde aus kultivierten Zellen Gesamtzellprotein direkt im Lysat verwendet. Hierzu wurden abgelöste Zellen mit PBS gewaschen, pelletiert und in RIPA-Puffer aufgenommen. Nach einer Inkubation für 15min. auf Eis wurden unlösliche Bestandteile mit 10.000g abzentrifugiert. Der Überstand wurde in eine neues Gefäß überführt und bei -20°C bis zu weiteren Verwendung gelagert.

RIPA-Puffer (pH 7,5)

25mM Tris-HCl

150mM NaCl

0,5% Natriumdeoxycholat

0,1% SDS

2% Tween

3.4.2 Quantifizierung von Proteinen

↓36

Bradford-Assay

Der Assay nutzt eine erstmals von Bradford et al. beschriebene Methode, die auf einer Verschiebung des Absorptionsmaximums bei Bindung von Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine basiert. Da der Extinktionskoeffizent über weite Konzentrationsbereiche konstant bleibt, kann mit Hilfe des Lambert Beerschen Gesetzes:

↓37

wobei E die Extinktion, ε der Extinktionsfaktor, c die Konzentration und d die Schichtdicke ist, die Konzentration der Proteinlösung photometrisch bestimmt werden.

Das Bradfordreagenz befindet sich vor der Reaktion mit Proteinen in der protonierten, roten kationisierten Form, bei Bindung von Protein wird die blaue anionische Form stabilisiert, welche dann photometrisch detektiert werden kann. Da zu hohe Konzentrationen an Detergenzien jedoch die grüne neutrale Form des Bradfordreagenz stabilisieren, konnte diese Methode für die Proteinlösungen in 1% SDS nicht angewendet werden.

BCA-Protein Assay

↓38

Für die Konzentrationsbestimmung von Proteinproben in 1% SDS wurde der BCA Protein Assay von Pierce (Bonn, Deutschland) herangezogen. Diese Methode verbindet die Reduktion von Cu2+ zu Cu1+ in alkalischer Umgebung durch Proteine (Biuret-Reaktion) und die selektive colorimetrische Quantifizierung von Cu1+ durch die Reaktion mit Bicinchinonischer Säure. Zuerst wurde die Gebrauchslösung hergestellt, hierfür wurden 50 Teile Reagenz A mit einem Teil Reagenz B gemischt. Von der Gebrauchslösung wurden 200µl pro Well einer 96-well Platte vorgelegt und anschließend 10µl Probe, Standard oder Wasser zugegeben. Die Platte wurde für 30min. bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben im Elisa Reader (Tecan, Crailsheim, Deutschland) bei 570nm gegen eine Referenz von 492nm vermessen und die Proteinkonzentration im Vergleich zur Eichgeraden des BSA-Standards bestimmt.

Als Standard für die Quantifizierung wurde BSA in Konzentrationen von 200, 400, 600, 800, 1000 und 1200µg/ml eingesetzt. Es wurden bei beiden Methoden jeweils Dreifachbestimmungen angefertigt.

3.4.3  SDS-Page

Die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamide-Gelelektrophorese) ist eine überwiegend analytisch genutzte Methode zur massenabhängigen Auftrennung von Proteinen [Laemmli et al., 1970]. Dabei wandern SDS-beladene, weitgehend entfaltete Proteine durch ein Polyacrylamidgel, angetrieben durch ein angelegtes, elektrisches Feld. Die gleichmäßige Beladung mit dem anionischen Detergenz SDS, welches als Mizelle um das Protein die Ladungen abschirmt, ermöglicht eine massenabhängige Auftrennung der Proteine. Die Proteinproben (E.coli-Lysate, Zell-Lysate, aufgereinigte Proteine, etc.) wurden in SDS-Probenpuffer aufgenommen und für 5-10min. bei 95°C inkubiert. Die SDS-PAGE bestand aus einem 4% Sammelgel und einem 10% Trenngel nach Schägger und von Jagow, 1987. Ein kommerzieller, vorgefärbter Größenstandard (Seeblue Plus II, Invitrogen) wurde mitgeführt. An das Gel im Mighty Small II System (Hoefer, San Francisco, CA, USA) wurde ein elektrisches Feld mit einer Spannung von 130V angelegt.

↓39

Die Gele wurden mittels Elektroblot auf eine Membran übertragen (siehe Kapitel 3.5.3 Seite 42) oder direkt für 1h bei Raumtemperatur mit Coomassie Blue G250 (Biorad, München, Deutschland) gefärbt und im Anschluss, um nicht komplexierten Farbstoff zu entfernen, 4h bei Raumtemperatur mit Entfärbe-Lösung entfärbt.

Kathodenpuffer (pH 8,25)

Anodenpuffer (pH 8,9)

0,1M Tris

0,2M Tris

0,1M Tricin

0,1% (w/v) SDS




Gelpuffer (pH 8,4)

Probenpuffer (2x):

0,1M Tris

50mM Tris

0,3% (w/v) SDS

12% (v/v) Glycerin

4% (w/v) SDS

5% (v/v) β-Mercaptoethanol

0,01% (w/v) Coomassie Blue G250

Entfärber-Lösung

10%(v/v) Essigsäure

25%(v/v) Methanol

in ddH2O

3.4.4  Klonierung, Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen

↓40

Restriktionsverdau mit Endonulkleasen

Zunächst wurde die dem Protein entsprechende DNA-Sequenz mittels PCR und spezifischen Primern zum Einführen von Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen amplifiziert. Restriktionsendonukleasen liegen als Homodimere vor und katalysieren ATP-abhängig die sequenzspezifische Spaltung der kovalenten Phospat-Zuckerbindung in der DNA-Doppelhelix. Die Erkennungssequenz dieser Enzyme kann 4-8 Nukleotide lang sein und ist im Regelfall palindromisch aufgebaut. Die Aufspaltung der DNA-Doppelhelix erfolgt meist innerhalb der Erkennungssequenz und kann sowohl glatte Enden (blunt ends) als auch überhängende Ende (sticky ends) ergeben. Die Auswahl der verwendeten Restriktionsendonukleasen (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Deutschland) und des zugehörigen Reaktionspuffer (New England Biolabs) erfolgte in Abhängigkeit vom Zielvektor und dem einzubringenden DNA-Fragment (Insert).

Bei Doppelverdauansätzen wurde nach Angaben des Herstellers ein für beide Enzyme geeigneter Puffer verwendet, oder, bei Pufferinkompatibilität, ein sequentieller Verdau durchgeführt.

↓41

Ein typischer Reaktionsansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- 100ng-2µg Plasmid-DNA oder PCR-Amplifikat

- 2µl 10x Reaktionspuffer (New England Biolabs)

- 2µl 10x BSA (New England Biolabs)

- 2-5units Enzym 1 (New England Biolabs)

- 2-5units Enzym 2 (New England Biolabs)

add 20µl ddH2O

Die Reaktion erfolgte in der Regel bei 37°C (abhängig vom Temperaturoptimum der verwendeten Enzyme) für zwei Stunden.

Dephosphorylierung mit SAP

↓42

Um eine Religation von einfach geschnittenen Vektorfragmenten zu unterbinden, wurden geöffnete Vektorfragmente mit der SAP (shrimp alkalische Phosphatase) am 5´-Ende dephosphoryliert. Dazu musste die DNA zunächst mit einem PCR-Purification-Kit (Qiagen, siehe unten) aus dem Restriktionspuffer in ddH2O überführt werden.

Ein typischer Reaktionsansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- 4µl 10x Reaktionspuffer RX (New England Biolabs)

- 5U SAP (New England Biolabs)

add 40µl ddH2O

Die Reaktion erfolgte bei 37°C für eine Stunde. Im Anschluss wurde die SAP durch Erhitzen auf 65°C für 30min. inaktiviert.

Plasmid-DNA-Präparation

↓43

Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA aus E.coli wurden kommerzielle Kits auf der Basis der Anionentauscher-Säulenchromatographie verwendet (Genomed Jetstar Maxi/Mini Plasmid Purification System, Genomed, Löhne, Deutschland).

Aufreinigung von linearen DNA-Fragmenten

Zur Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarosegelen oder aus dem PCR-Reaktionsmix wurden kommerzielle Kits auf der Basis der Anionentauscher-Säulenchromatographie verwendet (Genomed, Gel Extraction Kit und Genomed, PCR Purification Kit). Die Aufreinigung erfolgte nach Angaben des Herstellers.

↓44

Ligation

DNA-Ligasen katalysieren ATP-abhängig die Bildung einer kovalenten Phosphodiesterbindung zwischen einem freien 5´-Phospat- und einem freien 3´-OH-Ende von DNA-Molekülen. Restriktionsverdaute DNA-Fragmente wurden mit passend dazu geschnittenen Vektoren in einer Ligation fusioniert. Ligationsansätze wurden bei 16°C, 8-16h inkubiert, um eine möglichst große Reaktionseffizienz zu gewährleisten.

Ein typischer Ligationsansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- 100-200ng Vektor-DNA

- 300-600ng Insert-DNA

- 2µl 10x T4-Ligase-Puffer (New England Biolabs)

- 1-5units T4 Ligase (New England Biolabs)

add 20µl ddH2O

↓45

TOPO® TA Klonierung zur Sequenzierung von PCR Fragmenten

Zur Analyse der Produkte der RT-PCR wurden diese mit Hilfe des TOPO® Kits von Invitrogen kloniert. Hierbei wurden die PCR–Produkte über die von der Taq-Polymerase unspezifisch angehängten Adenosinreste in mit Hilfe der Topoisomerase in den pCR4-TOPO Vektor (siehe Anhang Seite XVIII) mit überhängenden Thymidinresten kloniert. Die PCR-Produkte wurden aus dem Agarosegel aufgereinigt (siehe Seite 31) oder direkt in die Klonierungsreaktion eingesetzt.

Ein Ansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- 0,5-4µl PCR-Produkt

- 1µl Salzlösung

- 1µl Vektor pCR®4- TOPO

- add 6µl ddH2O

↓46

Die Ligation wird von der am Vektor anhängenden Topoisomerase durchgeführt und hat den Vorteil, dass sie im Gegensatz zur Ligation mit T4-DNA-Ligase innerhalb von fünf Minuten bei Raumtemperatur abgeschlossen ist und direkt für eine Bakterien-Transformation verwendet werden kann.

Transformation

Bakterien:
Top10 F´(Stratagene): E.coli (F´(laclq, Tn10(TetR)) mcrA ∆(mrrhsdRMS-mcrBC) Φ80 lacZ∆m15 ∆lacX74 deoR recA1 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1nupG)
BL21-CodonPlus(DE3)-RP (Stratagene): E.coli B F- ompThsdS(rB- mB) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte (argU proL Camr)

↓47

Als Transformation wird das Einbringen von Plasmid-DNA in elektro- oder chemokompetente Bakterien und Hefen bezeichnet (Cohen et al. 1972). Chemokompetente E.coli Top10 F´ und BL21-CodonPlus(DE3)-RP wurden nach den Angaben im QIAexpressionist (Qiagen, 5.Auflage, 2002, S.39f) generiert und in 100µl Aliquots bei -80°C eingefroren.

Bei einer Transformation wurden 10µl Ligationsansatz (siehe oben) oder 100ng gereinigte Plasmid-DNA zu einem auf Eis aufgetauten 100µl Bakterien-Aliquot gegeben. Der Ansatz wurde durchmischt und 30min. auf Eis inkubiert. Durch Erhitzen auf 42°C wurde für 45s ein Hitzeschock durchgeführt, wodurch sich Poren in der Bakterienwand bilden, durch die die DNA aufgenommen wird. Im Anschluss wurde der Ansatz für 3min. auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 500µl LB-Medium (ohne Zusatz von Antibiotika) wurde der Ansatz 30min. bei 37°C geschüttelt, so dass die über das eingebrachte Plasmid vermittelte Resistenz ausgebildet werden konnte. Die Bakterien wurden bei 2.000g 2min. pelletiert und in 100µl Medium aufgenommen. 50-100µl Bakteriensuspension wurden auf einer LB-Agar-Platte mit Selektionsantibiotikum ausgestrichen und 16h bei 37°C inkubiert.

LB-Medium:

1% (w/v) Trypton

0,5% (w/v) Hefeextrakt

1% (w/v) NaCl

Antibiotika:

Ampicillin (100µg/ml Endkonzentration)

↓48

Sequenzierung

Um sicher zu stellen, dass eingebrachte DNA-Fragmente sich im richtigen Leseraster und in vollständiger Länge im Vektor befinden wurde die DNA-Sequenzierung nach Sanger et al. [1977] zur Überprüfung verwendet. Die moderne DNA-Sequenzierung nutzt die PCR, wobei neben den Desoxy-Nuklosidtriphosphaten (dNTP) auch Didesoxy-Nuklosidtriphosphate (ddNTP) im Reaktionsmix eingesetzt werden. Bei dem verwendeten DNA Sequenzierungsprotokoll wurden markierte ddNTPs im ABI BigDye 3.1-Mastermix (ABI Terminator Chemie, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) verwendet.

Ein typischer Sequenzierungssansatz ist im Folgenden aufgeführt:

- 1ng-3µg Template-DNA (PCR-Produkte: 1-20ng, Plasmide: 150ng-3µg)

- 5pmol Primer

- 2µl BigDye-Mastermix

- 1µl 5xPuffer (ABI)

- add 10µl ddH2O

Zur Auswertung wurde der im Haus bereitgestellte Sequenzierservice mit dem ABI Lycor 3200-Sequencer genutzt.

↓49

Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen

Proteine können rekombinant hergestellt werden, hierzu gibt es verschiedene kommerziell erhältliche Systeme mit aufeinander abgestimmten Expressionsvektor, Bakterien-Expressionsstamm und Aufreinigungssystem. Hier wurde das pMAL-System von New England Biolobs (New England Biolabs) für das HERV-K Transmembranprotein verwendet. Das 42kDa große Maltose-Bindeprotein wurde als Fusionsprotein mit dem Transmembranprotein exprimiert und kann über eine Affinitätschromatographie mit Amylose aufgereinigt werden. Für das kleinere HERV-K Rec Protein dagegen wurde das pCAL-n System von Stratagene verwendet. Hier wurde ein 4kD großes Calmodulin-Bindeprotein als Fusionsprotein mit dem Rec Protein exprimiert (siehe Anhang Seite XVI und XVII).

Für die Expression von rekombinanten Proteinen wurden chemokompetente E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RP von Stratagene (Amsterdam, Niederlande) verwendet.

↓50

IPTG-induzierte Expression

Isopropylthiogalaktopyranosid (IPTG) ist ein Galaktoseanalogon und wirkt genau wie dieses als Aktivator der lac-Promotor-abhängigen Transkription von nachgeschalteten Genen. Im Wildtyp E. coli wird so ein Umschalten zwischen der Verwertung der Substrate Glucose und Galaktose ermöglicht. Viele kommerziell erwerbliche Expressionsplasmide tragen diesen Promotor, so dass die Transkription des eingebrachten Gens und die nachfolgende Proteinproduktion gezielt durch Zugabe des Pseudosubstrates IPTG von außen eingeleitet werden kann. Von den verwendeten E.coli BL21 wurde über Nacht eine frische 5ml LB-Kultur mit Selektionsantibiotikum angesetzt. Am nächsten Tag wurden Expressionskulturen (1000ml LB-Medium mit Selektionsantibiotikum, für Expressionen mit dem pMAL System zusätzlich 2g/l Glukose) mit der Vorkultur angeimpft. Die Expressionskultur wurde bei 225rpm und 37°C bis geschüttelt bis eine optische Dichte von 0,8 bei einer Wellenlänge von 600nm erreicht war. Durch Zugabe von 1mM (Endkonzentration) IPTG wurde die Expression der rekombinanten Gene induziert. Nach 3h Inkubation bei 225rpm und 37°C wurden die Bakterien bei 6000g pelletiert. Das Bakterienpellet wurde bei -20°C gelagert oder direkt weiterverarbeitet.

Aufschluß der Bakterien

↓51

Der Aufschluss der stabilen Wand von gram-negativen Bakterien (hier E.coli) kann sowohl mit mechanischem (Ultraschall, Branson Sonifer 250), als auch mit enzymatischen (Lysozym) Methoden erfolgen [Jolles et al. 1969]. Ein eingefrorenes Bakterienpellet aus 1000ml Kulturvolumen wurde in 50ml Säulenpuffer aufgenommen, resuspendiert und mit einer Ultraschallsonde lysiert. Ungelöste Bakterienbestandteile wurden durch Zentrifugation mit 10.000g für 30min. bei Raumtemperatur abgetrennt. Der Überstand wurde affinitätschromatographisch gereinigt. Das eluierte Fusionsprotein wurde bei -20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

3.4.5 Test zur Aktivität von Reverser Transkriptase

Zur Bestimmung von Aktivität Reverser Transkriptasen in Zellkulturüberständen wurden der kommerzielle HS-kit Mg2+ RT von Cavidi (Cavidi Tech AB, Upsala, Schweden) verwendet. Es wurde nach dem über Nacht-Protokoll des Herstellers verfahren.

3.5  Immunologische Methoden

3.5.1  Herstellung von Immunseren in der Ziege

Die Ziegen wurden in der Tierversuchsanstalt, Berlin-Marienfelde (BfR) gehalten. 500µg Antigen wurde am Tag der Immunisierung in PBS aufgenommen und 1:1 mit öligem Adjuvant (Incomplete Freund´s Adjuvant, Pierce) gemischt. Durch mehrfaches Suspendieren durch eine Kanüle (∅0,6mm, BD, Heidelberg, Deutschland) erhielt das Antigen-Adjuvant-Gemisch eine halbfeste, sahnige Konsistenz. Die Immunisierung erfolgte durch intramuskuläre Injektion des Gemisches, in der Regel wurde je 1ml in die Muskulatur beider Oberschenkel injiziert. Drei und sechs Wochen nach der Immunisierung (Prime) erfolgte der Boost mit dem gleichen Immunogen-Adjuvant-Gemisch und nach dem gleichen Applikationsschema. Drei Wochen nach jeder Immunisierung (vor jedem Boost) wurde den Ziegen Blut abgenommen (ca. 50ml) und bei 4°C über Nacht gelagert. Das entstandene Koagulat wurde am nächsten Tag bei 16.000g und 4°C 30min. pelletiert. Der Serumüberstand wurde abgenommen und das Koagulat verworfen. Die Lagerung der Seren erfolgte bei -20°C.

↓52

Ein Teil der Antikörper wurde aufgereinigt, hierzu wurden Protein-G-Säulen (Montage Antibody Purification Kit, Millipore, Schwalbach, Deutschland) verwendet, um speziell IgG-Antikörper aus dem Immunserum aufzureinigen. Es wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren. Des weiteren wurden gp36 spezifische Antikörper affinität-chromatographisch aufgereinigt. Hierzu wurden 0,5g Sepharose in 100ml 1mM HCl resuspendiert und für 15min. gewaschen. 8mg rekombinantes gp36-Protein wurde gegen Kopplungspuffer über Nacht dialysiert und dann zur Sepharose gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C über Kopf geschüttelt. Am nächsten Morgen wurde mit fünf Volumen Kopplungspuffer gewaschen und danach verbliebene aktive Gruppen mit 0,1M Tris-HCl (pH 8,0) für 2 Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Zuletzt wurde dreimal abwechselnd mit Puffer 1 und Puffer 2 gewaschen und mit der gp36-Sepharose anschließend eine Säule gepackt. Die Säule wurde mit 3 Volumen PBS gewaschen. Über Nacht wurde bei 4°C 15ml von Ziegenserum 26 über die Säule gepumpt und am nächsten Morgen ungebundenes Material mit 10 Volumen PBS weggewaschen. Die Elution der gebundenen Antikörper erfolgte in 1ml Fraktionen mit Elutionspuffer in 200µl 2M Tris. Die Säule wurde anschließend durch dreimal abwechselndes Waschen mit Puffer 1 und Puffer 2 regeneriert.

Puffer 1

Puffer 2

0,1M Tris HCl (pH 8,0)

0,1M Acetat (pH 4,0)

0,5M NaCl

0,5M NaCl

Kopplungspuffer

Elutionspuffer (pH 2,5)

0,1M NaHCO3 (pH 8.3)

0,05M Glycine-HCl

0,5M NaCl

0,5m NaCl; 100µg/ml PMSF

3.5.2 Epitop-Kartierung mit einer Pepspot®-Membran

Die Pepspot-Membran (Jerini, Berlin, Deutschland) ermöglicht die schnelle Eingrenzung von antikörper- und serumspezifischen Epitopen auf einem bekannten Antigen. Dazu wurde eine Peptidbank aus 15 Aminosäuren langen Peptiden hergestellt, die um je 13 Aminosäuren überlappen, d.h. die Aminosäuresequenz der Peptide verschiebt sich von Peptid zu Peptid zwei Aminosäuren Richtung C-Terminus. Die Peptide wurden kovalent über den C-Terminus an eine Nitrozellulose-Membran gekoppelt. Die verwendeten Membranen umfassen die gesamte Aminosäuresequenz des Rec Proteins bzw. des transmembranen Hüllproteines von HERV-K. Die Inkubation mit dem zu testenden Serum erfolgte nach Angaben der Herstellerfirma, wobei die Verdünnung von Primär- und Sekundärantikörpern optimiert werden musste (siehe 3.5.2). Die Epitope des Serums ergeben sich aus der bei allen positiv reagierenden, aufeinander folgenden Peptid-Spots auftretenden Sequenz.

3.5.3 Westernblot mit Immunseren

↓53

Die Westernblot Analyse ist eine immunoanalytische Methode zur Detektion von Proteinen auf einer Trägermembran mit spezifischen Antikörpern [Towbin et al. 1989]. Beim verwendeten Semidry-Elektroblotting-Verfahren (Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell, Biorad) wurden die Proteine nach der Auftrennung in der SDS-PAGE durch ein senkrecht zum Gel orientiertes elektrisches Feld (10-15V für 60min.) auf eine PVDF-Membran (Polyvinyldifluorid, 0,2µm Poren von Millipore, Billerica, MA, USA) transferiert. Bindungsstellen auf der Membran, die nicht durch Proteine besetzt waren, wurden durch einstündige Inkubation der Membran in einer 5%igen Magermilch-Lösung in Waschpuffer blockiert. Die blockierte Membran wurde mit dem primären Antikörper (bzw. dem primären Antiserum, Verdünnung von 1:50 bis 1:20000, siehe 3.5.2) über Nacht bei 4°C inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen (je 10min.) entfernt. Die Membran wurde dann für 2h bei Raumtemperatur mit einem spezies-spezifischen, Peroxidase (POD)-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert. Die Detektion erfolgte entweder nach der ECL-Methode (Enhanced Chemiluminiszenz) und einem Röntgenfilm (beides Pierce) oder mit einer 3,3´-Diaminobenzidin-Substratlösung (DAB) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (beides Merck, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt.

Bei ECL detektierten Membranen konnte der Blot weiter verwendet werden, hierzu mussten jedoch die gebundenen Antikörper abgelöst werden. Die Membran wurde kurz gewaschen und dann in Strippingpuffer bei 50-65°C für 30-90min. inkubiert. Abschließend wurde noch zweimal gewaschen und die Membran konnte erneut blockiert und mit Antikörpern inkubiert werden.

Für den Westernblot mit Proteinen aus normalen Geweben wurde der kommerzielle WesternBlot VI von US Biological (Swampscott, MA, USA) verwendet.

↓54

Transferpuffer (pH 9.2)

Waschpuffer (pH 7,3)

48mM Tris

50mM Tris

39mM Glycin

150mM NaCl

20% (v/v) Methanol

0,5% (v/v) Tween-20

0,0375% (w/v) SDS

0,2% (w/v) Bovines Serum Albumin

Blockierungspuffer (pH 7,4)

Substratlösung (pH 8,0)

Waschpuffer

0,025 Tris-HCl

5% (w/v) Magermilchpulver

Spatelspitze Diaminobenzidin

Stripping-Puffer (pH 6,8)

62,5mM Tris-HCL

2% (w/v) SDS,

100mM ß-Mercaptoethanol,

3.5.4 Immunfluoreszenz

Die Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht die spezifische Detektion von Proteinen auf der Oberfläche und im Inneren von Zellen. Dazu werden Zielprotein-spezifische Antikörper oder Seren in Kombination mit fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpern verwendet. Bei einer intrazellulären Färbung muss zunächst die Zellmembran über ein Detergenz permeabilisiert werden, um den Antikörpern Zugang zum Antigen zu verschaffen. Die fluoreszenzmarkierten Antikörper werden über eine UV-Lichtquelle im Fluoreszenzmikroskop angeregt woraufhin sie Licht in einer farbstoffspezifischen Wellenlänge emittieren. Durch den Einsatz von auf den Farbstoff abgestimmten Filtern können interferierende Wellenlängen ausgeblendet werden. Adhärent wachsende Zellen wurden auf Deckgläschen in einer 6-well Platte ausgesät und bis zu ca. 70% Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde entfernt, die Deckgläschen mit PBS gespült und mit 2%-Formaldehyd in PBS für 30min. bei Raumtemperatur fixiert. Nach dreimaligem Waschen für je 10min. mit PBS wurden die Zellen gegebenenfalls mit einer 1%igen Tritonlösung (Triton X100) für 15min. permeabilisiert. Nach der Permeabilisierung der Zellen wurde wieder dreimal für 10min. mit PBS gewaschen und mit einer 5%igen Milch-in-PBS-Lösung für 1h bei 37°C und 95% Luftfeuchte (im Brutschrank) unspezifische Bindungen abgesättigt. Die Objektträger wurden mit dem entsprechend verdünnten Primärantikörper in einer 5%igen Milch-in-PBS-Lösung für 60min. im Brutschrank inkubiert. Danach wurde dreimal je fünf Minuten mit PBS gewaschen. Als Zweitantikörper wurden Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-gekoppelte spezies-spezifische Antikörper verwendet. Die Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgte für eine Stunde bei 37°C in einer 5%igen Milch-in-PBS-Lösung im Brutschrank. Anschließend wurde dreimal fünf Minuten mit PBS gewaschen. Zuletzt wurden die Deckgläschen aus den Wells genommen und zusammen mit ProLong® Antifade Reagenz (Invitrogen) auf Objektträger gegeben (Zellen nach unten), über Nacht getrocknet und anschließend dunkel gelagert. Die Zellen konnten unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, dabei wurde das FITC bei 488nm angeregt und dessen Emission bei 530nm detektiert.

3.5.5 Immunhistologie von Melanommetastasen

Die Immunhistologie wurde von Frau Petra Siegel an der Hautklinik der Charité durchgeführt. Die entnommenen Melanommetastasen wurden hierfür in 4% Paraformaldehyd fixiert, in Parafin eingebettet und mit dem Mikrotom 4-6µm dünne Schnitte geschnitten. Der Melanomcharakter der Metastasen wurde mit den Antikörpern HMB45 oder α-Tyrosinase verifiziert. Weitere Schnitte der Metastasen wurden mit den jeweiligen Primärantikörpern gegen HERV-K Proteine inkubiert und mit dem LSAB-Kit (DAKO) detektiert. Zur besseren Übersicht wurden die Schnitte mit Hämatoxylin-Eosin gegengefärbt.


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01.12.2006