4. Ergebnisse

↓54

4.1  Generierung neuer Methoden zur Analyse der HERV-K Expression

4.1.1  RT-PCR zum semiquantitativen Nachweis der HERV-K Expression

↓55

Zum detaillierten Nachweis der mRNA von HERV-K wurden von R. Phelps [1997] entwickelte Primer benutzt. Das Set besteht aus sieben Primern, die jeweils vor bzw. hinter den Spleißdonoren und -akzeptoren lokalisiert sind. Ihre Kombination ermöglicht es mit dem Primer Paar P4 und P5 deletierte (Deletionsmutante) und nicht deletierte (Prototyp) Proviren zu unterscheiden. Des weiteren ist die Unterscheidung zwischen gespleißter und Volllängen-mRNA möglich. So sind die Primerpaare P2 und P3 sowie P4 und P5 spezifisch für die Volllängen-mRNA, P2 und P5 bzw. P6 für das gespleißte env und P1 und P7 detektieren sowohl doppelt gespleißtes rec sowie auch die einfach gespleißte 1,5kb mRNA (siehe Abb. 4.1).

Abb. 4.1: Lokalisation der Primer für HERV-K. Organisation von HERV-K auf DNA-Ebene und die Lokalisation der einzelnen HERV-K spezifischen Primer P1 bis P7 auf mRNA-Ebene.

Im Gelbild ergibt sich so ein spezifisches Bandenmuster, die Expression von HERV-K in Zellen oder Geweben kann so bestimmt werden. Die humane Teratokarzinom-Zelllinie GH, welche Volllängen und gespleißte HERV-K mRNA transkribiert, wurde als Positiv-Kontrolle verwendet. Die humane embryonale Nierenzelllinie 293, dagegen exprimiert zwar Volllängen-mRNA, jedoch kein gespleißtes env oder rec (siehe Abb. 4.2).

↓56

Die Doppelbande in Spur 2 zeigt, dass sowohl Proviren der Deletionsmutante, wie auch Proviren des Prototyp von HERV-K transkribiert werden. Die zusätzliche Bande der 1,5kb mRNA (Spur 5) tritt jedoch nur bei GH- und nicht bei SK-MEL-28-Zellen auf, obwohl beide Zelllinien env und rec spleißen.

Abb. 4.2: RT-PCR mit HERV-K Primern. Agarosegel der RT-PCR mit dem Primerset von GH, 293 und SK-MEL-28 Zellen, M Marker, 1 P2+P3, 2 P4+P5, 3 P2+P5, 4 P2+P6, 5 P1+P7 und 6 GAPDH; * unspezifisch

4.1.2 RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HERV-K Expression

↓57

Um quantitativ die Menge exprimierter HERV-K Transkripte in den HERV-K positiven Geweben und Zelllinien bestimmen zu können, wurde eine real-time TaqMan reverse Transkriptase PCR entwickelt. Die Primer für die real-time RT-PCR wurden so gewählt, dass wie bei der konventionellen RT-PCR Volllängen-mRNA und gespleißte env-, rec- und np9-mRNA nachgewiesen werden können, die Unterscheidung zwischen deletiertem HERV-K und dem Prototyp ist allerdings nicht möglich. Der Nachweis verwendet für alle Reaktionen den gleichen forward Primer und die gleiche Sonde. Die Spezifität der jeweiligen Reaktion wird durch den reverse Primer gewährleistet, welcher jeweils über der für das gespleißte Transkript spezifischen Spleißstelle liegt (siehe Abb. 4.3 und Tabelle 1 Anhang Seite II). Die Verwendung von nur einer Sonde ist einfach und kostengünstig, jedoch sind die einzelnen Reaktionen nicht zusammen im Mutiplex Assay einsetzbar.

Abb. 4.3: Lokalisation der Primer für den real time RT-PCR Nachweis. Organisation der HERV-K DNA im humanen Genom und Lokalisation der Sonde sowie der einzelnen TaqMan Primer auf mRNA-Ebene.

Bestimmung der optimalen Reaktionsbedingungen der real-time RT-PCR

↓58

Zur Bestimmung der optimalen Reaktionsbedingungen wurden sowohl Sonden- als auch Primerkonzentration variiert und bei verschiedenen Magnesiumsulfatkonzentration getestet. Sonde, Primer MgSO4 und dNTPs sollten im Überschuss vorliegen, so dass der CT-Wert der einzelnen Proben nur von der Templatekonzentration abhängt. Zu hohe Konzentrationen der einzelnen Komponenten können jedoch zu unspezifischen Nebenprodukten führen und so die Effizienz der Reaktion erheblich beeinflussen.

Abb. 4.4: Bestimmung der optimalen Sondenkonzentration. Der CT in Abhängigkeit der Sondenkonzentration für die einzelnen Nachweise der HERV-K Transkripte

Zunächst wurde die optimale Konzentration der Sonde bei konstanter Primer- (250nM) und Template-Menge (20ng) bestimmt. 200nM erwies sich hier als optimal (niedrigster CT-Wert) und wurde daher für die weiteren Ansätze übernommen (siehe Abb. 4.4).

↓59

Als zweites wurde die optimale Primerkonzentration bei 200nM Sondenkonzentration und konstanter Template-Menge (20ng) bestimmt. Hier wurden zusätzlich zwei verschiedene Magnesiumsulfatmengen, 3mM und 5mM, getestet (siehe Abb. 4.5).

Abb. 4.5: Bestimmung der optimalen Primerkonzentration in Abhängigkeit von MgSO4.Der CT in Abhängigkeit der Primerkonzentration bei verschiedenen MgSO4- Konzentrationen für den Nachweise der HERV-K Volllänge und env .

Da sich hier abzeichnete, dass die erhöhte MgSO4-Konzentration einen nachteiligen Effekt zeigt, wurden die weiteren Primerkonzentrationen bei 3mM MgSO4 bestimmt. 250nM Primer erwies sich als optimal und wurde für den Standardansatz übernommen (siehe Abb. 4.6).

↓60

Abb. 4.6: Bestimmung der optimalen Primerkonzentration. Der CT in Abhängigkeit der Primerkonzentration für die einzelnen Nachweise der HERV-K Transkripte.

Als letzter Optimierungsschritt wurde die Effizienz der Reaktionen mit den unterschiedlichen reverse Primern bestimmt. Für genaue und reproduzierbare Resultate sollte die Effizienz nahe 100% liegen. Aus den CT-Werten bei definierten Verdünnungen des Templates lässt sich eine Standardkurve errechnen, über deren Steigung sich die Effizienz der Reaktion bestimmen lässt (Stratagene Application Note #10, siehe Material und Methoden Seite 33).

Abb. 4.7: Bestimmung der Effizienz der real time RT-PCR Reaktion am Beispiel des Nachweises der Volllänge von HERV-K. (A) Ausverdünnung der RNA von GH, dargestellt ist die Fluoreszenz in Abhängigkeit der Zyklenzahl. (B) Standardgerade der Ausverdünnung, dargestellt sind die CT-Werte in Abhängigkeit der eingesetzten Templatemenge, gestrichelte Linie: Konfidenzintervall bei 99%

↓61

Die Darstellung der Kurven zeigt die Verschiebung des CT-Wertes um ungefähr einen Zyklus bei der Verdünnung der Template RNA um die Hälfte. Dies spiegelt die Verdopplung der Templatemenge während eines Zyklus wieder (siehe Abbildung 4.7 A). Die Effizienz errechnet sich auf der Steigung der Standardgeraden. Da die Effizienz nicht 100% entspricht (s.u.), entspricht die Verschiebung nicht exakt einem Zyklus.

Das Bestimmtheitsmaß R2 gibt das Quadrat des Pearsonschen Korrelationskoeffizienten an, ein dimensionsloses Maß für den Grad des linearen Zusammenhangs zwischen zwei intervallskalierten Merkmalen. Er kann lediglich Werte zwischen -1 und 1 annehmen, bei einem Wert von +1 (bzw. -1) besteht ein vollständig positiver (bzw. negativer) linearer Zusammenhang. Wenn der Korrelationskoeffizient den Wert 0 aufweist, hängen die beiden Merkmale überhaupt nicht linear voneinander ab. Das Bestimmtheitsmaß liegt bei allen vier Reaktionen nahe dem Idealwert 1, d.h. die ermittelten Standardgeraden sind verlässlich.

Die Effizienzen der einzelnen Reaktionen wurden mit Hilfe der Standardkurven-Berechnung des MX4000 Programms bestimmt. Trotz optimierter Konzentrationen von Sonde, Primern und MgSO4 liegen die Effizienzen unter 100% was in die folgende Auswertung der Proben mit einbezogen werden muss.

↓62

 

Primer

Effizienz

Bestimmtheitsmaß R2

Volllänge

91,1 %

0,990

env

84,5 %

0,989

rec

78,2 %

0,990

np9

93,6 %

0,994

Davon ausgehend, dass die Effizienz, mit der die einzelnen Reaktionen in den verschiedenen Proben ablaufen, immer gleich ist, lässt sich die Expression von HERV-K relativ zu einem Kalibrator bestimmen. Hierfür wurde für alle Proben die Expression von HERV-K in Bezug auf GH oder SK-MEL-28 RNA bestimmt.

4.1.3  Charakterisierung neuer Antiseren zur Analyse der HERV-K Expression

Ektodomäne des Transmembranproteins gp36

↓63

Zur Klonierung des größten Teil der Ektodomäne des Transmembranproteins gp36 (Aminosäuren 488-586) wurde mit Gesamt-RNA von GH-Zellen eine semiquantitative RT-PCR mit den Primern rekTM-forward und rekTM-reverse durchgeführt (siehe Anhang Seite I). Die Primer amplifizieren den 469bp großen Teil der Ektodomäne des gp36/TM -Proteins wie in Abb. 4.8 gezeigt.

Abb. 4.8: Klonierungsstrategie der Ektodomäne des Transmembranproteins gp36 von HERV-K. Schematische Darstellung der Lage der Klonierungsprimer auf DNA-Ebene sowie der Klonierungsstrategie und das entsprechende Agarosegel der RT-PCR mit GH Gesamt-RNA.

Über die mit den Primern angefügten BamHI- und HindIII- Schnittstellen wurde das PCR-Fragment in den pMAL p2X -Vektor kloniert (siehe Anhang Seite XVI), in E.coli BL21 exprimiert und das 57kDa Fusionsprotein (42kDa Maltose-Bindeprotein und 15kDa gp36/TM-Protein) affinitätschromatographisch aufgereinigt. Ein Sequenzvergleich ergab, dass die geklonte Sequenz C6-5 am genauesten dem gp36-Protein von HERV-K 101 gleicht, sich jedoch in einem Aminosäureaustausch in AS481 (Lys zu Asn) unterscheidet. Der von R. Phelps [1997] hergestellte Klon HETM2 gleicht HERV-K 108 und HERV-K HOM, von diesem unterscheidet sich Klon C6-5 in einem weiteren Aminosäureaustausch, AS466 (Arg zu His), (siehe Abb. 4.9).

↓64

Ein Immunserum gegen das von Klon C6-5 exprimierte rekombinante Fusionsprotein wurde in Ziege 26 generiert (siehe Material und Methoden Seite 41).

Abb. 4.9: Sequenzvergleich der rekombinanten gp36 Proteine. Dargestellt sind die Sequenzen der Klone C6-5 und HETM2 [Phelps 1997] im Vergleich zu verschiedenen HERV-K Sequenzen der NCBI Datenbank (Accnrs. P61566, AAD51798, Q69384 und Q902F9).

Charakterisierung von Ziegenserum 26

↓65

Alle bei den einzelnen Immunisierungsschritten gewonnenen Seren erkennen das rekombinante Protein im Westernblot in einer Verdünnung von 1:200 (nach dem ersten Boost) bis 1:1000 (nach dem letzten Boost). Das entsprechende Präimmunserum reagiert nicht (nicht gezeigt). Zur genaueren Charakterisierung des Ziegenserums gegen HERV-K gp36 wurde eine Epitopkartierung mit einer Pepspot Membran durchgeführt. Das schon vorhandene mit Klon HETM2 erstellte Immunserum von Ziege 7 [Phelps 1997], welches unter anderem in der Arbeit von Muster et al. [2003] verwendet wurde, diente als Vergleich.

Beide Seren erkennen als Hauptepitop eine Region an der Cysteinschleife (siehe Abb. 4.10, rot dargestellt). Zudem werden vier weitere Epitope erkannt. Ziegeserum 26 erkennt im C-terminalen Teil des rekombinanten Proteins mehrere ineinander übergehende Epitope, deren Unterscheidung, durch die Überlappungen nicht möglich ist. Beide Seren zeigen keine kreuzreaktiven unspezifischen Bindungen außerhalb des zur Immunisierung verwendeten Proteinanteils. Das entsprechende Präimmunserum reagierte nicht (nicht gezeigt).

Abb. 4.10:10 Epitopkartierung der Ziegenseren 7 und 26 spezifisch für HERV-K gp36.
(A) Pepspotmembran zur Epitopkartierung am Beispiel für Ziegenserum 26. (B) Dargestellt ist die Sequenz von gp36 sowie die mittels Pepspot ermittelten Epitope der Ziegenseren 7 und 26 im Vergleich. Die Sequenz des zur Immunisierung verwendeten Anteils ist schwarz
dargestellt, die Sequenz der Cysteinschleife fett
.

↓66

Rekombinantes Np9-Protein

Zur Klonierung des zusätzlichen Proteins Np9 wurde ebenfalls mit Gesamt-RNA von GH-Zellen eine semiquantitative RT-PCR mit den Primern np9-G und np9-H (siehe Anhang Seite I) durchgeführt.

Abb. 4.11: Klonierungsstrategiedes HERV-K Np9 Proteins. Schematische Darstellung der Lage der Klonierungsprimer auf DNA-Ebene sowie der Klonierungsstrategie und das entsprechende Agarosegel der RT-PCR mit GH Gesamt-RNA.

↓67

Die Primer amplifizieren alle gespleißten mRNAs von HERV-K. Nach der Größen-auftrennung im Agarosegel und einer Gelextraktion wurde das passende Stück in den pCAL-n Vektor kloniert (siehe Abb. 4.11 und Anhang Seite XVII). Ein Sequenzvergleich der Klone von Np9 mit den veröffentlichten Sequenzen von Armbrüster et al. [2002] ergab, dass sie mit dem Np9-Protein von HERV-K HML2.HOM übereinstimmen (siehe Abb. 4.12). Der Klon rNp9-3 wurde in E.coli BL21-Zellen exprimiert und das 13kDa Fusionsprotein aus 4kDa Calmodulin-Bindeprotein und 9kDa Np9-Protein affinitäts-chromatographisch aufgereinigt. Ein Immunserum gegen das von Klon rNp9-3 exprimierte rekombinante Fusionsprotein wurde in Ziege 29 generiert (siehe Material und Methoden Seite 41).

Abb. 4.12: Sequenzvergleich der rekombinanten Np9 Proteine. Dargestellt sind die Sequenzen der Klone rNp9 2, 3 und 5 im Vergleich zu den veröffentlichen Sequenzen von Armbrüster et al. 2002.

Charakterisierung von Ziegenserum 29

↓68

Alle bei den verschiedenen Immunisierungsschritten (siehe Material und Methoden Seite 41) gewonnenen Seren erkennen das rekombinante Protein im Westernblot. Von einer Verdünnung von 1:100 (aufgereinigte Antikörper) bis 1:1.000 des Serums nach der letzten Immunisierung (siehe Abb. 4.13).

Abb. 4.13: Westernblotanalyse des für rNp9 spezifischen Ziegenserum 29. Dargestellt sind verschiedene Verdünnungen von Präimmunserum (1), Immunserum (2) sowie über eine IgG-Säule aufgereinigtes Immunserum (3) von Ziege 29 nach der dritten Immunisierung.

4.2 Expression von HERV-K in Melanomen

Insgesamt wurden 55 Melanomgewebeproben von der Dermatologie der Charité zur Verfügung gestellt. Aus allen Geweben wurde sowohl RNA als auch Protein isoliert (siehe Kap. 3.3.1).

↓69

Ebenso wurden RNA und Proteine aus den 37 in der Charité etablierten Melanomzelllinien und fünf weiteren, kommerziell erhältlichen, Zelllinien (SK-MEL-1, SK-MEL-28, GR-M, G-361 und MEWO) aufgereinigt (siehe Kap. 3.3.2).

Von 24 Patienten waren sowohl Melanomgewebe, als auch die daraus etablierte Zelllinie vorhanden.

Als Kontrolle wurden zum einen RNA aus den in der Charité kultivierten Nicht-Melanomzelllinien verwendet (siehe Kapitel 3.3.2), zum anderen wurde jeweils RNA oder Protein von folgenden Zelllinien mitgeführt: als Positiv-Kontrolle für HERV-K Expression und korrektes Spleißen die humane Teratokarzinomzelllinie GH, als Negativ-Kontrolle die humane embryonale Nierenzelllinie 293 und als Positiv-Kontrolle für maligne Melanome sowie HERV-K Expression und korrektes Spleißen, die Zelllinie SK-MEL-28 (siehe Kapitel 3.2.2).

↓70

Die Integrität der verwendeten RNA wurde zunächst mittels RT-PCR mit Primern für die ubiquitär exprimierte Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) mRNA überprüft. Hierfür wurde zunächst ein Primerpaar verwendet, welches ein Produkt bei 550bp ergibt. Des weiteren wurde später ein zweites Primerpaar entwickelt und verwendet, welches spezifisch nur humanes GAPDH erkennt und ein Produkt von 120bp ergibt (siehe Anhang Seite I).

Parallel wurden die Proben mittels einer PCR ohne Reverse Transkriptase auf eventuelle DNA-Verunreinigungen untersucht. Hierfür wurden die Primer P2 und P3 für die HERV-K Volllängen-mRNA verwendet (siehe Seite 44 und Anhang Seite II).

Abb. 4.14: RT-PCR zur Überprüfung der RNA-Integrität und DNA-Kontamination.
M Marker, 1 GH, 2 293, 3 SK-MEL-28, 4 KLM und 5 SC (Gewebe), 6 AN und 7 AP (Zellen), siehe Anhang Seite IV und V

↓71

Keine der isolierten RNA-Proben zeigte eine Kontamination mit DNA und die Integrität der RNA konnte mittels GAPDH RT-PCR als gut befunden werden (siehe Abb. 4.14 und 4.15 sowie Anhang Seite IV und V).

Sechs der 55 Melanomgewebe wiesen eine starke braune Färbung durch im Gewebe enthaltenes Melanin auf, welches sowohl mit der RNA eluiert wurde und sich auch in der Proteinfraktion befand. Es zeigte sich, dass Melanin sowohl in der Quantifizierung der RNA mittels OD-Messung interferiert, wie auch die RT-PCR inhibiert (siehe Abb. 4.15). Die Inhibition der PCR durch Melanin ist in der Literatur beschrieben [Eckhart et al. 2000]. Da sich diese Inhibition nicht durch die Zugabe von bovinem Serum Albumin (BSA) aufheben ließ [Giambernadi et al.1998, Price und Linge 1999] und es sich um eine geringe Anzahl an Proben handelte, wurden diese aus der weiteren Betrachtung ausgenommen (siehe Anhang Seite IV).

Abb. 4.15: RT-PCR zur Überprüfung der Integrität der RNA der Melanomgewebeproben.
M Marker, 1 bis 24 Gewebeproben, die Zahlen korrespondieren mit Tabelle 2, Anhang Seite IV

↓72

Um zu gewährleisten, dass es sich bei den verwendeten Geweben und Zelllinien um maligne Melanome handelt, wurden alle Proben zunächst auf Expression eines melanomspezifischen Gens hin untersucht. Hierzu wurde ein spezifisches Primerpaar für das Gen für MART-1 (Melanoma Antigen Recognized by T-Cell 1) entworfen und getestet. Die Expression von MART-1 ist zu 100% spezifisch und 38% sensitiv für maligne Melanome [Perez et al. 2000].

Abb. 4.16: RT-PCR zur Überprüfung des Melanomcharakters bei Melanom-Zelllinien.
M Marker, a MEWO, b 293, c SK-MEL-28, d SK-MEL-1, e GR-M und f GH;
32 bis 42 Melanom-Zelllinien, die Zahlen korrespondieren mit Tabelle 2, Anhang Seite V.

Alle verwendeten Melanomproben zeigten zumindest eine schwache Bande in der MART-1 RT-PCR, so dass der Melanomcharakter der verwendeten Proben als gesichert angesehen werden konnte (siehe Anhang Seite IV und V).

4.2.1  Expression von HERVs in Melanomgeweben und -zellen

↓73

HERV-R (oder ERV-3) ist mit nur einer Kopie auf Chromosom 7 im Genom vertreten [O´Connel et al. 1984, Wilkinson et al. 1994, Urnovitz und Murphy 1996]. Das gag-pol-Gen besitzt keinen offenen Leserahmen, für den env-Bereich dagegen wurden mRNA-Expression und Proteinproduktion nachgewiesen [de Parseval und Heidmann 1998]. Die Primer wurden daher so entwickelt, dass sie im env-Bereich des Provirus lokalisiert sind. Zum Nachweis der mRNA von HERV-H und -W wurden Primer von J. Johnston et al. [2001] verwendet. Die Primer für HERV-W liegen im pol-Bereich des Provirus, die für HERV-H im gag-Bereich. Beide sind so entworfen, dass sie in konservierten Bereichen liegen und spezifisch für die jeweilige HERV-Familie sind. Die Bestimmung der HERV-K Expression erfolgt mit den Primern spezifisch für die Volllängen-mRNA bzw. die gespleißte env-mRNA (vgl. Seite 45).

Abb. 4.17:Expression von HERV-R, -W und -H in Melanomzellinien.
(A) Expression von HERVs in 293- und GH- Zellen; M Marker, R HERV-R, W HERV-W, H HERV-H. (B) Expression von HERVs in Melanomzellen; M Marker, c SK-MEL-28,d SK-MEL-1, 0 H 2 O, 32 bis 47 Melanom-Zelllinien, die Zahlen korrespondieren mit Tabelle 2, Anhang Seite V.

Alle vorhandenen Gewebeproben und Zelllinien wurden auf die Expression von HERV-R, HERV-W, HERV-H und HERV-K mittels RT-PCR getestet. HERV-R ließ sich in den meisten untersuchten Proben nachweisen, ebenso HERV-H mit Ausnahme der Melanomzelllinien, die nur zu 60% positiv waren. HERV-W dagegen war nur in 25% der Melanomgewebe und in 60% der Zelllinien exprimiert. HERV-K Volllänge (gag) lässt sich in allen untersuchten Zellen nachweisen, gespleißtes env dagegen nur in 35% bzw. 43% der Melanome und in keiner Kontrollzelllinie (siehe Tabelle 2 und Anhang Seite IV f). Auffällig ist, dass sich HERV-R, -W und -H in fast allen Kontrollzelllinien nachweisen ließen. Im Gegensatz zu HERV-K, wo gespleißtes env nachgewiesen wurde, kann bei der PCR für HERV-R, -W und -H nicht zwischen Volllängen und gespleißter mRNA unterschieden werden.

↓74

Tabelle 2: Expression von HERVs

Melanomgewebe

Melanomzelllinien

Nicht-Melanomzelllinien

n = 47

n = 41

n = 16

HERV-R

env

100%

98%

100%

HERV-W

pol

23%

80%

94%

HERV-H

gag

83%

61%

94%

HERV-K

gag

100%

100%

100%

splice env

35%

43%

0%

4.2.2 Bestimmung exprimierter HERV-K Proviren

Als Positiv-Kontrolle der HERV-K Expression wird die Teratokarzinomzelllinie GH verwendet. Hier wurde erstmals die Expression von gespleißtem env und rec sowie Proteinproduktion und Partikelbildung beschrieben [Löwer et al. 1993]. Allerdings wurde bis heute noch nicht untersucht, welche der ca. 50 HERV-K Loci im Genom transkribiert werden. Da das von R. Phelps [Phelps 1997] entwickelte Primersystem es ermöglicht, zwischen der Deletionsmutante und dem Prototyp von HERV-K zu unterscheiden, ist klar, dass zumindest zwei Proviren unterschiedlichen Typs in allen untersuchten Zellen transkribiert werden. Um besser einschätzen zu können, ob ein heterogener Pool oder nur einige wenige HERV-K-Proviren transkribiert werden, wurden die mit P2+P3 (Volllänge) und P2+P5 (env) amplifizierten Banden in TOPO-TA-Vektoren kloniert, pro Konstrukt ca. 24 Klone sequenziert und mit der NCBI Datenbank verglichen. Um einen Eindruck zu bekommen, ob die Expression von HERV-K in Teratokarzinom und Melanomen gleich oder ähnlich ist, wurde Gesamt-RNA von GH-, SK-MEL-28- und 293-Zellen miteinander verglichen.

↓75

Volllängen Transkripte von HERV-K

Die Sequenzen von insgesamt 65 Volllängentranskripten, davon je 22 aus GH und 293 und 21 aus SK-MEL-28, wurden mit Hilfe des Moduls MegAlign von Lasergene V6 (DNAStar, Inc., USA) nach der Jotun-Hein-Methode miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass Sequenzen zu großen Teilen übereinstimmen und sich nur in einzelnen Nukleotiden unterscheiden. Aus Kosten und Zeitgründen wurden die klonierten Transkripte nur in einer Richtung sequenziert, so dass dies auch auf einzelne Sequenzierfehler zurückzuführen ist. Die niedrigste Übereinstimmung zweier Sequenzen liegt bei 93%. Diese Übereinstimmung spiegelt sich auch in der niedrigen Zahl an Nukleotidaustauschen wieder (siehe Anhang Seite IX ff) und zeigt, dass in SK-MEL-28-Zellen keine andere HERV-K Loci transkribiert werden, als in GH- oder 293-Zellen und in allen drei Zelllinien Transkripte aller in der NCBI-Datenbank-Suche gefundenen HERV-K Loci auftreten. Der Vergleich ausgewählter Sequenzen mit der NCBI-Datenbank zeigt, dass beide HERV-K Proviren gefunden werden. In der Hauptsache ähneln die Sequenzen dem HERV-K HML2.HOM Provirus (Accnr. AF074086) und dessen allelen Varianten (Accnrs. Y17832 und AF164614) sowie HERKLTGAG (Accnr. Y08032), HERV-K 101, 103 und 115 (Accrnrs. AF164609, AF164611 und AY037929) und HERV-K 10 (Accnr. M14123).

Env -Transkripte von HERV-K

↓76

Die Sequenzen von insgesamt 42 gespleißten env-Transkripten, davon je 21 aus GH- und SK-MEL-28-Zellen, wurden ebenfalls mit Hilfe von MegAlign miteinander verglichen. Auch hier stimmt der Großteil der Sequenzen (35 von 42) überein und unterscheidet sich nur in einzelnen Nukleotiden. Es finden sich sowohl Transkripte aus GH- und SK-MEL-28-Zellen (siehe Anhang Seite XII ff). Ein Vergleich ausgewählter Sequenzen mit der NCBI-Datenbank zeigt, dass auch hier die Sequenzen hauptsächlich dem HERV-K HML2.HOM Provirus (Accnr. AF074086) und dessen allelen Varianten (Accnrs. Y17832 und AF164614) gleichen. Zudem finden sich env-Sequenzen wie HERV-K env-mRNA (Accnr. X82272) und die env-Sequenz des HERV-K Provirus aus Melanomen MERV (Accnr. DQ058015). Neben diesen Sequenzen werden noch weitere acht Sequenzen nur von GH-Zellen transkribiert, die sich von dem Hauptteil durch Deletionen unterscheiden. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit der NCBI-Datenbank zeigt, dass sie HERV-K 101, 103 und 107 (Accrnrs. AF164609, AF164611 und AF164613) und HERV-K 10 (Accnr. M14123) zugeordnet werden können (deletierte Proviren). In SK-MEL-28 treten diese Transkripte nicht auf.

4.2.3 Semiquantitativer Nachweis der Expression von HERV-K

Kontrollzelllinien und normale Melanozyten

Bei normalen neonatalen Melanozyten HEMn-LP (leicht pigmentiert) und -DP (stark (dark) pigmentiert) konnten die Volllängen-Transkripte von HERV-K nachgewiesen werden. Es konnte kein gespleißtes env, dafür aber gespleißtes rec detektiert werden. Zusätzlich zeigte sich hier eine prominente Bande bei 230bp, die in keiner weiteren untersuchten Probe detektiert wurde (siehe Abb. 4.18). MART-1 wurde in den normalen Melanozyten nicht exprimiert.

↓77

Abb. 4.18: Agarosegel der RT-PCR mit normalen Melanozyten. RT-PCR mit dem HERV-K Primern von normalen Melanozyten; M Marker, 1 P2+P3, 2 P4+P5, 3 P2+P5, 4 P2+P6, 5 P1+P7, 6 GAPDH und 7 DNA Kontrolle.

Bei den verwendeten Nicht-Melanomzelllinien (siehe Material und Methoden Seite 24) konnte ebenfalls in allen Proben die Expression der Volllängen-mRNA von HERV-K nachgewiesen werden. Gespleißtes env konnte in nur 2 von 16 (13%), gespleißtes rec in und np9 in keiner Probe nachgewiesen werden (siehe Tabelle 3 Seite 61). Im Gegensatz zu den Melanomzelllinien und -geweben waren die Banden schwach, was trotz der semiquantitativen RT-PCR auf eine geringe Expression schließen lässt. MART-1 wurde nicht exprimiert (siehe Anhang Seite V).

Melanomgewebe und Melanomzelllinien

↓78

Das in 4.1.1 (siehe Seite 45 und Anhang Seite II) beschriebene Primerset bestehend aus sieben Primern wurde verwendet, um die Expression von HERV-K in den verschiedenen Melanomproben zu bestimmen. Alle vorhandenen Gewebeproben und Zelllinien wurden auf die Expression von Volllängen- und gespleißter HERV-K mRNA getestet.

Abb. 4.19: Exemplarisches Agarosegel der RT-PCR mit Melanomproben. RT-PCR mit dem HERV-K Primern von Melanomgewebe SCHM und -zelllinie GL (Anhang Seite IV und V); M Marker, 1 P2+P3, 2 P4+P5, 3 P2+P5, 4 P2+P6, 5 P1+P7, 6 GAPDH und 7 DNA Kontrolle.

↓79

In allen Proben, Geweben und Zelllinien ließ sich die Volllängen-mRNA nachweisen. Von den getesteten Melanomgeweben konnte in 35% (17 von 49) gespleißtes env und in 39% (19 von 49) gespleißtes rec nachgewiesen werden, zusätzlich konnte die 1,5kb mRNA in vier der rec positiven Proben detektiert werden. In 26% der Gewebe konnte gespleißtes np9 nachgewiesen werden. In den getesteten Melanomzelllinien konnte bei 36% (15 von 42) gespleißtes env und in 40% (17 von 42) gespleißtes rec detektiert werden, die 1,5kb mRNA in 2 der rec positiven Proben nachgewiesen werden. 19% der Zelllinien waren positiv für gespleißtes np9 (siehe Anhang Seite V).

Tabelle 3: Expression von HERV-K

Gewebe

Zelllinien

Nicht-Melanomzellinien

Volllänge

49

100%

42

100%

16

100%

env

17

35%

15

36%

2

13%

rec

19

39%

17

40%

0

0%

1,5kb

4

10%

5

12%

0

0%

np9

13

26%

8

19%

0

0%

gesamt

49

100%

42

100%

16

100%

↓80

Das parallele Vorhandensein von 24 Melanombiopsien und daraus entstandener Zellkultur erlaubte es, die Expression von HERV-K in Gewebe und Zellkultur zu vergleichen. Generelle unspezifische Aktivierungen der Expression von HERV-K aufgrund von Kultivierung konnten so ausgeschlossen werden. In 19 Biopsien und Zelllinien stimmte die Expression von HERV-K überein. In drei Fällen war eine in der Biopsie nachweisbare Expression von gespleißtem env und rec in der Zellkultur nicht nachweisbar. Da nicht alle Zellen eines Tumors HERV-K gleichermaßen spleißen, scheinen hier HERV-K negative Zellen angewachsen zu sein. Jedoch ist in zwei Zelllinien die Expression gespleißter RNA erst bei der Kultivierung aufgetreten (siehe Anhang Seite V).

4.2.4 Real-time RT-PCR zur quantitativen Bestimmung der Expression von HERV-K

GH Kalibrat or-RNA und normale Zelllinien

↓81

Da sich eine one-step RT-PCR schlecht mit der PCR eines Plasmidstandards vergleichen lässt, wurde zur Quantifizierung der Expression GH-RNA als Kalibrator festgelegt (GH-Zellen weisen eine stetige Expression aller HERV-K mRNA Spezies auf). Sämtliche Proben wurden auf diesen Standard bezogen. Um die Variabilität möglichst gering zu halten, wurde ein Stock an GH Gesamt-RNA hergestellt (positiv Kontrolle der HERV-K Expression), welcher für die einzelnen Vergleiche herangezogen wurde. Dieser Stock wurde ebenfalls für die Optimierung der Reaktionsbedingungen und die Bestimmung der Effizienzen eingesetzt.

Statt der von K. Livak [1997] verwendeten Methode, die Proben über die Expression eines Haushaltsgenes und in Bezug auf den Kalibrator (ΔΔCT) abzugleichen, wurden anstelle des Abgleichs durch die Expression eines Haushaltsgenes gleiche Mengen an Gesamt-RNA in den Assay eingesetzt (ΔCT). Die Effizienzen der einzelnen Reaktionen wurden ebenfalls in den Berechnungen berücksichtigt.

Zunächst wurde die Expression von HERV-K in SK-MEL-28-, 293-, C8166-Zellen und normalen PBMCs in Bezug auf GH bestimmt. Bei 293-, C8166-Zellen und normalen PBMCs ließ sich, wie auch schon in der semiquantitativen PCR, lediglich die Volllängen- und gespleißte rec-mRNA nachweisen. Die Expression der Volllängen-mRNA liegt bei ca. 2% von GH, die der rec-mRNA noch darunter. SK-MEL-28-Zellen dagegen weisen eine HERV-K Expression von ca. 50% von GH auf. Bei gespleißtem rec ist sie sogar annähernd gleich der Expression bei GH (siehe Abb. 4.20).

↓82

Abb. 4.20: Relative Expression von HERV-K. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in SK-MEL-28-, 293-, C8166-Zellen und PBMCs in Bezug auf GH.

Melanomgewebe und Melanom zelllinien

Bei den Melanomgeweben wurde die zuvor in der semiquantitativen PCR für die Expression von gespleißter HERV-K mRNA positiven Proben getestet, um quantitativ die Menge der Expression abschätzen zu können.

↓83

Abb. 4.21:Relative Expression von HERV-K. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in FE-, FM-, KLM-, MA-, SC-, TB-, AA- und AB- Melanomgeweben, AB zeigte in der semiquantitativen PCR nur eine schwache Bande und LAN-Gewebe war negativ für gespleißte HERV-K mRNA (siehe Anhang Seite IV). Jeweils in Bezug auf GH-mRNA.

Die Gewebe FE, FM, KLM, MA, SC, TB und AA (siehe Anhang Seite IV) waren in der vorhergegangenen semiquantitativen PCR positiv für gespleißtes HERV-K. In der real-time RT-PCR ließ sich ebenfalls für alle Proben gespleißte mRNA nachweisen. Der Prozentsatz in Bezug auf GH variiert, bei KLM ist er verglichen mit den anderen Gewebeproben sehr hoch, vor allem der Anteil an gespleißter env-mRNA (siehe Abb. 4.21). Bei den anderen Geweben liegt die Expression zwischen 5% und 10% von GH, wobei die Expression gespleißter env-mRNA bei FE und MA gegenüber den anderen mRNAs mit 40% von GH auch besonders erhöht ist. Die Gewebeprobe AB zeigte in der semiquantitativen PCR nur eine schwache Bande und zeigt auch in der quantitativen Bestimmung die niedrigste Expression. Die Gewebeprobe LAN zeigte kein gespleißtes HERV-K in der semiquantitativen PCR und auch in der real-time PCR nur eine geringe Expression. Gegenüber anderen negativen Proben (293, C8166-Zellen oder normalen PBMCs, siehe Seite 62f) lässt sich jedoch gespleißtes env nachweisen (siehe Abb. 4.21).

Tabelle 4: relative Expression von HERV-K in Melanomgeweben

Gewebe

relative Expression in %

VL

env

rec

np9

GH

100,0

101,8

100,5

107,6

FE

4,2

40,7

2,9

4,5

FM

8,4

9,8

6,2

4,7

KLM

53,7

448,1

72,7

108,8

MA

10,8

38,4

9,5

8,4

SC

2,3

6,0

3,8

2,7

TB

35,8

7,4

7,2

4,0

LAN

7,4

1,6

1,0

0,3

AA

13,9

6,0

2,6

0,9

AB

22,3

0,2

2,6

0,4

↓84

Von den Melanomzelllinien wurden ebenfalls nur die in der semiquantitativen PCR für gespleißtes HERV-K positiv getesteten Zellen für die Quantifizierung der Expression eingesetzt. Bei den Proben BA, LAU, SCHM, SCHW und ZO (siehe Anhang Seite V) ließ sich in der real-time RT-PCR ebenfalls für alle Proben gespleißte mRNA nachweisen. Der Prozentsatz an gespleißter RNA in Bezug auf GH variiert auch hier, bei SCHW ist er mit 50% (env und np9) und 68% (rec) von GH relativ hoch. Bei den anderen Geweben liegt die Expression zwischen 2% und 10% von GH, wobei die Expression gespleißter mRNA im allgemeinen niedriger ist als bei den Gewebeproben (siehe Abb. 4.22).

Abb. 4.22: Relative Expression von HERV-K. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in BA-, LAU-, SCHM-, SCHW-, ZO- und AC-Melanomzellen, RA- Zellen waren in der semiquantiativen PCR negativ für gespleißtes HERV-K mRNA (siehe Anhang Seite V). Jeweils in Bezug auf GH mRNA.

Die Zelllinie RA war in der semiquantitativen PCR negativ für gespleißtes HERV-K und zeigt auch in der real-time PCR nur eine geringe Expression der Volllängen-mRNA. Wie bei anderen für die Expression von HERV-K negativen Proben (293, C8166 oder normalen PBMCs siehe Seite 62 f) lässt sich kein gespleißtes env oder np9 nachweisen (siehe Abb. 4.22).

↓85

Tabelle 5: Relative Expression von HERV-K in Melanomzelllinien

relative Expression in %

Zellen

VL

env

rec

np9

GH

101,1

100,3

101,4

100,7

BA

5,3

6,4

3,9

2,1

LAU

5,5

10,6

3,1

1,9

SCHM

10,4

6,9

14,3

5,8

SCHW

15,8

55,6

68,4

45,5

ZO

4,6

14,4

4,0

2,2

RA

2,6

0,1

0,5

0,0

AC

2,7

1,2

4,6

2,3

Die Expression von HERV-K mRNA wurde in Proben von denen parallel Gewebe und Zelllinien vorhanden sind, ebenfalls quantitativ bestimmt. Exemplarisch wurden zwei Proben miteinander verglichen. Das Muster der Expression von HERV-K stimmte in den Biopsien und den Zelllinien überein, jedoch trat eine Steigerung der Volllängen-mRNA von 2% bzw. 4% im Gewebe auf 5% bzw. 6% in den Zelllinien auf. Damit konnte neben einer generellen unspezifischen Aktivierung auch eine Erhöhung der Expression von gespleißten HERV-K Transkripten aufgrund von Kultivierungsbedingungen ausgeschlossen werden (siehe Abb. 4.23).

Abb. 4.23: Relative Expression von HERV-K in Ausgangsgeweben und korrespondierenden Zelllinien. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in AS- und AT Melanomen und Zelllinien. Jeweils in Bezug auf GH mRNA.

↓86

4.2.5 Expression von HERV-K Proteinen

Die Expression von HERV-K Proteinen wurde mit Hilfe spezifischer Antiseren und den entsprechenden Präimmunseren untersucht (siehe Anhang, Seite VI). Um zunächst die Expression HERV-K spezifischer Proteine in normalen Geweben zu untersuchen, wurde ein kommerzieller Westernblot der Firma USBiological verwendet. Die Expression von HERV-K in Melanommetastasen wurde zum einen über isoliertes Gesamtprotein im Westernblot und zum anderen mittels Immunfluoreszenz und Immunhistologie untersucht.

HERV-K Proteine im Westernblot

↓87

Für die Analyse der Expression von HERV-K Proteinen im Westernblot wurden von jeder Probe 20µg Gesamtprotein pro Gelspur aufgetragen. Gesamtprotein von GH-Zellen wurde als Positiv-Kontrolle und von 293-Zellen als Negativ-Kontrolle mitgeführt.

Eine spezifische Bande bei 36kDA in Höhe des prozessierten gp36/TM-Protein lässt sich bei GH- und SK-MEL-28 Zellen nachweisen, zudem kann in SK-MEL-28-Zellen das Env-Vorläuferprotein bei 80kDA nachgewiesen werden. In 293-Zellen lässt sich keine der spezifischen Banden detektieren, das Präimmunserum zeigt keine Banden (siehe Abb. 4.24).

Abb. 4.24: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression. Westernblot mit je 20µg Gesamtprotein von GH-, 293- und SK-MEL-28-Zellen und Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM. Vorläuferprotein und gp36 sind markiert. GAPDH und β-Aktin zeigen die gleichmäßige Beladung.

↓88

Expression von HERV-K Proteinen in normalen Geweben

Der kommerzielle Western Blot IV von US Biological ist mit je 50µg Zelllysat aus folgenden unveränderten Geweben bestückt: Herz, Leber, Pankreas, Testis, Prostata und Plazenta. Der Blot wurde mit Seren gegen HERV-K gp36/TM, Np9 und Rec sowie den entsprechenden Präimmunseren, soweit vorhanden, getestet (siehe Anhang Seite VI).

Mit Antiseren gegen HERV-K Np9 und Rec konnte in keinem der Gewebe eine Expression der Proteine nachgewiesen werden, die entsprechenden Präimmunseren waren ebenfalls negativ. Mit dem Ziegenserum 26 gegen HERV-K gp36/TM konnte in Herz, Leber, Pankreas, Testis und Plazenta eine spezifische Bande bei 30kDa anstelle von 36kDa festgestellt werden, wobei in Plazentagewebe die Expression erhöht ist (siehe Abb. 4.25). In Prostatagewebe dagegen lässt sich kein Protein dieser Größe nachweisen. Dies geht konform mit den Ergebnissen der semiquantitativen RT-PCR, bei der sich in humanen Prostatakarzinomzellen (LNCaP, zur Verfügung gestellt von O.Hohn, RKI) nur Volllängen-mRNA und keine gespleißte mRNA nachweisen lässt.

↓89

Abb. 4.25: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression in normalen Geweben.
Westernblot mit je 50µg Gesamtprotein aus 1 Herz-, 2 Leber-, 3 Pankreas-, 4 Testis-, 5 Prostata- und 6 Plazentagewebe mit Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM/gp36. β-Aktin zeigt die gleichmäßige Beladung.

Expression von HERV-K Proteinen in Melanommetastasen

Die in der RT-PCR für HERV-K Expression positiv getesteten Proben wurden auch auf die Expression des Proteins HERV-K gp36/TM untersucht.

↓90

Abb. 4.26: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression in Melanomgeweben und -zelllinien. Westernblot mit je 30µg Gesamtprotein aus den entsprechenden Geweben bzw. Zelllinien (siehe Anhang Seite IV und V) mit Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM/gp36. GAPDH zeigt die gleichmäßige Beladung des Gels.

Insgesamt wurden neun Melanomgewebe auf die Expression von HERV-K gp36/TM getestet. Von diesen konnte in sieben ein Protein nachgewiesen werden, zum Teil war die Expression jedoch relativ schwach wie bei TB und SE, hier ist jedoch auch die Anfärbung von GAPDH schwach (siehe Abbildung 4.26). Insgesamt zeigt dieses Gel trotz der gleichen Auftragsmenge eine recht ungleichmäßige Beladung, so dass lediglich eine Aussage über das Vorhandensein und nicht über die relative Menge getroffen werden kann. Von sechs untersuchten Melanomzelllinien konnte in fünf HERV-K-gp36/TM klar nachgewiesen werden, bei AO dagegen nur schwach (siehe Abbildung 4.26).

Mit dem Antiserum gegen HERV-K Np9 konnte in keinem der Gewebe oder Zellen eine Expression des Proteins nachgewiesen werden.

↓91

HERV-K Proteine in der Immunfluoreszenz

Um zu bestimmen, ob das TM-Protein von HERV-K in Melanomzellen auf der Oberfläche exprimiert wird, wurde zunächst eine Immunfluoreszenz mit Ziegenserum 26, spezifisch für HERV-K gp36/TM und permeabilisierten Zellen, durchgeführt. GH- und SK-MEL-28-Zellen zeigen die Expression von TM-Protein (siehe Abb. 4.27 a und c), 293-Zellen dagegen sind negativ (siehe Abb. 4.27 e). Das Muster der Färbung bei GH- und SK-MEL-28-Zellen sieht ähnlich aus und zeigt Cluster von Viruspartikeln an der Zelloberfläche. Das Präimmunserum zeigt bei allen Zellen keine Reaktion (siehe Abb. 4.27 b, d und f).

Abb. 4.27: Immunfluoreszenz mit GH-, SK-MEL-28- and 293-Zellen. Die Zellen wurden mit HERV-K gp36/TM spezifischem Ziegenserum 26 (a, c und e) und mit Präimmunserum (b, d und f) gefärbt.

↓92

Eine Immunfluoreszenzfärbung ohne Permeabilisierung bei SK-MEL-28-Zellen zeigt die Lokalisation der Cluster auf der Zelloberfläche. Die Färbung ist im Mikroskop deutlich über die gesamte Zelloberfläche verteilt, aber sehr schwach und lässt sich daher selbst mit dem konfokalen Laserscanning Mikroskop nicht zufriedenstellend darstellen (siehe Abb. 4.28).

Abb. 4.28: Immunfluoreszenz mit SK-MEL-28 Zellen. Die Zellen wurden nicht permeabilisiert und mit HERV-K gp36/TM spezifischen Ziegenserum 26 gefärbt.

Des weiteren wurden die HERV-K Proteine Rec und Np9 bei GH-Zellen in der Immun-fluoreszenz untersucht (siehe Abb. 4.29). Die Färbung von GH-Zellen mit dem spezifischen Serum bzw. Präimmunserum für Np9 wurde analog des angegebenen Protokolls durchgeführt (siehe Material und Methoden Seite 43). Die Färbung gegen HERV-K Rec wurde von Frau S. Hahn (Paul Ehrlich Institut, Langen) angefertigt.

↓93

Abb. 4.29: Immunfluoreszenz mit GH-Zellen. Die Zellen wurden mit spezifischen Seren gegen die HERV-K Proteinen Rec (Kaninchen 4) und Np9 (Ziege 29) sowie den entsprechenden Präimmunseren gefärbt.

Trotz der in Bezug auf GH geringen Expression von gespleißtem Env in den Melanom-zelllinien, wurde eine Immunfluoreszenz mit Seren gegen die Proteine gp36/TM, Rec und Np9 durchgeführt. Obwohl auch im Westernblot bei diesen Zellen das Transmembran-protein nachweisbar war, konnte bei keiner der getesteten Zellen eine Färbung beobachtet werden.

HERV-K Proteine in der Immunhistologie

↓94

Abb. 4.30: Immunhistologische Färbung von Melanommetastasen. Schnitte wurden mit Antikörpern spezifisch für verschiedene HERV-K Proteine und den entsprechenden Präimmun-seren gefärbt, um die Expression von HERV-K Proteinen zu untersuchen.

Die Expression von HERV-K Proteinen wurde zudem im Melanom-Primärtumoren und Metastasen mittels Immunhistologie untersucht. Um den Tumor zu lokalisieren und den Melanomcharakter zu charakterisieren wurde zunächst mit Melanommarkern gefärbt. Hierfür wurden die Antikörper HMB45, spezifisch für gp100, und anti-Tyrosinase verwendet (siehe Abb. 4.30). Die Expression von HERV-K Gag- und gp36/TM-Proteinen konnte so in den Melanomzellen gezeigt werden, wobei das den Tumor umgebende Gewebe nicht angefärbt wurde. Die entsprechenden Präimmunseren zeigten keine Reaktion. Nicht jede Tumorzelle ist gefärbt, was darauf hinweist, dass HERV-K nicht in jeder Zelle gleichermaßen exprimiert wird. Drei von sechs (50%) Primärtumoren sind positiv für HERV-K TM und vier von fünf (80%) sind positiv für HERV-K Gag. Von den untersuchten Metastasen sind 15 von 36 (42%) positiv für HERV-K TM und 35 von 44 (80%) positiv für Gag.

↓95

Tabelle 6: Immunhistologie von HERV-K Proteinen in Primärtumoren und Metastasen

Primärtumore

Metastasen

HERV-K

HERV-K

HERV-K

HERV-K

HERV-K

HERV-K

HMB45

TM

Gag

TM

Gag

Rec

Np9

gesamt

6

5

36

44

21

21

21

positive

3

4

15

35

3

0

14

negative

3

1

21

96

18

21

7

4.2.6 HERV-K spezifische Antikörper in Seren von Melanompatienten

102 Seren von Melanompatienten wurden zusammen mit 20 Seren von Patienten mit Alopezie und 25 Seren von normalen Blutspendern auf Antikörper gegen HERV-K Proteine untersucht. 17% (17 von 102) der Seren von Melanompatienten reagierten positiv mit dem rekombinanten HERV-K TM Protein im Westernblot (siehe Tabelle 4 Anhang Seite VII). Die gleichen Seren wurden im Westernblot auf spezifische Antikörper gegen HERV-K Np9 (siehe Tabelle 4 Anhang Seite VII) und von Frau S. Hahn am Paul Ehrlich Institut auf spezifische Antikörper gegen HERV-K Rec getestet. Gegen beide Proteine zeigte sich jedoch keine Reaktion. Von den getesteten Seren der Alopeziepatienten oder normalen Blutspendern reagierte keines positiv.

Abb. 4.31: Westernblot Analyse mit rekombinantem HERV-K TM. Serum von Patient LAN über den Verlauf der Zeit getestet auf Antikörper gegen HERV-K TM.

↓96

Der Krankheitsverlauf eines Patienten wurden genauer studiert. Von Patient LAN wurde über die Zeit von einem Jahr neun Seren gesammelt und das Level des Serummarkers für malignes Melanom, MIA (Melanoma inhibiting activity) bestimmt. An den Zeitpunkten 0, 17 und 22 Wochen nach der ersten Tumordiagnose war das MIA Level besonders hoch und korrelierte mit dem Auftreten eines Tumors. An diesen Zeitpunkten ist das Level der HERV-K spezifischen Antikörper in Westernblot niedriger als zu den anderen Zeitpunkten (siehe Abb. 4.31).

Tabelle 7: Klinische Daten von Patient LAN

Datum der Blutentnahme

Tumor

MIA Level

10.10.2001

+

14,9

24.10.2001

-

11,6

24.01.2002

-

15,1

06.02.2002

+

11,4

12.03.2002

+

19,7

21.03.2002

-

17,5

25.06.2002

-

9,3

25.09.2002

-

9,3

04.10.2002

-

9,4

4.2.7  Infektionsversuche mit HERV-K Partikeln

Die Produktion von HERV-K Partikeln wurde für GH-Zellen nachgewiesen, daher wurde die Melanomzelllinie SK-MEL-28 auf die Produktion von infektiösen Viruspartikeln getestet.

↓97

Zunächst wurden Überstände von SK-MEL-28- und GH-Zellen auf die Aktivität von Reverser Transkriptase getestet und waren positiv. Zusätzlich wurden Pellets aus der Ultrazentrifugation der Überstände positiv im RT-Test getestet sowie auch in der RT-PCR für virale HERV-K RNA. Dies ließ die Produktion von viralen Partikeln von GH- und SK-MEL-28-Zellen vermuten (siehe Abb. 4.32).

Abb. 4.32: Bestimmung der Aktivität von Reverser Transkriptase in Zellkulturüberständen und Nachweis viraler HERV-K RNA im Viruspellet. (A) Bestimmung der RT-Aktivität im Zellkulturüberstand (schwarz) und im Viruspellet der Ultrazentrifugation von Zellkultur-überständen (grau) von SK-MEL-28-, 293- und GH-Zellen. (B) RT-PCR Nachweis viraler HERV-K Volllängen-RNA im Viruspellet aus GH-, 293-, und SK-MEL-28-Zellen. 1 keine RT zur Kontrolle von kontamin.ierender (zellulärer) DNA; 2 HERV-K Vollängen Nachweis mit Primer-paar P2 und P3 (siehe Seite 47).

Infektionsversuche wurden mit virushaltigen Überständen von SK-MEL-28- und GH-Zellen auf Nicht-humanen PG4-, 3T3- und MDBK-Zellen durchgeführt. Zusätzlich wurden Kokultivierungen mit den virusproduzierenden Zellen durchgeführt, da der Kontakt der Zellen eine Infektion forcieren kann.

↓98

Mittels PCR ließ sich jedoch in den zu infizierenden Zellen, sowohl aus den Infektionen mit Überstand, wie auch aus der Kokultivierung bei MDBK- und 3T3- Zellen kein Provirus nachweisen. Auch wenn HERV-K spezifische Signale nach der Infektion in PG4-Zellen nachgewiesen werden konnte, verlor sich dieses Signal nach spätestens vier Passagen.

Im Pellet aus dem Überstand von SK-MEL-28-Zellen konnten von Frau Holland und Herrn Özel [Robert Koch-Institut, Özel et al. 1988] in der Elektronenmikroskopie Strukturen, ähnlich den aus GH-Zellen gezeigten HERV-K Partikeln [Boller et al. 1993], dargestellt werden. Allerdings erscheinen diese pleiomorph und zeigen nicht die typische Form retroviraler Partikel (siehe Abb. 4.33).

Abb. 4.33: HERV-K Partikel im Pellet aus dem Überstand von SK-MEL-28-Zellen. Dargestellt sind pleiomorphe Strukturen, die retroviralen Partikeln ähnlich sehen, aber defekt zu sein scheinen. 150nm sind angezeigt.

4.3  Expression von HERV-K in humanen embryonalen Stammzellen

4.3.1  Expression von HERV-K in humanen embryonalen Stammzellen

↓99

Um den Expressionstatus von HERV-K in embryonalen Stammzellen zu untersuchen, wurde Gesamt-RNA aus drei verschiedenen Stammzelllinien, H9 und dessen Subklon H9.2 sowie I3, verwendet. Alle Zelllinien sind zunächst auf murinen Feederzellen (MEF) und später auf humanen Feederzellen (HFF) kultiviert worden. Die Kultivierung der Zellen sowie die Aufreinigung von Gesamt-RNA und Proteinen wurde von Frau S. Terstegge (Institut für Rekonstruktive Neurobiology, LIFE & BRAIN GmbH Cellomics Unit, Bonn), durchgeführt. Die Expression von HERV-K Volllängen-mRNA, gespleißter env-, rec- und np9-mRNA ließ sich in allen Zellen nachweisen. Die einzelnen Zelllinien wurden miteinander verglichen und in Bezug auf die Expression von HERV-K in GH Zellen getestet. Eine Schwierigkeit hierbei lag darin, dass zwar von allen Proben gleich viel Gesamt-RNA eingesetzt wurde, jedoch der Anteil der RNA der Feederzellen, human wie murin, nicht zu bestimmen war. Daher ist ein exakter Vergleich hier nicht möglich.

Dennoch zeigte sich, dass die Expression in den hESC bei ca. 10% von GH lag (siehe Abb. 4.34) und erhöht ist. Auch ließ sich, im Gegensatz zu 293-, C8166-Zellen und normalen PBMCs, gespleißtes env und np9 nachweisen (siehe Abb. 4.20, Seite 62 f).

Abb. 4.34: Relative Expression von HERV-K in humanen embryonalen Stammzellen. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in humanen embryonalen Stamm-zelllinien in Bezug auf GH-Zellen. Stammzelllinien H9, H9.2 und I3 jeweils mit humanen (HFF) bzw. murinen (MEF) Feederzellen kultiviert.

4.3.2 Veränderung der HERV-K Expression während der Differenzierung

↓100

Um Veränderungen in der Expression von HERV-K während der Differenzierung nachzuvollziehen, wurden zunächst nur wenige Stadien miteinander verglichen. Von den Ausgangszelllinien I3-MEF und H9.2-MEF (Passagen 50 und 60) wurden differenzierte neuronale Vorläuferzellen (neuronal progenitor; NP-H9.2 bzw. NP-I3) untersucht, zudem wurden Zellen eines Zwischenstadiums (Embryoid Bodies (EBs)) analysiert.

Wie in Abb. 4.34 gezeigt, liegt die Expression von HERV-K in den humanen embryonalen Stammzellen unter 10% in Bezug auf GH. Nach der Differenzierung sinkt die Expression auf ein Level vergleichbar mit anderen Zellen, die negativ für gespleißtes HERV-K sind (293-, C8166-Zellen oder normale PMBCs; siehe Abb. 4.20, Seite 62 f). Gespleißtes env ist nicht mehr detektierbar (siehe Abb. 4.35). Die Schwierigkeit, dass der Anteil an RNA von Feederzellen nicht bestimmt werden kann und ein exakter Vergleich nicht möglich ist, ergibt sich auch hier.

Abb. 4.35: Relative Expression von HERV-K in undifferenzierten ES-Zellen und differenzierten neuronalen Vorläuferzellen. HERV-K Expression in humanen ES Zellen und den jeweilig daraus differenzierten Zellen. Die Expression der differenzierten Zellen ist jeweils auf die hES-Ursprungszelllinie bezogen.

4.3.3  Expression von HERV-K Proteinen in embryonalen Stammzellen

↓101

Humane embryonale Stammzellen, kultiviert auf humanen bzw. murinen Feederzellen, wurden auf die Expression von HERV-K gp36/TM getestet. Es konnte in allen Stammzellproben ein Protein nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4.36). Die humanen Feederzellen dagegen zeigten kein HERV-K TM/gp36 Protein. Bei den differenzierten Zellen NP-I3, NP-H9.3 und Embryoid Bodies zeigt sich analog zum Rückgang der HERV-K Expression (siehe Seite 77) auch kein oder nur noch sehr wenig (im Falle von NP-I3) TM/gp36 Protein.

Die unterschiedliche Intensität der Banden lässt auch hier, analog zur RT-PCR, keinen Rückschluss auf die Menge an vorhandenem Protein zu, da der Anteil an Proteinen aus den Feederzellen nicht bestimmt werden kann.

Abb. 4.36: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression in humanen embryonalen Stammzellen und daraus differenzierten neuronalen Progenitorzellen. Westernblot mit je 30µg Gesamtprotein pro Spur (Beschriftung siehe Text Seite 83), gefärbt mit Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM. Gp36/TM ist jeweils markiert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
01.12.2006